CN1032190A - 生产微生物细胞体的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

通过在整个发酵器(1)各处保证溶解甲烷(11)和 氧气(13)和铵的浓度保持恒定来实现生物体的生产 量以及它的均匀性和纯度的极大提高。
此外，用硝酸盐测量代来控制氢的形成，以防止 硝酸盐的形成太多而阻碍生长。
为了在甲烷和空气被输入到发酵器中之前得到 最大限度的混合，采用一个或多个由压力流体驱动的 喷射器(33)因而避免使用机械混合装置。
最后，经由喷口(36)进料，仍于喷口的喷射方向 以得到最大可能的湍流，并以此获得发酵器中最大可 能的混合。

Description

本发明涉及在发酵罐中生产微生物细胞体的方法，罐中所培养的细菌是甲烷营养型，其碳源和能源是天然气，氧气源是空气，氮源是氨，并且培养是在腐化条件下进行的。所说发酵过程由计算机控制。本发明还涉及实施本方法的装置。
英国专利1，270，006描述了在发酵罐中生产生物体的方法，它是通过在含有同化氮源和在必要的矿物质盐存在的液体生长介质中，在甲烷气存在下培养微生物，并从液体生长介质中提取所述的生物体。
然而，迄今为止的这些已知方法不能令人满意地运行。因为在腐化条件下，要避免不需要的毒素和/或损害生长的生物体的增加是特别困难的，而且要得到很纯的和均匀的生物体也是困难的。
因此，在实现有用的连续的生物体生产方面至今未取得成功。
本发明的目的是要使这种生物体的生产有利可图。该方法是通过利用一个在整个发酵器中保持发酵罐中溶解的甲烷和氧气的浓度恒定的方法来实现的。
由此对细菌的培养实现了至今未被发现的稳定度和均匀的最佳生长条件。该方法的最佳化提供了在液体中获得高细胞密度的可能性，即直至高达4.5%以上。它是现在已知水平的两倍，这意味着在干燥过程中的节省，因为在干燥过程中只需去掉一半量的水。
该方法能实现均匀一致的高生产率，实践表明该方法比已知生产方法生产能力高出10倍。
另外，加入的气体量仅仅是保持该培养物最佳活性所需的量。与目前已知的方法比较（这些已知方法由于排出大量的发酵罐中产生的气体，而引起气体的大量损失），本发明的方法大大地降低了气体的消耗量。
这使得实施本方法可以获利，原因是气体的价格约为生产成本的75%。
如权利要求2中表示的那样，通过使用群体谱测定法可以实现联机控制。
如权利要求3中表示的那样，通过使用装有膜片入口的群体谱测定法，能够快速而可靠地实现测量。
如权利要求4中表示的那样，通过保持整个发酵器中氨的浓度恒定，确保了细菌的快速生长。
如权利要求5中表示的那样，通过使用离子选择电极能够连续地进行测量。
如权利要求6中表示的那样，通过增加使用硝酸盐测定仪，可以控制发酵器中硝酸盐的形成，不致因为过多而妨碍生长。
如权利要求7中表示的那样，通过在喷射器中混合甲烷和空气，由于大量吸收到喷射器中的氧气可以达到特别高的气体传输常数。
如权利要求8中表示的那样，通过使用压力液体作为泵介质，可以在不使用机械搅拌装置下，确保高的分散度。
如权利要求9中表示的那样，通过利用一些可调的喷口，它们能够在发酵器内提供任何所需的流动方向。
最后，如权利要求10中表示的那样，通过转动来调节喷口的方向是很方便的。
下面将参照附图对本发明作出更详细的描述，其中
图1是完成本方法的系统的示意。
图2是沿图4中Ⅱ-Ⅱ方向看的，带有管道系统和喷射器的发酵器下部的剖视图。
图3是沿图2和4中Ⅲ-Ⅲ方向看的发酵器的剖面图。
图4是沿图2和3中Ⅳ-Ⅳ方向看的发酵器的剖面图。
图5为稀释速度随甲烷浓度变化的曲线图。
图1是具有发凸?的所谓“空气提升式发酵器”系统的一个实施方案。
发酵器可制造成具有一个密闭的顶部，作为一个压力罐，这样可以增加营养气体的可溶解度。气体的溶解度与它们的分压成正比。
天然气11和氧气13的供应分别经过调节阀10和12通过分配管3和4进入发酵罐的底部，而营养液23则通过调节阀24和20送至罐的顶部。
天然气和氧气通过发酵器底部的两个分配管3和4独立地送入发酵罐中，每个分配管由均匀地分布在底部区域上的管子装置构成，在这些管子的顶部有若干流出气体用的0.5mm至1mm的孔。
该分配系统在0.5mm的孔经处产生直径小于1cm的气泡，均匀地分布在发酵器的横截面上。
当气泡在罐的底部吹出时，在罐内就发生将供给的天然气和氧气输送到发酵介质中的传递。罐子可以划分为由于气体含量高而使流体向上移动的第一部份，和由于气体含量低而使流体向下移动的第二部份。为了确保培养物的均匀混合和最佳利用吹出的气体，发酵器必须相当高，因为气体心须通过高达50米的液体才能被完全地利用。
为了减少这么长的流体通路，因而降低成本，可以用如图所示的带有循环器的发酵器，该循环器用带有循环泵14a的一个旁通管道将罐的下部管3a经过2a与其顶部相连。这样可以强迫气体通过罐中的介质进行循环直到发生所希望的吸收作用。
再循环和喷射新气体11和13的次数根据保持在再循环空气中气体的含量来调节。
用群体谱分析仪15a来测定循环过程中的甲烷和氧气的含量。
通过使流体逆气体流方向循环来增加发酵器中气体和停留时间。从罐的底部经过管14a并借助于循环泵14得到一个液体流，它被送入发酵器的顶部，在顶部再与通过管2供给的营养液一起被输入。这种流体的循环也进一步促进了发酵器中的良好混合，循环流体与提供的营养液一起通过喷雾或栅网被送到发酵器的顶部，从而实现了抑制泡沫的效果。
或者循环流可以与再循环气体一起加压通过置于发酵介质中的向下的喷嘴被引入，可以达到特别好的气体到流体中的传递。
用与罐1连接的群体谱分析仪6来测定发酵器1内部介质中的甲烷和氧气的含量。由于在发酵器中使用了群体谱分析仪6和用于测定循环流体的群体谱分析仪15，并且借助于循环传输时间的知识，就可以根据发酵器内部和外部测量值的差异计算代谢活性。
使用设有膜进口的群体谱分析仪连续地测量发酵器中溶解的甲烷和氧气，根据群体谱分析仪测定值来调整气体的供给，以便使介质中溶解的甲烷和氧气的浓度保持常数。
为了便于循环，用分光光度计18测定介质中细胞的密度。通过穿过介质进入的一个已知光源被细菌分散后，测定通过细菌的光量作为细胞密度的一个量度。该方法受到如细菌同样具有光扩散作用的气泡的影响。然而，通过泵出一部分发酵介质穿过一个具有垂直放置的作为测量池的园柱形玻璃管的分光光度计可以解决这个问题，在一些适当的时间间隔上停止通过该垂直柱体的泵流。几秒钟后，气泡将上升到该园柱体的上端。并且能够进行对园柱体下端存在的微生物进行测量而不受气体原始含量的影响。在进行测量时，再一次启动泵流，新的发酵介质被带入测量池中，泵和测定结果的记录由一个计算机27控制，于是实现了自动化。
即使希望在恒定细胞密度下进行发酵，随着细胞的生长可以把新的介质17同时抽到循环器和发酵器中，由此可以保持细胞密度恒定。通过记录加到发酵器中的新介质17的速率，可以确定发酵的速度，因而测定了具体生长速率。
以细胞密度相应的方式，代谢活动可以控制通过阀16的稀释速度，以便使培养物的活性保持恒定。
以氨25形式的氮源通过阀26输入到介质中，由于氨对甲烷的氧化具有限制性的影响，所以必须控制氨的供给，以实现最佳在长。水溶性介质中的氨（NH3）与铵离子（NH+ 4）平衡。PH为6.8时，甲烷营养型细菌生长良好，大多数氨以铵的形式存在，可以用一个离子选择性电极19来测量铵离子。
电极可以置于发酵器1本身中或者如图所示，放在外部从发酵器出来的循环中。铵离子选择电极不能耐蒸压，因此，没有发现直接应用于无菌发酵。根据铵浓度的测量值，计算机27可以控制氨25的加入量。这种加入量是铵消耗量的一个表示，从而也是培养物的代谢活动的一个量度。
离子选择电极19用于连续测定发酵器中的铵，而且氮传感器28〔以已知的FIA（流动注射分析）原理建立的〕用于测定发酵器中的氮。根据铵的测定量，调节加入的介质和铵，以便使发酵器中铵的浓度保持恒定。铵的浓度不发生变化是很重要的，铵是细菌快速生长的先决条件，但同时它也阻止生长。后者是因为铵是甲烷氧化酶的竞争底物，此酶能把铵氧化成硝酸盐。硝酸盐的形成取决于介质中铵和甲烷的浓度。
不控制铵供给的方法显示出不稳定性。铵浓度一个十分小的增加会阻止甲烷与此细胞氧化，这导致铵消耗的降低，并且如果不马上降低或中止铵的供应，结果使铵的浓度、硝酸盐的形成增加，以及进一步限制生长等等。
如果不控制，一个稳态培养物中的内部不稳定性致使自破坏。只有通过连续的测量和控制铵的浓度才能防止这种自破坏。
铵浓度的测定被用于保持发酵器中生物体恒定，用于调节稀释速率以便使产量达到最佳。生物体中氮含量（以蛋白质形式结合的）是极恒定的，大约为11%或更少。进料流中以铵形式存在的氮含量和稳定态下发酵器中铵浓度之间的关系确定了发酵器中生物体的浓度。
改进的FIA（流动注射分析）方法被用于测定氮含量。穿过选择小分子并且不让细胞通过的渗透膜，从发酵器中取出样品，膜片在发酵器的一侧通过一股强流使其保持清洁，在渗透侧，硝酸盐由缓慢通过膜的渗透流吸收。然而该渗透流与专门与硝酸盐反应的着色剂混合。测量这种吸收度，将它作为介质中的硝酸盐含量的一个表示量。用测定的渗透流和已知标准之间的变化来校准信号。
硝酸盐的形成是该方法没有实现最佳方式的一个指示。这可以是因为铵的浓度太高，甲烷浓度太低，或者是在发酵器中设有充分搅拌的缘故。
为了整体地控制发酵过程，这些测量值可以与甲烷和氧吸收速率的测定和细胞测定结合起来。
可以通过置于发酵器1中的一个PH电极5并经阀22加入酸或碱21控制培养物的PH。
发酵器的温度由发酵器中的温度传感器7测量，通过阀8调节加入到发酵器1中的冷却水。
图2-4示出了用于加入甲烷和氧气装置的另一种实施方案，这些装置包括两个管道系统，它们围绕在发酵器1周围，并且包括用于甲烷11和空气13的管3、4和29。这些管子是与一些分配管37连接的，每个分配管引入到它的喷射器33中。
另外，有一个液体进料管2a和30，它将约4个大气压的流体引入与喷射器32相连通的分配管31中。气体在很大的湍流下被吸入到介质中，通过喷嘴口36流注到发酵器中，每个喷嘴口以可旋转的方式与可调节的装配件35连接，该调节装配件35牢固地连接在分配管34上。因而各个喷嘴36，如图4中所示，可被设置在给出最好的罐内混合度的方向上。
下面将描述使用本发明方法的三个实施例
例1
甲烷氧化培养物在搅拌下（1500转/分）于2升发酵器中生长，根据被溶解的甲烷和氧气的群体谱分析测定值来调节天然气和氧气的供给。用铵离子选择电极测定铵的浓度，并保持在约1mM的恒值。介质和铵以同一比率连续地被加入，以使细胞密度保持恒定。采用溶解氧气和甲烷的不同稳态浓度。实现了各种不同的生长速率和在排出气体中甲烷/氧气的不同损失。
图5表明，在实验中使用了1克/升NH3NO3和近似3克干料/升的稳态细胞密度时，稀释速率是如何随介质中甲烷的浓度变化的。在甲烷浓度为60uM和以上时，得到最佳稀释速率为每小时0.37。因此，为了达到最大稀释速率，仅仅需要几个uM的氧气。表1示出稀释速率和不同稀释速率下，排出空气中甲烷和氧气的损失。可以看出，为了尽可能降低损失，重要的是保持尽可能减低的溶解甲烷和氧气的浓度
表1
浓度    稀释速率    排出气体中的损耗
甲烷    氧气    甲烷    氧气
um um h-1% %
100    20    0.37    25    28
60    20    0.37    19    20
60    2    0.33    17    5
20    4    0.3    11    7.3
例2
在700升的发酵器中，用喷射嘴来混合天然气和空气，用群体谱分析仪来控制气体的供给，使用铵选择电极和硝酸盐传感器来控制介质进料。这种系统的生产率比相应的空气提升式发酵器高出3-4倍。当细胞密度为25克干料/升和稀释速率为每小时0.2时，培养物要求提供每小时略小于6m3天然气和42m3空气。由于甲烷和氧气的溶解度低。如果使用在此描述的一个特殊的喷射嘴或使用一个工作在几个大气压下的发酵器系统，就能够适应这种大量的气体需要，但后者会带来安全问题。
表2
700升发酵器，在以传统的空气提升式发酵器工作时和有喷射情况下的生产率。
细胞密度    稀释速率    产率
克/升 （t-1） 克/升/小时
4    0.33    1.3
8    0.12    0.96
16    0.02    0.32
有喷口：
4    0.35    1.4
8    0.33    2.6
16    0.27    4.32
26    0.21    4.9
30    0.18    5.4
例3
参照图2-4，用置于一个50，000升发酵器周围的一个外环中的8个喷射嘴来混合甲烷气和空气，通过该可以转动喷射嘴的一个外部调节装置能够调节对发酵器的喷射，喷口可以调节在50，000升容量罐中的最佳气体传递常数和进行搅拌，由于在罐中气体的有效混合和控制气体及介质的进料，所以得到约6克生物体/升/小时的高产率。

Claims (10)

1、在发酵罐中生产微生物细胞体的方法，其中培养的细菌是甲烷营养型，碳和能源是天然气、氧气源是空气、氮源是铵，培养可以在腐化条件下进行，所述的发酵过程由计算机调节，其特征在于：整个发酵器(1)各处溶解的甲烷(11)和氧气(13)的浓度保持恒定。
2、根据权利要?的方法，其特征在于：用群体谱分析仪测定浓度。
3、权利要求2方法中使用的测量设备，其特征在于：测量仪是由一个具有膜片进口的群体谱分析仪（6，15，15a）组成的。
4、根据权利要求1和2的方法，其特征在于：整个发酵器各处的铵浓度保持恒定。
5、权利要求4方法使用的测量设备，其特征在于：它包括一个离子选择测定电极（19）。
6、权利要求5的测量设备，其特征在于：它进一步包括带有渗透膜的硝酸盐测量仪（28）。
7、根据权利要求1、2或4的方法，其特征在于甲烷（11）和空气（13）在它们的混合物被送入发酵器（1）（图2-4）之前，在一个或多个喷射器（33）中混合。
8、权利要求7中使用的喷射器，其特征在于压力流体作为传动介质被送入喷射嘴（32）中。
9、根据权利要求8的喷射器，其特征在于：出料是通过具有可调节在发酵器（1）中外流方向的喷口（34、35、36、）实现的。
10、根据权利要求9的喷射器，其特征在于：喷口嘴部（36）相对于进口管（34）伸长，并可转动地安装（35）在该转轴进口管（34）上。
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