NO883935L - Fremgangsmaate for fremstilling av en mikroorganismecellemasse, samt maaleutstyr for anvendelse ved fremgangsmaaten. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av en mikroorganismecellemasse i en fermenteringstank, hvor de dyrkede bakterier er metanotrofe, hvor karbon- og energikilden er naturgass, hvor oksygenkilden er luft, hvor nitrogenkilden er ammoniakk og hvor dyrkningen kan foregå under septiske betingelser, hvilken fermenteringsprosess reguleres ved hjelp av en computer, samt midler for utøvelse av fremgangsmåten.

Fra beskrivelsen av blant andre engelsk patent nr.

1 270 006 er det kjent å fremstille biomasse i en fermenteringstank ved dyrkning av mikroorganismer i et flytende vekstmedium som inneholder assimilerbare nitrogenkilder og essensi-elle mineralsalter i nærvær av metangass, hvilke organismer utvinnes fra det flytende vekstmedium.

Disse hittil kjente fremgangsmåter har imidlertid ikke fungert tilfredsstillende, idet det er særdeles vanskelig under septiske betingelser å unngå vekst av uønskede giftige og/eller veksthemmende organismer, liksom det er vanskelig å oppnå en helt ren og ensartet biomasse.

Derfor har det hittil ikke lykkes å oppnå en lønnsom kon-tinuert biomasseproduksjon.

Det er oppfinnelsens formål å gjøre denne biomasseproduksjon lønnsom, og dette oppnås ved en fremgangsmåte hvor konsentrasjonen av oppløst metan og oksygen i fermentoren holdes konstant over hele fermentoren.

Herved oppnås en hittil ukjent grad av stabilitet og dermed ensartede optimale vekstbetingelser for bakteriekulturen. Denne optimering av prosessen gir mulighet for en stor celletetthet i væsken, nemlig helt opp til over 4,5%. Dette er en fordobling i forhold til det hittil kjente nivå, og betyr en besparelse i den etterfølgende tørkeprosess, hvor man derfor bare behøver fjerne halvdelen av vannet.

Dette muliggjør en ensartet høy produksjon, som i praksis har vist seg å være opp til ti ganger større enn det de hittil kjente fremgangsmåter har kunnet produsere.

Hertil kommer at det kun tilføres den mengde gass som er nødvendig for å opprettholde kulturens optimale aktivitet.

Dette medfører et betydelig lavere gassforbruk i forhold til de hittil kjente fremgangsmåter, som har et betydelig gasstap på grunn av den store mengde avgangsgass som ledes ut av fermentoren.

Dette er medvirkende til at prosessen blir lønnsom, idet gassprisen utgjør ca. 75% av produksjonsomkostningene.

Ved å anvende massespektrometri, som omtalt i krav 2, kan kontrollen skje i drift ("on-line").

Ved å anvende et massespektrometer med membran-inntak, som omtalt i krav 3, kan målingene utføres hurtig og pålitelig.

Ved å holde ammoniumkonsentrasjonen konstant over hele fermentoren, som omtalt i krav 4, sikres hurtig vekst av bakteriene.

Ved å anvende en ioneselektiv elektrode, som omtalt i krav 5, kan målingen skje kontinuerlig.

Ved ytterligere å anvende en nitritt-måler, som omtalt i krav 6, kan man kontrollere at nitrittdannelsen i fermentoren ikke blir for stor og veksten dermed hemmet.

Ved å blande metan og luft i ejektorer, som omtalt i krav 7, kan man oppnå særdeles høye gassoverføringskonstanter på grunn av den betydelige oksygenabsorpsjon som oppnås i ejektoren.

Ved å anvende væske under trykk som pumpemedium, som omtalt i krav 8, sikres det en høy dispergering uten bruk av mekaniske omrøringsinnretninger.

Ved å anvende innstillbare dyser, som omtalt i krav 9, kan disse gis en hver ønsket strømningsretning inne i fermentoren.

Endelig er det hensiktsmessig å innstille dysens retning ved å kunne dreie denne, som omtalt i krav 10.

Oppfinnelsen vil i det følgende bli nærmere beskrevet under henvisning til tegningen, hvor

Fig. 1 i skjematisk form viser et anlegg for utførelse av

fremgangsmåten,

Fig. 2 viser et utsnitt av fermentorens nedre del med

et rørsystem og en ejektor sett i retning II-II på fig. 4, Fig. 3 viser et snitt av fermentoren sett i retningen III-III på fig. 2 og 4 og Fig. 4 viser et snitt av fermentoren sett i retningen

IV-IV på fig. 2 og 3.

Fig. 5 viser i diagramform hvordan fortynningshastigheten

varierer med metankonsentrasjonen.

På fig. 1 er det vist en utførelsesform for et anlegg hvor fermentoren er en såkalt "air-lift"-fermentor, omfattende en fermenteringstank 1.

Fermentoren kan utføres med lukket topp som en trykkbehol-der, hvorved løseligheten av næringsgassene kan økes. Løselig-heten av gassene er proporsjonal med deres partialtrykk.

Tilføringen av naturgass 11 og oksygen 13 skjer via regu-lerbare ventiler henholdsvis 10 og 12 til tankens underside gjennom fordelerrørene 3 og 4, mens en næringsoppløsning 23 tilføres til tankens topp via reguleringsventiler 24 og 20.

Naturgass og oksygen innføres hver for seg via to forde-lerrør 3 og 4 i bunnen av fermentoren. Hvert fordelerrør består av et rørarrangement som er fordelt jevnt over bunnarea-let. I rørene er det øverst 0,5 - 1 mm huller, gjennom hvilke gassen strømmer ut.

Fordelersystemet frembringer gassbobler med en diameter på under 1 cm ved 0,5 mm hulldiameter jevnt fordelt over fermentorens tverrsnittsareal.

Overføringen av den tilførte naturgass og oksygen til fermenteringsmediet skjer i tanken, når gassene blåses inn fra tankens bunn. Tanken kan være oppdelt i en første seksjon, hvor væsken beveger seg oppover som følge av et stort luftinnhold, og en andre seksjon, hvor væsken beveger seg nedad som følge av et mindre luftinnhold. For å sikre en homogen blan-ding av kulturen og en optimal utnyttelse av de innblåste gasser, skal fermentoren ha en betydelig høyde, siden gassene skal passere opp til femti meter væske før de er helt utnyttet.

For å redusere denne lange væskepassasje og dermed bringe omkostningene ned, kan fermentoren som vist på tegningen, forsynes med et omløp, som forbinder tankens nedre rør 3a med dens topp via 2a ved hjelp av en ytre omløpskanal med en sirku- lasjonspumpe 14a. På denne måte kan man tvangssirkulere gassene gjennom mediet i tanken, inntil det ønskede opptak har funnet sted.

Antallet resirkulasjoner og innblåsing av nye gasser 11 og 13 reguleres avhengig av restinnholdet av gasser i den resirkulerte luft.

For bestemmelse av metan- og oksygeninnholdet i sirkulasjonen er det innskutt et massespektrometer 15a.

Gassenes oppholdstid i fermentoren økes ved å sirkulere væsken i motsatt retning av gasstrømmen. Fra tankens nedre ende uttas en væskestrøm via rør 4a, som ved hjelp av en sirku-lasjonspumpe 14 ledes til fermentorens topp, hvor den sammen med tilført næringsvæske innføres via rør 2. •Væskesirkulasjon er også med på å gi god oppblanding i fermentoren. Den sirkulerende væske kan sammen med de tilførte næringsvæsker innføres i fermentorens topp via en dusj eller en rist, hvorved det oppnås en skumdempende virkning.

Alternativt kan den sirkulerende væske innføres sammen med den resirkulerte gass under trykk via en nedadrettet dyse som er plassert i fermenteringsmediet. Det kan oppnås en særlig god overførsel av gassene til væsken.

Et massespektrometer 6 er forbundet med tanken 1 for bestemmelse av metan- og oksygeninnholdet i mediet inne i fermentoren l. Ved anvendelse av et massespektrometer 6 i fermentoren og et massespektrometer 15 for måling i den sirkulerte væske og med kjennskap til transporttiden i sirkulasjonen, kan den metabolske aktivitet beregnes ut fra forskjellen i de regist-rerte verdier i og utenfor fermentoren.

Det anvendes et massespektrometer med membran-inntak for kontinuerlig måling av oppløst metan og oksygen i fermentoren. Gasstilførselen reguleres ut fra de massespektrometriske målinger, slik at konsentrasjonen av oppløst metan og oksygen i mediet er konstant.

I sirkulasjonen er det dessuten innskutt et spektrofotometer 18 for bestemmelse av celletettheten i mediet. Dette skjer ved hjelp av en tilledet kjent lysmengde, som sendes inn gjennom mediet og spredes av bakteriene, hvoretter mengden av lys gjennom mediet bestemmes som et mål for celletettheten. Denne metode påvirkes av luftbobler, som virker lysspredende liksom bakterier. Problemet kan imidlertid løses ved at en del av fermenteringsmediet pumpes gjennom et spektrofotometer med et sylindrisk glassrør som sitter loddrett som kyvette. Pumpe-strømmen gjennom den loddrette sylinder stoppes ved passende tidsintervaller. Etter få sekunder vil luftboblene ha steget opp i den øvre ende av sylinderen, og en måling av de mikroorganismer som er tilstede, kan foregå i den nedre ende av sylinderen uten påvirkning av opprinnelig gassinnhold. Når målingen er foretatt, startes pumpestrømmen igjen, hvorved nytt fermenteringsmedium bringes til målecellen. Pumpen og regist-rering av måleresultatet styres av en computer 27 og er således automatisert.

Dersom fermenteringen ønskes utført ved konstant celletetthet, kan det pumpes nytt medium 17 inn i sirkulasjonen og i fermentoren i takt med at cellene vokser, hvorved celletettheten kan holdes konstant. Ved å registrere hastigheten ved hvilken nytt medium 17 tilsettes til fermenteringen, kan fermenterings-hastigheten og dermed den spesifikke veksthastighet fastslås.

Den metabolske aktivitet kan på tilsvarende måte som celletettheten styre fortynningshastigheten via ventilen 16, slik at kulturens aktivitet kan holdes helt konstant.

Nitrogenkilden i form av ammoniakk 25 tilføres via en ventil 2 6 til mediet. En styrt tilføring av ammoniakk er nødven-dig for oppnåelse av optimal vekst, siden ammoniakk virker hem-mende på metanoksydasjonen. Ammoniakk (NH3) vil i et vandig medium være i likevekt med ammoniumionet (NH4<+>). Ved pH 6,8, hvor metanotrofe bakterier trives godt, vil det meste av ammo-niakken være i ammoniumform. Ammonium-ioner kan måles med en ioneselektiv elektrode 19.

Elektroden kan plasseres i selve fermentoren 1 eller, som vist, eksternt i forbindelse med den sirkulerende strøm fra fermentoren. Ammonium-selektive elektroder kan ikke tåle auto-klavering, og kan derfor ikke umiddelbart anvendes i aseptiske fermenteringer. En computer 27 kan ut fra målingen av ammoniumkonsentrasjonen styre tilsetningen av ammoniakk 25. Denne tilsetning er et uttrykk for ammoniumforbruket og altså også et mål for kulturens metabolske aktivitet.

Det anvendes en ioneselektiv elektrode 19 for kontinuerlig måling av ammonium i fermentoren. Dessuten anvendes det en nitrittsensor 28 bygget etter det velkjente FIA-(Flow Injection Analysis)-prinsipp for måling av nitritt i fermentoren. Til-førselen av medium og ammonium reguleres ut fra ammonium-målinger, slik at konsentrasjonen av ammonium i fermentoren holdes konstant. Det er meget viktig at ammoniumkonsentrasjonen ikke varierer. Ammonium er en forutsetning for bakterienes hurtige vekst, men er samtidig en hemmer av veksten. Det siste skyldes at ammonium er et kompetitivt substrat for det metanoksyderende enzym, som kan oksydere ammonium til nitritt. Dannelse av nitritt avhenger av ammonium- og metankonsentrasjonen i mediet.

En prosess uten kontroll av ammoniumtilførselen viser ustabilitet. En ganske liten stigning i ammoniumkonsentrasjonen hemmer metanoksydasjonen og derved cellene. Det fører til et redusert ammoniumforbruk, og hvis tilførselen av ammonium ikke straks reduseres eller stoppes, blir resultatet en økning i ammoniumkonsentrasjon, dannelse av nitritt og ytterligere hemning av veksten o.s.v.

Ukontrollert fører den innbygde ustabilitet i en like-vektskultur til selvødeleggelse. Kun ved en kontinuerlig måling og kontroll av ammoniumkonsentrasjonen kan denne selv-ødeleggelse hindres.

Målingen av ammoniumkonsentrasjonen anvendes for å holde en konstant biomasse i fermentoren og for å regulere fortynningshastigheten, slik at produktiviteten blir optimal. Bio-massens innhold av nitrogen bundet i form av proteiner er ganske konstant omkring 11% eller mindre, og forholdet mellom tilførselsstrømmens nitrogeninnhold i form av ammonium og ammoniumkonsentrasjonen under likevekt i fermentoren, bestemmer biomassekonsentrasjonen i fermentoren.

Det anvendes et modifisert FIA-(Flow Injection Analysis)-system til nitrittmålinger. Prøven tas ut fra fermentoren over en dialysemembran som er selektiv overfor mindre molekyler og ikke tillater celler å passere. Membranen holdes ren på fer-mentorsiden ved en kraftig strømning. På analysesiden tas nitritten opp i en dialysestrøm som langsomt ledes over membranen. Strømmen blandes deretter med et fargereagens som reage- rer spesifikt med nitritt, og absorpsjon måles, som uttrykk for mengden av nitritt i mediet. For kalibrering av signalet, veksles det mellom måling av dialysestrøm og av en kjent standard.

Dannelsen av nitritt er et uttrykk for at prosessen ikke forløper optimalt. Det kan skyldes at ammoniumkonsentrasjonen er blitt for høy, at metankonsentrasjonen er for lav eller at det ikke er tilstrekkelig god omrøring i fermentoren.

Målingene kan kombineres med metan- og oksygenopptakshas-tighetsmålingene og cellemassemålingene til en integrert styring av, fermenteringsprosessen.

Kulturens pH kan kontrolleres ut fra en pH-elektrode 5 som er plassert i fermentoren 1 og tilførsel av syre eller base 21 via en ventil 22.

Temperaturen i fermentoren bestemmes med en temperatursensor 7 i fermentoren 1 og regulerer tilførselen av kjølevann 9 til fermentoren 1 via en ventil 8.

På fig. 2-4 er det vist en annen utførelsesform av midler for tilføring av metan og oksygen. Disse midler omfatter to rørsystemer, som går rundt fermentoren 1, og som omfatter rør 3, 4 og 29 for metan 11 og luft 13, og hermed forbundne forde-lerrør 37, som munner ut i hver sin ejektor 33.

Videre er det en væsketilførselsledning 2a og 30, som leder væske under trykk på omkring 4 atm. til fordelingsrør 31, som munner ut i ejektordysen 32. Gassene suges herved inn i mediet under stor turbulens.

Utmunning i fermentoren skjer via dysemunninger 36, som er dreibart koplet til hver sitt justerbare samleorgan 35, som er fast forbundet med forbindelsesrør 34. Herved kan hver enkelt dyse 36, som vist på fig. 4, innstilles i den retning som gir den beste oppblanding av gassen i tanken.

I det følgende skal det omtales tre eksempler på anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

Den metan-oksyderende kultur dyrkes i en 2 liters fermentor under omrøring (1500 rpm). Tilførselen av naturgass og oksygen reguleres ut fra massespektrometriske målinger av oppløst metan og oksygen. Ammoniumkonsentrasjonen måles ved en ammoniumselektiv elektrode og holdes konstant på omkring 1 mM. Medium og ammonium tilføres hele tiden i samme forhold, slik at celletettheten holdes konstant. Ved at det brukes forskjellige likevektskonsentrasjoner av oppløst oksygen og metan, oppnås varierende veksthastighet og tap av metan/oksygen i avgangsgas-sen.

Fig. 5 viser hvordan fortynningshastigheten varierer mediets metankonsentrasjon i et forsøk hvor det er anvendt 1 g/l NH3NO3og en likevekst-celletetthet på ca. 3 g tørrstoff pr. liter. Den optimale fortynningshastighet på 0,37 pr. time oppnås ved metankonsentrasjoner på 60 jjM og over dette. Tilsvarende kreves det kun noen få jjM oksygen i mediet for å oppnå maksimal fortynningshastighet. Tabell 1 viser fortynningshastigheten og tapet til avgangsluften av metan og oksygen ved forskjellige fortynningshastigheter. Det vil sees at for å redusere tapet mest mulig, er det viktig å holde så lave kon-sentrasjoner som mulig av oppløst metan og oksygen.

Eksempel 2

Det anvendes en injektordyse for oppblanding av naturgass og luft i en 700 liters fermentor, massespektrometer til kontroll av gasstilførselen og ammoniumselektiv elektrode og nitrittsensor for kontroll av medietilførselen. Dette system har gitt en produktivitet som er 3-4 ganger høyere enn det som er oppnådd i en tilsvarende "air-lift"-fermentor. Med en celletetthet på 25 g tørrstoff pr. liter og en fortynningshastighet på 0,2 pr. time krever kulturen tilførsel av knapt 6 m<3>natur gass og42m<3>luft pr. time. På grunn av den dårlige løselighet av metan og oksygen, kan dette store gassbehov kun imøtekommes hvis det anvendes enten en spesiell injektordyse som beskrevet her, eller et stystem hvor fermentoren opererer under flere atmosfærers trykk. Det siste gir sikkerhetsmessige problemer.

Eksempel 3

Det anvendes 8 dyser plassert i en ytterring omkring en

50 000 liters fermentor for oppblanding av metangass og luft, kfr. fig. 2-4. Innblåsingen i fermentoren kan reguleres ved en munning av dysene som kan dreies utenfra. Derved kan dysene justeres til å gi den optimale gassoverføringskonstant og omrø-ring i den 50 000 liter store tank. På grunn av den effektive oppblanding av gasser i tanken og den anvendte styring av gass-og medietilførselen, kan det oppnås en høy produktivitet, omkring 6 g biomasse/l/time.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en mikroorganismecellemasse i en fermenteringstank, hvor de dyrkede bakterier er metanotrofe, hvor karbon- og energikilden er naturgass, hvor oksygenkilden er luft, hvor nitrogenkilden er ammoniakk og hvor dyrkningen kan foregå under septiske betingelser, hvilken fermenteringsprosess reguleres ved hjelp av en computer, karakterisert ved at konsentrasjonen av opp-løst metan (11) og oksygen (13) overalt i fermentoren (1) holdes konstant.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen måles ved massespektrometri.

3. Måleutstyr for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 2, karakterisert ved at det består av et massespektrometer (6, 15, 15a) med membran-inntak.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at ammoniumkonsentrasjonen overalt i fermentoren (1) holdes konstant.

5. Måleutstyr for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 4, karakterisert ved at det omfatter en ioneselektiv måleelektrode (19).

6. Måleutstyr ifølge krav 5, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en nitrittmåler (28) med dialysemembran.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 og 4, karakterisert ved at metan (11) og luft (13) blandes i én eller flere ejektorer (33) før blandingen tilføres til fermentoren (1) (fig. 2-4).

8. Ejektor for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 7, karakterisert ved at væske under trykk tilfø-res til ejektordysen (32) som drivmedium.

9. Ejektor iføolge krav 8, karakterisert ved at avgangen skjer gjennom en dyse (34, 35, 36), hvis utløpsret-ning i fermentoren (1) kan innstilles.

10. Ejektor ifølge krav 9, karakterisert ved at dysens munningsdel (36) er forskjøvet i forhold til tilgangs-røret (34) og dreibart montert (35) på dette.