DK157884B - Fremgangsmaade til fremstilling af mikroorganismecellemasse - Google Patents

Description

DK 157884 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling 5 af en mikroorganismecellemasse i en fermenterings tank, hvor de dyrkede bakterier er methanotrofe, hvor carbonstof- og energikilden er naturgas, hvor oxygenkilden er luft, hvor nitrogenkilden er ammoniak, og hvor dyrkningen kan foregå under septiske betingelse, 10 hvilken fermenteringsproces reguleres ved hjælp af en computer.

Fra DE fremlæggelsesskrift nr. 2.538.839 og DK patentansøgningerne nr. 1699/73 og nr. 4194/72 er det 15 kendt at fremstille en biomasse ved kontinuerlig dyrkning af mikroorganismer. Dyrkningen sker i en såkaldt air-lift fermentor, og resultatet af disse kendte fremgangsmåder til dyrkning er maksimalt en celleproduktionshastighed på 2,5 g biomassetørvægt pr 20 liter/time.

Derfor er det ikke hidtil lykkedes at opnå en rentabel kontinuert biomasseproduktion.

25 Det er opfindelsens formål at gøre denne biomassepro duktion rentabel, og dette opnås ved en fremgangsmåde af den ovennævnte art, hvilken fremgangsmåde ifølge opfindelsen er særegen ved, at koncentrationen af opløst methan og oxygen overalt i fermentoren holdes 30 konstant, at methan og luft blandes i en eller flere ejektorer, før blandingen tilledes fermentoren, og at afgangen sker gennem en dyse, hvis udløbsretning i fermentoren kan indstilles.

35 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås en cel leproduktionshastighed, som er op til tre gange højere, end hvad de kendte fremgangsmåder har kunnet pro-

DK 157884B

2 ducere.

Dette skyldes især, at methan og luft ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan tilledes separat og 5 blandes effektivt i ejektoren, hvorved man opnår særdeles høje gasoverførselskonstanter på grund af den større oxygenabsorption, som opnås i ejektoren, ligesom tilledningen via indstillelige dyser giver mulighed for optimal opblanding i fermentoren.

10

Hertil kommer, at der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen alene tilføres den mængde gas, som er nødvendig for at opretholde kulturens optimale aktivitet. Dette medfører et betydeligt lavere gasforbrug i 15 forhold til de kendte fremgangsmåder, som har et betydeligt gastab på grund af den store mængde afgangs- . gas, som udledes fra fermentoren.

Dette er medvirkende til, at processen bliver renta-20 bel, da gasprisen udgør omkring 75% af produktionsomkostningerne .

Ved, som omhandlet i krav 2, at anvende massespektro-metri til måling af koncentrationen af opløst methan 25 og oxygen, kan kontrollen ske on-line.

Ved, som omhandlet i krav 3, at anvende et masse-spektrometer med membran-inlet, kan målingerne udføres hurtigt og pålideligt.

30

Ved, som omhandlet i krav 4, at holde ammoniumkoncentrationen konstant overalt i fermentoren, sikres hurtig vækst af bakterierne.

35 . Ved, som omhandlet i krav 5, at anvende en ion-selek tiv elektrode, kan målingen af ammoniakkoncentrationen ske kontinuerligt.

DK 157884 B

3

Ved, som omhandlet i krav 6, at anvende en nitritmåler med dialysemembran, kan man kontrollere, at nitritdannelsen i fermentoren ikke bliver for stor og 5 væksten dermed hæmmet.

Ved, som omhandlet i krav 7, at anvende væske under tryk som pumpemedium i ejektordysen eller -dyserne, sikres en høj dispergering uden brug af mekaniske om-10 røreindretninger.

Endelig er det hensigtsmæssigt, som omhandlet i krav 8, at indstille dysens eller dysernes retning ved at kunne dreje denne henholdsvis disse.

15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i det følgende blive nærmere beskrevet under henvisning til tegningen, hvor: .20 Fig. 1 i skematisk form viser et kendt fermente ringsanlæg, fig. 2 viser et udsnit af den nedre del af en fermentor til brug ved udøvelse af frem-25 gangsmåden ifølge opfindelsen med et rørsystem og en ejektor set i retning II-II på fig. 4, fig. 3 viser et snitbillede af den i fig. 2 af-30 bildede nedre del af fermentoren set i retningen III-III på fig. 2 og 4 og fig. 4 viser et snitbillede af den i fig. 2 afbildede nedre del af fermentoren set i 35 retningen IV-IV på fig. 2 og 3.

På fig. 1 er vist en udførelsesform for et anlæg,

DK 157884B

4 hvor fermentoren er en såkaldt "air-lift" fermentor, omfattende en fermenteringstank 1, hvilket anlæg er til brug ved udøvelse af den indledningsvist anførte kendte teknik.

5

Fermentoren kan udføres med lukket top som en trykbeholder, hvorved opløseligheden af næringsgasserne kan øges. Opløseligheden af gasserne er proportional med deres partialtryk.

10

Tilledningen af naturgas 11 og oxygen 13 sker via regulerbare ventiler 10 henholdsvis 12 til tankens underside gennem fordelerrør 3 og 4, medens en næringsopløsning 23 ledes til tankens top via regule-15 ringsventiler 24 og 20.

De to fordelerrør 3 og 4 omfatter hvert et rørarrangement, der er fordelt jævnt over bundarealet. I rørene er der øverst 0,5 mm - 1 mm huller, hvorigennem 20 gassen strømmer ud.

Fordelersysternet frembringer gasbobler med en diameter på under 1 cm ved 0,5 mm huldiameter jævnt fordelt over fermentorens tværsnitsareal.

25

Overførslen af den tilledte naturgas og oxygen til fermenteringsmediet 23 sker i tanken, når gasserne indblæses fra tankens bund. Tanken kan være opdelt i en første sektion, hvori væsken bevæger sig opad som 30 følge af et stort luftindhold, og en anden sektion, hvor væsken bevæger sig nedad som følge af et mindre luftindhold. For at sikre en homogen blanding af kulturen og en optimal udnyttelse af de indblæste gasser, skal gasserne passere op til halvtreds meter 35 · væske, før de er helt udnyttet, hvilket kan opnås ved at udføre fermentoren 1 med en betydelig højde.

DK 157884 B

5

For at reducere denne lange væskepassage og de.rmed nedbringe omkostningerne ved en mindre byggehøjde for fermentoren er denne på i og for sig kendt måde som vist på fig. 1 forsynet med et omløb, der forbinder 5 tankens nedre rør 3a med dens top ved hjælp af en yd re omløbskanal 2a med en heri anbragt cirkulationspumpe 14a. På denne måde kan man tvangscirkulere gasserne gennem mediet i tanken, indtil den ønskede optagelse har fundet sted.

10

Denne optagelse kan ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremmes ved den på fig. 2-4 viste udførelsesform for midler til tilførsel af methan og oxygen.

Disse midler omfatter to rørsystemer, der forløber 15 rundt omkring fermentoren 1, og som omfatter rør 3, 4 og 29 for methan 11 og luft 13, og hertil forbundne fordelerrør 37, som udmunder i hver sin ejektor 33.

Endvidere er der en væsketilgangsledning 2a og 30, 20 som leder væske under tryk på omkring 4 atm til fordelingsrør 31, som udmunder i ejektordyserne 32. Gasserne suges herved ind i mediet under stor turbulens.

Udmunding i fermentoren sker via dysemundinger 36, 25 som er drejeligt lejret til et justerbart samleorgan 35, som er fast forbundet med forbindelsesrør 34.

Herved kan hver enkelt dyse 36, som vist på fig. 4, indstilles i den retning, som giver den bedste opblanding af gassen i tanken.

30

Antallet af recirkulationer og indblæsning af nye gasser 11 og 13 reguleres i afhængighed af restindholdet af gasser i den recirkulerede luft.

35 Til bestemmelse af methan- og oxygenindholdet i omløbet er der indskudt et massespektrometer 15a.

DK 157884B

6

Gassernes opholdstid i fermentoren øges ved at cirkulere væsken modsat gasflowet. Fra tankens nedre ende udtages via rør 4a en væskestrøm, der ved hjælp af en cirkulationspumpe 14 føres til fermentorens top, hvor 5 den sammen med tilført næringsvæske indføres via rør 2. Væskecirkulation er også med til at give en god ' opblanding i fermentoren. Den cirkulerede væske kan sammen med de tilførte næringsvæsker indføres i fermentorens top via en bruser eller rist, hvorved der 10 opnås en skumdæmpende virkning.

Alternativt kan den cirkulerende væske indføres sammen med den recirkulerede gas under tryk via en ned-adrettet dyse placeret i fermenteringsmediet. Der kan 15 opnås en særlig god overførsel af gasserne til væsken.

Et massespektrometer 6 er forbundet til tanken 1 til bestemmelse af methan- og oxygenindholdet i mediet 20 inde i fermentoren 1. Ved anvendelse af et massespektrometer 6 i fermentoren og et massespektrometer 15 til måling i den cirkulerede væske og med kendskab til transporttiden i omløbet, kan den metaboliske aktivitet beregnes ud fra forskellen i de registrerede 25 værdier i og uden for fermentoren.

Der anvendes et massespektrometer med membran-inlet til kontinuert måling af opløst methan og oxygen i fermentoren. Gastilførslen reguleres ud fra de mas-30 sespektrometriske målinger, så koncentrationen af opløst methan og oxygen i mediet er konstant.

Til omløbet er desuden indskudt et spektrofotometer 18 til bestemmelse af celletætheden i mediet. Dette 35 sker ved hjælp af en tilledt kendt lysmængde, der sendes ind gennem mediet, og af bakterierne spredes, hvorefter mængden af lys gennem mediet bestemmes som

DK 157884 B

7 et mål for celletætheden. Denne metode påvirkes af luftbobler, der ligesom bakterier virker lysspredende. Problemet kan imidlertid løses ved, at en del af fermenteringsmediet pumpes gennem et spektrofotometer 5 med et cylindrisk glasrør, der sidder lodret som ku-vette. Pumpestrømmen gennem den lodrette cylinder stoppes med passende tidsintervaller. Efter få sekunder vil luftboblerne være steget op i den øvre ende af cylinderen og en måling af de tilstedeværende mi-10 kroorganismer kan foregå i den nedre ende af cylinderen uden påvirkning af oprindeligt gasindhold. Når målingen er foretaget, startes pumpestrømmen igen, hvorved nyt fermenteringsmedium bringes til målecellen. Pumpen og registrering af måleresultatet styres 15 af en computer 27 og er således automatiseret.

I tilfælde af, at fermenteringen ønskes udført ved konstant celletæthed, kan der pumpes nyt medium 17 ind i omløbet og i fermentoren i takt med, at celler-20 ne vokser, hvorved celletætheden kan holdes konstant.

Ved at registrere hastigheden hvormed nyt medium 17 tilsættes fermenteringen, kan fermenteringshastigheden og dermed den specifikke væksthastighed fastslås.

25 Den metaboliske aktivitet kan på tilsvarende måde som celletætheden styre fortyndingshastigheden via ventilen 16, så kulturens aktivitet kan holdes helt konstant.

30 Kvælstofkilden i form af ammoniak 25 tilledes via en ventil 26 til mediet. En styret tilledning af ammoniak er nødvendig for opnåelse af optimal vækst, da ammoniak virker hæmmende på methanoxidationen. Ammoniak (NH3) vil i et vandigt medium være i ligevægt med am-35 moniumionen (NH4+). Ved pH 6,8, hvor methanotrofe bakterier trives godt, vil det meste ammoniak være på ammoniumform. Ammoniumioner kan måles med en ion-se-

DK 157884B

8 lektiv elektrode 19.

Elektroden kan placeres i selve fermentoren 1 eller, som vist, eksternt i forbindelse med den cirkulerende 5 strøm fra fermentoren. Ammonium-selektive elektroder kan ikke tåle autoklavering, og kan derfor ikke umiddelbart anvendes i aseptiske fermenteringer. En computer 27 kan ud fra målingen af ammoniumkoncentrationen styre tilsætningen af ammoniak 25. Denne tilsæt-10 ning er et udtryk for ammoniumforbruget og altså også et mål for kulturens metaboliske aktivitet.

Der anvendes desuden en nitritsensor 28 bygget efter det velkendte FIA (Flow Injection Analysis) princip 15 til måling af nitrit i fermentoren. Tilførslen af medium og ammonium reguleres ud fra ammonium-målinger, så koncentrationen af ammonium i fermentoren holdes konstant. Det er meget vigtigt, at ammoniumkoncentrationen ikke varierer. Ammonium er en forudsætning for 20 bakteriernes hurtige vækst, men er samtidigt en hæmmer af væksten. Det sidste skyldes, at ammonium er et kompetitivt substrat for det methanoxiderende enzym, som kan oxidere ammonum til nitrit. Dannelsen af nitrit afhænger af ammonium- og methankoncentrationen i 25 mediet.

En proces uden kontrol af ammoniumtilførslen viser ustabilitet. En ganske lille stigning i ammoniumkoncentrationen hæmmer methanoxidationen og dermed cel-30 lerne. Det fører til et reduceret ammoniumforbrug, og hvis tilførslen af ammonium ikke straks reduceres eller stoppes, bliver resultatet en øgning i ammonium-koncentration, dannelse af nitrit og yderligere hæmning af væksten etc.

Ukontrolleret fører den indbyggede ustabilitet i en steady-state kultur til selvdestruktion. Kun ved en 35

DK 157884B

9 kontinuert måling og kontrol af ammoniumkoncentrationen kan denne selvdestruktion hindres.

Målingen af ammoniumkoncentrationen anvendes til at 5 holde en konstant biomasse i fermentoren og til at regulere fortyndingshastigheden, så produktiviteten bliver optimal. Biomassens indhold af kvælstof bundet i form af proteiner er ret konstant omkring 11% eller derunder, og forholdet mellem fødestrømmens kvælstof-10 indhold, i form af ammonium og ammonium-koncentrationen under steady-state i fermentoren, bestemmer biomassekoncentrationen i fermentoren.

Den omhandlede nitritsensor 28 er et modificeret FIA 15 (Flow Injection Analysis) system til nitritmålinger.

Prøven udtages fra fermentoren over en dialysemembran, der er selektiv for mindre molekyler og ikke tillader celler at passere. Membranen holdes ren på fermentorsiden ved et kraftigt flow. På analysesiden 20 optages nitritten i en dialysestrøm, der langsomt føres over membranen. Strømmen blandes derefter med et farvereagens, der specifikt reagerer med nitrit, og absorption måles, som udtryk for mængden af nitrit i mediet. For kalibrering af signalet veksles der mel-25 lem måling af dialysestrøm og af en kendt standard.

Dannelsen af nitrit er udtryk for, at processen ikke forløber optimalt. Det kan skyldes, at ammoniumkoncentrationen er blevet for høj, at methankoncentra-30 tionen er for lav, eller at der ikke er tilstrækkelig god omrøring i fermentoren.

Målingerne kan kombineres med methan- og oxygenoptagelseshastighedsmålingerne og cellemassemålingerne 35 til en integreret styring af fermenteringsprocessen.

Kulturens pH kan kontrolleres ud fra en pH-elektrode

DK 157884 B

10 5 placeret i fermentoren 1 og tilførsel af syre eller base 21 via en ventil 22.

Temperaturen i fermentoren bestemmes med en tempera-5 tursensor 7 i fermentoren 1 og regulerer tilførslen af kølevand 9 til fermentoren 1 via en ventil 8.

I det følgende skal omtales to eksempler på anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

10

Eksempel 1

Der anvendes en ejektordyse til opblanding af naturgas og luft, i en 700 liter fermentor, massespek-15 trometer til kontrol af gastilførslen og ammonium-selektiv elektrode og nitritsensor til kontrol af medietilførslen. Dette system har givet en produktivitet, der er 3-4 gange højere end opnået i en tilsvarende air-lift fermentor. Med en celletæthed på 25 g 20 tørstof/1 og en fortyndingshastighed på 0,2 pr. time kræver kulturen tilførsel af knap 6 m3 naturgas og 42 m3 luft pr. time. På grund af den ringe opløseligehed af methan og oxygen kan dette store gasbehov kun imødekommes, hvis der anvendes enten en speciel ejek-25 tordyse som beskrevet her eller et system, hvor fermentoren opererer under flere atmosfæres tryk. Det sidste giver sikkerhedsmæssige problemer.

30 Tabel 1

Produktivitet i 700 1 fermentor opereret som traditionel air-lift fermentor og med ejektordyse.

35 Celletæthed Fortyndings- Produktivitet g/1 hastighed (t_1) g/l/time

DK 157884 B

11 4 0,33 1,3 8 0,12 0,96 16 0,02 0,32 5 Med dyse: 4 0,35 1,4 8 0,33 2,6 16 0,27 4,32 10 26 0,21 5,46 30 0,18 5,4

Eksempel 2 15 Der anvendes med 8 dyser placeret i en yderring omkring en 50.000 liter fermentor til opblanding af methan-gas og luft, jfr. fig. 2-4. Indblæsningen i fermentoren kan reguleres ved en udefra drejelig munding af dyserne. Derved kan dyserne justeres til at 20 give den optimale gasoverførselskonstant og omrøring i den 50.000 1 store tank. På grund af den effektive opblanding af gasser i tanken og den anvendte styring af gas- og medietilførslen, kan der opnås en høj produktivitet, omkring 6 g biomasse/l/time.

25

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorga-5 nismecellemasse i en fermenteringstank, hvor de dyrkede bakterier er methanotrofe, hvor carbonstof- og energikilden er naturgas, hvor oxygenkilden er luft, hvor nitrogenkilden er ammoniak, og hvor dyrkningen kan foregå under septiske betingelser, hvilken fer- 10 menteringsproces reguleres ved hjælp af en computer, kendetegnet ved, at koncentrationen af opløst methan (11) og oxygen (13) overalt i fermentoren (1) holdes konstant, at methan (11) og luft (13) blandes i en eller flere ejektorer (33), før blandin-15 gen tilledes fermentoren (1), og at afgangen sker gennem en dyse (34, 35, 36), hvis udløbsretning i fermentoren (1) kan indstilles.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- 20 net v e d, at koncentrationen af opløst methan (11) og oxygen (13) måles ved massespektrometri.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at koncentrationen måles af et masse- 25 spektrometer (6, 15, 15a) med membran-inlet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kende tegnet ved, at ammoniumkoncentrationen o-veralt i fermentoren (1) holdes konstant. 30

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg- n e t ved, at koncentrationen af ammoniak måles af en ion-selektiv måleelektrode (19).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net v e d, at nitritdannelsen i fermentoren (1) kontrolleres af en nitritmåler (28) med dialysemem- DK 157884B 13 bran.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet v e d, at væske under tryk tilledes ejektordy- 5 sen eller -dyserne (32) som drivmedium.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dysens eller hver dyses (32) mundingsdel (36) forsættes i forhold til dens henholdsvis de- 10 res tilgangsrør (34) og monteres (35) drejeligt herpå.