JP2004532027A5

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Publication number: JP2004532027A5
Application number: JP2002582264A
Authority: JP
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2022-04-17

Claims

サンプル中のターゲット核酸分子の存在を決定するプライマー伸長連鎖反応法において、以下の工程を含む前記方法：
（ａ）リバースプライマーをターゲット核酸分子と、プライマー伸長連鎖反応を行うのに適した条件下でハイブリダイズする工程；
（ｂ）ターゲット核酸分子を鋳型として用いてリバースプライマーを伸長して、リバースプライマー伸長産物を形成する工程、ここでリバースプライマー伸長産物と結合したリバースプライマーはリバースプライマー増幅産物を構成する；
（ｃ）前記鋳型由来のリバースプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｄ）フォワードプライマーを以下のものとハイブリダイズする工程：
（ｉ）存在する場合には、ターゲット核酸分子と相補的な核酸分子；又は
（ii）リバースプライマー増幅産物；
（ｅ）存在する場合には、相補的ターゲット核酸分子又はリバースプライマー増幅産物を鋳型として用いてフォワードプライマーを伸長する工程、ここでフォワードプライマー伸長産物と結合したフォワードプライマーはフォワードプライマー増幅産物を構成する；
（ｆ）前記鋳型由来のフォワードプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｇ）リバースプライマーをフォワードプライマー増幅産物とハイブリダイズする工程；
（ｈ）フォワードプライマー増幅産物を鋳型として用いてリバースプライマーを伸長して、追加のリバースプライマー伸長産物を形成する工程、ここで追加のリバースプライマー伸長産物と結合したリバースプライマーは追加のリバースプライマー増幅産物を構成する；
（ｉ）前記鋳型由来の追加のリバースプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｊ）フォワードプライマーをリバースプライマー増幅産物とハイブリダイズする工程；
（ｋ）リバースプライマー増幅産物を鋳型として用いてフォワードプライマーを伸長して、追加のフォワードプライマー伸長産物を形成する工程、ここで追加のフォワードプライマー伸長産物と結合したフォワードプライマーは追加のフォワードプライマー増幅産物を構成する；
（ｌ）前記鋳型由来の追加のフォワードプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｍ）追加のリバースプライマー増幅産物と追加のフォワードプライマー増幅産物をそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマー用の鋳型として用いて、検出可能な量の追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物を産生するのに十分な回数、工程（ｇ）から（ｌ）を繰り返す工程；及び
（ｎ）追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物の存在を検出する工程；
ここで、リバースプライマーの3'末端のヌクレオチドは以下のものとハイブリダイズし：
（ｉ）フォワードプライマー伸長産物又は追加のフォワードプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチド；又は
（ii）フォワードプライマー伸長産物又は追加のフォワードプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチドとはヌクレオチドのギャップで離れたヌクレオチド、ここで前記ギャップは高く保存されていることが知られている配列を含み、かつ、前記ギャップは約１〜約５のヌクレオチドを含む；及び
フォワードプライマーの3'末端のヌクレオチドは以下のものとハイブリダイズする：
（ｉ）リバースプライマー伸長産物又は追加のリバースプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチド；又は
（ii）リバースプライマー伸長産物又は追加のリバースプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチドとはヌクレオチドのギャップで離れたヌクレオチド、ここで前記ギャップは高く保存されていることが知られている配列を含み、かつ、前記ギャップは約１〜約５のヌクレオチドを含む。
ターゲット核酸分子が変異体配列を有することが知られている、請求項１に記載の方法。
プライマー伸長連鎖反応がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である、請求項１に記載の方法。
ターゲット核酸分子がウイルスである、請求項１に記載の方法。
ウイルスがヒト免疫不全症ウイルス（HIV）である、又はウイルスがC型肝炎ウイルス（HCV）若しくはB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項４に記載の方法。
ギャップがウイルスのゲノムの高く保存された領域を含む、請求項４に記載の方法。
ギャップが約2個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
工程（ｄ）（ｉ）のターゲット核酸分子と相補的である核酸分子がターゲット核酸分子のcDNAとして単独に与えられる、請求項３に記載の方法。
追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物の存在を検出する工程が以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
（Ａ）自己変性シグナル発生プローブを用意する工程、ここで前記プローブは以下のものを含む：
（ｉ）検出可能なシグナルを発生することができるレポーター部分に付着した第1核酸配列；
（ii）（ａ）第1核酸配列に相補的であり、
（ｂ）第1核酸配列と第2核酸配列が互いにハイブリダイズする場合にレポーター部分のシグナルを変性することができる相互作用部分に付着した第2核酸配列；及び
（iii）第1核酸配列と第2核酸配列を繋ぐプローブ配列、ここで前記プローブ配列は以下のもののいずれかを含む：
（ａ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列；又は
（ｂ）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列；及び
（Ｂ）前記増幅産物を前記プローブと接触させる工程；
ここで、前記プローブのプローブ配列は追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物とハイブリダイズする場合、第1及び第2核酸配列は変性し、それによってレポーター部分によりシグナルを発生し、
レポーター部分によって発生したシグナルはターゲット分子の存在を示す。
プローブ配列が以下のいずれかのものを含む、請求項９に記載の方法：
（ａ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列、ただしリバースプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列は含まない；又は
（ｂ）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列、ただしフォワードプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列は含まない。
プローブ配列が以下のいずれかのものを含む、請求項９に記載の方法：
（ａ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列及びリバースプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列；又は
（ｂ）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列及びフォワードプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列。
前記プローブによって発生した検出可能なシグナルのレベルがサンプル中のターゲット核酸分子の量に比例する、請求項９に記載の方法。
約60〜約95％の前記プローブ配列が以下のいずれかのものを含む、請求項１１に記載の方法：
（ｉ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列；又は
（ii）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列。
前記プローブ配列がリバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列を含む場合に、リバースプライマーとフォワードプライマーのモル比が約1:5〜約1:20の範囲であるか、又は
前記プローブ配列がフォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列を含む場合に、フォワードプライマーとリバースプライマーのモル比が約1:5〜約1:20の範囲である、請求項９に記載の方法。
前記プローブ配列が約10〜約30個のヌクレオチド残基を含む、又は前記プローブ配列が約18〜約24個のヌクレオチド残基を含む、請求項９に記載の方法。
検出可能なシグナルが発光シグナルである、請求項９に記載の方法。
発光シグナルが蛍光シグナル又は化学発光シグナルである、請求項１６に記載の方法。
レポーター部分が自己変性シグナル発生プローブの5'末端又は3'末端で付着する、請求項９に記載の方法。
相互作用部分が自己変性シグナル発生プローブの5'末端又は3'末端で付着する、請求項９に記載の方法。
レポーター部分がフルオロフォアである、請求項９に記載の方法。
相互作用部分がクエンチャーである、請求項９に記載の方法。
クエンチャーがDABCYL、アントロキノン、ニトロチアゾール、ニトロイミダゾール又はマラカイトグリーンである、請求項２１に記載の方法。
相互作用部分がフルオロフォアである、請求項９に記載の方法。
増幅産物が終点分析により測定及び定量化される、又は実時間分析により測定及び定量化される、又は一連の閾値サイクル測定から導かれる標準曲線を用いて測定される、請求項１に記載の方法。
サンプル中のターゲット核酸分子の検出用キットであって、前記ターゲット核酸分子は変異体配列を有することが知られている、以下のものを含む前記キット：
（ｉ）請求項１に記載の方法に有用な一組のプライマー；
（ii）プライマー伸長連鎖反応を行うための試薬；及び
（iii）プライマー増幅産物の存在を検出する自己変性シグナル発生プローブ、ここで前記プローブは検出可能なシグナルを発生することができるレポーター部分に付着した第1核酸配列、レポーター部分のシグナルを変性することができる相互作用部分に付着した第2核酸配列、並びに第1及び第2核酸配列を繋ぐプローブ配列を含む。