JP2004529910A - 炎症過程及び非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させるためのプレバイオティクスを含む組成物 - Google Patents
炎症過程及び非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させるためのプレバイオティクスを含む組成物 Download PDFInfo
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、非特異的免疫防御パラメータ及びリンパ球亜集団の生体恒常性を改善することによって炎症過程を減少させるためのプレバイオティクス(プレバイオティクスアジュバント)を含む組成物に関する。本発明はまた、炎症過程及び/又は非特異的免疫パラメータ、たとえば食細胞の異常活性化を減少させる薬剤又は食品又はペット飼料組成物の製造におけるプレバイオティクス調合物の使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
プレバイオティクスは炭化水素、より具体的にはオリゴ糖類を含むことはよく知られている。さらに、これらは機能性食品成分として広く使用されてきたことが知られている。これらはヒト消化管酵素による加水分解に耐性で、分解されずに結腸に到達することができ、特にビフィズス菌の増殖に適した炭水化物物質を提供することができる。オリゴ糖類は、グルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム又はそれらの混合物から生成することが可能である。フルクトオリゴ糖類などの精製された市販品には約95%以上の固形物がオリゴ糖の形態で含まれている。
【0003】
フルクトオリゴ糖類は、無機質の生物学的利用率、脂質代謝及び排便習慣の調節に関する機能的要求のために主にヒトで試験されてきた(Roberfroid、M.B.Delzenne、N.M.Annu Rev Nutr 1998;18:117〜143)。それらの免疫学的機能に対する効果についてはほとんど関心が持たれていなかったが、発癌性を変化させ、消化管関連リンパ系組織を刺激するという示唆が動物での試験によって得られている(Pierre、F.他、Cancer Res 1997;57:225〜228)。
【0004】
実際には、フルクトオリゴ糖類、長鎖(イヌリン)及び短鎖(オリゴフルクトース)は上部胃腸管での消化を免れる炭水化物である。これらは次いで結腸で発酵し、ビフィズス菌の増殖を選択的に刺激する。
【0005】
重要な代謝活性を備えたヒト腸内フローラは、おそらく腸管恒常性の維持、生体異物の代謝及び腸管免疫の刺激などの多くの健康に関する機能に関連している。これは、疾患、食事、ストレス及びおそらく加齢によっても影響を受ける。大腸には、1012細菌/g糞便に達する細菌数が含まれ、属にして約40〜50個、種にして約103の異なる細菌が含まれる。そのほとんどが偏性嫌気性菌であるが、多数の通性嫌気性菌も存在する。主な偏性嫌気性菌はバクテロイド属、ビフィズス菌、真性細菌で、糞便フローラ全体の99%を占め、次にクロストリジウム属、乳酸桿菌及びグラム陽性球菌、腸球菌、腸内バクテリア、メタン細菌が多く、硫酸還元細菌も極めて低濃度で存在する(Hill、M.J.Normal gut bacterial flora.1995;3〜17)。
【0006】
成人の微小フローラの特徴は、約2才から見られる。成人の腸内微小フローラはかなり安定なようであるが、加齢によっていくらかの変化が報告されており、主にビフィズス菌及びバクテロイド属の濃度が低下する(Hopkins、M.J.他、Gut 2001;48:198〜205)。腸内フローラは、ビフィズス菌などの有益な影響を及ぼす種、又はシュードモナス エルジノーサ、プロテウス種、ブドウ球菌、いくつかのクロストリジウム属及びベイヨネラ属などの有害な影響を及ぼす種、及び腸球菌、大腸菌、エンテロコッカス及びバクテロイド属などの実際には中間的な種に分けることができる。ビフィズス菌及び乳酸桿菌は特定の免疫機能に有益な影響を及ぼすことが報告されている(Schiffrin、E.J.他、J.Dairy Sci 1995;78:491〜497)。
【0007】
加齢と共に、ビフィズス菌は消失し、一方クロストリジウム パーフリンジェンス、腸球菌及び腸内細菌科は増大することが一般的に報じられている(Mitsuoka、T.Hayakawa、K.Zentralbl Bakteriol(Orig A)1973;223:333〜342)。高齢者では萎縮性胃炎及び低塩酸症の罹患率が高いため、細菌の過剰増殖がより頻繁に生じる。健康な高齢者では細菌の過剰増殖による臨床症状はないようであるが、75才以上の虚弱な高齢者ではいくらか重要となる可能性があり、クロストリジウムディフィシレに関係する下痢は、抗生物質治療及び免疫応答を減少させる可能性のある急性期治療中又は長期治療中の高齢者ではより頻繁に見られる。加齢は免疫機能の消失に関係しており、栄養と免疫機能との間の関係の存在が認識されてきた(Meydani、S.N.栄養状態と免疫の試験(Status of Nutritional Immunology Studies):J Nutr Immunol 1994;2:93〜97)。
【0008】
免疫応答の変化(サイトカイン産生のリモデリング及び免疫機能の調節不能)は、感染の発症率及び感染に関連した死亡率の増加に関係する。栄養学的介入、主にビタミン及び無機質の補給によって虚弱な高齢者の免疫応答を改善することができる(Lesourd、B.M.Am J Clin Nutr 1997;66:478S〜484S 41)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、免疫機能の調節不能、より具体的には非特異的免疫応答、たとえば食細胞及び単核細胞マクロファージ細胞系の異常活性化を制限することができ、かつリンパ細胞亜集団の正常レベルの活性化を維持できる他の組成物を提供することが目的である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
したがって、本発明の第1の態様では、炎症過程及び/又は非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させる少なくとも1種類のプレバイオティクスを含む組成物を提供する。
【0011】
特に、たとえば食細胞の異常活性化を減少させることを目的とする。
【0012】
驚くべきことに、プレバイオティクス補給によって炎症過程の減少を誘導することができ、特に非特異的免疫の変化、たとえば食細胞作用の減少並びに末梢血単核細胞のインターロイキン−6 mRNAの発現の減少を誘導することができることがわかってきた。
【0013】
第2の態様では、本発明はほ乳類の炎症過程を減少させるための薬剤又は食品又はペット飼料組成物の製造における少なくとも1種のプレバイオティクスの使用を提供する。
【0014】
第3の態様では、本発明はほ乳類の非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させるための薬剤又は食品又はペット飼料組成物の製造における少なくとも1種のプレバイオティクスの使用を提供する。
【0015】
第4の態様では、本発明はほ乳類の炎症過程を減少させる方法であって、有効量のプレバイオティクス又は少なくとも1種のプレバイオティクスを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0016】
第5の態様では、本発明はほ乳類の非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させる方法であって、有効量の、プレバイオティクス又は少なくとも1種のプレバイオティクスを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【0017】
本発明の利点は、炎症過程の減少、特に末梢血単核細胞におけるインターロイキン−6 mRNAの発現減少をもたらすことである。
【0018】
本発明の他の利点は、特に慢性炎症状態の虚弱な患者において顆粒球及び単核細胞の食細胞作用の減少をもたらすことである。
【0019】
本発明のさらに他の利点は、ほ乳類の炎症状態を改善するために使用でき、したがって本発明による食品組成物を単純に消費することによって、有害な感染を悪化させる危険性を減少することができることである。薬剤の静脈内投与又は皮下投与には専門的技術が必要で、経口投与と比較して安全ではなく、便利でもなく、患者にも許容されないことは理解されるであろう。これらの観点から、本発明によって経口的に投与できる栄養素及び/又は治療製品の明らかな利点がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【0020】
第1の態様では、組成物は少なくとも1種のプレバイオティクス又はプレバイオティクス混合物を含むことが好ましい。
【0021】
好ましくは、プレバイオティクスはグルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム(たとえば、アカシアゴム)又はそれらの混合物から生成されたオリゴ糖を含む。より好ましくは、オリゴ糖はフルクトオリゴ糖(FOS)を含む。最も好ましくは、プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖とイヌリンの混合物を含む。好ましくは、この混合物はPREBIO1(登録商標)又は市販のRAFTILOSE(登録商標)とRAFTILINE(登録商標)の混合物を含む。
【0022】
好ましくは、このプレバイオティクスはFOSを約50%から約95%含む。より好ましくは、FOSを約60%から約80%含む。最も好ましくはFOSを約70%含む。
【0023】
好ましくは、このプレバイオティクスはイヌリンを約10%から約50%含む。より好ましくは、イヌリンを約20%から約40%含む。最も好ましくはイヌリンを約30%含む。
【0024】
このプレバイオティクスは、フルクトオリゴ糖とイヌリンの混合物を重量に基づいてフルクトオリゴ糖を70%及びイヌリンを30%含むことが可能である。
【0025】
好ましくは、この組成物はプレバイオティクスに加えてプロバイオティクスを含む。プロバイオティクスは、たとえばビフィドバクテリウムビフィダム又はストレプトコッカスサーモフィルスである。ビフィドバクテリウムビフィダムは、ビフィドバクテリウムラクティスであることが好ましい。
【0026】
一実施形態では、この組成物は完全で、栄養学的にバランスのとれた食品又はペット飼料であることが可能である。たとえば、栄養補助食品であることができる。好ましくは、高齢のヒト、高齢のペット、又は慢性炎症を有する重症な病気の患者を対象とする。
【0027】
したがって、栄養学的に完全なペット飼料を調製することができる。栄養学的に完全なペット飼料は、任意の適切な形態、たとえば乾燥形態、半湿潤形態又は湿潤形態であることが可能である。冷蔵又は長期保存ペット飼料製品であることが可能である。これらのペット飼料は、慣用の通りに製造することができる。プレバイオティクスは、プレバイオティクスを含有した植物材料の形態で形成することが好ましい。適切な植物材料には、アスパラガス、アーティチョーク、タマネギ、小麦、ヤーコン又はチコリ、又はこれらの植物材料の残渣が含まれる。あるいは、プレバイオティクスは、イヌリン抽出物として、又は通常、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖又は澱粉のオリゴ誘導体として知られるその加水分解物として提供することができる。チコリの抽出物が特に適している。ペット飼料中のプレバイオティクスの最高濃度は、好ましくは約20重量%、特に約10重量%である。たとえば、プレバイオティクスはペット飼料の約0.1重量%から約5重量%を構成することが可能である。プレバイオティクスとしてチコリを使用するペット飼料では、チコリは飼料混合物に約0.5重量%から約10重量%、より好ましくは約1重量%から約5重量%で含まれることが可能である。
【0028】
本発明のプレバイオティクス以外に、これらのペット飼料は1種又は複数の炭水化物源、蛋白質源及び脂質源を含むことが可能である。
【0029】
任意の適切な炭水化物源を使用することができる。炭水化物源は穀粒、穀粉及び澱粉の形態で提供されることが好ましい。たとえば、炭水化物源は米、オオムギ、モロコシ、アワ、オーツ麦、挽き割りトウモロコシ又は小麦粉であることが可能である。スクロース、グルコース及びコーンシロップなどの単純糖類もまた使用することができる。炭水化物源によってもたらされる炭水化物の量は、所望するように選択することができる。たとえば、ペット飼料には、約60重量%の炭水化物を含めることができる。
【0030】
適切な蛋白質源は、適切な動物蛋白質源又は植物蛋白質源、たとえば、筋肉又は骨格肉、肉及び骨粉、鳥肉粉、魚粉、ミルク蛋白質、トウモロコシグルテン、小麦グルテン、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離物、卵蛋白質、乳清、カゼイン、グルテンなどから選択することができる。高齢の動物には、蛋白質源として高品質の動物蛋白質を含めることが好ましい。蛋白質源によってもたらされる蛋白質の量は、所望するように選択することができる。たとえば、ペット飼料には乾燥重量をベースとして約12重量%から約70重量%の蛋白質を含めることができる。
【0031】
ペット飼料は脂肪源を含有することができる。適切な脂肪源には、動物脂肪及び植物脂肪の両者を使用することができる。脂肪源は、獣脂などの動物脂肪源であることが好ましい。植物油、たとえばトウモロコシ油、ヒマワリ油、ベニハナ油、ナタネ油、大豆油、オリーブ油及びモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸に富んだその他の油もまた使用することができる。必須脂肪酸(リノレン酸及びアルファ−リノレン酸)に加えて、脂肪源には長鎖脂肪酸を含めることができる。適切な長鎖脂肪酸には、ガンマリノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸が含まれる。魚油は、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の適切な原料である。ルリヂサ油、ブラックカレント油及びマツヨイグサ油は、ガンマリノレン酸の適切な原料である。ナタネ油、大豆油、アマニ油及びクルミ油は、アルファ−リノレン酸の適切な原料である。ベニハナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油及び大豆油は、リノレン酸の適切な原料である。オリーブ油、ナタネ油(キャノーラ)高オレイン酸ヒマワリ油、ベニハナ油、ピーナッツ油、米ぬか油はモノ不飽和脂肪酸の適切な原料である。脂肪原料によってもたらされる脂肪の量は、所望するように選択することができる。たとえば、ペット飼料は、乾燥重量をベースにして脂肪を約5重量%から約40重量%含むことができる。ペット飼料の脂肪の量は比較的少ない方が好ましい。
【0032】
ペット飼料は、長鎖脂肪酸など他の活性成分を含んでよい。適切な長鎖脂肪酸には、アルファ−リノレン酸、ガンマリノレン酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸が含まれる。魚油はエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の適切な原料である。ルリヂサ油、ブラックカレント油及びマツヨイグサ油は、ガンマリノレン酸の適切な原料である。ベニハナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油及び大豆油は、リノレン酸の適切な原料である。
【0033】
炭水化物源、蛋白質源及び脂質源の選択は重要ではなく、動物が必要とする栄養、嗜好性を考慮し、製造する製品の形態に基づいて選択する。さらに、様々な他の成分、たとえば、糖、塩、スパイス、調味料、ビタミン、無機質、矯臭剤、ガム、及びプロバイオティクス微生物もまた、所望するならばペット飼料に取り込ませることができる。
【0034】
プロバイオティクス微生物もまた添加することができる。動物消費に適し、腸内の微生物のバランスを改善することができる1種又は複数の微生物から選択することができる。適切なプロバイオティクス微生物には、酵母、たとえばサッカロマイセス、デバロマイセス、カンジダ、ピキア及びトルロプシス、カビ類、たとえばアスペルギルス、リゾープス、ムコール、及びペニシリウム及びトルロプシス及び細菌、たとえば、ビフィズス菌属、バクテロイド属、クロストリジウム属、フゾバクテリウム属、メリソコッカス属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、バシラス属、ペジオコッカス属、ミクロコッカス属、リューコノストック属、Weissella属、アエロコッカス属、エノコッカス属及びラクトバシラス属が含まれる。プロバイオティクス微生物は、粉末形態又は乾燥形態、特に胞子を形成する微生物では胞子形態であってよい。さらに、所望するならば、プロバイオティクス微生物は、生存の可能性を高めるために、たとえば、糖基質、脂肪基質又は多糖基質内にカプセル化することができる。プロバイオティクス微生物を使用する場合、ペット飼料はプロバイオティクス微生物を好ましくはペット飼料1グラム当たり約104細胞から約1010細胞、より好ましくは1グラム当たり約106から約108細胞含有する。ペット飼料は、プロバイオティクス微生物の混合物を約0.5重量%から約20重量%、好ましくは約1重量%から約6重量%、たとえば約3重量%から約6重量%含むことができる。
【0035】
高齢ペット用のペット飼料は、若年ペット用のペット飼料と比較して脂肪が少ない方が好ましい。さらに、澱粉源はオーツ麦、米、大麦、小麦及びトウモロコシの1種又は複数を含むことが可能である。
【0036】
乾燥ペット飼料に適した方法は、押し出し調理法であるが、焼くか、その他の適切な方法を使用することが可能である。押し出し調理の場合、乾燥ペット飼料は通常粗挽き粉の形態で形成する。プレバイオティクスを使用する場合、プレバイオティクスは加工する前に乾燥ペット飼料のその他の成分と混合することができる。適切な方法が欧州特許出願第0850569号に記載されている。プロバイオティクス微生物を使用する場合、微生物は乾燥ペット飼料上に被覆するか、又は内部に充填することが最も良い。適切な方法は欧州特許出願第0862863号に記載されている。
【0037】
湿潤ペット飼料については、米国特許第4781939号及び第5132137号に記載された方法を使用して模造肉製品を製造することができる。厚切り型の製品を製造する他の方法、たとえば蒸気釜での調理もまた使用することができる。あるいは、塊型の製品は、適切な肉材料を乳化して肉エマルジョンを生成し、適切なゲル化剤を添加し、缶又はその他の容器に充填する前に肉エマルジョンを加熱することによって製造することができる。
【0038】
他の実施形態では、ヒトが消費するための食品組成物を調製する。この組成物は栄養学的に完全な調合物、乳製品、冷蔵又は長期保存飲料、スープ、栄養補助食品、代用食品、及び栄養バー又は菓子であることが可能である。
【0039】
本発明のプレバイオティス以外に、栄養調合物には蛋白質源を含めることができる。食品蛋白質を蛋白質源として使用することが好ましい。食品蛋白質はいかなる適切な食品蛋白質、たとえば動物性蛋白質(たとえば、ミルク蛋白質、肉蛋白質及び卵蛋白質)、野菜蛋白質(たとえば、大豆蛋白質、小麦蛋白質、米蛋白質及びエンドウ蛋白質)、遊離アミノ酸混合物、又はそれらの組み合わせであってもよい。カゼイン、乳清蛋白質などのミルク蛋白質及び大豆蛋白質が特に好ましい。この組成物はまた、炭水化物源及び脂肪源を含むことができる。
【0040】
栄養調合物に脂肪源を含める場合、脂肪源は栄養調合物のエネルギーの約5%から約55%、たとえばエネルギーの約20%から約50%をもたらすことが好ましい。脂肪源を構成する脂質は、いかなる適切な脂肪又は脂肪混合物であってもよい。植物性脂肪、たとえば、大豆油、ヤシ油、ココナツ油、ベニハナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、キャノーラ油、レシチンなどが特に好ましい。牛乳脂肪などの動物性脂肪はまた、所望するならば添加することが可能である。
【0041】
炭水化物源を栄養調合物に添加することができる。これは、栄養組成物のエネルギーの約40%から約80%をもたらすことが好ましい。適切な炭水化物源、たとえばスクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、固形コーンシロップ、及びマルトデキストリン、及びそれらの混合物を使用することができる。食物繊維もまた所望により使用することができる。使用する場合、栄養調合物のエネルギーの約5%まで含めることが好ましい。食物繊維は、たとえば大豆、エンドウ、オーツ麦、ペクチン、グアーガム、アラビアゴム、及びフルクトオリゴ糖を含めた適切な原料から得ることができる。適切なビタミン及び無機質を適切な指針に見合った量で栄養調合物に含めることができる。
【0042】
1種又は複数の食品等級の乳化剤、たとえばジアセチル酒石酸のモノグリセリド又はジグリセリドエステル及びレシチン及びモノグリセリド及びジグリセリドを所望するならば栄養調合物に取り込むことができる。同様に適切な塩及び安定剤を含めることができる。
【0043】
栄養調合物は、たとえば粉末、錠剤、カプセル、濃縮液体、固形製品又はすぐに飲用できる飲料の形態で腸で溶解するように投与することが好ましい。粉末栄養調合物を製造することが所望される場合は、ホモジナイズした混合物を噴霧乾燥又は凍結乾燥などの適切な乾燥装置に移し、粉末に変換する。
【0044】
他の実施形態では、栄養組成物はミルクをベースとしたシリアルと共にプレバイオティクス調合物を含む。ミルクをベースとしたシリアルは、プレバイオティクス調合物の担体として役立つ乳児用シリアルであることが好ましい。
【0045】
他の実施形態では、通常の食品が少なくとも1種の本発明のプレバイオティクスに富んでいることができる。たとえば、発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネットミルク、菓子製品、たとえば甘味飲料又は加糖飲料、菓子バー、朝食用シリアルフレーク又はバー、飲料、粉末乳、大豆をベースとした製品、非ミルク発酵製品又は臨床栄養学的栄養補助食品である。次に、添加する組成物の量は少なくとも約0.01重量%であることが好ましい。
【0046】
以下の実施例は例示するためのみに挙げられており、決して本出願の主題を制限するものではない。他に指示がなければ、パーセント及び部は重量に基づく。実施例の後に図面の簡単な説明がある。
【実施例1】
【0047】
高齢者における糞便フローラ及び非特異的免疫系に対するオリゴ糖の効果
材料及び方法
試験計画
この試験は、老人ホームの19人の高齢者に対する試験前/試験後の試験である(試験スキーム参照)。
【0048】
体重測定と糞便、血液及び尿の試料収集は1(試験前又はウォッシュアウト期間開始時)、2(プレバイオティクス摂取前)、3(プレバイオティクス摂取中)及び4(追跡期間後)の時点で実施した。
【0049】
試験全体を通じて、発酵乳製品の摂取は禁止し、フルクトオリゴ糖含有食品(タマネギ、ニラ、チコリ根)は制限した。
【0050】
被験者
老人ホームの19人の高齢の被験者をこの試験のために動員した。以下の基準の1つ又は複数を満たす被験者はこの試験の参加者から除外した。
この1カ月抗生物質治療を受けた。
慢性腸疾患である。
特定の食事療法(すなわち、菜食主義)をしている。
消化器癌と診断されている。
鼓腸である。
【0051】
倫理委員会団体から承認を受けた。被験者全員から同意書を得た。この試験は地方の老人ホーム、Le Mont−Pelerin、スイスで実施した。
【0052】
栄養状態
試験開始時、以下の項目、身体測定(ふくらはぎ及び腕の周径、身長、体重及び体重減少)、一般的評価(生活様式、薬物療法、運動)、食事調査(食事回数、液体及び食品摂取、摂食の自主性)及び主観的評価(健康及び栄養に関する自己認識)を含めた簡易栄養評価法(MNA)によって栄養状態の評価を行った(Guigoz、Y他、Nutr Rev 1996;54:S59〜S65)。MNAでは30点の尺度を使用して高齢者の栄養状態を分類した。MNA≧24=栄養状態良好、MNA17〜23.5=栄養不良の危険性有り、NMA<17=栄養不良。
【0053】
プレバイオティクス補給
1日当たり短鎖フルクトオリゴ糖(FOS)8グラムを以下の通りに投与した。1日2回FOS粉末(Actilight 950P、Beghin−Meiji industries、Neuilly−sur−Seine、フランス)4gを看護士が食事時に食事に入れた。服薬遵守を推定するために、毎日の補給物消費を看護士が毎日の記録表に記録した。
【0054】
微生物検査
ラクトバシラス、バクテロイド、エンテロバクター、エンテロコッカス、ビフィズス菌及びクロストリジウムパーフリンジェンスの内在集団数を計数した。
【0055】
糞便試料を各被験者から0、21、42及び63日目に収集した。糞便試料を直ちに(30分以内)無酸素瓶に入れ、分析するまで4℃に維持した(最長6時間)。システイン0.5%を含有する予備還元リンガー溶液で、−2から−8まで100倍連続希釈を実施した。種々の培地のペトリ皿に接種し、Anaerocult A(Merck、Darmstadt、ドイツ)を使用して無酸素雰囲気中で37℃で48時間インキュベートし、エンテロコッカス及びエンテロバクターについては有酸素雰囲気中で37℃で24時間インキュベートした。細菌は以下の通りに選択的又は半選択的培地で検出した。ドリガルスキー培地(Sanofi Diagnostics Pasteur、フランス)でエンテロバクターを、ユーゴントマト培地(Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual、V.Suter、D.Citron and S.Finegold 3版)でビフィズス菌を、MRS(Difco、MI.米国)及び抗生物質(ホスホマイシン(79.5mg/l)+スルファメトキサゾール(0.93mg/l)+トリメトプリム(5mg/l))でラクトバシラスを、NN寒天(Lowbury and Lilly、1995)でクロストリジウム パーフリンジェンスを、シェドラーNeo−Vanco培地(BioMerieux、Marcy−l’Etoile、フランス)でバクテロイドを、及びアジド寒天(Difco)でエンテロコッカスを検出した。
【0056】
インキュベートした後、コロニーを計数して、必要であればさらに同定した。ラクトバシラス及びビフィズス菌株は顕微鏡によって、及びAPI gallery system(BioMerieux)を使用して、ラクトバシラスはAPI50CHLギャラリー、ビフィズス菌はAPI ID 32Aギャラリーでそれぞれ生化学的に同定した。細菌数は新鮮糞便試料1グラム当たりlog10コロニー形成単位(CFU)として表し、検出限界を3.30cfu/gとした。
【0057】
糞便のpH
糞便排出直後に看護士が微量電極(Orion)で粗糞便の3カ所について糞便のpHを測定した。平均pHを各時点について算出した。
【0058】
血液試料
各被験者から空腹時の血液試料を試験開始前(4ml)及び0、21、42及び63日目(23ml)に採取した。一晩絶食した後、朝(午前10時前)に血液を採取した。ヴァキュテイナー管に収集した試料13mlをヘパリン管に収集し、10mlを室温で30〜60分間凝固させた。血清試料を分析するまで−70℃で凍結維持した。ヘパリン化血を免疫機能パラメータ(食作用、以下参照)及び血液学用に使用した。
【0059】
免疫学的分析
末梢血単核細胞の集団及びその食作用活性をヘパリン化血の新鮮試料についてSimulset及びPagotest(Becton Dickinson、Basel、スイス)を使用して分析した。
【0060】
インターロイキン−6 mRNA発現のPCRによる分析。末梢血単核細胞中のmRNA発現の分析をPCRによってDelneste、Y.他(Nutr Rev 1998;56:S93〜S98)で記載された方法によって評価した。プライマー配列は、
5’−CTGCAGGAACTGGATCAGGACTTTTGTACT−3’及び
インターロイキン−6(IL−6)用には5’−GCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGG−3’及び
5’CGTTTCCCGCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC−3’及び
β−アクチン用には5’−GGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCATC−3’である。
【0061】
生化学的測定
血清アルブミン、トランスチレチン(プレアルブミン)、C反応性蛋白質、及びα1−酸糖タンパク質濃度は、免疫比濁分析法によってBehring比濁計(ドイツのBehring、Marburgの方法及び試薬)で分析した。血清中の葉酸及びビタミンB12(コバラミン)濃度は、放射免疫測定法(Dual Count、Diagnostic Product Corporation、Los Angeles、カリフォルニア、米国)によって分析した。
【0062】
統計学的分析
1標本t検定又はウィルコクソン符号順位検定を、平均差について算出し、測定した様々なパラメータについてプレバイオティクスの影響はあったかという主な仮説について0.05%で統計学的有意を評価した。さらに、1標本t検定を平均差について算出し、試験期間前及び試験期間後を含めた試験計画に関する2つの問題について、0.025%で統計学的有意を評価した(自由度の損失について補正)。測定した様々なパラメータについて発酵乳停止(=ウォッシュアウト期間)の影響はあったか。測定した様々なパラメータについてプレバイオティクス停止(=追跡期間)の影響はあったか。全ての統計学的分析は、NCSS6.0.22統計ソフトウェアを使用して実施した。
【0063】
結果
被験者
男性4人及び女性15人の19人の被験者の平均年齢は85±6.0才(77〜97才)であった。女性は男性よりも有意に体重が少なかった。試験開始時の被験者の特徴を表1に挙げる。
【0064】
【表1】
【0065】
【表2】
【0066】
1人のみ栄養不良であった。栄養不良の危険性がある7人の女性では、上部スコア範囲は21.5〜23であり、平均NMAスコアは栄養状態が良好な範囲内にあり、24.6±3.0点であった。
【0067】
血清アルブミン(正常範囲35〜55g/L)及びトランスチレチン(プレアルブミン、正常範囲0.16〜0.40)は正常範囲内の低い方であったが、男性2人(C反応性蛋白質が高い)及び女性2人(アルブミン濃度が低いが、トランスチレチンは正常で、C反応性蛋白質は境界線上である)以外では、急性期蛋白質、α1−酸糖蛋白質(正常範囲0.5〜1.3)及びC反応性蛋白質(正常値<10mg/L及び高齢者の異常値>20mg/L)は炎症過程の存在を示していなかった。これらの結果は、まだ栄養状態は良好であるがかなり虚弱な高齢者の群であることを示唆している。
【0068】
細菌学的分析及び糞便のpH
ビフィズス菌の細菌数は、FOS補給3週間の間に平均2.8±0.57log10CFU増加したが(p<0.001)、バクテロイドの細菌数もまた増加した(p<0.032)(表2a及び2b及び図1参照)。
【0069】
【表3】
【0070】
エンテロバクター、エンテロコッカス及びラクトバシラスの細菌数は発酵乳製品の補給及び/又はフルクトオリゴ糖(FOS)の摂取によって有意な影響を受けなかった。一方、ビフィズス菌はFOSの摂取に特異的に応答するようであり、主に、FOS開始前、log10 CFUが7よりも低かった被験者でビフィズス菌細菌数の増加が生じた。FOS補給を抑制するとビフィズス菌細菌数が有意に1.1±0.39log10CFU減少したが、開始濃度にはならなかった(表2a及び2b及び図1)。図2では、この試験で得られたビフィズス菌の変化を以前の試験と比較すると、高齢者は少なくとも若年成人と同様にFOSの影響に感受性であることが示された。発酵乳製品の制限も、FOSの摂取も、糞便pHを変化させなかった(表2a)。
【0071】
非特異的免疫
FOS摂取により、末梢Tリンパ球並びにリンパ球亜集団、CD4+、CD8+T細胞の割合の有意な増加がもたらされた(表3a及び3b)。白血球細胞の総数、活性化Tリンパ球及びナチュラルキラー(NK)細胞は、FOS細胞の摂取によって影響を受けなかった(表3a及び3b)。
【0072】
【表4】
【0073】
【表5】
【0074】
【表6】
【0075】
【表7】
【0076】
顆粒球及び単核球の食作用活性は、FOSの摂取によって有意に減少した。蛍光強度中央値で表された食作用活性は、顆粒球では130±10から52±2(p<0.001)に、単核球では75±5から26±2(p<0.001)に変化した。
【0077】
このような炎症過程の減少の可能性はまた、FOS摂取後の末梢血単核細胞のインターロイキン−6 mRNAの有意な減少によっても示唆される(図3)。
【0078】
ビタミンB12及び葉酸状態
ビタミンB12及び葉酸の血清濃度はいずれも、FOSの補給によって影響を受けなかった。血清ビタミンB12は、補給前は271±143ng/Lで、補給中は289±160ng/Lであった。しかし、3人の被験者ではビタミンB12が欠乏していた。2人の被験者では試験期間中に正常状態に回復したが、もう1人は試験期間中欠乏したままであった。血清葉酸濃度は、補給前は5.9±2.0μg/Lで、補給中は5.7μg/Lであった。
【0079】
虚弱で高齢な被験者は試験開始時にビフィズス菌数が少なかったので、我々の結果は、高齢の被験者においてフルクトオリゴ糖のビフィズス発生効果によってビフィズス菌数が2log増加することを強く示唆している。炎症過程の減少は、末梢血単核球におけるIL−6 mRNAの発現の減少によって示唆される。
【0080】
実際に、本試験によって成人及び高齢者ではビフィズス菌に対してFOS補給の正の影響が見られることが確認され(図2)、高齢者はプレバイオティクス(FOS)摂取に応答して若年成人のようにビフィズス菌が増加し、ビフィズス菌数が低い場合はさらに増加することが示された。さらに、FOS8g以下でもビフィズス菌数に対する最大効果を実現するために十分なようである。別の試験では用量応答が存在するようであるが、単一の試験では閾値である4〜5g/日を上回ると最大応答が得られ、ビフィズス菌の増加は最初の数により依存するらしいことが示された(図1及び2)。食事に添加したFOSは、有害な可能性がある細菌、主にクロストリジウム及びバクテロイドに代わってビフィズス菌の濃度を増加させることが多かった。しかし、試験全体を通じてバクテロイドの有意な増加が認められた(表2a及び2b)。
【0081】
食作用活性の重大な減少が認められた。この食作用活性の減少は、病原菌を抑制する可能性に関与したマクロファージの活性の減少を反映しており、したがって少量の内毒素負荷による炎症の減少が示唆される。しかし、驚いたことに、この炎症過程の減少の可能性は、末梢血単核細胞のインターロイキン−6 mRNA濃度の減少によっても示唆される(図3)。
【実施例2】
【0082】
補助食品
補助食品は、フルクトオリゴ糖とイヌリンをフルクトオリゴ糖約70%、イヌリンが約30%の重量比で混合又はブレンドすることによって調製した。得られたプレバイオティクス混合物を適切な担体、たとえば発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネットミルク、菓子バー、朝食用シリアルフレーク又はバー、飲料、粉末乳、大豆をベースとした製品、非ミルク発酵製品又は臨床栄養学的栄養補助食品に添加又はブレンドすることが可能である。
【実施例3】
【0083】
乾燥ペット試料
飼料混合物は、トウモロコシ約58重量%、トウモロコシグルテン約5.5重量%、鶏肉約22重量%、乾燥チコリ2.5%、カルニチン1%から構成され、残部は塩類、ビタミン及び無機質から構成される。
【0084】
飼料混合物を予備調製器に送り込み、水分を入れる。次に、水分を含んだ飼料を押し出し調理器に送り込み、糊化する。押し出し器から排出した糊化基質をダイに入れ、押し出し成形する。成型物をイヌに与えるのに適した切片に切断し、約110℃で約20分間乾燥し、冷却してペレットを形成する。
【0085】
この乾燥ドッグフードは特に炎症過程及び/又は非特異的免疫パラメータ、たとえば食細胞の異常活性化を減少させるためのものである。
【実施例4】
【0086】
湿性缶入りペットフード
混合物は、鶏ガラ、ブタ肺及びブタ肝臓(磨砕)56%、魚13%、小麦粉16%、血漿2%、水10.8%、色素2.2%、半精製カッパカラギーナン1%、無機塩、及びモノ不飽和脂肪酸に富んだ油(オリーブ油)9%及びチコリ3%から調製する。この混合異物を12℃で乳化して、プディング型に押し出し、次に90℃の温度で調理する。これを30℃まで冷却して塊状に切断する。
【0087】
これらの塊(水分含量58%)の30%を鶏ガラ23%、グアーガム1%、色素及び香料1%及び水75%から調製された基質に取り込ませる。次に、ブリキ缶に充填し、127℃で60分間滅菌する。
【図面の簡単な説明】
【0088】
【図1】老人ホーム高齢者の新鮮糞便中のビフィズス菌の生菌数に対する短鎖フルクトオリゴ糖(FOS)8g投与の効果。時点は、FOS3週間摂取の摂取前(2)、摂取中(3)、及び摂取後(4)であった。(A)個々の値。(B)四角。四角は25パーセンタイル及び75パーセンタイルを示し、四角内の実線は中央値を示し、t型は5パーセンタイル及び95パーセンタイルを示し、実線の点は範囲外の値を示す。
【0089】
【図2】成人及び高齢者のビフィズス菌に対するフルクトオリゴ糖(FOS)の効果。参照文献24(Bouhnik Y他、J Nutr 1999;129:113)は18〜47才の成人における2.5gから20g FOS/日に対する用量応答である。参照文献25(Menne E他、J Nutr 2000;130:1197)は20〜50才の中年成人における8g FOS/日に対する応答である。参照文献26(Gibson GR J Nutr 1999;129:1438S)は若年成人における15g FOS/日に対する応答である。参照文献27(Kruse HP他、Brit J Nutr 1999;87:325)は、26〜53才の中年成人におけるイヌリン34g/日までに対する応答である。参照文献28(Kleesesen B他、Am J Clin Nutr 1997;65:1397)は、68〜89才の便秘の高齢被験者における20g FOS/日に対する応答である。本試験:老人ホームの77〜91才の被験者における8g FOS/日に対する応答である。
【0090】
【図3】FOSを補給した高齢者の末梢血単核細胞(PBMC)におけるIL−6mRNA発現の差違。PBMCにおけるIL−6mRNA発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって測定した。定量的変化は、NIHイメージプログラムを使用してバンドの強度を走査し、IL−6mRNAのβ−アクチンmRNAに対するパーセントによる密度比として算出することによって推定した。時点はFOS3週間摂取の摂取前(2)、摂取中(3)、及び摂取後(4)であった。(A)臭化エチジウム染色したゲルにおける個々の変化の代表的なイメージ。(B)IL−6 mRNA発現の定量的推定。FOS摂取中のIL−6 mRNAの変化はFOS摂取前と有意に異なっている(p=0.018)。
Claims (23)
- ほ乳類の炎症過程及び/又は非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させるために少なくとも1種のプレバイオティクスを含む組成物。
- ほ乳類の食細胞の異常活性化を減少させるための請求項1に記載の組成物。
- 前記プレバイオティクスはグルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム又はそれらの混合物から生成したオリゴ糖を含む請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖とイヌリンの混合物を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記プレバイオティクスは重量を基にしてフルクトオリゴ糖を約60%から約80%及びイヌリンを約20%から約40%含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。
- プレバイオティクスに加えてプロバイオティクスを含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記プロバイオティクスはビフィドバクテリウムビフィダム及びストレプトコッカスサーモフィルスから成る群から選択される請求項7に記載の組成物。
- 高齢のヒト又は高齢のペット、あるいは慢性炎症を有する重症患者を対象とした請求項1から請求項7までに記載の組成物。
- ほ乳類の炎症過程を減少させるための薬剤又は食品又はペット飼料組成物の製造における少なくとも1種のプレバイオティクスの使用。
- ほ乳類における非特異的免疫パラメータの異常活性化を減少させるための薬剤又は栄養組成物の製造における少なくとも1種のプレバイオティクスの使用。
- 前記プレバイオティクスはグルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム又はそれらの混合物から生成したオリゴ糖を含む請求項10又は請求項11に記載の使用。
- 前記プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖又はフルクトオリゴ糖とイヌリンとの混合物を含む請求項10から請求項12までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記プレバイオティクスは重量を基にしてフルクトオリゴ糖を約60%から約80%及びイヌリンを約20%から約40%含む請求項10から請求項13までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記プレバイオティクスはプロバイオティクス、特にビフィドバクテリウムビフィダム及びストレプトコッカスサーモフィルスとの混合物で提供される請求項10から請求項14までのいずれか一項に記載の使用。
- 高齢のヒト又は高齢のペット、あるいは慢性炎症を有する重症患者のための請求項10から請求項15までのいずれか一項に記載の使用。
- 有効量の、プレバイオティクス又は少なくとも1種のプレバイオティクスを含む組成物を投与することを含むほ乳類の炎症過程を減少させる方法。
- 有効量の、プレバイオティクス又は少なくとも1種のプレバイオティクスを含む組成物を投与することを含むほ乳類の非特異的免疫パラメータ、たとえば食細胞の異常活性化を減少させる方法。
- 前記プレバイオティクスはグルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム又はそれらの混合物から生成したオリゴ糖を含む請求項17又は請求項18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖を含む請求項17から請求項19までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖とイヌリンとの混合物を含む請求項17から請求項20までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記プレバイオティクスは重量を基にしてフルクトオリゴ糖を約60%から約80%及びイヌリンを約20%から約40%含む請求項16から請求項20までのいずれか一項に記載の使用。
- プレバイオティクスに加えて有効量のプロバイオティクスを投与することを含む請求項17から請求項22までのいずれか一項に記載の方法。
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