JP2004529763A - 蛋白質を選択的に切断する合成触媒及びこれを用いた蛋白質の選択的切断方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、標的蛋白質に選択的に結合して切断出来る合成触媒を提供することにある。また、本発明の他の目的は、該合成触媒を用いて標的蛋白質を選択的に切断する方法を提供することにある。
【解決手段】標的蛋白質を選択的に切断する能力を有する、下記一般式(A)
(R)(Z)n (A)
(式中、nは1以上の整数を示し、Rは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質、例えば、酵素の阻害剤や受容体の拮抗剤を示し、Zは金属イオン−リガンド錯体を示す。)
で表される合成触媒、及び該合成触媒を用いることを特徴とする、標的蛋白質を選択的に切断する方法。
【解決手段】標的蛋白質を選択的に切断する能力を有する、下記一般式(A)
(R)(Z)n (A)
(式中、nは1以上の整数を示し、Rは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質、例えば、酵素の阻害剤や受容体の拮抗剤を示し、Zは金属イオン−リガンド錯体を示す。)
で表される合成触媒、及び該合成触媒を用いることを特徴とする、標的蛋白質を選択的に切断する方法。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は蛋白質の混合物中から特定蛋白質のみを選択的に認識して切断出来る合成触媒及びこれを利用して特定蛋白質を選択的に切断する方法に関するものである。特定蛋白質を選択的に切断することによって蛋白質の生理活性を選択的に抑制することが可能である。
【背景技術】
【0002】
蛋白質は生体内で様々な生理的な機能を担っている。特に、酵素と受容体は疾患に係わる機能を担当する場合が多いため、酵素と受容体の機能を抑制する分子は医薬品として使われることがある。酵素の場合には、阻害剤が酵素の活性部位を可逆的に封鎖して酵素機能を抑制し、受容体の場合は、拮抗剤が可逆的に結合することにより受容体の機能を低下させる(非特許文献1)。自殺阻害剤は、酵素の活性部位に共有結合により結合して酵素の活性を阻害する。狂牛病に対するプリオンやアルツハイマー病に対するアミロイドで例示されるように、多くの毒性蛋白質は深刻な健康上の問題を誘発させる。毒性蛋白質に対し、その蛋白質の骨格を特異的に切断出来る合成分子は効果的な医薬として使われ得るが、このような分子については未だ報告された例がない。
【0003】
このような阻害剤又は拮抗剤を酵素又は受容体に加える時、活性を持った蛋白質の濃度が減少する程度を簡単な数式で表すと以下の通りである。
【0004】
【化2】
【0005】
(式中、Pは活性を持った蛋白質を示し、Lは阻害剤又は拮抗剤を示す。)
前記式(1)は単純な阻害剤又は拮抗剤に関するものであり、式(2)は自殺阻害剤に関するものである。
【0006】
活性を持った蛋白質の濃度([P])が全体蛋白質の濃度([P]o)の半分になるLの全体濃度([L]+[PL]+[PL’])をL50と表現すれば、L50は式(1)の場合には(KL+0.5[P]o)となる。即ち、一般的な阻害剤や拮抗剤の場合には、KLが小さいほどL50は小さくなるものの、0.5[P]oより小さくはならない。式(2)の場合には、L50は0.5[P]oであるが、KLが小さいほど、又はKsiが大きいほどLの濃度を半分の水準に減少させるのにかかる時間が短くなる。L50が小さいほど阻害剤や拮抗剤を医薬品として使用するには効果的である。しかしながら、いくら優れた阻害剤や拮抗剤であっても、当量より多い量の蛋白質の生理活性を阻害することは出来ない。
【0007】
ある種の金属錯体は蛋白質を切断する能力を有していることが知られている。例えば、Cu(II)とシクレン(cyclen)、Cu(II)と1,4,7−トリアザノナン、Cu(II)とトレン(tren)、Pd(II)とエチレンジアミン、Fe(III)又はCo(III)と配位高分子二重膜(coordinatively polymerized bilayer membranes)間に形成された錯体が蛋白質のペプチド結合を加水分解する能力を有していると報告されている(非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6及び非特許文献7)。また、コバルト(III)に配位されたアミドがコバルト(III)イオンによって加水分解されることも知られている(非特許文献8)。しかしながら、金属の錯体が特定蛋白質を選択的に攻撃して切断した例は今まで報告された例がない。
【0008】
【非特許文献1】
Medicinal Chemistry, 2nd Ed., Ganellin, C. R.; Roberts, S. M. Ed.; Academic Press: London, 1993
【非特許文献2】
Zhu, L.; Qin, L.; Parac, T. N.; Kostic, N. M. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5218
【非特許文献3】
Hegg, E. L.; Burstyn, J. N. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7015
【非特許文献4】
Suh, J.; Oh, S. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1067
【非特許文献5】
Jang, B.-B.; Lee, K. P.; Min, D. H.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12008
【非特許文献6】
Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 7742
【非特許文献7】
Suh, J.; Moon, S.-J. Inorg. Chem. 2001, 40, 4890
【非特許文献8】
Sutton, D. A.; Buckingham, D. A. Acc. Chem. Res. 1987, 20, 357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、標的蛋白質に選択的に結合して切断出来る合成触媒を提供することにある。また、本発明の他の目的は、該合成触媒を用いて標的蛋白質を選択的に切断する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前述のように、阻害剤や拮抗剤はどんなに性能が素晴らしくても当量より多い量の標的蛋白質の生理活性を阻害することは出来ない。また、毒性蛋白質を特異的に切断する合成触媒は知られていない。従って、本発明者らは阻害剤又は拮抗剤として作用する医薬品が有する、このような基本的な限界を克服し、毒性蛋白質を特異的に切断する合成触媒を創出するために鋭意研究を行った結果、下記一般式(A)
(R)(Z)n (A)
(式中、nは1以上の整数を示し、Rは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質、例えば、酵素の阻害剤や受容体の拮抗剤を示し、Zは金属イオン−リガンド錯体を示す。)
で表される合成触媒を創出することに成功した。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
本発明に係る一般式(A)で表される合成触媒について、以下に詳細に説明する。
本発明の合成触媒は標的蛋白質を認識する部位である、基Rを持っており、この部位は標的蛋白質と選択的に結合して錯体を形成することが出来る。このように認識部位と標的蛋白質との間に結合が形成された後、金属イオン−リガンド錯体で構成された反応部位(Z)が標的蛋白質のペプチド結合を切断することになる。切断された蛋白質は新しい高次構造に迅速に変わり、触媒を結合する能力が低くなり、これに伴って触媒は切断された蛋白質から分離され再生されることによって、他の標的蛋白質の切断に再び使用することが出来る。従って、標的蛋白質と合成触媒が結合する能力が強くなくても、時間を充分にかければ相当量の標的蛋白質が切断され、蛋白質の活性を充分に抑制することが出来る。
【0012】
本発明に係る合成触媒が蛋白質の活性を阻害する機序はミカエリス・メンテンの式に類似の下記式(4)により簡単に表すことが出来る。
【0013】
【化3】
【0014】
(式中、Pは前記と同義であり、Cは本発明に係る一般式(A)の合成触媒を示し、P’は切断された新しい蛋白質を示し、Kcはミカエリス定数に対応する定数である。)
【0015】
前記式(4)から分かるように、合成触媒(C)は活性蛋白質(P)と結合して錯体(PC)を形成した後、蛋白質を切断して新しい蛋白質(P’)を生成すると同時に自らを再生させる。この場合、標的蛋白質(P)の半分を切断し、その生理活性を抑制するのに必要な触媒の量に何らの制限はない。標的蛋白質の活性を一定水準まで阻害するのに必要とする時間を長くするほど少量の触媒を使用することが出来る。合成触媒が標的蛋白質と錯体(PC)を強く形成するほどKcは小さくなり、Kcが小さくなるかkpcが大きくなるほど蛋白質切断速度は速くなる。
【0016】
本発明に係る合成触媒の認識部位Rとしては、使用する標的蛋白質を選択的に認識し、結合出来る全ての物質が使用可能である。標的蛋白質についての過去に蓄積されたデータから既存の構造を選択しても良いし、新しい構造をデザインすることも出来る。
【0017】
例えば、蛋白質が酵素である場合、その酵素の活性を阻害する公知の阻害剤を使用することが出来、蛋白質が受容体である場合、その受容体に結合する公知の拮抗剤を使用することが出来る。即ち、阻害剤或いは拮抗剤に対する情報が知られている標的蛋白質の場合、既存の阻害剤或いは拮抗剤を認識部位として活用して蛋白質切断合成触媒をオーダーメードで合成することが出来る。しかしながら、本発明に係る合成触媒が結合する標的蛋白質上の位置は公知の阻害剤や拮抗剤が結合する標的蛋白質上の位置と異なっても構わない。阻害剤や拮抗剤は標的蛋白質の活性に必須な部位に結合するのに対し、本発明に係る合成触媒は活性部位以外の位置であっても標的蛋白質を特異的に認識して結合した後、結合部位周辺に位置したペプチド結合を切断しさえすれば、所期の目的を達成出来るからである。従って、公知の阻害剤や拮抗剤と関連のない新しい構造を認識部位として使用することも出来る。また、拮抗剤や阻害剤が知られていない標的蛋白質の場合には本発明に係る合成触媒を使用してスクリーニングすることによって新しい認識部位を探索することが出来る。
【0018】
どの蛋白質が標的蛋白質になるかによって、またその標的蛋白質に対して公知の多くの阻害剤又は拮抗剤中からどれを選択するかによって、又は認識部位を新たに設計するかしないかによって、本発明に係る合成触媒の認識部位Rは限りなく変化させることが出来る。かくして、この認識部位を構造的に特定することは不可能である。
【0019】
前記一般式(A)の構造で反応部位Zに該当する触媒中心はCu(II)のシクレン(cyclen)錯体のような金属錯体である。使用可能な金属錯体は、認識部位に結合しない状態では蛋白質を切断出来ないか、切断効果が僅かに確認できる程度である。この金属錯体を蛋白質認識部位に結合させて合成した分子、即ち、合成触媒は標的蛋白質と複合体を形成する。標的蛋白質と合成触媒の複合体における、金属錯体と標的蛋白質の切断部位との間の有効濃度が十分に高くなることにより、標的蛋白質のペプチド結合の效果的な切断が可能となる。
【0020】
本発明者らはこのような合成触媒を使用して標的蛋白質を選択的に切断することによって、生理活性を抑制しようとする目的を達成するに当たって、金属イオン−リガンド錯体を構成する金属イオン及びリガンドの種類が特定のものに限定されることが非常に重要であることを見出した。
【0021】
蛋白質を切断する能力を持った多数の金属錯体が知られている。この中で、本発明に係る金属イオン-リガンド錯体の構成要素に適した金属イオンとしては、Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)、Pd(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(III)、Rh(III)、Ir(III)、Ru(III)、Pt(IV)、Zr(IV)、及びHf(IV)からなる群より選ばれた1種以上、好ましくはCu(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(III)、Rh(III)、Ir(III)、及びRu(III)からなる群より選ばれた1種以上が挙げられ、キレート形成リガンドの骨格としては下記分子構造の群から選ばれた1種以上が挙げられる。
【0022】
【化4】
【0023】
前記構造式から分かるように、本発明に係るキレート形成リガンドは環状又は非環状であり、リガンド内に含まれる金属配位原子中1〜4個は、窒素原子であるという特徴を持っている。これらの窒素原子は芳香族の窒素原子であっても非芳香族の窒素原子であってもどちらでも良い。
【0024】
本発明に係る一般式(A)の構造において、R及びZは、RとZとの間を直接連結する主鎖及び主鎖に任意に結合した側鎖を含むリンカーにより連結されている。認識部位Rが標的蛋白質に結合すれば、反応部位Zは標的蛋白質内のペプチド結合中の一つ以上を切断することになる。蛋白質上の切断部位と反応部位Zとの間の有効濃度を増加させれば、反応部位Zの反応性を向上させることが出来る。この有効濃度を調節する効果的な方法は合成触媒中に含まれる認識部位(R)と反応部位(Z)との間の相対的な位置を調節することである。相対的な位置調節のために利用されるものが、リンカーの長さと形状である。
【0025】
リンカーは主鎖を含むべきである。主鎖の骨格は1〜30個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び/又は硫黄原子から構成され、これらの原子はアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び/又はチオエーテル基のような官能基や、アミド、イミド、エステル及び/又はチオエステルのような誘導体に属する。リンカーは側鎖を含むことが出来、これらはそれぞれ、アルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び/又はチオエーテル基のような官能基や、酸、アミド、イミド、エステル及び/又はチオエステルのような誘導体に属する1〜30個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び/又は硫黄原子から構成される骨格を有する。
上記で説明したような定義に基づいて、様々な標的蛋白質及び合成触媒に対する切断部位及び反応部位間の有効濃度を調節するのに好適なリンカーの構造を設計することが出来る。
【0026】
本発明に係る合成触媒で反応部位(Z)は認識部位(R)1個当り1個以上の割合で結合出来る。反応部位は相互に同じであるか、或いは互いに異なる。認識部位1個当り1〜3個の反応部位を結合させる場合、典型的な結合形態を例示すると、以下の通りである。別のやり方で認識部位内部に反応部位を挿入することも可能である。
【0027】
【化5】
【0028】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、これらによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。実施例ではミオグロビン(Mb)とアビジンが標的蛋白質として用いられている。Mbの場合、触媒は新しく用意した組合せライブラリーを用いて見出された認識部位を備えたものである。他方、アビジンの場合は、ビオチンがアビジンに強く結合することが知られているので、ビオチンを触媒の認識部位として使用した。実施例では反応性金属中心のキレート形成リガンドとして種々の有機化合物らが試みられた。実施例では合成触媒を標的蛋白質のそれよりも多いモル量、又は少ないモル量で添加した。
【実施例1】
【0029】
蛋白質−切断触媒の結合部位を調べるために、ペプチド核酸(PNA)類縁体を含むシクレン(Cyc)誘導体の組合せライブラリー(CycAc(Q)nLysNH2:QはPNAモノマーA'、 G、 T'、 又はCを示す)を作製した。PNA類縁体はDNAの核酸塩基と塩基対をなすために使用し得る核酸塩基類縁体(NB(A')、NB(G)、NB(T')、NB(C))を含んでいる。NB(A')及びNB(T')はそれぞれNB(T)及びNB(A)を認識するが、相互間での認識は出来ない(Lohse, J.; Dahl, O.; Nielson, P. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999,96, 10804)。それ故、ライブラリーに存在するPNA混合物間の塩基対の結合はPNAsの成分としてA及びTの代りにA'及びT'を使用することによって抑制され得る。
【0030】
【化6】
【0031】
A'のFmoc誘導体(N−[(2−アミノ−6−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}−9H-プリン−9−イル)アセチル]−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシン(1))を下記スキーム1に従って合成した。
【0032】
【化7】
【0033】
DMF(100mL)中に(2−アミノ−6−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}−9H−プリン−9−イル)酢酸(1a)(2.0g,5.8mmol)(Haaima, G.; Hansen, H.; Christensen, L.; Dahl, O.; Nielsen, P. Nucleic Acid Res. 1997,25, 4639)を加えて攪拌し、これにtert−ブチル N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(1b)のHCl塩(2.8g,6.4mmol) (Thomson, S.; Josey, J.; Cadilla, R.; Gaul, M.; Hassman, C.; Luzzio, M.; Pipe, A.; Reed, K.; Ricca, D.; Wiethe, R.; Noble, S.; Tetrahedron 1995,51, 6179)とトリエチルアミン(TEA)(1.6mL,12mmol)を加えた。反応混合物にO−ベンゾトリアゾル−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HBTU)(2.4g,6.4mmol)を加え、混合物を3時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を塩化メチレン(MC)(100mL)に溶解した。MC溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5%Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のtert−ブチル N−[(2−アミノ−6−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}−9H−プリン−9−イル)アセチル]−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(1c)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:20);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (s, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.37-7.25 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05 及び 4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H), 4.00及び3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37(m, 2H), 3.15(s, 1H), 1.38(m, 9H).
1c(1.5g,2.1mmol)のMC(25mL)溶液にトリフルオロ酢酸(TFA)(25mL)を加えて、反応混合物を5時間攪拌した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状の1を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.1 (s, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.45-7.29 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05及び4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H) 4.00及び3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.15 (s, 1H); HRMS実測値(exact mass)665.6874 (M+H)+, C34H33N8O7としての計算値(calcd)665.6854.
【0034】
T'(N−{[2−(ベンジルチオ)−4−オキソピリミジン−1(4H)−イル]アセチル}−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシン(2))のFmoc誘導体を下記スキーム2に従って合成した。
【0035】
【化8】
【0036】
[2−(ベンジルチオ)−4−オキソピリミジン−1(4H)−イル]酢酸(2a)を、メトキシベンジル基の代りにベンジル基をS−保護基として使用したことを除いては文献(Lohse, J.; Dahl, O.; Nilesen, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 11804)に記載された方法に従って合成した。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.54 (br s 1H), 7.69 (d, 1H), 7.42 (d, 2H), 7.38-7.25 (m, 3H), 5.91 (d, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.56 (s, 2H).
2a(3.6g,5.8mmol)のDMF(100mL)溶液に攪拌下、1b(6.2g,6.4mmol)及びTEA(3.6mL,12mmol)を加えた。反応混合物にHBTU(5.4g,6.4mmol)を加えて混合物を3時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣をMC(100mL)に溶解した。溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5% Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のtert−ブチル N−{[2−(ベンジルチオ)−4−オキソピリミジン−1(4H)−イル]アセチル}−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(2b)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:20);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.47-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.35 (d, 2H), 4.27 (d, 2H), 4.18-4.16 (m, 2H), 4.14 (s, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.30 (m, 1H), 3.28 (m, 1H), 1.38 (m, 9H).
2b(3.0g,4.6mmol)のMC(25mL)溶液にTFA(25mL)を加えて、反応混合物を5時間攪拌した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状の2を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.39-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.23-4.16 (m, 3H), 4.14 (s, 1H), 3.39-3.35 (m, 2H), 3.32 (m, 1H), 3.15 (m, 1H); HRMS実測値599.6873 (M+H)+, C32H32N4O6Sとしての計算値599.6875.
[4,7,10−トリス(tert−ブトキシカルボニル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル]酢酸(3)を下記スキーム3に従って合成した。
【0037】
【化9】
【0038】
トリ−tert−ブチル 1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(3a)(10g,21mmol)(Kimura, E.; Aoki, S.; Koike, T.; Shiro, M. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 3068)、Na2CO3(2.5g,23mmol)、及びCH3CN(200mL)の混合物にエチルブロモアセテート(3.2mL,23mmol)を加えた。不均一な混合物を一晩還流させた。濾過後、溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のトリ−tert−ブチル 10−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(3b)を得た。
Rf:0.5(酢酸エチル(EtOAc)/ヘキサン1:1);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.16 (q, 2H), 3.55-3.32 (br, 14H), 2.94 (br s, 4H), 1.45 (m, 27H), 1.32 (t, 3H).
3b(10g,18mmol)のCH3OH(100mL)溶液にNaOH水溶液(1N,100mL)を加え、反応混合物を2時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を10%クエン酸水溶液に溶解させた後、pHを5に調整した。溶液をEtOAc(100mL×2)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥した後、蒸発させて無定形固体状の3を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H), 1.43 (m, 27H); MS (MALDI-TOF) m/z 531.75 (M+H)+(C25H47N4O8としての計算値531.67).
【0039】
fmoc基で保護されたPNAモノマーG及びCをApplied Biosystems社から購入し、fmoc基で保護されたL−リジンをNova Biochem社から購入した。
組合せライブラリー用のPNA(CycAc(Q)nLysNH2)を、A'、T'、G、C、及びL−リジンのfmoc誘導体とカルボン酸3から、Expedite Model 8909 Nucleic Acid Synthesis Systemを用いた自動合成装置により合成した。ライブラリーの合成において、A'、T'、G、及びCのfmoc誘導体は重合体支持体に結合して長さが増加しているPNA鎖に対して同等の反応性を有してカップリングするものと推定された。PNAの純度をVoyager−DETM STR Biospectrometry Workstation modelを使用したMALDI−TOF MS分析により確認した。CycAc(Q)nLysNH2ライブラリー(全体濃度:約7×10−5M)をCuCl2水溶液(3.5×10−4M)と混合すると、Cu(II)がCyc部位に結合したCu(II)CycAc(Q)nLysNH2ライブラリーを生成した。蛋白質(約1×10−5M)溶液をこの混合物に加えて蛋白質の切断を試験した。37℃、pH7.0(50mM 4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES))の条件で各分子当たり最大8個のPNAモノマーを含有するCu(II)Cycライブラリーで試験したところ、電気泳動(SDS−PAGE)で測定した結果では、牛血清アルブミン、γ−グロブリン、延長因子P、ゼラチンA、ゼラチンB、及びウマ心臓Mbのような蛋白質が切断されていることを示す証拠は確認出来なかった。分子当たり9個のPNAモノマーを含有するCu(II)Cycライブラリーは、Mbの切断に対する明白な活性を示した。本発明者らはCu(II)Cycの側に位置した既知のPNAモノマーを使用して4グループのライブラリーを合成しており、Mb切断に対する活性を試験して最上のターミナルモノマーを見出した。残りのモノマーに対しても検索を繰り返した結果、下記構造式(I)のCu(II)錯体(MS (MALDI-TOF) m/z 2851.49 (M+H)+(C111H153N64O25S2としての計算値2850.58)が最良の触媒として選択された。
【0040】
【化10】
【0041】
緩衝液(1mM 2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、pH6.0)に(I)(1.2当量)を溶解し、これにCuCl2の水溶液を加えて(I)のCu(II)錯体のストック溶液を調製した。[Cu(II)(I)]でMbを分解した後、電気泳動(SDA−PAGE)を行った。その結果を図1に示した。ここで、反応は、pH7.5(50mM HEPES)、[Mb]o(Mbの初期濃度)が7.9μM、[Cu(II)(I)]o([Cu(II)(I)]の初期濃度)が2.0μMの条件で行われた。170時間の間に[Cu(II)(I)]1分子当たりMb2.5分子が切断された。[Mb]の時間−依存的な減少を擬一次動力学的方程式に適用した結果、擬一次反応速度定数(ko)が5.7×10−3h−1であることが示された。図1の曲線はそのデータを擬一次動力学的方程式に適用して得られたものである。反応混合物から酸素を除去することはkoに特別な影響を与えなかった。前記実験と同じ条件で[Cu(II)(I)]の代りに[Cu(II)Cyc]でMbを処理すると、Mbが切断されないことが観察された。
【0042】
文献(Castillo-Blum, S. E.; Sosa-Torres, M. E. Polyhedron, 1995,14, 223)に報告された一般的な方法によって、Co(III)イオンを(I)のCyc部位に導入して、(I)のCo(III)錯体を製造した。[Co(III)(I)]として:MS (MALDI-TOF) m/z 2908.44 (M+H)+(C111H153N64O25S2Coとしての計算値2908.51).
【0043】
また、[Co(III)(I)]によってMbを分解した後、電気泳動(SDS−PAGE)を行った。その結果が図1に示されている。ここで、反応はpH7.5(50mM HEPES)、[Mb]oが4.7μM、[Co(III)(I)]oが0.47μMの条件で行った。100時間の間に[Co(III)(I)]1分子当たりMb6.0分子が切断された。[Mb]の時間−依存的な減少を擬一次動力学的方程式に適用した結果、koは9.4×10−3h−1であった。反応混合物から酸素を除去することはko値に特別な影響を与えなかった。前記実験と同じ条件で[Co(III)(I)]の代りに[Co(III)Cyc]でMbを処理すると、Mbが切断されないことが観察された。
【0044】
前記(I)の構造はCu(II)錯体を使用して検索したが、詳細な動力学的分析はより高い触媒活性を有する[Co(III)]錯体を使用して行った。pH7.5でCo(触媒の初期濃度)に対するkoの依存性を図2に示した。ここで、[Mb]oは4.7μMに固定させた。図2に示された2つの直線はCo=[Mb]oで交差している。図2の動力学的データはCo≧[Mb]oであり、従ってKc<<5μMの時、Mbが[Co(III)(I)]と完全に結合していることを示している。また、[Mb]oより大きいCoを使用して測定したkoはkpcに該当する。ここでKcとkpcは式(4)に定義されている。このようにして測定した種々のpHでのkpc値を図3に示す。式(5)のスキームによるベルシェープ型のpH分布を分析した結果、pKa1=5.50±0.42及びpKa2=8.68±0.46の値を得た。図3の曲線はこれらのpK値に基づいて図示されたのである。もしも、Mb又は(I)のイオン化が無視出来るならば、これらのpKa値はMbと錯体を形成した[Co(III)(I)]におけるCo(III)イオンのアコリガンドのイオン化と考えられる。
【0045】
【化11】
【0046】
Mb(12μM)と[Co(III)(I)](3.5μM)とをpH6.0で、37℃で、85時間インキュベートして得られた反応混合物のMALDI−TOF MSによれば、図4に示すように、Mbは2対の蛋白質(一方の対の分子量:7074及び9892、他方の対の分子量:8045及び8909)に分けられる。図4で、m/z値16953及び16953/2のピークは、Mb(分子量:16953)に起因するものである。[Co(III)(I)]による蛋白質切断の可能な部位はそれぞれの2対に対して、Leu89−Ala90(分子量:7077及び9894の断片を生成)及びLeu72−Gly73(分子量:8057及び8914の断片を生成)である。現時点では2個の切断部位が触媒の異なる結合様式を含んでいるか否かは明白ではない。2個の切断部位がMbと触媒との間に形成された同じ錯体に起因する可能性もある。
【0047】
牛血清アルブミン、γ−グロブリン、延長因子P、ゼラチンA、及びゼラチンBのような他の蛋白質を[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]とインキュベーションした場合には、蛋白質切断は観察されなかった。このことは[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]がMbに対して特異的であることを示している。
【0048】
構造式(Ia)で示される如く、CycAcユニットに隣接したPNA残基がA'の代りにCである[Co(III)(I)]の類縁体を合成した。[Co(III)(Ia)]はMbの切断に対する触媒活性を示さなかったが、これはMbが[Co(III)(I)]だけを特異的に認識していることを示している。
【0049】
【化12】
【0050】
図1のデータにおいては、[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]の各分子によりそれぞれ最大2.5又は6個のMb分子が切断されたが、これは[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]の作用が触媒的性質を持っていることを示している。反応速度は反応混合物からO2を除去することにより影響を受けなかった。これらの結果をテトラアザリガンドのCu(II)錯体及びCo(III)錯体によるペプチド結合の水解切断についての先の知見(Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 7742: Suh, J.; Moon, S. J. Inorg. Chem. 2001,40, 4890: Sutton, D. A.; Buckingham, D. A. Acc. Chem. Res. 1987,20, 357)と結びつけて考えると、[Cu(II)(I)]及び[Co(III)(I)]によるMb切断が加水分解的性質を有していることが支持される。
【実施例2】
【0051】
実施例1に記載の方法に準じて化合物(II)を合成した。
【0052】
【化13】
【0053】
(II)のCo(III)錯体を実施例1と同じ方法により得た。Mb(12μM)と[Co(III)(II)](12μM)とをpH7.0又はpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベートしたところ、Mbはそれぞれko値1.4×10−2h−1又は6.9×10−3h−1で分解された。実施例2の結果は、(I)のLysは触媒活性を必要としないことを示している。
【実施例3】
【0054】
スキーム4に従って、N2,N6−ビス{[4,7,10−トリス(tert−ブトキシカルボニル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル]アセチル}リジン(4)を合成した。
【0055】
【化14】
【0056】
ブロモ酢酸(3.5g,26mmol)のクロロホルム(100mL)溶液にN,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(5.3g,26mmol)をゆっくり加えた。4a(2g,8.58mmol)のHCl塩をジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(3.0mL,17mmol)を加えてクロロホルム(50mL)に完全に溶解し、この溶液をブロモ酢酸溶液にゆっくり加えた。室温で8時間攪拌した後、N,N'−ジシクロヘキシルウレア(DCU)を濾去し、濾液を濃縮した。残渣をCH3CN(100mL)に再溶解し、溶けないDCUを濾去した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のメチル N2,N6−ビス(ブロモアセチル)リシネート(4b)を得た。Rf:0.7 (EtOAc);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.30 (br s, 1H), 6.71 (br s, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.05 (d, 0.7H), 3.90 (m, 3.4H), 3.86 (s, 3H), 3.30 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.57 (m, 2H), 1.37 (m, 2H).
3a(3.1g,6.5mmol)、Na2CO3(2.2g,19mmol)、及びCH3CN(100mL)の混合物に4b(1.3g,3.2mmol)を加えた。混合物を攪拌し、2日間還流させた。濾過後、溶媒を留去してフラッシュクロマトグラフィーで精製し、無定形固体状のメチル N2,N6−ビス{[4,7,10−トリス(tert−ブトキシカルボニル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル]アセチル}リシネート(4c)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:40);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.06 (br s, 1H), 6.92 (br s, 1H), 4.50 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.13-3.53 (br m, 30H), 2.79-2.63 (br m, 8H), 1.84-1.65 (m, 4H), 1.44-1.47 (m, 54H), 1.36 (m, 2H).
4c(1.7g,1.4mmol)のCH3OH(50mL)溶液にNaOH水溶液(1N,50mL)を加え、反応混合物を1時間攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣を10%クエン酸水溶液に溶解した後、pHを4に調整した。溶液をEtOAc(50mL×2)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮して無定形固体状の4を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 4.14 (m, 1H), 3.17-3.46 (br m, 28H), 3.14 (t, 2H), 2.79-2.70 (br m, 8H), 1.73 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.36 (m, 54H), 1.33-1.20 (m, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 1172.48 (M+H)+(C56H103N10O16としての計算値1172.49).
【0057】
4を使用して実施例1に記載の方法に従って下記化合物(III)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 3191.87 (M+H)+(C127H185N70O28S2としての計算値3190.23).
【0058】
【化15】
【0059】
Cu(II)イオンと(III)との錯体形成、及びMbの分解についての動力学的測定を実施例1と同様にして行った。Mb(7.9μM)と[Cu(II)(III)](6.4μM)とをpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベーションしたところ、Mbはko値:3.3×10−3h−1で分解された。
【0060】
(III)のCo(III)錯体を実施例1と同様にして得た。Mb(7.9μM)を[Co(III)(III)](4.8μM)とpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベーションしたところ、Mbはko値:3.2×10−3h−1で分解された。
【実施例4】
【0061】
スキーム5に従って、N−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシル−N−(2−{[(9H-フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシン(5)を合成した。
【0062】
【化16】
【0063】
N−保護基として、ジ−tert−ブチルジカボネートの代りにベンジルクロロホルメートを使用したことを除いては、3の合成に用いた方法に従って、化合物5a({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン-1−イル}酢酸)を合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34 (m, 15H), 5.15 (m, 6H) 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H). 5a(2g,3.2mmol)のCH3CN(100mL)溶液に、撹拌下、グリシンエチルエステル塩酸塩(0.53g,3.8mmol)及びDIEA(1.4mL,7.9mmol)を加えた。反応混合物にHBTU(1.3g,3.5mmol)を加えて2時間攪拌した。溶液を濃縮し、得られた残渣をEtOAc(100mL)に溶解した。溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5%Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過後、溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、無定形固体状のエチル N−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシネート(5b)を得た。
Rf:0.5 (CH3OH/MC 1:19);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.90 (br s, 2H), 3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H), 1.26-1.22 (m,3H). 5b(2.0g,2.8mmol)のCH3OH(50mL)溶液にNaOH水溶液(1N,50mL)を加え、反応混合物を1時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を10%クエン酸水溶液に溶解した後、pHを4に調整した。溶液をEtOAcで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させた後、濃縮して無定形固体状のN−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシン(5c)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 3.90 (br s, 2H),3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H).
5c(1.5g,2.2mmol)のCH3CN(100mL)溶液に、撹拌下、1b(1.5g,2.4mmol)及びDIEA(1.1mL,4.3mmol)を加えた。反応混合物にHBTU(0.90g,2.4mmol)を加えて混合物を2時間攪拌した。溶液を濃縮し、残渣をEtOAc(100mL)に溶解した。溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5%Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のtert−ブチル N−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシル−N−2−{[(9H-フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(5d)を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:19);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.75 (m, 2H), 7.59 (m, 2H), 7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 2H), 4.22-4.16 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.70-3.32 (br m, 18H), 3.04 (br s, 4H), 1.47 (m, 9H).
5d(1.5g,1.5mmol)のMC(25mL)溶液にTFA(25mL)を加えた。反応混合物を5時間攪拌し、溶媒を留去した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状の5を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.72 (m, 2H), 7.57(m,2H),7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 1H), 4.20-4.18 (m, 2H), 4.06-3.95 (br s, 4H), 3.70 (br s, 2H), 3.40-3.10 (br m, 18H), 2.83-2.78 (br s, 4H); HRMS実測値1013.1403 (M+H)+, C55H62N7O12としての計算値1013.1370.
【0064】
実施例1に記載の方法に従って、5を使用して化合物(IV)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2879.63 (M+H)+(C117H165N68O26S2としての計算値2877.75) 実施例2の結果から(I)のLys残基は、Mbの認識に必須でないことが確認された。従って、(I)のPNA 9−mer部分が認識部位である。アミノ末端の代りにカルボキシル末端に結合したCycとPNA 9−merも同様にMb−切断触媒として有用であるか否かをテストするために化合物(IV)を合成した。
【0065】
【化17】
【0066】
Cu(II)イオンと(IV)との錯体形成、及びMbの分解についての動力学的測定を実施例1と同様にして行った。Mb(7.9μM)と[Cu(II)(IV)](6.4μM)とをpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベーションしたところ、Mbはko値:2.2×10−3h−1で分解された。
【実施例5】
【0067】
スキーム6に従って{4,10−ビス[(ベンジルオキシ)カルボニル]-1-オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−7−イル}酢酸(6)を合成した。
【0068】
【化18】
【0069】
文献(Sasugue, J. M.; Segat-Dioury, F.; Sylvestre, I.; Favre- Reguillon, A.; Foos, J.; Madic, C.; Guy, A. Tetrahedron, 2001,57, 4713)に従って、tert−ブチル N,N−ビス(2−{[(2−ニトロフェニル)スルホニル]アミノ}エチル)グリシネイト(6a)を合成した。6a及び無水Na2CO3(3.0g,29mmol)をDMF(100mL)に懸濁させ、撹拌下、これにブロモエチルエーテル(1mL,7.9mmol)のDMF(100mL)溶液を100℃で滴下した。反応混合物を一晩加熱した後、濃縮した。残渣をEtOAc(100mL)中に加えた。有機層を食塩水(100mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のtert−ブチル{4,10−ビス[(2−ニトロフェニル)スルホニル]−1−オキソ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−7−イル}アセテート(6b)を得た。
Rf:0.3 (EtOAc/ヘキサン 2:1);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01-7.98 (m, 2H), 7.69 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 3.68 (m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.72-3.38 (m, 4H), 3.33 (s, 2H), 3.05 (m, 4H), 1.45 (s, 9H).
6b(1.8g,2.7mmol)及びチオフェノール(0.70mL,6.8mmol)のDMF(30mL)溶液にNa2CO3(2.3g,22mmol)を加えた。反応混合物を一晩攪拌した後、濃縮した。残渣を10%クエン酸水溶液に溶解してpHを3に調整した。水層をEtOAc(100mL×3)で抽出した。1N NaOH水溶液を加えて水層のpHを約13に上げた後、水層をMC(100mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させた後、濃縮した。得られた粗生成物(tert−ブチル 1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−7−イルアセテート(6c))を精製せずに、そのまま次の反応に使用した。6c(0.50g,1.7mmol)のクロロホルム(70mL)溶液にTEA(0.61mL,4.3mmol)を加えた。溶液を攪拌した後、ここにベンジルクロロホルメート(0.43mL,3.9mmol)をゆっくり加えた。反応混合物を3時間攪拌し、5%クエン酸水溶液(50mL×3)で洗浄し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製してオイル状のジベンジル 7−(2−tert−ブトキシ−2−オキソ−エチル)−1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−4,10−ジカボネート(6d)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:15);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.32-7.27 (m, 10H), 5.12 (s, 4H), 3.59-3.33 (br m, 14H), 2.99-2.93 (br m, 4H), 1.45 (s, 9H).
6d(0.50g,1.0mmol)のMC(15mL)溶液にTFA(10mL)を加えた。反応混合物を5時間攪拌した。溶媒を留去した後、残渣を10%クエン酸水溶液に溶解してEtOAc(50mL×3)で抽出した。有機層を食塩水(50mL×3)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮してオイル状の6を得た。
Rf:0.2 (CH3OH/MC 1:10);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34-7.25 (m, 10H), 5.11 (m, 4H), 4.23-4.08 (br m, 4H), 3.84-3.50 (br m, 10H), 3.25-3.15 (br m, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 500.50 (M+H)+(C26H34N3O7に対する計算値500.58).
【0070】
実施例1に記載の方法に従って、6を使用して化合物(V)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2851.49 (M+H)+(C111H152N63O26S2に対する計算値2850.75).
【0071】
【化19】
【0072】
実施例1に記載の方法に従って、(V)のCo(III)錯体を製造した。
pH8.0(50mM HEPES)又は9.0(50mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、温度37℃でMb(7.9μM)を[Co(III)(V)](4.8μM)とインキュベートしたところ、Mbはそれぞれko値:1.5×10−3h−1又は5.3×10−3h−1で分解された。
【実施例6】
【0073】
スキーム7に従って、{4,7−ビス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7−トリアザノナン−1−イル}酢酸(7)を合成した。
【0074】
【化20】
【0075】
文献(Schulz, D.; Weyhermueller, T.; Wieghardt, K.; Nuber, B. Inorg. Chim. Acta 1995,240, 217)に従って、1,4,7−トリアザノナン−1−イル酢酸(7a)を合成した。7a(3.0g,7.4mmol)をNaOH水溶液(1N,50mL)と1,4−ジオキサン(50mL)の混合液に溶解し、この溶液にベンジルクロロホルメート(3.0mL,22mmol)をゆっくり加え、その溶液を3時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を1N HClに溶解した後、pHを3に調整した。その溶液をEtOAcで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥した後、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形の固体状の7を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34 (m, 10H), 5.15 (d, 4H), 3.38 (m, 10H), 2.74 (br s, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 456.06 (M+H)+(C24H30N3O6に対する計算値456.52).
【0076】
実施例1に記載された方法に従って、7を使用して化合物(VI)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2807.51 (M+H)+(C109H148N63O25S2に対する計算値2806.69).
【0077】
【化21】
【0078】
実施例1の記載に準じて、Cu(II)イオンと(VI)の錯体を製造し、Mbの分解に対する動力学的測定を行った。pH8.0(50mM HEPES)、温度37℃でMb(7.9μM)を[Cu(II)(VI)](6.4μM)とインキュベートしたところ、Mbはko値:3.6×10−3h−1で分解された。
【実施例7】
【0079】
スキーム8に従って、シクレンを含むd−ビオチン誘導体の5−[(3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル]−N−[3−(1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル)プロピル]ペンタンアミド(VII)を合成した。
【0080】
【化22】
【0081】
−60℃に冷却したMC(30mL)にオキサリルクロリド(1.4mL,16mmol)、DMSO(0.89mL,13mmol)、8a(2.2g,10mmol)のMC(20mL)溶液、及びTEA(8.7mL,63mmol)を順次滴下した。1時間後、反応混合物を50mMクエン酸で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン=1/1)で精製して無色オイル状のベンジル 3−オキソプロピルカルバメート(8b)を得た。3a(2.3g,4.8mmol)のTHF(20mL)溶液に8b(1.0g,4.8mmol)のTHF(40mL)溶液及びNaBH(OAc)3(1.3g,6.3mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌した。THFを留去し、反応混合物を0.1M Na2CO3(50mL)と混合してEtoAc(50mL×2)で抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン=1/1)で精製してトリ−tert−ブチル 10−(3−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}プロピル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(8c)を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.32 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 3.56-3.16 (br, 14H), 2.58 (br, 6H), 1.66 (m, 6H), 1.44 (m, 27H).
8c(1.0g,1.5mmol)と10%Pd/C(500mg)のEtOAc(100mL)懸濁液を1気圧水素下に24時間攪拌した。触媒をセライト濾過により除き、溶媒を留去して無色オイル状のトリ−tert−ブチル 10−(3−アミノプロピル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(8d)を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 3.56-3.30 (br, 12H), 2.72-2.58 (br, 8H), 1.59 (m, 2H), 1.43 (m, 27H).
d−ビオチン(0.22g,0.89mmol)のDMF(5mL)溶液を0℃に冷却し、ここにHBTU(0.44g,1.2mmol)、8d(0.47g,0.89mmol)のDMF(5mL)溶液、及びDIEA(200μL,1.2mmol)を加えて、混合物を室温で6時間攪拌した。反応混合物をMC(30mL)と混合し、その混合物を50mMクエン酸(30mL×2)及び食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH3OH/MC=1/9)で精製してトリ−tert−ブチル 10−[3−({5−[(3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル]ペンタノイル}アミノ)プロピル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(8e)を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.52 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 4.50 (q, 1H), 4.31 (t, 1H), 3.53-3.33 (br, 12H), 3.19 (m, 3H), 2.90 (m, 2H), 2.60 (br, 6H), 2.25 (t, 2H), 1.70 (m, 6H), 1.44 (d, 27H).
TFAの10%MC溶液に8e(0.51g,0.67mmol)を加え、反応混合物を3時間攪拌した。反応混合物にエチルエーテルを注入した。白色沈澱物を集めてCH3OH−ジエチルエーテル混合液に溶解した。HCl溶液を滴下すると(VII)のHCl塩が生成した。この塩をCH3OH−ジエチルエーテルで再結晶した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 4.57 (t, 1H), 3.85 (q, 1H), 3.30-2.94 (br, 20H), 2.74 (br, 3H), 2.23 (t, 2H), 1.76-1.55 (m, 6H), 1.38 (m, 2H); MS (MALDI-TOF) m/z 456.56 (M+H)+(C21H42N7O2Sに対する計算値456.68).
【0082】
Cu(II)をCyc部位に結合させると、(VII)のCu(II)錯体である[Cu(II)(VII)]が形成されることは、Cu(II)イオンを(VII)に添加するに伴って生じるUVスペクトルの変化を測定することにより確認した。アビジンに対するビオチンの強い親和力を考え、[Cu(II)(VII)]をアビジンに対する蛋白質−切断剤としてテストした。アビジンと[Cu(II)(VII)]との錯体形成をアビジンの存在下又は不在下における[Cu(II)(VII)]のゲル濾過クロマトグラフィーで分析して確認した。pH6(50mM MES)、温度50℃で7日間アルゴン雰囲気中でアビジン(2.5×10−5M)を[Cu(II)(VII)](2.5×10−5M)とインキュベートして得られた反応混合物を尿素−SDS−PAGE電気泳動で分析した結果、約50%のアビジンが分解され、より小さなフラグメントを造ることが確認された。同生成物をMALDI−TOF MSで分析した結果、アビジン(M.W.15630)は、分子量10759及び4922の2つの蛋白質に切断されることが確認された。アビジンのアミノ酸配列とアビジン−ビオチン錯体の3次元X線結晶構造を調べたところ、切断部位はThr35−Ala36で、分子量10726及び4922のフラグメントが生成することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0083】
以上の説明のように、本発明者らによって創出された合成触媒は標的蛋白質に対する親和力を持つ認識部位とペプチド結合切断活性を持つ反応部位とから構成され、標的蛋白質を選択的に認識する能力とペプチド結合を速かに切断する能力とを同時に保有することが出来る。従って、このような合成触媒を使用すれば種々の蛋白質が混合されている状況でも標的蛋白質だけを選択的に切断することによってその蛋白質の生理活性を抑制することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1】[Cu(II)(I)](a)又は[Co(III)(I)](b)によるMbの時間−依存的な分解を示すグラフである。(実施例1)
【図2】Mb[Co(III)(I)]の分解における、Coに対するkoの依存性を示すグラフである。(実施例1)
【図3】Mb[Co(III)(I)]の分解における、kpcのpH分布を示す。(実施例1)
【図4】Mbを[Co(III)(I)]とインキュベーションすることによって得られる反応生成物のMALDI−TOF MSスペクトルである。(実施例1)
【0001】
本発明は蛋白質の混合物中から特定蛋白質のみを選択的に認識して切断出来る合成触媒及びこれを利用して特定蛋白質を選択的に切断する方法に関するものである。特定蛋白質を選択的に切断することによって蛋白質の生理活性を選択的に抑制することが可能である。
【背景技術】
【0002】
蛋白質は生体内で様々な生理的な機能を担っている。特に、酵素と受容体は疾患に係わる機能を担当する場合が多いため、酵素と受容体の機能を抑制する分子は医薬品として使われることがある。酵素の場合には、阻害剤が酵素の活性部位を可逆的に封鎖して酵素機能を抑制し、受容体の場合は、拮抗剤が可逆的に結合することにより受容体の機能を低下させる(非特許文献1)。自殺阻害剤は、酵素の活性部位に共有結合により結合して酵素の活性を阻害する。狂牛病に対するプリオンやアルツハイマー病に対するアミロイドで例示されるように、多くの毒性蛋白質は深刻な健康上の問題を誘発させる。毒性蛋白質に対し、その蛋白質の骨格を特異的に切断出来る合成分子は効果的な医薬として使われ得るが、このような分子については未だ報告された例がない。
【0003】
このような阻害剤又は拮抗剤を酵素又は受容体に加える時、活性を持った蛋白質の濃度が減少する程度を簡単な数式で表すと以下の通りである。
【0004】
【化2】
【0005】
(式中、Pは活性を持った蛋白質を示し、Lは阻害剤又は拮抗剤を示す。)
前記式(1)は単純な阻害剤又は拮抗剤に関するものであり、式(2)は自殺阻害剤に関するものである。
【0006】
活性を持った蛋白質の濃度([P])が全体蛋白質の濃度([P]o)の半分になるLの全体濃度([L]+[PL]+[PL’])をL50と表現すれば、L50は式(1)の場合には(KL+0.5[P]o)となる。即ち、一般的な阻害剤や拮抗剤の場合には、KLが小さいほどL50は小さくなるものの、0.5[P]oより小さくはならない。式(2)の場合には、L50は0.5[P]oであるが、KLが小さいほど、又はKsiが大きいほどLの濃度を半分の水準に減少させるのにかかる時間が短くなる。L50が小さいほど阻害剤や拮抗剤を医薬品として使用するには効果的である。しかしながら、いくら優れた阻害剤や拮抗剤であっても、当量より多い量の蛋白質の生理活性を阻害することは出来ない。
【0007】
ある種の金属錯体は蛋白質を切断する能力を有していることが知られている。例えば、Cu(II)とシクレン(cyclen)、Cu(II)と1,4,7−トリアザノナン、Cu(II)とトレン(tren)、Pd(II)とエチレンジアミン、Fe(III)又はCo(III)と配位高分子二重膜(coordinatively polymerized bilayer membranes)間に形成された錯体が蛋白質のペプチド結合を加水分解する能力を有していると報告されている(非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6及び非特許文献7)。また、コバルト(III)に配位されたアミドがコバルト(III)イオンによって加水分解されることも知られている(非特許文献8)。しかしながら、金属の錯体が特定蛋白質を選択的に攻撃して切断した例は今まで報告された例がない。
【0008】
【非特許文献1】
Medicinal Chemistry, 2nd Ed., Ganellin, C. R.; Roberts, S. M. Ed.; Academic Press: London, 1993
【非特許文献2】
Zhu, L.; Qin, L.; Parac, T. N.; Kostic, N. M. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5218
【非特許文献3】
Hegg, E. L.; Burstyn, J. N. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7015
【非特許文献4】
Suh, J.; Oh, S. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1067
【非特許文献5】
Jang, B.-B.; Lee, K. P.; Min, D. H.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12008
【非特許文献6】
Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 7742
【非特許文献7】
Suh, J.; Moon, S.-J. Inorg. Chem. 2001, 40, 4890
【非特許文献8】
Sutton, D. A.; Buckingham, D. A. Acc. Chem. Res. 1987, 20, 357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、標的蛋白質に選択的に結合して切断出来る合成触媒を提供することにある。また、本発明の他の目的は、該合成触媒を用いて標的蛋白質を選択的に切断する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前述のように、阻害剤や拮抗剤はどんなに性能が素晴らしくても当量より多い量の標的蛋白質の生理活性を阻害することは出来ない。また、毒性蛋白質を特異的に切断する合成触媒は知られていない。従って、本発明者らは阻害剤又は拮抗剤として作用する医薬品が有する、このような基本的な限界を克服し、毒性蛋白質を特異的に切断する合成触媒を創出するために鋭意研究を行った結果、下記一般式(A)
(R)(Z)n (A)
(式中、nは1以上の整数を示し、Rは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質、例えば、酵素の阻害剤や受容体の拮抗剤を示し、Zは金属イオン−リガンド錯体を示す。)
で表される合成触媒を創出することに成功した。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
本発明に係る一般式(A)で表される合成触媒について、以下に詳細に説明する。
本発明の合成触媒は標的蛋白質を認識する部位である、基Rを持っており、この部位は標的蛋白質と選択的に結合して錯体を形成することが出来る。このように認識部位と標的蛋白質との間に結合が形成された後、金属イオン−リガンド錯体で構成された反応部位(Z)が標的蛋白質のペプチド結合を切断することになる。切断された蛋白質は新しい高次構造に迅速に変わり、触媒を結合する能力が低くなり、これに伴って触媒は切断された蛋白質から分離され再生されることによって、他の標的蛋白質の切断に再び使用することが出来る。従って、標的蛋白質と合成触媒が結合する能力が強くなくても、時間を充分にかければ相当量の標的蛋白質が切断され、蛋白質の活性を充分に抑制することが出来る。
【0012】
本発明に係る合成触媒が蛋白質の活性を阻害する機序はミカエリス・メンテンの式に類似の下記式(4)により簡単に表すことが出来る。
【0013】
【化3】
【0014】
(式中、Pは前記と同義であり、Cは本発明に係る一般式(A)の合成触媒を示し、P’は切断された新しい蛋白質を示し、Kcはミカエリス定数に対応する定数である。)
【0015】
前記式(4)から分かるように、合成触媒(C)は活性蛋白質(P)と結合して錯体(PC)を形成した後、蛋白質を切断して新しい蛋白質(P’)を生成すると同時に自らを再生させる。この場合、標的蛋白質(P)の半分を切断し、その生理活性を抑制するのに必要な触媒の量に何らの制限はない。標的蛋白質の活性を一定水準まで阻害するのに必要とする時間を長くするほど少量の触媒を使用することが出来る。合成触媒が標的蛋白質と錯体(PC)を強く形成するほどKcは小さくなり、Kcが小さくなるかkpcが大きくなるほど蛋白質切断速度は速くなる。
【0016】
本発明に係る合成触媒の認識部位Rとしては、使用する標的蛋白質を選択的に認識し、結合出来る全ての物質が使用可能である。標的蛋白質についての過去に蓄積されたデータから既存の構造を選択しても良いし、新しい構造をデザインすることも出来る。
【0017】
例えば、蛋白質が酵素である場合、その酵素の活性を阻害する公知の阻害剤を使用することが出来、蛋白質が受容体である場合、その受容体に結合する公知の拮抗剤を使用することが出来る。即ち、阻害剤或いは拮抗剤に対する情報が知られている標的蛋白質の場合、既存の阻害剤或いは拮抗剤を認識部位として活用して蛋白質切断合成触媒をオーダーメードで合成することが出来る。しかしながら、本発明に係る合成触媒が結合する標的蛋白質上の位置は公知の阻害剤や拮抗剤が結合する標的蛋白質上の位置と異なっても構わない。阻害剤や拮抗剤は標的蛋白質の活性に必須な部位に結合するのに対し、本発明に係る合成触媒は活性部位以外の位置であっても標的蛋白質を特異的に認識して結合した後、結合部位周辺に位置したペプチド結合を切断しさえすれば、所期の目的を達成出来るからである。従って、公知の阻害剤や拮抗剤と関連のない新しい構造を認識部位として使用することも出来る。また、拮抗剤や阻害剤が知られていない標的蛋白質の場合には本発明に係る合成触媒を使用してスクリーニングすることによって新しい認識部位を探索することが出来る。
【0018】
どの蛋白質が標的蛋白質になるかによって、またその標的蛋白質に対して公知の多くの阻害剤又は拮抗剤中からどれを選択するかによって、又は認識部位を新たに設計するかしないかによって、本発明に係る合成触媒の認識部位Rは限りなく変化させることが出来る。かくして、この認識部位を構造的に特定することは不可能である。
【0019】
前記一般式(A)の構造で反応部位Zに該当する触媒中心はCu(II)のシクレン(cyclen)錯体のような金属錯体である。使用可能な金属錯体は、認識部位に結合しない状態では蛋白質を切断出来ないか、切断効果が僅かに確認できる程度である。この金属錯体を蛋白質認識部位に結合させて合成した分子、即ち、合成触媒は標的蛋白質と複合体を形成する。標的蛋白質と合成触媒の複合体における、金属錯体と標的蛋白質の切断部位との間の有効濃度が十分に高くなることにより、標的蛋白質のペプチド結合の效果的な切断が可能となる。
【0020】
本発明者らはこのような合成触媒を使用して標的蛋白質を選択的に切断することによって、生理活性を抑制しようとする目的を達成するに当たって、金属イオン−リガンド錯体を構成する金属イオン及びリガンドの種類が特定のものに限定されることが非常に重要であることを見出した。
【0021】
蛋白質を切断する能力を持った多数の金属錯体が知られている。この中で、本発明に係る金属イオン-リガンド錯体の構成要素に適した金属イオンとしては、Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)、Pd(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(III)、Rh(III)、Ir(III)、Ru(III)、Pt(IV)、Zr(IV)、及びHf(IV)からなる群より選ばれた1種以上、好ましくはCu(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(III)、Rh(III)、Ir(III)、及びRu(III)からなる群より選ばれた1種以上が挙げられ、キレート形成リガンドの骨格としては下記分子構造の群から選ばれた1種以上が挙げられる。
【0022】
【化4】
【0023】
前記構造式から分かるように、本発明に係るキレート形成リガンドは環状又は非環状であり、リガンド内に含まれる金属配位原子中1〜4個は、窒素原子であるという特徴を持っている。これらの窒素原子は芳香族の窒素原子であっても非芳香族の窒素原子であってもどちらでも良い。
【0024】
本発明に係る一般式(A)の構造において、R及びZは、RとZとの間を直接連結する主鎖及び主鎖に任意に結合した側鎖を含むリンカーにより連結されている。認識部位Rが標的蛋白質に結合すれば、反応部位Zは標的蛋白質内のペプチド結合中の一つ以上を切断することになる。蛋白質上の切断部位と反応部位Zとの間の有効濃度を増加させれば、反応部位Zの反応性を向上させることが出来る。この有効濃度を調節する効果的な方法は合成触媒中に含まれる認識部位(R)と反応部位(Z)との間の相対的な位置を調節することである。相対的な位置調節のために利用されるものが、リンカーの長さと形状である。
【0025】
リンカーは主鎖を含むべきである。主鎖の骨格は1〜30個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び/又は硫黄原子から構成され、これらの原子はアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び/又はチオエーテル基のような官能基や、アミド、イミド、エステル及び/又はチオエステルのような誘導体に属する。リンカーは側鎖を含むことが出来、これらはそれぞれ、アルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び/又はチオエーテル基のような官能基や、酸、アミド、イミド、エステル及び/又はチオエステルのような誘導体に属する1〜30個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び/又は硫黄原子から構成される骨格を有する。
上記で説明したような定義に基づいて、様々な標的蛋白質及び合成触媒に対する切断部位及び反応部位間の有効濃度を調節するのに好適なリンカーの構造を設計することが出来る。
【0026】
本発明に係る合成触媒で反応部位(Z)は認識部位(R)1個当り1個以上の割合で結合出来る。反応部位は相互に同じであるか、或いは互いに異なる。認識部位1個当り1〜3個の反応部位を結合させる場合、典型的な結合形態を例示すると、以下の通りである。別のやり方で認識部位内部に反応部位を挿入することも可能である。
【0027】
【化5】
【0028】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、これらによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。実施例ではミオグロビン(Mb)とアビジンが標的蛋白質として用いられている。Mbの場合、触媒は新しく用意した組合せライブラリーを用いて見出された認識部位を備えたものである。他方、アビジンの場合は、ビオチンがアビジンに強く結合することが知られているので、ビオチンを触媒の認識部位として使用した。実施例では反応性金属中心のキレート形成リガンドとして種々の有機化合物らが試みられた。実施例では合成触媒を標的蛋白質のそれよりも多いモル量、又は少ないモル量で添加した。
【実施例1】
【0029】
蛋白質−切断触媒の結合部位を調べるために、ペプチド核酸(PNA)類縁体を含むシクレン(Cyc)誘導体の組合せライブラリー(CycAc(Q)nLysNH2:QはPNAモノマーA'、 G、 T'、 又はCを示す)を作製した。PNA類縁体はDNAの核酸塩基と塩基対をなすために使用し得る核酸塩基類縁体(NB(A')、NB(G)、NB(T')、NB(C))を含んでいる。NB(A')及びNB(T')はそれぞれNB(T)及びNB(A)を認識するが、相互間での認識は出来ない(Lohse, J.; Dahl, O.; Nielson, P. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999,96, 10804)。それ故、ライブラリーに存在するPNA混合物間の塩基対の結合はPNAsの成分としてA及びTの代りにA'及びT'を使用することによって抑制され得る。
【0030】
【化6】
【0031】
A'のFmoc誘導体(N−[(2−アミノ−6−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}−9H-プリン−9−イル)アセチル]−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシン(1))を下記スキーム1に従って合成した。
【0032】
【化7】
【0033】
DMF(100mL)中に(2−アミノ−6−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}−9H−プリン−9−イル)酢酸(1a)(2.0g,5.8mmol)(Haaima, G.; Hansen, H.; Christensen, L.; Dahl, O.; Nielsen, P. Nucleic Acid Res. 1997,25, 4639)を加えて攪拌し、これにtert−ブチル N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(1b)のHCl塩(2.8g,6.4mmol) (Thomson, S.; Josey, J.; Cadilla, R.; Gaul, M.; Hassman, C.; Luzzio, M.; Pipe, A.; Reed, K.; Ricca, D.; Wiethe, R.; Noble, S.; Tetrahedron 1995,51, 6179)とトリエチルアミン(TEA)(1.6mL,12mmol)を加えた。反応混合物にO−ベンゾトリアゾル−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HBTU)(2.4g,6.4mmol)を加え、混合物を3時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を塩化メチレン(MC)(100mL)に溶解した。MC溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5%Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のtert−ブチル N−[(2−アミノ−6−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}−9H−プリン−9−イル)アセチル]−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(1c)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:20);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (s, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.37-7.25 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05 及び 4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H), 4.00及び3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37(m, 2H), 3.15(s, 1H), 1.38(m, 9H).
1c(1.5g,2.1mmol)のMC(25mL)溶液にトリフルオロ酢酸(TFA)(25mL)を加えて、反応混合物を5時間攪拌した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状の1を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.1 (s, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.45-7.29 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05及び4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H) 4.00及び3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.15 (s, 1H); HRMS実測値(exact mass)665.6874 (M+H)+, C34H33N8O7としての計算値(calcd)665.6854.
【0034】
T'(N−{[2−(ベンジルチオ)−4−オキソピリミジン−1(4H)−イル]アセチル}−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシン(2))のFmoc誘導体を下記スキーム2に従って合成した。
【0035】
【化8】
【0036】
[2−(ベンジルチオ)−4−オキソピリミジン−1(4H)−イル]酢酸(2a)を、メトキシベンジル基の代りにベンジル基をS−保護基として使用したことを除いては文献(Lohse, J.; Dahl, O.; Nilesen, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 11804)に記載された方法に従って合成した。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.54 (br s 1H), 7.69 (d, 1H), 7.42 (d, 2H), 7.38-7.25 (m, 3H), 5.91 (d, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.56 (s, 2H).
2a(3.6g,5.8mmol)のDMF(100mL)溶液に攪拌下、1b(6.2g,6.4mmol)及びTEA(3.6mL,12mmol)を加えた。反応混合物にHBTU(5.4g,6.4mmol)を加えて混合物を3時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣をMC(100mL)に溶解した。溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5% Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のtert−ブチル N−{[2−(ベンジルチオ)−4−オキソピリミジン−1(4H)−イル]アセチル}−N−(2−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(2b)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:20);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.47-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.35 (d, 2H), 4.27 (d, 2H), 4.18-4.16 (m, 2H), 4.14 (s, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.30 (m, 1H), 3.28 (m, 1H), 1.38 (m, 9H).
2b(3.0g,4.6mmol)のMC(25mL)溶液にTFA(25mL)を加えて、反応混合物を5時間攪拌した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状の2を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.39-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.23-4.16 (m, 3H), 4.14 (s, 1H), 3.39-3.35 (m, 2H), 3.32 (m, 1H), 3.15 (m, 1H); HRMS実測値599.6873 (M+H)+, C32H32N4O6Sとしての計算値599.6875.
[4,7,10−トリス(tert−ブトキシカルボニル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル]酢酸(3)を下記スキーム3に従って合成した。
【0037】
【化9】
【0038】
トリ−tert−ブチル 1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(3a)(10g,21mmol)(Kimura, E.; Aoki, S.; Koike, T.; Shiro, M. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 3068)、Na2CO3(2.5g,23mmol)、及びCH3CN(200mL)の混合物にエチルブロモアセテート(3.2mL,23mmol)を加えた。不均一な混合物を一晩還流させた。濾過後、溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のトリ−tert−ブチル 10−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(3b)を得た。
Rf:0.5(酢酸エチル(EtOAc)/ヘキサン1:1);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.16 (q, 2H), 3.55-3.32 (br, 14H), 2.94 (br s, 4H), 1.45 (m, 27H), 1.32 (t, 3H).
3b(10g,18mmol)のCH3OH(100mL)溶液にNaOH水溶液(1N,100mL)を加え、反応混合物を2時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を10%クエン酸水溶液に溶解させた後、pHを5に調整した。溶液をEtOAc(100mL×2)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥した後、蒸発させて無定形固体状の3を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H), 1.43 (m, 27H); MS (MALDI-TOF) m/z 531.75 (M+H)+(C25H47N4O8としての計算値531.67).
【0039】
fmoc基で保護されたPNAモノマーG及びCをApplied Biosystems社から購入し、fmoc基で保護されたL−リジンをNova Biochem社から購入した。
組合せライブラリー用のPNA(CycAc(Q)nLysNH2)を、A'、T'、G、C、及びL−リジンのfmoc誘導体とカルボン酸3から、Expedite Model 8909 Nucleic Acid Synthesis Systemを用いた自動合成装置により合成した。ライブラリーの合成において、A'、T'、G、及びCのfmoc誘導体は重合体支持体に結合して長さが増加しているPNA鎖に対して同等の反応性を有してカップリングするものと推定された。PNAの純度をVoyager−DETM STR Biospectrometry Workstation modelを使用したMALDI−TOF MS分析により確認した。CycAc(Q)nLysNH2ライブラリー(全体濃度:約7×10−5M)をCuCl2水溶液(3.5×10−4M)と混合すると、Cu(II)がCyc部位に結合したCu(II)CycAc(Q)nLysNH2ライブラリーを生成した。蛋白質(約1×10−5M)溶液をこの混合物に加えて蛋白質の切断を試験した。37℃、pH7.0(50mM 4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES))の条件で各分子当たり最大8個のPNAモノマーを含有するCu(II)Cycライブラリーで試験したところ、電気泳動(SDS−PAGE)で測定した結果では、牛血清アルブミン、γ−グロブリン、延長因子P、ゼラチンA、ゼラチンB、及びウマ心臓Mbのような蛋白質が切断されていることを示す証拠は確認出来なかった。分子当たり9個のPNAモノマーを含有するCu(II)Cycライブラリーは、Mbの切断に対する明白な活性を示した。本発明者らはCu(II)Cycの側に位置した既知のPNAモノマーを使用して4グループのライブラリーを合成しており、Mb切断に対する活性を試験して最上のターミナルモノマーを見出した。残りのモノマーに対しても検索を繰り返した結果、下記構造式(I)のCu(II)錯体(MS (MALDI-TOF) m/z 2851.49 (M+H)+(C111H153N64O25S2としての計算値2850.58)が最良の触媒として選択された。
【0040】
【化10】
【0041】
緩衝液(1mM 2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、pH6.0)に(I)(1.2当量)を溶解し、これにCuCl2の水溶液を加えて(I)のCu(II)錯体のストック溶液を調製した。[Cu(II)(I)]でMbを分解した後、電気泳動(SDA−PAGE)を行った。その結果を図1に示した。ここで、反応は、pH7.5(50mM HEPES)、[Mb]o(Mbの初期濃度)が7.9μM、[Cu(II)(I)]o([Cu(II)(I)]の初期濃度)が2.0μMの条件で行われた。170時間の間に[Cu(II)(I)]1分子当たりMb2.5分子が切断された。[Mb]の時間−依存的な減少を擬一次動力学的方程式に適用した結果、擬一次反応速度定数(ko)が5.7×10−3h−1であることが示された。図1の曲線はそのデータを擬一次動力学的方程式に適用して得られたものである。反応混合物から酸素を除去することはkoに特別な影響を与えなかった。前記実験と同じ条件で[Cu(II)(I)]の代りに[Cu(II)Cyc]でMbを処理すると、Mbが切断されないことが観察された。
【0042】
文献(Castillo-Blum, S. E.; Sosa-Torres, M. E. Polyhedron, 1995,14, 223)に報告された一般的な方法によって、Co(III)イオンを(I)のCyc部位に導入して、(I)のCo(III)錯体を製造した。[Co(III)(I)]として:MS (MALDI-TOF) m/z 2908.44 (M+H)+(C111H153N64O25S2Coとしての計算値2908.51).
【0043】
また、[Co(III)(I)]によってMbを分解した後、電気泳動(SDS−PAGE)を行った。その結果が図1に示されている。ここで、反応はpH7.5(50mM HEPES)、[Mb]oが4.7μM、[Co(III)(I)]oが0.47μMの条件で行った。100時間の間に[Co(III)(I)]1分子当たりMb6.0分子が切断された。[Mb]の時間−依存的な減少を擬一次動力学的方程式に適用した結果、koは9.4×10−3h−1であった。反応混合物から酸素を除去することはko値に特別な影響を与えなかった。前記実験と同じ条件で[Co(III)(I)]の代りに[Co(III)Cyc]でMbを処理すると、Mbが切断されないことが観察された。
【0044】
前記(I)の構造はCu(II)錯体を使用して検索したが、詳細な動力学的分析はより高い触媒活性を有する[Co(III)]錯体を使用して行った。pH7.5でCo(触媒の初期濃度)に対するkoの依存性を図2に示した。ここで、[Mb]oは4.7μMに固定させた。図2に示された2つの直線はCo=[Mb]oで交差している。図2の動力学的データはCo≧[Mb]oであり、従ってKc<<5μMの時、Mbが[Co(III)(I)]と完全に結合していることを示している。また、[Mb]oより大きいCoを使用して測定したkoはkpcに該当する。ここでKcとkpcは式(4)に定義されている。このようにして測定した種々のpHでのkpc値を図3に示す。式(5)のスキームによるベルシェープ型のpH分布を分析した結果、pKa1=5.50±0.42及びpKa2=8.68±0.46の値を得た。図3の曲線はこれらのpK値に基づいて図示されたのである。もしも、Mb又は(I)のイオン化が無視出来るならば、これらのpKa値はMbと錯体を形成した[Co(III)(I)]におけるCo(III)イオンのアコリガンドのイオン化と考えられる。
【0045】
【化11】
【0046】
Mb(12μM)と[Co(III)(I)](3.5μM)とをpH6.0で、37℃で、85時間インキュベートして得られた反応混合物のMALDI−TOF MSによれば、図4に示すように、Mbは2対の蛋白質(一方の対の分子量:7074及び9892、他方の対の分子量:8045及び8909)に分けられる。図4で、m/z値16953及び16953/2のピークは、Mb(分子量:16953)に起因するものである。[Co(III)(I)]による蛋白質切断の可能な部位はそれぞれの2対に対して、Leu89−Ala90(分子量:7077及び9894の断片を生成)及びLeu72−Gly73(分子量:8057及び8914の断片を生成)である。現時点では2個の切断部位が触媒の異なる結合様式を含んでいるか否かは明白ではない。2個の切断部位がMbと触媒との間に形成された同じ錯体に起因する可能性もある。
【0047】
牛血清アルブミン、γ−グロブリン、延長因子P、ゼラチンA、及びゼラチンBのような他の蛋白質を[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]とインキュベーションした場合には、蛋白質切断は観察されなかった。このことは[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]がMbに対して特異的であることを示している。
【0048】
構造式(Ia)で示される如く、CycAcユニットに隣接したPNA残基がA'の代りにCである[Co(III)(I)]の類縁体を合成した。[Co(III)(Ia)]はMbの切断に対する触媒活性を示さなかったが、これはMbが[Co(III)(I)]だけを特異的に認識していることを示している。
【0049】
【化12】
【0050】
図1のデータにおいては、[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]の各分子によりそれぞれ最大2.5又は6個のMb分子が切断されたが、これは[Cu(II)(I)]又は[Co(III)(I)]の作用が触媒的性質を持っていることを示している。反応速度は反応混合物からO2を除去することにより影響を受けなかった。これらの結果をテトラアザリガンドのCu(II)錯体及びCo(III)錯体によるペプチド結合の水解切断についての先の知見(Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 7742: Suh, J.; Moon, S. J. Inorg. Chem. 2001,40, 4890: Sutton, D. A.; Buckingham, D. A. Acc. Chem. Res. 1987,20, 357)と結びつけて考えると、[Cu(II)(I)]及び[Co(III)(I)]によるMb切断が加水分解的性質を有していることが支持される。
【実施例2】
【0051】
実施例1に記載の方法に準じて化合物(II)を合成した。
【0052】
【化13】
【0053】
(II)のCo(III)錯体を実施例1と同じ方法により得た。Mb(12μM)と[Co(III)(II)](12μM)とをpH7.0又はpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベートしたところ、Mbはそれぞれko値1.4×10−2h−1又は6.9×10−3h−1で分解された。実施例2の結果は、(I)のLysは触媒活性を必要としないことを示している。
【実施例3】
【0054】
スキーム4に従って、N2,N6−ビス{[4,7,10−トリス(tert−ブトキシカルボニル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル]アセチル}リジン(4)を合成した。
【0055】
【化14】
【0056】
ブロモ酢酸(3.5g,26mmol)のクロロホルム(100mL)溶液にN,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(5.3g,26mmol)をゆっくり加えた。4a(2g,8.58mmol)のHCl塩をジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(3.0mL,17mmol)を加えてクロロホルム(50mL)に完全に溶解し、この溶液をブロモ酢酸溶液にゆっくり加えた。室温で8時間攪拌した後、N,N'−ジシクロヘキシルウレア(DCU)を濾去し、濾液を濃縮した。残渣をCH3CN(100mL)に再溶解し、溶けないDCUを濾去した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のメチル N2,N6−ビス(ブロモアセチル)リシネート(4b)を得た。Rf:0.7 (EtOAc);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.30 (br s, 1H), 6.71 (br s, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.05 (d, 0.7H), 3.90 (m, 3.4H), 3.86 (s, 3H), 3.30 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.57 (m, 2H), 1.37 (m, 2H).
3a(3.1g,6.5mmol)、Na2CO3(2.2g,19mmol)、及びCH3CN(100mL)の混合物に4b(1.3g,3.2mmol)を加えた。混合物を攪拌し、2日間還流させた。濾過後、溶媒を留去してフラッシュクロマトグラフィーで精製し、無定形固体状のメチル N2,N6−ビス{[4,7,10−トリス(tert−ブトキシカルボニル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル]アセチル}リシネート(4c)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:40);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.06 (br s, 1H), 6.92 (br s, 1H), 4.50 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.13-3.53 (br m, 30H), 2.79-2.63 (br m, 8H), 1.84-1.65 (m, 4H), 1.44-1.47 (m, 54H), 1.36 (m, 2H).
4c(1.7g,1.4mmol)のCH3OH(50mL)溶液にNaOH水溶液(1N,50mL)を加え、反応混合物を1時間攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣を10%クエン酸水溶液に溶解した後、pHを4に調整した。溶液をEtOAc(50mL×2)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮して無定形固体状の4を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 4.14 (m, 1H), 3.17-3.46 (br m, 28H), 3.14 (t, 2H), 2.79-2.70 (br m, 8H), 1.73 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.36 (m, 54H), 1.33-1.20 (m, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 1172.48 (M+H)+(C56H103N10O16としての計算値1172.49).
【0057】
4を使用して実施例1に記載の方法に従って下記化合物(III)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 3191.87 (M+H)+(C127H185N70O28S2としての計算値3190.23).
【0058】
【化15】
【0059】
Cu(II)イオンと(III)との錯体形成、及びMbの分解についての動力学的測定を実施例1と同様にして行った。Mb(7.9μM)と[Cu(II)(III)](6.4μM)とをpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベーションしたところ、Mbはko値:3.3×10−3h−1で分解された。
【0060】
(III)のCo(III)錯体を実施例1と同様にして得た。Mb(7.9μM)を[Co(III)(III)](4.8μM)とpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベーションしたところ、Mbはko値:3.2×10−3h−1で分解された。
【実施例4】
【0061】
スキーム5に従って、N−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシル−N−(2−{[(9H-フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシン(5)を合成した。
【0062】
【化16】
【0063】
N−保護基として、ジ−tert−ブチルジカボネートの代りにベンジルクロロホルメートを使用したことを除いては、3の合成に用いた方法に従って、化合物5a({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン-1−イル}酢酸)を合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34 (m, 15H), 5.15 (m, 6H) 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H). 5a(2g,3.2mmol)のCH3CN(100mL)溶液に、撹拌下、グリシンエチルエステル塩酸塩(0.53g,3.8mmol)及びDIEA(1.4mL,7.9mmol)を加えた。反応混合物にHBTU(1.3g,3.5mmol)を加えて2時間攪拌した。溶液を濃縮し、得られた残渣をEtOAc(100mL)に溶解した。溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5%Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過後、溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、無定形固体状のエチル N−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシネート(5b)を得た。
Rf:0.5 (CH3OH/MC 1:19);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.90 (br s, 2H), 3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H), 1.26-1.22 (m,3H). 5b(2.0g,2.8mmol)のCH3OH(50mL)溶液にNaOH水溶液(1N,50mL)を加え、反応混合物を1時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を10%クエン酸水溶液に溶解した後、pHを4に調整した。溶液をEtOAcで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させた後、濃縮して無定形固体状のN−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシン(5c)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 3.90 (br s, 2H),3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H).
5c(1.5g,2.2mmol)のCH3CN(100mL)溶液に、撹拌下、1b(1.5g,2.4mmol)及びDIEA(1.1mL,4.3mmol)を加えた。反応混合物にHBTU(0.90g,2.4mmol)を加えて混合物を2時間攪拌した。溶液を濃縮し、残渣をEtOAc(100mL)に溶解した。溶液を5%クエン酸水溶液(50mL×2)、5%Na2CO3水溶液(50mL×2)、及び食塩水(50mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のtert−ブチル N−({4,7,10−トリス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル}アセチル)グリシル−N−2−{[(9H-フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)グリシネイト(5d)を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:19);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.75 (m, 2H), 7.59 (m, 2H), 7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 2H), 4.22-4.16 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.70-3.32 (br m, 18H), 3.04 (br s, 4H), 1.47 (m, 9H).
5d(1.5g,1.5mmol)のMC(25mL)溶液にTFA(25mL)を加えた。反応混合物を5時間攪拌し、溶媒を留去した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状の5を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.72 (m, 2H), 7.57(m,2H),7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 1H), 4.20-4.18 (m, 2H), 4.06-3.95 (br s, 4H), 3.70 (br s, 2H), 3.40-3.10 (br m, 18H), 2.83-2.78 (br s, 4H); HRMS実測値1013.1403 (M+H)+, C55H62N7O12としての計算値1013.1370.
【0064】
実施例1に記載の方法に従って、5を使用して化合物(IV)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2879.63 (M+H)+(C117H165N68O26S2としての計算値2877.75) 実施例2の結果から(I)のLys残基は、Mbの認識に必須でないことが確認された。従って、(I)のPNA 9−mer部分が認識部位である。アミノ末端の代りにカルボキシル末端に結合したCycとPNA 9−merも同様にMb−切断触媒として有用であるか否かをテストするために化合物(IV)を合成した。
【0065】
【化17】
【0066】
Cu(II)イオンと(IV)との錯体形成、及びMbの分解についての動力学的測定を実施例1と同様にして行った。Mb(7.9μM)と[Cu(II)(IV)](6.4μM)とをpH8.0(50mM HEPES)で、37℃でインキュベーションしたところ、Mbはko値:2.2×10−3h−1で分解された。
【実施例5】
【0067】
スキーム6に従って{4,10−ビス[(ベンジルオキシ)カルボニル]-1-オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−7−イル}酢酸(6)を合成した。
【0068】
【化18】
【0069】
文献(Sasugue, J. M.; Segat-Dioury, F.; Sylvestre, I.; Favre- Reguillon, A.; Foos, J.; Madic, C.; Guy, A. Tetrahedron, 2001,57, 4713)に従って、tert−ブチル N,N−ビス(2−{[(2−ニトロフェニル)スルホニル]アミノ}エチル)グリシネイト(6a)を合成した。6a及び無水Na2CO3(3.0g,29mmol)をDMF(100mL)に懸濁させ、撹拌下、これにブロモエチルエーテル(1mL,7.9mmol)のDMF(100mL)溶液を100℃で滴下した。反応混合物を一晩加熱した後、濃縮した。残渣をEtOAc(100mL)中に加えた。有機層を食塩水(100mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のtert−ブチル{4,10−ビス[(2−ニトロフェニル)スルホニル]−1−オキソ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−7−イル}アセテート(6b)を得た。
Rf:0.3 (EtOAc/ヘキサン 2:1);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01-7.98 (m, 2H), 7.69 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 3.68 (m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.72-3.38 (m, 4H), 3.33 (s, 2H), 3.05 (m, 4H), 1.45 (s, 9H).
6b(1.8g,2.7mmol)及びチオフェノール(0.70mL,6.8mmol)のDMF(30mL)溶液にNa2CO3(2.3g,22mmol)を加えた。反応混合物を一晩攪拌した後、濃縮した。残渣を10%クエン酸水溶液に溶解してpHを3に調整した。水層をEtOAc(100mL×3)で抽出した。1N NaOH水溶液を加えて水層のpHを約13に上げた後、水層をMC(100mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させた後、濃縮した。得られた粗生成物(tert−ブチル 1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−7−イルアセテート(6c))を精製せずに、そのまま次の反応に使用した。6c(0.50g,1.7mmol)のクロロホルム(70mL)溶液にTEA(0.61mL,4.3mmol)を加えた。溶液を攪拌した後、ここにベンジルクロロホルメート(0.43mL,3.9mmol)をゆっくり加えた。反応混合物を3時間攪拌し、5%クエン酸水溶液(50mL×3)で洗浄し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製してオイル状のジベンジル 7−(2−tert−ブトキシ−2−オキソ−エチル)−1−オキサ−4,7,10−トリアザシクロドデカン−4,10−ジカボネート(6d)を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:15);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.32-7.27 (m, 10H), 5.12 (s, 4H), 3.59-3.33 (br m, 14H), 2.99-2.93 (br m, 4H), 1.45 (s, 9H).
6d(0.50g,1.0mmol)のMC(15mL)溶液にTFA(10mL)を加えた。反応混合物を5時間攪拌した。溶媒を留去した後、残渣を10%クエン酸水溶液に溶解してEtOAc(50mL×3)で抽出した。有機層を食塩水(50mL×3)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮してオイル状の6を得た。
Rf:0.2 (CH3OH/MC 1:10);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34-7.25 (m, 10H), 5.11 (m, 4H), 4.23-4.08 (br m, 4H), 3.84-3.50 (br m, 10H), 3.25-3.15 (br m, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 500.50 (M+H)+(C26H34N3O7に対する計算値500.58).
【0070】
実施例1に記載の方法に従って、6を使用して化合物(V)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2851.49 (M+H)+(C111H152N63O26S2に対する計算値2850.75).
【0071】
【化19】
【0072】
実施例1に記載の方法に従って、(V)のCo(III)錯体を製造した。
pH8.0(50mM HEPES)又は9.0(50mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、温度37℃でMb(7.9μM)を[Co(III)(V)](4.8μM)とインキュベートしたところ、Mbはそれぞれko値:1.5×10−3h−1又は5.3×10−3h−1で分解された。
【実施例6】
【0073】
スキーム7に従って、{4,7−ビス[(ベンジルオキシ)カルボニル]−1,4,7−トリアザノナン−1−イル}酢酸(7)を合成した。
【0074】
【化20】
【0075】
文献(Schulz, D.; Weyhermueller, T.; Wieghardt, K.; Nuber, B. Inorg. Chim. Acta 1995,240, 217)に従って、1,4,7−トリアザノナン−1−イル酢酸(7a)を合成した。7a(3.0g,7.4mmol)をNaOH水溶液(1N,50mL)と1,4−ジオキサン(50mL)の混合液に溶解し、この溶液にベンジルクロロホルメート(3.0mL,22mmol)をゆっくり加え、その溶液を3時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を1N HClに溶解した後、pHを3に調整した。その溶液をEtOAcで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥した後、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形の固体状の7を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34 (m, 10H), 5.15 (d, 4H), 3.38 (m, 10H), 2.74 (br s, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 456.06 (M+H)+(C24H30N3O6に対する計算値456.52).
【0076】
実施例1に記載された方法に従って、7を使用して化合物(VI)を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2807.51 (M+H)+(C109H148N63O25S2に対する計算値2806.69).
【0077】
【化21】
【0078】
実施例1の記載に準じて、Cu(II)イオンと(VI)の錯体を製造し、Mbの分解に対する動力学的測定を行った。pH8.0(50mM HEPES)、温度37℃でMb(7.9μM)を[Cu(II)(VI)](6.4μM)とインキュベートしたところ、Mbはko値:3.6×10−3h−1で分解された。
【実施例7】
【0079】
スキーム8に従って、シクレンを含むd−ビオチン誘導体の5−[(3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル]−N−[3−(1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1−イル)プロピル]ペンタンアミド(VII)を合成した。
【0080】
【化22】
【0081】
−60℃に冷却したMC(30mL)にオキサリルクロリド(1.4mL,16mmol)、DMSO(0.89mL,13mmol)、8a(2.2g,10mmol)のMC(20mL)溶液、及びTEA(8.7mL,63mmol)を順次滴下した。1時間後、反応混合物を50mMクエン酸で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン=1/1)で精製して無色オイル状のベンジル 3−オキソプロピルカルバメート(8b)を得た。3a(2.3g,4.8mmol)のTHF(20mL)溶液に8b(1.0g,4.8mmol)のTHF(40mL)溶液及びNaBH(OAc)3(1.3g,6.3mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌した。THFを留去し、反応混合物を0.1M Na2CO3(50mL)と混合してEtoAc(50mL×2)で抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン=1/1)で精製してトリ−tert−ブチル 10−(3−{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}プロピル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(8c)を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.32 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 3.56-3.16 (br, 14H), 2.58 (br, 6H), 1.66 (m, 6H), 1.44 (m, 27H).
8c(1.0g,1.5mmol)と10%Pd/C(500mg)のEtOAc(100mL)懸濁液を1気圧水素下に24時間攪拌した。触媒をセライト濾過により除き、溶媒を留去して無色オイル状のトリ−tert−ブチル 10−(3−アミノプロピル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(8d)を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 3.56-3.30 (br, 12H), 2.72-2.58 (br, 8H), 1.59 (m, 2H), 1.43 (m, 27H).
d−ビオチン(0.22g,0.89mmol)のDMF(5mL)溶液を0℃に冷却し、ここにHBTU(0.44g,1.2mmol)、8d(0.47g,0.89mmol)のDMF(5mL)溶液、及びDIEA(200μL,1.2mmol)を加えて、混合物を室温で6時間攪拌した。反応混合物をMC(30mL)と混合し、その混合物を50mMクエン酸(30mL×2)及び食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH3OH/MC=1/9)で精製してトリ−tert−ブチル 10−[3−({5−[(3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル]ペンタノイル}アミノ)プロピル]−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリカルボキシルレート(8e)を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.52 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 4.50 (q, 1H), 4.31 (t, 1H), 3.53-3.33 (br, 12H), 3.19 (m, 3H), 2.90 (m, 2H), 2.60 (br, 6H), 2.25 (t, 2H), 1.70 (m, 6H), 1.44 (d, 27H).
TFAの10%MC溶液に8e(0.51g,0.67mmol)を加え、反応混合物を3時間攪拌した。反応混合物にエチルエーテルを注入した。白色沈澱物を集めてCH3OH−ジエチルエーテル混合液に溶解した。HCl溶液を滴下すると(VII)のHCl塩が生成した。この塩をCH3OH−ジエチルエーテルで再結晶した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 4.57 (t, 1H), 3.85 (q, 1H), 3.30-2.94 (br, 20H), 2.74 (br, 3H), 2.23 (t, 2H), 1.76-1.55 (m, 6H), 1.38 (m, 2H); MS (MALDI-TOF) m/z 456.56 (M+H)+(C21H42N7O2Sに対する計算値456.68).
【0082】
Cu(II)をCyc部位に結合させると、(VII)のCu(II)錯体である[Cu(II)(VII)]が形成されることは、Cu(II)イオンを(VII)に添加するに伴って生じるUVスペクトルの変化を測定することにより確認した。アビジンに対するビオチンの強い親和力を考え、[Cu(II)(VII)]をアビジンに対する蛋白質−切断剤としてテストした。アビジンと[Cu(II)(VII)]との錯体形成をアビジンの存在下又は不在下における[Cu(II)(VII)]のゲル濾過クロマトグラフィーで分析して確認した。pH6(50mM MES)、温度50℃で7日間アルゴン雰囲気中でアビジン(2.5×10−5M)を[Cu(II)(VII)](2.5×10−5M)とインキュベートして得られた反応混合物を尿素−SDS−PAGE電気泳動で分析した結果、約50%のアビジンが分解され、より小さなフラグメントを造ることが確認された。同生成物をMALDI−TOF MSで分析した結果、アビジン(M.W.15630)は、分子量10759及び4922の2つの蛋白質に切断されることが確認された。アビジンのアミノ酸配列とアビジン−ビオチン錯体の3次元X線結晶構造を調べたところ、切断部位はThr35−Ala36で、分子量10726及び4922のフラグメントが生成することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0083】
以上の説明のように、本発明者らによって創出された合成触媒は標的蛋白質に対する親和力を持つ認識部位とペプチド結合切断活性を持つ反応部位とから構成され、標的蛋白質を選択的に認識する能力とペプチド結合を速かに切断する能力とを同時に保有することが出来る。従って、このような合成触媒を使用すれば種々の蛋白質が混合されている状況でも標的蛋白質だけを選択的に切断することによってその蛋白質の生理活性を抑制することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1】[Cu(II)(I)](a)又は[Co(III)(I)](b)によるMbの時間−依存的な分解を示すグラフである。(実施例1)
【図2】Mb[Co(III)(I)]の分解における、Coに対するkoの依存性を示すグラフである。(実施例1)
【図3】Mb[Co(III)(I)]の分解における、kpcのpH分布を示す。(実施例1)
【図4】Mbを[Co(III)(I)]とインキュベーションすることによって得られる反応生成物のMALDI−TOF MSスペクトルである。(実施例1)
Claims (8)
- 標的蛋白質を選択的に切断する能力を有する、下記一般式(A)
(R)(Z)n (A)
(式中、nは1以上の整数を示し、Rは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質を示し、Zは金属イオン−リガンド錯体を示す。)
で表される合成触媒。 - リガンドが環状又は非環状であり、リガンド内に含まれる金属配位原子中の1〜4個が窒素原子である請求項1に記載の合成触媒。
- 金属イオンがNi(II)、Cu(II)、Zn(II)、Pd(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(III)、Rh(III)、Ir(III)、Ru(III)、Pt(IV)、Zr(IV)、及びHf(IV)からなる群より選ばれた1種以上である請求項1に記載の合成触媒。
- RとZが互いにリンカーによって連結されている、請求項1に記載の合成触媒。
- リンカーがアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル,スルフヒドリル及び/又はチオエーテル基といった官能基や、アミド、イミド、エステル及び/又はチオエステルといった誘導体に属する、1〜30個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び/又は硫黄原子からなる骨格を有する主鎖を含むものである、請求項5に記載の合成触媒。
- リンカーがそれぞれアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び/又はチオエーテルといった官能基や、酸、アミド、イミド、エステル及び/又はチオエステルといった誘導体に属する、1〜30個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び/又は硫黄原子からなる骨格を有する側鎖を含むものである、請求項5に記載の合成触媒。
- 請求項1に記載の合成触媒を用いることを特徴とする、標的蛋白質を選択的に切断する方法。
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