KR20040004578A

KR20040004578A - 단백질을 선택적으로 절단하는 합성 촉매 및 이를 이용한단백질의 선택적 절단방법

Info

Publication number: KR20040004578A
Application number: KR1020037013101A
Authority: KR
Inventors: 서정헌; 손상준; 송정배; 유창은; 정철승; 전중원; 홍인석
Original assignee: 대한제당 주식회사
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2004-01-13
Also published as: WO2002085413A1; JP2004529763A; EP1381392A1; CN1531444A; US20020165365A1; EP1381392A4

Abstract

본 발명은 단백질 혼합물중에서 특정 단백질을 선택적으로 인식하여 절단할 수 있는 합성 촉매, 및 이를 사용하여 표적 단백질을 선택적으로 절단하는 방법에 관한 것이다.

Description

단백질을 선택적으로 절단하는 합성 촉매 및 이를 이용한 단백질의 선택적 절단방법 {Synthetic catalyst for selective cleavage of protein and method for selective cleavage of protein using the same}

단백질은 생체내에서 다양한 생리적인 기능을 담당하고 있다. 특히, 효소(enzyme)와 수용체(receptor)는 질병에 관련된 기능을 담당하는 경우가 많기 때문에, 효소와 수용체의 기능을 억제하는 분자는 의약품으로 사용되기도 한다. 효소의 경우에는 저해제(inhibitor)가 효소의 활성부위를 가역적으로 봉쇄하여 효소기능을 억제하게 되고, 수용체의 경우는 길항제(antagonist)가 가역적으로 결합함으로써 수용체의 기능을 감소시킨다(Medicinal Chemistry, 2nd Ed., Ganellin,C. R.; Roberts, S. M. Ed.; Academic Press: London, 1993). 효소의 경우에 자살 저해제(suicide inhibitor)는 활성부위에 공유결합으로 결합하여 효소의 활성을 봉쇄한다. 광우병에 대한 프리온(prion)이나 알츠하이머병에 대한 아밀로드(amylod)로 예시되듯이, 많은 독성 단백질은 심각한 건강상의 문제를 유발시킨다. 독성 단백질의 경우, 그 단백질의 골격을 특이적으로 절단할 수 있는 합성 분자는 효과적인 의약으로 사용될 수 있으나, 그러한 분자에 대해서는 보고된 바 없다.

이러한 저해제 또는 길항제를 효소 또는 수용체에 가해줄 때 활성을 가진 단백질의 농도가 감소하는 정도를 간단한 수식으로 표현하면 다음과 같다.

상기식에서

P는 활성을 가진 단백질을 나타내고,

L은 저해제 또는 길항제를 나타낸다.

상기 식(1)은 단순한 저해제 또는 길항제에 관한 것이고, 식(2)는 자살저해제에 관한 것이다.

활성을 가진 단백질의 농도([P])가 전체 단백질의 농도([P]₀)의 절반이 되는 L의 전체 농도([L] + [PL] + [PL'])를 L₅₀이라 표현하면, L₅₀은 식(1)의 경우에 (K_L+0.5[P]₀)가 된다. 즉, 일반적인 저해제나 길항제의 경우에는 K_L이 작을수록 L₅₀은 작아지되 0.5[P]₀보다 작아지지는 않는다. 식(2)의 경우, L₅₀은 0.5[P]₀인데, K_L이 작을수록, 또는k _si가 클수록 L의 농도를 절반수준으로 감소시키는데 걸리는 시간이 짧아진다. L₅₀이 작을수록 저해제 또는 길항제를 의약품으로 사용하는데 효과적이다. 그런데, 위에 기술한 저해제 또는 길항제는 아무리 성능이 우수해도 당량보다 많은 양의 단백질의 생리활성을 봉쇄할 수는 없다.

한편, 금속의 착화합물 중에 일부는 단백질을 절단하는 능력을 보유하고 있음이 알려져 있다. 예를 들어, Cu(II)와 싸이클렌(cyclen), Cu(II)와 1,4,7-트리아자노난(1,4,7-triazanonane), Cu(II)와 트렌(tren), Pd(II)와 에틸렌다이아민 (ethylenediamine), Fe(III) 또는 Co(III)와 배위고분자화 이중막(coordinatively polymerized dilayer membranes) 사이에 형성된 착화합물이 단백질의 펩타이드 결합을 가수분해하는 능력을 보유하고 있는 것으로 보고되어 있다(Zhu, L.; Qin, L.; Parac, T. N.; Kostic, N. M.J. Am. Chem. Soc.1994,116, 5218: Hegg, E. L.; Burstyn, J. N.J. Am. Chem. Soc.1995,117, 7015: Suh, J.; Oh, S.Bioorg. Med. Chem. Lett.1996,6, 1067: Jang, B.-B.; Lee, K. P.; Min, D. H.; Suh, J.J. Am. Chem. Soc.1998,120, 12008: Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J.J. Am. Chem. Soc.2000,122, 7742: Suh, J.; Moon, S.-J.Inorg. Chem. 2001,40, 4890). 또한, 코발트(III)에 배위된 아마이드가 코발트(III)이온에 의하여 가수분해되는 반응도 알려져 있다(Sutton, D. A.; Buckingham, D. A.Acc. Chem. Res. 1987,20, 357). 그러나, 금속의 착화합물이 특정 단백질을 선택적으로 공격하여 절단한 예는 지금까지 보고된 바 없다.

본 발명은 단백질의 혼합물 중에서 특정 단백질만을 선택적으로 인식하여 절단할 수 있는 합성 촉매(synthetic catalyst) 및 이를 이용하여 특정 단백질을 선택적으로 절단하는 방법에 관한 것이다. 특정 단백질을 선택적으로 절단함에 따라 단백질의 생리활성만을 선택적으로 억제하는 것이 가능하다.

본 발명의 성질 및 대상을 보다 잘 이해하기 위하여 첨부된 도면과 함께 하기 설명을 참고할 수 있다.

도 1은 Cu(II)I(a) 또는 Co(III)I(b)에 의한 Mb의 시간-의존적인 분해를 나타내는 그래프이며,

도 2는 Mb Co(III)I의 분해에 있어서C _o 에 대한k _o 의 의존성을 나타내는 그래프이고,

도 3은 Mb Co(III)I의 분해에 있어서k _o 의 pH 프로파일을 나타내며,

도 4는 Mb를 Co(III)I과 함께 인큐베이션 함에 따라 얻어지는 반응 생성물의 MALDI-TOF MS 스펙트럼이다.

본 발명에 따른 일반식(A)의 합성 촉매에 대해 이하 좀더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 합성 촉매는 표적 단백질을 인식하는 부위인 그룹 R을 가지고 있으며, 이 부위는 표적 단백질과 선택적으로 결합하여 착화합물을 형성할 수 있다. 이와 같이 인식부위와 표적 단백질 사이에 결합이 형성된 후, 금속이온-리간드 착화합물로 구성된 반응부위(Z)가 표적 단백질의 펩타이드 결합을 절단하게 된다. 절단된 단백질은 새로운 형태(conformation)로 신속히 바뀌어져서 촉매를 결합하는 능력이 낮아지게 되며, 이에 따라 촉매는 절단된 단백질로부터 분리되어 재생됨으로써 다른 표적 단백질을 절단하는데 다시 사용될 수 있다. 따라서, 표적 단백질과 합성 촉매가 결합하는 능력이 강하지 않더라도 충분한 시간이 경과하면 표적 단백질의 상당한 양을 절단하여 그 활성을 충분한 정도로 억제할 수 있게 된다.

본 발명에 따른 합성 촉매가 단백질의 활성을 저해하는 방식을 Michaelis- Menten scheme과 유사한 하기 식에 의해 간단히 표시할 수 있다.

상기식에서

P는 앞에서 정의한 바와 같고,

C는 본 발명에 따른 일반식(A)의 합성 촉매를 나타내며,

P'는 절단된 새로운 단백질을 나타내고,

K _c는 Michaelis 상수(constant)에 상응하는 상수이다.

상기 식(4)로부터 알 수 있듯이, 합성 촉매(C)는 활성 단백질(P)와 결합하여 착화합물(PC)를 형성한 후 단백질을 절단하여 새로운 단백질(P')을 생성하는 동시에 스스로를 재생시킨다. 이 경우에 표적 단백질(P)의 절반을 절단하여 그의 생리활성을 억제하는데 필요한 촉매의 양에 대해서는 아무런 제한조건이 없다. 표적 단백질의 활성을 일정 수준으로 저해하는데 소요되는 시간을 길게 잡을수록 소량의 촉매를 사용할 수 있다. 합성 촉매가 표적 단백질과 착화합물(PC)을 강하게 형성할수록K _c는 작아지고,K _c가 작아지거나k _pc가 커질수록 단백질 절단속도는 빨라진다.

본 발명에 따른 합성 촉매에서 인식부위 R로는 표적 단백질을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 어떤 물질이라도 사용할 수 있으며, 표적 단백질에 대하여 기존에 축적된 정보를 활용하여 이미 보고된 구조를 사용할 수도 있고 새로운 구조를 모색하여 사용할 수도 있다.

예를 들어, 단백질이 효소인 경우 그 효소의 활성을 저해하는 공지의 저해제를 사용할 수 있고, 단백질이 수용체인 경우 그 수용체에 결합하는 공지의 길항제를 사용할 수 있다. 즉, 저해제 혹은 길항제에 대한 정보가 알려져 있는 표적 단백질의 경우, 기존의 저해제 혹은 길항제를 인식부위로 활용하여 단백질 절단 합성 촉매를 주문제작 방식으로 합성할 수 있는 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 합성 촉매가 결합하는 표적 단백질 상의 위치는 공지의 저해제나 길항제가 결합하는 표적 단백질상의 위치와 달라도 무방하다. 저해제나 길항제는 표적 단백질의 활성에 필수적인 부위에 결합하는데 비하여, 본 발명에 따른 합성 촉매는 활성자리 이외의 위치라도 표적 단백질을 특이적으로 인식하여 결합한 다음 결합 부위 주변에 위치한 펩타이드 결합을 절단하기만 하면 소기의 목적을 달성할 수 있기 때문이다. 따라서 공지의 저해제나 길항제와 관련이 없는 새로운 구조를 인식부위로 사용할 수도 있다. 또한, 길항제나 저해제가 알려져 있지 않은 표적 단백질의 경우에는 본 발명에 따른 합성 촉매를 사용하여 스크리닝함으로써 새로운 인식부위를 탐색할 수 있다.

어떤 단백질이 표적 단백질로 되느냐에 따라, 또한 그 표적 단백질에 대해 공지된 많은 저해제 또는 길항제 중에서 어느 것을 선택하느냐에 따라, 또는 새로운 인식부위를 고안하여 사용하느냐에 따라 본 발명에 따른 합성 촉매의 인식부위 R은 얼마든지 변화할 수 있으며 따라서 이 부위를 구조적으로 특정하는 것은 불가능하다.

상기 일반식(A)의 구조에서 반응부위 Z에 해당하는 촉매중심은 Cu(II)의 싸이클렌(cyclen) 착화합물과 같은 금속 착화합물이다. 사용 가능한 금속 착화합물은 인식부위에 연결되지 않은 상태에서는 단백질을 절단하지 못하거나 절단효과가 매우 미미하여 관찰하기 어려운 것이다. 이 금속 착화합물을 단백질 인식부위와 연결하여 합성한 분자, 즉 합성 촉매는 신속하게 표적 단백질과 결합체를 형성하게 된다. 표적 단백질과 합성 촉매의 결합체를 형성함에 따라 금속 착화합물과 표적 단백질 절단부위 사이의 유효농도가 충분히 높아져서 표적 단백질의 펩타이드 결합을 효과적으로 절단하게 된다.

본 발명자들은 이러한 합성 촉매를 사용하여 표적 단백질을 선택적으로 절단함으로써 생리활성을 억제하고자 하는 목적을 달성함에 있어 금속이온-리간드 착화합물을 구성하는 금속이온 및 리간드의 종류가 특정의 것으로 한정되는 것이 매우 중요함을 발견하였다.

단백질을 절단하는 능력을 가진 다수의 금속 착화합물이 공지되어 있다. 이중에서 본 발명에 따른 금속이온-리간드 착화합물의 구성요소로 사용하기에 적합한 금속이온으로는 Ni(II), Cu(II), Zn(II), Pd(II), Cr(III), Fe(III), Co(III), Rh(III), Ir(III), Ru(III), Pt(IV), Zr(IV), 및 Hf(IV)로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상, 바람직하게는 Cu(II), Cr(III), Fe(III), Co(III), Rh(III),Ir(III), 및 Ru(III)로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 언급할 수 있고, 킬레이트 형성 리간드의 골격으로는 하기 분자구조의 그룹중에서 선택된 1종 이상을 언급할 수 있다:

상기 구조식으로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 킬레이트 형성 리간드는 고리형 또는 비고리형으로서 리간드내에 포함된 금속 배위원자중 1 내지 4개는 질소원자라는 특징을 가지고 있다. 또한, 여기서 질소원자는 방향족환에 속한 질소원자일 수도 있고 비방향족 질소원자일 수도 있다.

본 발명에 따른 상기 일반식(A)의 구조에서 R 및 Z는 링커에 의해 연결되며, 링커는 R과 Z 사이를 직접 연결하는 주 사슬(main chain) 및 주 사슬에 임의로 부착된 곁사슬(side chain)을 포함할 수 있다. 인식부위 R이 표적 단백질에 결합하면 반응부위 Z는 표적 단백질내의 펩타이드 결합중 하나 이상을 절단하게 된다. 단백질 상의 절단부위와 반응부위 Z 사이의 유효농도를 증가시키면 반응부위 Z 의 반응성을 증진시킬 수 있으며, 이 유효농도를 조절하는 효과적인 방법은 합성 촉매 안에 포함된 인식부위(R)와 반응부위(Z) 간의 상대적인 위치를 조절하는 것이다. 상대적인 위치를 조절하는데 이용되는 것이 바로 링커의 길이와 모양이다.

링커는 주 사슬을 포함하여야 한다. 주 사슬의 골격은 1 내지 30개의 붕소, 탄소, 질소, 산소, 규소, 인 및/또는 황 원자로 구성될 수 있고, 이들 원자는 알킬, 아릴, 카보닐, 아민, 에테르, 하이드록시, 실릴, 설프하이드릴 및/또는 티오에테르 그룹과 같은 작용기(functional group) 또는 아미드, 이미드, 에스테르 및/또는 티오에스테르와 같은 유도체(derivative)에 속한다. 링커는 곁 사슬을 포함할 수 있고, 이들은 각각 1 내지 30개의 붕소, 탄소, 질소, 산소, 규소, 인 및/또는 황 원자로 구성된 골격을 포함하고, 이들 원자는 알킬, 아릴, 카보닐, 아민, 에테르, 하이드록시, 실릴, 설프하이드릴 및/또는 티오에테르 그룹과 같은 작용기 또는 산, 아미드, 이미드, 에스테르 및/또는 티오에스테르와 같은 유도체에 속한다. 상기 설명된 바와 같은 정의 안에서 다양한 표적 단백질 및 합성 촉매에 대한 절단부위 및 반응부위 사이의 유효 농도를 조절하기에 적합한 링커의 구조를 고안할 수있다.

본 발명에 따른 합성 촉매에서 반응부위(Z)는 인식부위(R) 1개당 1개 이상의 비율로 결합할 수 있으며, 이때 결합하는 반응부위는 상호 동일하거나 상이할 수 있다. 인식부위 1개당 1-3개의 반응부위를 결합시킬 경우, 전형적인 결합형태를 예시하면 다음과 같다. 이외에 인식부위 내부에 반응부위를 삽입하는 것도 가능하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다. 실시예에서는 미오글로빈(Mb)과 아비딘(avidin)이 표적 단백질로 사용되었다. Mb의 경우, 새로 준비된 조합 라이브러리(combinatorial library)를 이용하여 발견된 인식부위를 사용하여 촉매를 제조하였다. 반대로, 아비딘의 경우, 바이오틴이 아비딘에 강하게 결합하는 것으로 공지되어 있으므로 바이오틴을 촉매의 인식부위로 사용하였다. 실시예에서는 반응성 금속 중심의 킬레이트 형성 리간드로서 다양한 유기 화합물들이 시도되었다. 실시예에서는 합성 촉매를 표적 단백질의 양보다 많은 또는 적은 몰양으로 첨가하였다.

전술한 바와 같이, 저해제 또는 길항제는 아무리 성능이 우수하여도 당량보다 많은 양의 표적 단백질의 생리활성을 봉쇄할 수는 없다. 또한, 독성 단백질을 특이적으로 절단하는 합성 촉매는 알려져 있지 않다. 따라서, 본 발명자들은 저해제 또는 길항제로 작용하는 의약품이 가지는 이러한 본원적인 한계를 극복하고 독성 단백질을 특이적으로 절단하는 합성 촉매를 고안하기 위해 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 하기 일반식(A)의 합성 촉매를 고안하는데 성공하였다:

상기식에서

n 은 1 이상의 정수를 나타내고,

R 은 표적 단백질을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 물질, 예를 들어 효소의 저해제 또는 수용체의 길항제를 나타내며,

Z 는 금속이온-리간드 착화합물을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 목적은 표적 단백질에 선택적으로 결합하여 절단할 수 있는 상기 일반식(A)의 합성 촉매를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 일반식(A)의 합성 촉매를 이용하여 표적 단백질을 선택적으로 절단하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

[실시예 1]

단백질-절단 촉매의 결합부위를 조사하기 위하여, 펩타이드 핵산(PNA) 유사체를 포함하는 사이클렌(Cyc) 유도체의 조합 라이브러리(CycAc(Q)_nLysNH₂: Q 는 PNA 모노머 A', G, T', 또는 C를 나타낸다)를 작제하였다. PNA 유사체는 DNA의 염기(nucleobase)와 염기쌍을 이루는데 사용될 수 있는 염기 유사체들 (NB(A'), NB(G), NB(T'), NB(C))을 포함한다. NB(A') 및 NB(T')는 각각 NB(T) 및 NB(A)를 인식하지만 상호간에는 인식하지 못한다(Lohse, J.; Dahl, O.; Nielson, P. E.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999,96, 10804). 따라서 라이브러리에 존재하는 PNA 혼합물사이의 염기쌍 결합은 PNAs의 성분으로서 A 및 T 대신에 A' 및 T'를 사용함으로써 억제될 수 있다.

A'의 Fmoc 유도체 (N-[(2-아미노-6-{[(벤질옥시)카보닐]아미노}-9H-퓨린-9-일)아세틸]-N-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리신(1))를 반응식 1에 따라 합성하였다.

DMF (100 mL) 중의 (2-아미노-6-{[(벤질옥시)카보닐]아미노}-9H-퓨린-9-일)아세트산(1a) (2.0 g, 5.8 mmol) (Haaima, G.; Hansen, H.; Christensen, L.; Dahl, O.; Nielsen, P.Nucleic Acid Res.1997,25, 4639) 용액을 교반하고 여기에tert-부틸N-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리시네이트 (1b)의 HCl 염 (2.8 g, 6.4 mmol) (Thomson, S.; Josey, J.; Cadilla, R.; Gaul, M.; Hassman, C.; Luzzio, M.; Pipe, A.; Reed, K.; Ricca, D.; Wiethe, R.; Noble, S.;Tetrahedron 1995,51, 6179)과 트리에틸아민(TEA) (1.6 mL, 12 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물에O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU) (2.4 g, 6.4 mmol)를 가하고, 혼합물을 3시간동안 교반하였다. 반응액을 증발시키고 잔류물을 메틸렌 클로라이드(MC) (100 mL)에 용해시켰다. MC 용액을 5% 시트르산 수용액 (50 mL × 2), 5% Na₂CO₃수용액 (50 mL × 2), 및 염수(brine) (50 mL × 2)로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시켰다. 용매를 증발시켜 제거하고, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체상의tert-부틸N-[(2-아미노-6-{[(벤질옥시)카보닐]아미노}-9H-퓨린-9-일)아세틸]-N-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리시네이트(1c)를 수득하였다.R _f 0.4 (CH₃OH/MC 1:20);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.01 (s, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.37-7.25 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05 및 4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H), 4.00 및 3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37(m, 2H), 3.15(s, 1H), 1.38(m, 9H). MC (25 mL) 중의1c(1.5 g, 2.1 mmol) 용액에 트리플루오로아세트산(TFA) (25 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 5시간동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 제거하고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체상의1을수득하였다.R _f 0.3 (CH₃OH/MC 1:9);¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 10.1 (s, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.45-7.29 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05 및 4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H) 4.00 및 3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.15 (s, 1H); HRMS 실측치(exact mass) 665.6874 (M+H)⁺, C₃₄H₃₃N₈O₇에 대한 계산치(calcd) 665.6854.

T'(N-{[2-(벤질티오)-4-옥소피리미딘-1(4H)-일]아세틸}-N-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리신(2))의 Fmoc 유도체를 하기 반응식 2에 따라 합성하였다.

[2-(벤질티오)-4-옥소피리미딘-1(4H)-일]아세트산(2a)을 메톡시벤질 그룹 대신에 벤질 그룹을S-보호기로 사용한 것을 제외하고는 문헌(Lohse, J.; Dahl, O.; Nilesen, P.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,96, 11804)에 기재된 방법에 따라 합성하였다.¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 13.54 (br s 1H), 7.69 (d, 1H), 7.42 (d, 2H), 7.38-7.25 (m, 3H), 5.91 (d, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.56 (s, 2H). DMF (100 mL) 중의2a(3.6 g, 5.8 mmol) 용액을 교반한 후,1b(6.2 g, 6.4 mmol) 및 TEA (3.6 mL, 12 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물에 HBTU (5.4 g, 6.4 mmol)를 가하고 혼합물을 3시간동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 제거하고 잔류물을 MC (100 mL)에 용해시켰다. 용액을 5% 시트르산 수용액 (50 mL × 2), 5% Na₂CO₃수용액 (50 mL × 2), 및 염수 (50 mL × 2)로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시켰다. 용매를 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체상의tert-부틸N-{[2-(벤질티오)-4-옥소피리미딘-1(4H)-일]아세틸}-N-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리시네이트(2b)를 수득하였다.R _f 0.4 (CH₃OH/MC 1:20);¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.47-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.35 (d, 2H), 4.27 (d, 2H), 4.18-4.16 (m, 2H), 4.14 (s, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.30 (m, 1H), 3.28 (m, 1H), 1.38 (m, 9H). MC (25 mL) 중의2b(3.0 g, 4.6 mmol) 용액에 TFA (25 mL)를 가하였다. 반응 혼합물을 5시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체상의2를 수득하였다.R _f 0.3 (CH₃OH/MC 1:9);¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.39-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.23-4.16 (m, 3H), 4.14 (s, 1H), 3.39-3.35 (m, 2H), 3.32 (m, 1H), 3.15 (m, 1H); HRMS 실측치 599.6873 (M+H)⁺, C₃₂H₃₂N₄O₆S 에 대한 계산치 599.6875.

[4,7,10-트리스(tert-부톡시카보닐)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]아세트산(3)을 하기 반응식 3에 따라 합성하였다.

트리-tert-부틸 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리카복실레이트(3a) (10 g, 21 mmol) (Kimura, E.; Aoki, S.; Koike, T.; Shiro, M.J. Am.Chem. Soc.1997,119, 3068), Na₂CO₃(2.5 g, 23 mmol), 및 CH₃CN (200 mL)의 혼합물에 에틸 브로모아세테이트 (3.2 mL, 23 mmol)를 가하였다. 균질하지 않은 혼합물을 밤새 환류시켰다. 여과한 후, 용매를 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의 트리-tert-부틸 10-(2-에톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리카복실레이트(3b)를 수득하였다.R _f 0.5 (에틸 아세테이트(EtOAc)/헥산 1:1);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 4.16 (q, 2H), 3.55-3.32 (br, 14H), 2.94 (br s, 4H), 1.45 (m, 27H), 1.32 (t, 3H). CH₃OH (100 mL) 중의3b(10 g, 18 mmol) 용액에 NaOH 수용액 (1 N, 100 mL)을 가하고, 반응 혼합물을 2시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 10% 시트르산 수용액에 용해시킨 후, pH를 5로 조정하였다. 용액을 EtOAc (100 mL × 2)로 추출하고 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고 증발시켜 무정형 고체상의3을수득하였다.¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H), 1.43 (m, 27H); MS (MALDI-TOF)m/z531.75 (M+H)⁺(C₂₅H₄₇N₄O₈에 대한 계산치 531.67).

fmoc 그룹으로 보호된 PNA 모노머 G 및 C를 Applied Biosystems 로부터 구입하고 fmoc 그룹으로 보호된 L-리신을 Nova Biochem 으로부터 구입하였다. A', T', G, C, 및 L-리신의 fmoc 유도체들 및 카복실산3으로부터 Expedite Model 8909 Nucleic Acid Synthesis System을 사용한 자동화된 합성 공정에 따라 조합 라이브러리용 PNA (CycAc(Q)_nLysNH₂)를 합성하였다. 라이브러리의 합성에 있어서, A', T', G, 및 C 의 fmoc 유도체들은 중합체 지지체에 부착되어 길이가 증가하고 있는 PNA 사슬에 대해 동일한 반응성을 가지고 커플링하는 것으로 추정하였다. PNA 의 순도를 Voyager-DE^TMSTR Biospectrometry Workstation model을 사용한 MALDI-TOF MS 분석에 의해 확인하였다. CycAc(Q)_nLysNH₂라이브러리(전체 농도: ca. 7 × 10^-5M)를 CuCl₂수용액 (3.5 × 10^-4M)과 혼합하여 Cu(II)가 Cyc 부위와 결합된 Cu(II)CycAc(Q)_nLysNH₂라이브러리를 생성하였다. 단백질 (ca. 1 × 10^-5M) 용액을 이 혼합물에 가하여 단백질의 절단을 시험하였다. 37℃, pH 7.0 (50 mM 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(Hepes))의 조건에서 각 분자당 최대 8개의 PNA 모노머를 함유하는 Cu(II)Cyc 라이브러리로 시험하였을 때, 전기영동(SDS-PAGE)으로 측정한 바로는 소 혈청 알부민, γ-글로불린, 연장(elongation) 인자 P, 젤라틴 A, 젤라틴 B, 및 말 심장 Mb와 같은 단백질이 절단되었음을 보여주는 증거를 찾지 못하였다. 분자당 9개의 PNA 모노머를 함유하는 Cu(II)Cyc 라이브러리는 Mb의 절단에 대한 명백한 활성을 보여주었다. 본 발명자들은 Cu(II)Cyc 옆에 위치한 공지의 PNA 모노머를 사용하여 4 그룹의 라이브러리를 합성하였으며 Mb 절단에 대한 활성을 시험하여 최상의 터미널 모노머를 찾아내었다. 나머지 모노머들에 대해서도 검색을 반복한 결과, 하기 구조식 I의 Cu(II) 착화합물 (MS (MALDI-TOF)m/z2851.49 (M+H)⁺(C₁₁₁H₁₅₃N₆₄O₂₅S₂에 대한 계산치 2850.58)이 가장 좋은 촉매로 선택되었다.

완충액 (1 mM 2-모폴리노에탄설폰산 (Mes), pH 6.0)에 용해된 I (1.2 equiv)에 CuCl₂의 수용액을 가하여 I의 Cu(II) 착화합물의 저장 용액을 제조하였다. Cu(II)I 으로 Mb를 분해한 다음 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과가 도 1에 도시되어 있다. 여기에서, 반응은 pH 7.5 (50 mM Hepes)이고, [Mb]_o(Mb의 초기 농도)가 7.9 μM 이며, [Cu(II)I]_o(Cu(II)I의 초기 농도)가 2.0 μM 인 조건에서 수행되었다. 170 시간동안 Cu(II)I 1 분자 당 Mb 2.5 분자가 절단되었다. [Mb]의 시간-의존적인 감소를 pseudo-first-order kinetic equations 에 적용한 결과, pseudo-first-order rate constant (k _o ) 가 5.7 × 10^-3h^-1인 것으로 나타났다. 도 1의 커브는 그 데이터를 pseudo-first-order kinetic equations에 적용하여 얻어진 것이다. 반응 혼합물로부터 산소를 제거하는 것은k _o 에 별다른 영향을 주지 못하였다. 상기 실험과 동일한 조건에서 Cu(II)I 대신에 Cu(II)Cyc 로 Mb 를 처리하면 Mb 가 절단되지 않는 것으로 관찰되었다.

문헌(Castillo-Blum, S. E.; Sosa-Torres, M. E.Polyhedron,1995,14,223)에 보고된 일반적인 방법에 따라 Co(III) 이온을 I의 Cyc 부위에 혼입시켜 I의 Co(III) 착화합물을 제조하였다: Co(III)I의 경우, MS (MALDI-TOF)m/z2908.44 (M+H)⁺(C₁₁₁H₁₅₃N₆₄O₂₅S₂Co 에 대한 계산치 2908.51).

또한, Co(III)I에 의하여 Mb를 분해한 후 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 결과가 도 1에 도시되어 있다. 여기에서, 반응은 pH 7.5 (50 mM Hepes)이고, [Mb]_o가 4.7 μM 이며, [Co(III)I]_o가 0.47 μM 인 조건에서 수행되었다. 100 시간동안 Co(III)I 1 분자 당 Mb 6.0 분자가 절단되었다. [Mb]의 시간-의존적인 감소를 pseudo-first-order kinetic equations 에 적용한 결과,k _o 가 9.4 × 10^-3h^-1인 것으로 나타났다. 반응 혼합물로부터 산소를 제거하는 것은k _o 에 별다른 영향을 주지 못하였다. 상기 실험과 동일한 조건에서 Co(III)I 대신에 Co(III)Cyc 로 Mb 를 처리하면 Mb 가 절단되지 않는 것으로 관찰되었다.

Cu(II) 착화합물을 사용하여 상기 구조 I을 검색하기는 하였지만, 구체적인 역학(kinetic) 분석은 Co(III) 착화합물을 사용하여 수행되었는데, 이는 Co(III) 착화합물이 더 높은 촉매 활성을 가지고 있기 때문이다. pH 7.5에서C _o (촉매의 초기 농도)에 대한k _o 의 의존성을 도 2에 도시하였다. 여기에서, [Mb]_o는 4.7 μM로 고정시켰다. 도 2에 도시된 2개의 직선은C _o = [Mb]_o에서 교차하고 있다. 도 2의 역학(kinetic) 데이터는C _o ≥ [Mb]_o, 따라서K _c << 5 μM 일때 Mb 가Co(III)I 과 완전히 결합되어 있음을 나타낸다. 또한, [Mb]_o보다 큰C _o 를 사용하여 측정된k _o 는k _pc 에 해당하며, 여기에서K _c 와k _pc 는 식 (4)에 정의되어 있다. 이에 따라 다양한 pH에서 측정된k _pc 값은 도 3에 도시되어 있다. 식 (5)의 스킴에 따른 종모양(bell-shaped) pH 프로파일을 분석한 결과 pK _a1 = 5.50 ± 0.42 및 pK _a2 = 8.68 ± 0.46의 값을 구하였다. 도 3의 커브는 이들 pK값에 의거하여 도시된 것이다. Mb 또는 I 의 이온화가 무시된다면, 이들 pK _a 값은 Mb 와 착화합물을 형성한 Co(III)I의 Co(III) 이온의 아쿠오 리간드의 이온화로 생각될 수 있다.

Mb (12 μM)을 Co(III)I (3.5 μM)과 pH 6.0 및 37℃ 조건에서 85 시간동안 인큐베이션하여 얻어진 반응 혼합물의 MALDI-TOF MS 에 따르면 도 4에 나타낸 바와 같이 Mb 는 2쌍의 단백질 (M.W.: 첫 번째 쌍의 경우 7074 및 9892, 다른 쌍의 경우 8045 및 8909)로 나뉘어진다. 도 4에서, m/z 값 16953 및 16953/2 의 피크는 Mb (M.W. 16953)에 기인한 것이다. Co(III)I에 의한 단백질 절단의 가능한 부위는 각각의 2쌍에 대하여 Leu89-Ala90 (M.W. 7077 및 9894의 단편을 생성) 및 Leu72-Gly73 (M.W. 8057 및 8914의 단편을 생성)이다. 현재로서는 2개의 절단 부위가 촉매의 상이한 결합 모드를 나타내는 것인지 확실치 않다. 2개의 절단 부위가 Mb와촉매 사이에 형성된 동일한 착화합물에 기인할 가능성도 있다.

소 혈청 알부민, γ-글로블린, 연장 인자 P, 젤라틴 A, 및 젤라틴 B와 같은 다른 단백질들이 Cu(II)I 또는 Co(III)I과 인큐베이션되는 경우에, 단밸질 절단은 관찰되지 않았다. 이는 Cu(II)I 또는 Co(III)I 이 Mb에 특이적임을 증명한다.

CycAc 유닛에 인접한 PNA 잔기가 A' 대신에 C 인 Co(III)I의 유사체를 하기 구조식 Ia로 나타내었다. Co(III)Ia는 Mb의 절단에 대한 촉매 활성을 보이지 않았는데, 이는 Mb 가 Co(III)I 만을 특이적으로 인식함을 나타낸다.

도 1의 결과에서는 Cu(II)I 또는 Co(III)I 의 각 분자에 의해 최대 2.5 또는 6 개의 Mb 분자가 절단됨을 보여주고 있는데, 이는 Cu(II)I 또는 Co(III)I의 작용이 촉매적 성질을 갖고 있음을 나타낸다. 반응속도는 반응 혼합물로부터 O₂를 제거하는 것에 의해 영향을 받지 않았다. 이들 결과를 테트라아자 리간드의 Cu(II) 착화합물 및 Co(III) 착화합물(Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J.J. Am. Chem. Soc.2000,122, 7742: Suh, J.; Moon, S. J.Inorg. Chem. 2001,40, 4890: Sutton, D. A.; Buckingham, D. A.Acc. Chem. Res. 1987,20, 357)에 의한 펩타이드 결합의 가수분해성 절단에 대한 이전의 관찰 결과와 종합하면, Cu(II)I 및 Co(III)I에 의한 Mb 절단이 가수분해적 성질을 띤다고 할 수 있다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 방법에 따라 하기 구조식의 화합물 II를 합성하였다.

II의 Co(III) 착화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 수득하였다. Mb (12 μM)를 Co(III)II (12 μM)과 pH 7.0 또는 pH 8.0 (50 mM Hepes) 및 37℃에서 인큐베이션하면 Mb 는 각각 1.4 × 10^-2h^-1또는 6.9 × 10^-3h^-1의k _o 로 분해되었다. 실시예 2의 결과로부터 I의 Lys이 촉매 활성에 필요치 않음을 알 수 있다.

[실시예 3]

하기 반응식 4에 따라N ² ,N ⁶ -비스{[4,7,10-트리스(tert-부톡시카보닐)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]아세틸}리신 (4)을 합성하였다.

클로로포름 (100 mL) 중의 브로모아세트산 (3.5 g, 26 mmol) 용액에N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (5.3 g, 26 mmol)을 천천히 가하였다. 디이소프로필에틸아민 (DIEA) (3.0 mL, 17 mmol)을 가하여4a(2 g, 8.58 mmol)의 HCl 염을 클로로포름 (50 mL) 에 완전히 녹이고, 이 용액을 브로모아세트산 용액에 천천히 가하였다. 실온에서 8시간동안 교반한 후,N,N'-디사이클로헥실우레아 (DCU)를 여과하고 여액을 증발시켰다. 잔류물을 CH₃CN (100 mL)에 다시 녹이고 녹지 않은 DCU를 여과하였다. 여액을 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체상의 메틸N ² ,N ⁶ -비스(브로모아세틸)리시네이트 (4b)를 수득하였다.R _f 0.7 (EtOAc);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.30 (br s, 1H), 6.71 (br s, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.05 (d, 0.7H), 3.90 (m, 3.4H), 3.86 (s, 3H), 3.30 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.57 (m, 2H), 1.37 (m, 2H).3a(3.1 g, 6.5 mmol), Na₂CO₃(2.2 g, 19mmol), 및 CH₃CN (100 mL) 의 혼합물에4b(1.3 g, 3.2 mmol)를 가하였다. 혼합물을 교반하고 2일간 환류시켰다. 여과 후, 용매를 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의 메틸N ² ,N ⁶ -비스{[4,7,10-트리스(tert-부톡시카보닐)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]아세틸}리시네이트 (4c)를 수득하였다.R _f 0.4 (CH₃OH/MC 1:40);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.06 (br s, 1H), 6.92 (br s, 1H), 4.50 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.13-3.53 (br m, 30H), 2.79-2.63 (br m, 8H), 1.84-1.65 (m, 4H), 1.44-1.47 (m, 54H), 1.36 (m, 2H). CH₃OH (50 mL) 중의4c(1.7g, 1.4 mmol) 용액에 NaOH 수용액 (1 N, 50 mL)을 가하고, 반응 혼합물을 1시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔류물을 10% 시트르산 수용액에 녹인 다음 pH 를 4로 조정하였다. 용액을 EtOAc (50 mL × 2)로 추출하고 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고 증발시켜 무정형 고체상의4를수득하였다.¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 4.14 (m, 1H), 3.17-3.46 (br m, 28H), 3.14 (t, 2H), 2.79-2.70 (br m, 8H), 1.73 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.36 (m, 54H), 1.33-1.20 (m, 4H); MS (MALDI-TOF)m/z1172.48 (M+H)⁺(C₅₆H₁₀₃N₁₀O₁₆에 대한 계산치 1172.49).

4를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법에 따라 하기 화합물 III을 합성하였다: MS (MALDI-TOF)m/z3191.87 (M+H)⁺(C₁₂₇H₁₈₅N₇₀O₂₈S₂에 대한 계산치 3190.23)

실시예 1과 동일하게 III에 대한 Cu(II) 이온의 착화합물을 형성하고 Mb의 분해에 대한 역학(kinetic) 측정을 수행하였다. pH 8.0 (50 mM Hepes) 및 37℃에서 Mb (7.9 μM)을 Cu(II)III (6.4 μM)과 인큐베이션 하였을 때, Mb 는 3.3 × 10^-3h^-1의k _o 로 분해되었다.

III의 Co(III) 착화합물을 실시예 1과 동일하게 제조하였다. pH 8.0 (50 mM Hepes) 및 37℃에서 Mb (7.9 μM)을 Co(III)III (4.8 μM)과 인큐베이션 하였을 때, Mb 는 3.2 × 10^-3h^-1의k _o 로 분해되었다.

[실시예 4]

반응식 5의 방법에 따라N-({4,7,10-트리스[(벤질옥시)카보닐]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일}아세틸)글리실-N-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리신(5)을 합성하였다.

N-보호기로서 디-tert-부틸 디카보네이트 대신에 벤질 클로로포르메이트를 사용한 점을 제외하고는3의 합성에 사용된 방법에 따라 반응시켜 화합물5a({4,7,10-트리스[(벤질옥시)카보닐]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일}아세트산)을 합성하였다.¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.34 (m, 15H), 5.15 (m, 6H) 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H). CH₃CN (100 mL) 중의5a(2 g, 3.2 mmol) 용액을 교반하고, 여기에 글리신 에틸 에스테르 하이드로클로라이드 (0.53 g, 3.8 mmol) 및 DIEA (1.4 mL, 7.9 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물에 HBTU (1.3 g. 3.5 mmol)를 가하고 2시간동안 교반하였다. 용액을 증발시키고 생성된 잔류물을 EtOAc (100 mL)에 녹였다. 용액을 5% 시트르산 수용액(50 mL × 2), 5% Na₂CO₃수용액 (50 mL × 2), 및 염수 (50 mL × 2)로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시켰다. 여과한후, 용매를 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의 에틸N-({4,7,10-트리스[(벤질옥시)카보닐]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일}아세틸)글리시네이트(5b)를 수득하였다.R _f 0.5 (CH₃OH/MC 1:19);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.90 (br s, 2H), 3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H), 1.26-1.22 (m,3H). CH₃OH (50 mL) 중의5b(2.0 g, 2.8 mmol) 용액에 NaOH 수용액 (1 N, 50 mL)을 가하고, 반응 혼합물을 1시간동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 10 % 시트르산 수용액에 녹인 다음 pH 를 4로 조정하였다. 용액을 EtOAc 로 추출하고 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 증발시켜 무정형 고체상의N-({4,7,10-트리스[(벤질옥시)카보닐]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일}아세틸)글리신(5c)을 수득하였다.¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 3.90 (br s, 2H), 3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H). CH₃CN (100 mL) 중의5c(1.5 g, 2.2 mmol) 용액을 교반하고 여기에1b(1.5 g, 2.4 mmol) 및 DIEA (1.1 mL, 4.3 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물에 HBTU (0.90 g, 2.4 mmol)를 가하고 혼합물을 2시간동안 교반하였다. 용액을 증발시키고 잔류물을 EtOAc (100 mL)에 용해시켰다. 용액을 5% 시트르산 수용액 (50 mL × 2), 5% Na₂CO₃수용액 (50 mL × 2), 및 염수 (50 mL × 2)로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시켰다. 용매를 증발시키고플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의tert-부틸N-({4,7,10-트리스[(벤질옥시)카보닐]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일}아세틸)글리실-N-2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노}에틸)글리시네이트(5d)를 수득하였다.R _f 0.3 (CH₃OH/MC 1:19);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.75 (m, 2H), 7.59 (m, 2H), 7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 2H), 4.22-4.16 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.70-3.32 (br m, 18H), 3.04 (br s, 4H), 1.47 (m, 9H). MC (25 mL) 중의5d(1.5 g, 1.5 mmol) 용액에 TFA (25 mL)를 가하였다. 반응 혼합물을 5시간동안 교반하고, 용매를 증발시킨 후, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의5를 수득하였다.R _f 0.4 (CH₃OH/MC 1:9);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.72 (m, 2H), 7.57 (m, 2H), 7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 1H), 4.20-4.18 (m, 2H), 4.06-3.95 (br s, 4H), 3.70 (br s, 2H), 3.40-3.10 (br m, 18H), 2.83-2.78 (br s, 4H); HRMS 실측치 1013.1403 (M+H)⁺, C₅₅H₆₂N₇O₁₂에 대한 계산치 1013.1370.

실시예 1과 동일한 방법으로5를 사용하여 화합물 IV를 합성하였다: MS (MALDI-TOF)m/z2879.63 (M+H)⁺(C₁₁₇H₁₆₅N₆₈O₂₆S₂에 대한 계산치 2877.75). 실시예 2의 결과로부터 I의 Lys 잔기는 Mb의 인식에 필수적이지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서 I의 PNA 9-mer 부위가 인식부위이다. 아미노 말단 대신에 카복실 말단에 부착된 Cyc와 PNA 9-mer도 역시 Mb-분해 촉매로서 유용한지 테스트하기 위하여 하기 구조식의 화합물 IV를 합성하였다.

실시예 1에 따라 Cu(II) 이온과 IV의 착화합물을 제조하고 Mb 의 분해에 대한 역학(kinetic) 측정을 수행하였다. pH 8.0 (50 mM Hepes) 및 37℃에서 Mb (7.9 μM)를 Cu(II)IV (6.4 μM) 와 인큐베이션하였을 때, Mb 는 2.2 × 10^-3h^-1의k _o 로 분해되었다.

[실시예 5]

하기 반응식 6에 따라 {4,10-비스[(벤질옥시)카보닐]-1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-7-일}아세트산(6)을 합성하였다.

문헌(Sasugue, J. M.; Segat-Dioury, F.; Sylvestre, I.; Favre- Reguillon, A.; Foos, J.; Madic, C.; Guy, A.Tetrahedron,2001,57, 4713)에 기재된 방법에 따라tert-부틸N,N-비스(2-{[(2-니트로페닐)설포닐]아미노}에틸)글리시네이트(6a)를 합성하였다. DMF (100 mL) 중의6a및 무수 Na₂CO₃(3.0 g, 29 mmol)의 현탁액을 교반하고, 여기에 DMF (100 mL) 중의 브로모에틸 에테르 (1 mL, 7.9 mmol) 용액을 100℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 밤새 가열하고 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (100 mL)에 취하였다. 유기층을 염수 (100 mL × 2)로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 농축시킨 다음, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의tert-부틸 {4,10-비스[(2-니트로페닐)설포닐]-1-옥소-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-7-일}아세테이트(6b)를 수득하였다.R _f 0.3 (EtOAc/헥산 2:1);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.01-7.98 (m, 2H), 7.69 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 3.68(m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.72-3.38 (m, 4H), 3.33 (s, 2H), 3.05 (m, 4H), 1.45 (s, 9H). Na₂CO₃(2.3 g, 22 mmol)을 DMF (30 mL) 중의6b(1.8 g, 2.7 mmol) 및 티오페놀 (0.70 mL, 6.8 mmol) 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음 농축시켰다. 잔류물을 10 % 시트르산 수용액에 녹이고 pH를 3으로 조정하였다. 수층을 EtOAc (100 mL × 3)로 추출하였다. 1 N NaOH 수용액을 가하여 수층의 pH를 약 13으로 올린 후, 수층을 MC (100 mL × 3)로 추출하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고 농축시켰다. 수득된 불순한 화합물 (tert-부틸 1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-7-일아세테이트(6c))를 추가의 정제없이 다음 반응에 사용하였다. 클로로포름 (70 mL) 중의6c(0.50 g, 1.7 mmol) 용액에 TEA (0.61 mL, 4.3 mmol)를 가하였다. 용액을 교반한 다음, 여기에 벤질 클로로포르메이트 (0.43 mL, 3.9 mmol)를 서서히 가하였다. 반응 혼합물을 3시간동안 교반하고, 5% 시트르산 수용액 (50 mL × 3)으로 세척하고, 농축시킨 후, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 오일상의 디벤질 7-(2-tert-부톡시-2-옥소-에틸)-1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-4,10-디카보네이트(6d)를 수득하였다.R _f 0.4 (CH₃OH/MC 1:15);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.32-7.27 (m, 10H), 5.12 (s, 4H), 3.59-3.33 (br m, 14H), 2.99-2.93 (br m, 4H), 1.45 (s, 9H). MC (15 mL) 중의6d(0.50 g, 1.0 mmol) 용액에 TFA (10 mL)를 가하였다. 반응 혼합물을 5시간동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 제거한 다음, 잔류물을 10 % 시트르산 수용액에 녹이고 EtOAc (50 mL × 3)로 추출하였다. 유기층을 염수 (50 mL × 3)로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 증발시켜 오일상의6을 수득하였다.R _f 0.2 (CH₃OH/MC 1:10);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.34-7.25 (m, 10H), 5.11 (m, 4H), 4.23-4.08 (br m, 4H), 3.84-3.50 (br m, 10H), 3.25-3.15 (br m, 4H); MS (MALDI-TOF)m/z500.50 (M+H)⁺(C₂₆H₃₄N₃O₇에 대한 계산치 500.58).

실시예 1에서와 동일한 방법으로6을 사용하여 하기 구조식의 화합물 V를 합성하였다: MS (MALDI-TOF)m/z2851.49 (M+H)⁺(C₁₁₁H₁₅₂N₆₃O₂₆S₂에 대한 계산치 2850.75).

실시예 1에 따라 V 의 Co(III) 착화합물을 제조하였다. pH 8.0 (50 mM Hepes) 또는 9.0 (50 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 및 37℃에서 Mb (7.9 μM)를 Co(III)V (4.8 μM) 와 인큐베이션하였을 때, Mb 는 각각 1.5 × 10^-3h^-1또는 5.3 × 10^-3h^-1의k _o 로 분해되었다.

[실시예 6]

하기 반응식 7에 따라 {4,7-비스[(벤질옥시)카보닐]-1,4,7-트리아자노난-1-일}아세트산(7)을 합성하였다.

문헌 (Schulz, D.; Weyhermueller, T.; Wieghardt, K.; Nuber, B.Inorg.Chim.Acta 1995,240, 217)에 기재된 방법에 따라 1,4,7-트리아자노난-1-일아세트산(7a)을 합성하였다. NaOH 수용액 (1 N, 50 mL) 및 1,4-디옥산 (50 mL) 혼합액중의7a(3.0 g, 7.4 mmol) 용액에 벤질 클로로포르메이트 (3.0 mL, 22 mmol)를 천천히 가하고 용액을 3시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 1 N HCl에 녹인 다음, pH 를 3으로 조정하였다. 용액을 EtOAc로 추출하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 증발시킨 다음, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 무정형 고체상의7을 수득하였다.R _f 0.4 (CH₃OH/MC 1:9);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.34 (m, 10H), 5.15 (d, 4H), 3.38 (m, 10H), 2.74 (br s, 4H); MS (MALDI-TOF)m/z456.06 (M+H)⁺(C₂₄H₃₀N₃O₆에 대한 계산치 456.52).

실시예 1에서와 동일한 방법으로7을 사용하여 하기 구조식의 화합물 VI을 합성하였다: MS (MALDI-TOF)m/z2807.51 (M+H)⁺(C₁₀₉H₁₄₈N₆₃O₂₅S₂에 대한 계산치2806.69).

실시예 1에 따라 Cu(II) 이온과 VI의 착화합물을 제조하고 Mb 의 분해에 대한 역학(kinetic) 측정을 수행하였다. pH 8.0 (50 mM Hepes) 및 37℃에서 Mb (7.9 μM)를 Cu(II)VI (6.4 μM) 와 인큐베이션하였을 때, Mb 는 3.6 × 10^-3h^-1의k _o 로 분해되었다.

[실시예 7]

하기 반응식 8에 따라 사이클렌을 포함하는d-바이오틴 유도체로서 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]-N-[3-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일)프로필]펜탄아미드(VII)를 합성하였다.

-60℃로 냉각된 MC (30 mL)에 옥살릴 클로라이드 (1.4 mL, 16 mmol), DMSO (0.89 mL, 13 mmol), MC (20 mL) 중의8a(2.2 g, 10 mmol) 용액, 및 TEA (8.7 mL, 63 mmol)를 순서대로 적가하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 50 mM 시트르산으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 농축시킨 다음 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산=1/1)로 정제하여 무색 오일상의 벤질 3-옥소프로필카바메이트(8b)를 수득하였다. THF (20 mL) 중의3a(2.3 g, 4.8 mmol) 용액에 THF (40 mL) 중의8b(1.0 g, 4.8 mmol) 용액 및 NaBH(OAc)₃(1.3 g, 6.3 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. THF를 증발시키고 반응 혼합물을 0.1 M Na₂CO₃(50 mL)와 혼합하고 EtOAc (50 mL × 2)로 추출하였다. 회수된 유기층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 농축시킨 다음, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산=1/1)로 정제하여 트리-tert-부틸 10-(3-{[(벤질옥시)카보닐]아미노}프로필)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리카복실레이트(8c)를 수득하였다.¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 7.32 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 3.56-3.16 (br, 14H), 2.58 (br, 6H), 1.66 (m, 6H), 1.44 (m, 27H). EtOAc (100 mL) 중의8c(1.0 g, 1.5 mmol) 및 10 % Pd/C (500 mg)의 현탁액을 1기압 수소 대기하에 24시간동안 교반하였다. 촉매를 셀라이트를 통해 여과하고 용매를 증발시켜 무색 오일상의 트리-tert-부틸 10-(3-아미노프로필)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리카복실레이트(8d)를 수득하였다.¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 3.56-3.30 (br, 12H), 2.72-2.58 (br, 8H), 1.59 (m, 2H), 1.43 (m, 27H). DMF (5 mL) 중의d-바이오틴 (0.22 g, 0.89 mmol) 용액을 0℃로 냉각시키고, 여기에 HBTU (0.44 g, 1.2 mmol), DMF (5 mL)에 용해시킨8d(0.47 g, 0.89 mmol), 및 DIEA (200 ㎕, 1.2 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 MC (30 mL)와 혼합하였다. 혼합물을 50 mM 시트르산 (30 mL × 2) 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 농축시킨 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(CH₃OH/MC=1/9)로 정제하여 트리-tert-부틸 10-[3-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일}아미노)프로필]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리카복실레이트(8e)를 수득하였다.¹HNMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 6.52 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 4.50 (q, 1H), 4.31 (t, 1H), 3.53-3.33 (br, 12H), 3.19 (m, 3H), 2.90 (m, 2H), 2.60 (br, 6H), 2.25 (t, 2H), 1.70 (m, 6H), 1.44 (d, 27H). MC 중의 10 % TFA 용액에8e(0.51 g, 0.67 mmol)를 가하고 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 에틸 에테르를 부었다. 백색 침전물을 회수하여 CH₃OH-디에틸에테르 혼합물에 녹였다. HCl 용액을 적가하여 VII의 HCl 염을 생성시켰다. 염을 CH₃OH-디에틸에테르에서 재결정하였다.¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 4.57 (t, 1H), 3.85 (q, 1H), 3.30-2.94 (br, 20H), 2.74 (br, 3H), 2.23 (t, 2H), 1.76-1.55 (m, 6H), 1.38 (m, 2H); MS (MALDI-TOF)m/z456.56 (M+H)⁺(C₂₁H₄₂N₇O₂S 에 대한 계산치 456.68).

Cu(II)를 Cyc 부위에 결합시켜 VII의 Cu(II) 착화합물 (Cu(II)VII)이 형성되는지를 VII에 Cu(II) 이온을 첨가하면서 UV 스펙트럼 변화를 측정하여 확인하였다. 아비딘에 대한 바이오틴의 강한 친화력을 고려하여, Cu(II)VII를 아비딘에 대한 단백질-절단제로서 테스트하였다. 아비딘과 Cu(II)VII의 착화합물 형성을 아비딘의 존재 또는 부재하에 Cu(II)VII을 겔 여과 크로마토그래피로 분석하여 확인하였다. pH 6 (50 mM Mes) 및 50℃에서 7일간 아르곤 대기하에 아비딘 (2.5 × 10^-5M) 을 Cu(II)VII (2.5 × 10^-5M)와 인큐베이션하여 얻어진 반응 혼합물을 우레아-SDS-PAGE 전기영동으로 분석한 결과, 약 50%의 아비딘이 분해되어 더 작은 단편들을 만든 것으로 나타났다. 동 생성물을 MALDI-TOF MS 으로 분석한 결과, 아비딘 (M.W. 15630)은 분자량 10759 및 4922의 2가지 단백질로 절단된 것으로 확인되었다. 아비딘의 아미노산 서열 및 아비딘-바이오틴 착화합물의 3차원 X-선 결정구조를 조사한 결과는 절단 부위가 Thr35-Ala36 이며, 그 결과 분자량 10726 및 4922의 단편이 생성됨을 보여준다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명자들에 의해 고안된 합성 촉매는 표적 단백질에 대한 친화력을 갖는 인식부위와 펩타이드 결합 절단 활성을 지닌 반응부위로 구성되어 있어, 표적 단백질을 선택적으로 인식하는 능력과 펩타이드 결합을 신속하게 절단하는 능력을 동시에 보유하게 된다. 따라서, 이러한 합성 촉매를 사용하면 여러 가지 단백질이 혼합되어 있는 상황에서도 표적 단백질만을 선택적으로 절단함으로써 그 단백질의 생리활성을 억제할 수 있다.

Claims

표적 단백질을 선택적으로 절단하는 능력을 보유하는 하기 일반식 (A)의 합성 촉매:

상기식에서

n 은 1 이상의 정수를 나타내고,

R 은 표적 단백질을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 물질을 나타내며,

Z 는 금속이온-리간드 착화합물을 나타낸다.
제1항에 있어서, 리간드가 고리형 또는 비고리형으로서 리간드 내에 포함된 금속 배위 원자중 1 내지 4개는 질소원자인 합성 촉매.
제1항 또는 2항에 있어서, 리간드의 골격이 하기 그룹 중에서 선택된 1종 이상인 합성 촉매:
제1항에 있어서, 금속이온이 Ni(II), Cu(II), Zn(II), Pd(II), Cr(III), Fe(III), Co(III), Rh(III), Ir(III), Ru(III), Pt(IV), Zr(IV), 및 Hf(IV)로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상인 합성 촉매.
제1항에 있어서, R과 Z가 링커(linker)에 의해 연결된 합성 촉매.
제5항에 있어서, 링커가 알킬, 아릴, 카보닐, 아민, 에테르, 하이드록시, 실릴, 설프하이드릴 및/또는 티오에테르 그룹과 같은 작용기(functional group) 또는 아미드, 이미드, 에스테르 및/또는 티오에스테르와 같은 유도체(derivative)에 속하는 1 내지 30개의 붕소, 탄소, 질소, 산소, 규소, 인 및/또는 황 원자로 구성된 골격(backbone)을 갖는 주 사슬(main chain)을 포함하는 합성 촉매.
제5항에 있어서, 링커가 각각 알킬, 아릴, 카보닐, 아민, 에테르, 하이드록시, 실릴, 설프하이드릴 및/또는 티오에테르 그룹과 같은 작용기 또는 산, 아미드, 이미드, 에스테르 및/또는 티오에스테르와 같은 유도체에 속하는 1 내지 30개의 붕소, 탄소, 질소, 산소, 규소, 인 및/또는 황 원자로 구성된 골격을 갖는 곁 사슬(side chain)들을 포함하는 합성 촉매.
제1항에 정의된 합성 촉매를 사용함을 특징으로 하여 표적 단백질을 선택적으로 절단하는 방법.