CN1531444A - 用于选择性地切割蛋白质的合成催化剂和使用它选择性地切割蛋白质的方法 - Google Patents

用于选择性地切割蛋白质的合成催化剂和使用它选择性地切割蛋白质的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1531444A
CN1531444A CNA028088271A CN02808827A CN1531444A CN 1531444 A CN1531444 A CN 1531444A CN A028088271 A CNA028088271 A CN A028088271A CN 02808827 A CN02808827 A CN 02808827A CN 1531444 A CN1531444 A CN 1531444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
iii
protein
synthesis catalyst
target protein
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028088271A
Other languages
English (en)
Inventor
徐正宪
孙相准
宋正培
刘昌恩
郑喆胜
全众源
洪麟锡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KOREA SUGAR PRODUCTION CO Ltd
Original Assignee
KOREA SUGAR PRODUCTION CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KOREA SUGAR PRODUCTION CO Ltd filed Critical KOREA SUGAR PRODUCTION CO Ltd
Publication of CN1531444A publication Critical patent/CN1531444A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/56—One oxygen atom and one sulfur atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/18—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 one oxygen and one nitrogen atom, e.g. guanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种可选择性地识别和切割蛋白质混合物中的特定蛋白质的合成催化剂，并涉及使用它选择性地切割目标蛋白质的方法。

Description

用于选择性地切割蛋白质的合成催化剂和使用它选择性地切割蛋白质的方法
                        技术领域
本发明涉及一种可选择性地识别和切割蛋白质混合物中的特定蛋白质的合成催化剂，和一种使用它选择性地切割特定蛋白质的方法。特定蛋白质的选择性切割使得有可能选择性地抑制蛋白质的生物活性。
                        背景技术
蛋白质在生物体中发挥各种生物功能。尤其，因为许多酶和受体负责与疾病有关的功能，抑制这些酶或受体的分子往往用作医药。对于酶的情况，抑制剂可逆地阻断酶的活性位点以抑制酶功能，而对于受体的情况，拮抗剂可逆地结合受体以降低受体功能(医药化学，第二版，Ganellin，C.R.；Roberts，S.M.Ed.；Academic Press：London，1993)。自杀抑制剂通过共价键键接到酶的活性位点上以阻断酶功能。许多毒性蛋白质造成严重健康问题，例如疯牛病的朊病毒或阿耳茨海默氏病的淀粉状蛋白(amylod)。对于毒性蛋白质，特异地切割蛋白质主链的合成分子可用作有效医药，但尚未报道过这些分子。
如果抑制剂或拮抗剂加入酶或受体中，具有活性的蛋白质的浓度的降低程度可简单地描述如下：
                     KL＝[P][L]/[PL]                (3)
其中
P表示具有活性的蛋白质，L表示抑制剂或拮抗剂。
方程式(1)的方案涉及简单的抑制剂或拮抗剂，方程式(2)的方案涉及自杀抑制剂。
如果L50表示当具有活性的蛋白质的浓度([P])变成总蛋白质浓度([P]o)的一半时L的总浓度([L]+[PL]+[PL’])，L50在方程式(1)的方案的情况下是(KL+0.5[P]o)。即，L50随着KL的下降而下降，但对一般的抑制剂或拮抗剂而言不会下降至低于0.5[P]o。在方程式(2)的方案的情况下，L50是0.5[P]o，且用于降低L浓度至其一半水平所需的时间随着KL的下降或ksi的增加而缩短。具有较低L50值的抑制剂或拮抗剂是更有效的医药。但无论是多么优异的抑制剂或拮抗剂，它们都不能阻断超过当量量的蛋白质的生物活性。
一些金属配合物已知具有切割蛋白质的能力。例如，在Cu(II)和环楞胺(cyclen)，Cu(II)和1，4，7-三氮杂壬烷，Cu(II)和三(氨乙基)胺，Pd(II)和亚乙基二胺，和Fe(III)或Co(III)和配位聚合双层膜之间形成的配合物据说能够水解蛋白质的肽键(Zhu，L.；Qin，L.；Parac，T.N.；Kostic，N.M.J.Am.Chem.Soc.1994，116，5218：Hegg，E.L.；Burstyn，J.N.J.Am.Chem.Soc.1995，117，7015：Suh，J.；Oh，S.Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，1067：Jang，B.-B.；Lee，K.P.；Min，D.H.；Suh，J.J.Am.Chem.Soc.1998，120，12008：Moon，S.-J.；Jeon，J.W.；Kim，H.；Suh，M.P.；Suh，J.J.Am.Chem.Soc.2000，122，7742：Suh，J.；Moon，S.-J.Inorg.Chem.2001，40，4890)。另外，配合到Co(III)上的酰胺已知被Co(III)离子水解(Sutton，D.A.；Buckingham，D.A.Acc.Chem.Res.1987，20，357)。但迄今没有报道选择性地进攻和切割特定蛋白质的金属配合物。
                    发明内容
如上所述，无论是多么优异的抑制剂或拮抗剂，它们不能阻断超过当量量的蛋白质的生物活性。另外，特异地切割毒性蛋白质的合成催化剂不是已知的。因此，本发明人进行深入研究以克服对用作抑制剂或拮抗剂的医药的基本限制并设计特异地切割毒性蛋白质的合成催化剂，结果，设计出一种具有以下式(A)的合成催化剂：
                (R)(Z)n                          (A)
其中
n表示整数1或更多，
R表示能够选择性地识别和结合目标蛋白质的物质，尤其是酶抑制剂或受体拮抗剂，和
Z表示金属离子-配体配合物。
因此，本发明的目的是提供一种选择性地结合和切割目标蛋白质的具有定义如上的式(A)的合成催化剂。
本发明的另一目的是提供一种使用具有式(A)的合成催化剂用于选择性地切割目标蛋白质的方法。
                        附图说明
为了充分理解本发明的本质和目的，应该结合附图参考以下详细描述，其中：
图1是显示Mb被Cu(II)I(a)或Co(III)I(b)时间依赖性降解的图；
图2是显示Mb Co(III)I降解时ko对Co的依赖性的图；
图3是Mb Co(III)I降解时ko的pH分布图；和
图4是通过Co(III)I与Mb孵育而得到的反应产物的MALDI-TOFMS光谱。
                 实现本发明的最佳方式
以下，更具体地解释按照本发明的具有式(A)的合成催化剂。
本发明的合成催化剂包含基团R作为用于识别目标蛋白质的部位，该部位可选择性地结合目标蛋白质以形成配合物。在识别部位配合到目标蛋白质上之后，由金属离子-配体配合物组成的反应部位(Z)切割目标蛋白质的肽键。如此切割的蛋白质迅速变化成具有较低催化剂结合能力的构象，且催化剂从切割的蛋白质中分离并再生以再次用于切割其它目标蛋白质分子。因此，即使合成催化剂对目标蛋白质的结合能力不强，也可以切割显著量的目标蛋白质且只要允许足够长的时间，蛋白质的活性可被抑制至足够的程度。
按照本发明的合成催化剂抑制蛋白质活性的方式可简单地表示为类似于Michaelis-Menten方案的以下方案：
其中
P定义如上，
C表示按照本发明的具有式(A)的合成催化剂，
P’表示通过蛋白质切割而得到的产物，和
Kc表示对应于Michaelis常数的常数。
从方程式(4)的方案可以看出，在合成催化剂(C)结合到活性蛋白质(P)上以形成配合物(PC)之后，它切割蛋白质以产生新蛋白质(P’)且同时自身再生。在这种情况下，对通过切割目标蛋白质(P)的一半而抑制其生物活性所需的催化剂量没有限制。允许用于抑制目标蛋白质的活性至特定水平的时间越长，可以使用的催化剂量越低。由于合成催化剂与目标蛋白质形成较强的配合物(PC)，Kc下降，而且随着Kc下降或kpc增加，蛋白质切割的速率增加。
作为按照本发明的合成催化剂的识别部位R，可以使用能选择性地识别和结合目标蛋白质的任何物质。现有结构可选自过去为目标蛋白质所积累的数据，或另外可设计新结构。
如果目标蛋白质是酶，可以使用阻断该蛋白质活性的任何已知的抑制剂。如果目标蛋白质是受体，可以使用结合到受体上的任何已知的拮抗剂。即，如果可得到用于目标蛋白质的抑制剂或拮抗剂的任何信息，现有的抑制剂或拮抗剂可用作识别部位以制备用于切割蛋白质的特制合成催化剂。但目标蛋白质上的本发明合成催化剂所结合的位置可不同于现有抑制剂或拮抗剂的结合部位。抑制剂或拮抗剂结合到对目标蛋白质的活性重要的位置上，而按照本发明的合成催化剂可在包括活性部位的任何位置上特异地识别和结合目标蛋白质。这是因为，本发明的预期目的可简单地通过切割邻近结合部位的任何肽键而实现。因此，与现有抑制剂或拮抗剂没有任何关系的新结构可用作识别部位。另外，如果目标蛋白质没有报道用于它的任何抑制剂或拮抗剂，可使用本发明的合成催化剂通过筛选而设计出新识别部位。
根据所选的目标蛋白质，或从已知用于目标蛋白质的那些中选择的抑制剂或拮抗剂，或识别部位是否是新设计的，本发明的合成催化剂中的识别部位R可不受限制地变化。因此，不可能在结构方面定义识别部位。
在以上式(A)的结构中，对应于反应部位Z的催化剂核是金属配合物如环楞胺的Cu(II)配合物。可能的金属配合物包括当其未结合到识别部位上时不能切割蛋白质或仅表现出几乎不可检测的切割活性的那些。通过将金属配合物与蛋白质识别部位结合而合成的分子，即合成催化剂，被配合到目标蛋白质上以形成缀合物(conjugate)。在目标蛋白质和合成催化剂的缀合物中，金属配合物和目标蛋白质的切割位点之间的有效浓度可足够高地使目标蛋白质的肽键有效切割。
本发明人已经发现，在使用如上的合成催化剂通过其选择性切割而实现抑制目标蛋白质的生物活性的目的时，重要的是将构成配合物的金属离子和配体限定为特定种类。
具有切割蛋白质的能力的各种金属配合物是已知的。可适用作本发明金属离子-配体配合物的组分的金属离子包括选自Ni(II)，Cu(II)，Zn(II)，Pd(II)，Cr(III)，Fe(III)，Co(III)，Rh(III)，Ir(III)，Ru(III)，Pt(IV)，Zr(IV)，和Hf(IV)的一种或多种，优选选自，Cu(II)，Cr(III)，Fe(III)，Co(III)，Rh(III)，Ir(III)和Ru(III)的一种或多种。螯合配体的骨架(skeleton)包括选自以下式的一种或多种：
Figure A0280882700091
从以上式可以看出，根据本发明的螯合配体的特征在于它是环状或无环的且包含在配体中的金属配位原子中的1-4个原子是氮原子。这些氮原子可以是芳族或非芳族氮原子。
在按照本发明的式(A)的结构中，R和Z可通过具有直接将R与Z连接的主链和可有可无的连接到主链上的一些侧链的连接体连接。当识别部位R结合到目标蛋白质上时，反应部位Z切割目标蛋白质中的一个或多个肽键。如果蛋白质上的切割位点和反应部位Z之间的有效浓度增加，可提高反应部位Z的反应性。用于控制有效浓度的有效方法是控制合成催化剂中识别部位(R)和反应部位(Z)之间的相对位置。用于控制相对位的方式是连接体的长度和形状。
连接体应该包含主链。主链的骨架(backbone)可由1-30个属于官能团如烷基，芳基，羰基，胺，醚，羟基，甲硅烷基，巯基，和/或硫醚基团以及衍生物如酰胺，二酰亚胺，酯，和/或硫代酸酯的硼，碳，氮，氧，硅，磷，和/或硫原子组成。连接体可包含侧链，后者分别具有由1-30个属于官能团如烷基，芳基，羰基，胺，醚，羟基，甲硅烷基，巯基，和/或硫醚基团以及衍生物如酸，酰胺，二酰亚胺，酯，和/或硫代酸酯的硼，碳，氮，氧，硅，磷，和/或硫原子组成的骨架。在如上所述的定义内，可设计出适合对各种目标蛋白质和合成催化剂控制切割部位和反应部位之间的有效浓度的连接体的结构。
按照本发明的合成催化剂中的反应部位(Z)可与识别部位(R)按照每一个识别部位一个或多个反应部位的比率结合。反应部位可相互相同或不同。如果1-3个反应部位相对一个识别部位而结合，典型连接模式的例子可表示如下。或者，可以将反应部位插入识别部位中。
(1)Z-R        (2)Z-Z-R      (3)Z-R-Z
(4)Z-Z-Z-R   
Figure A0280882700101
本发明通过以下实施例更具体地说明。尽管以下实施例为了说明本发明而提供，但它们不应理解为限定本发明的范围。肌红蛋白(Mb)和抗生物素蛋白用作实施例中的目标蛋白质。对于Mb，催化剂配有通过使用新制备的组合文库(combinatorial library)而发现的识别部位。另一方面，对于抗生物素蛋白，生物素用作催化剂的识别部位，因为生物素已知牢固地结合抗生物素蛋白。各种有机化合物在实施例中用作反应性金属中心的螯合配体。在实施例中，合成催化剂的摩尔加入量大于或小于目标蛋白质的量。
                      实施例
[实施例1]
在寻找蛋白质切割催化剂的结合时位，我们构建了一个包含肽核酸(PNA)类似物的环楞胺(Cyc)衍生物的组合文库(CycAc(Q)nLysNH2：Q是PNA单体A’，G，T’，或C)。PNA类似物包含可用于与DNA的核酸碱基(nucleobase)进行碱基配对的核酸碱基类似物(NB(A’)，NB(G)，NB(T’)，NB(C))。NB(A’)和NB(T’)分别识别NB(T)和NB(A)。但NB(A’)和NB(T’)相互不识别(Lohse，J.；Dahl，O.；Nielson，P.E.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，10804)。存在于文库中的PNA混合物之间的碱基配对因此可通过使用A’和T’替代A和T作为PNAs的组成成分而抑制。
Figure A0280882700111
                  CycAc(Q)nLysNH2
A’的Fmoc衍生物(N-[(2-氨基-6-{[(苄基氧基)羰基]氨基}-9H-嘌呤-9-基)乙酰基]-N-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸(1))根据方案1而合成。向(2-氨基-6{[(苄基氧基)羰基]氨基}-9H-嘌呤-9-基)乙酸(1a)(2.0g，5.8mmol)(Haaima，G.；Hansen，H.；Christensen，L.；Dahl，O.；Nielsen，P.核酸研究1997，25，4639)在DMF(100mL)中的搅拌溶液中加入N-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸叔-丁基酯的HCl盐(1b)(2.8g，6.4mmol)(Thomson，S.；Josey，J.；Cadilla，R.；Gaul，M.；Hassman，C.；Luzzio，M.；Pipe，A.；Reed，K.；Ricca，D.；Wiethe，R.；Noble，S.；四面体1995，51，6179)和三乙基胺(TEA)(1.6mL，12mmol)。向反应混合物中加入O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)(2.4g，6.4mmol)，并将该混合物搅拌3h。将溶液蒸发并将残余物溶解在二氯甲烷(MC)(100mL)中。将MC溶液用5％含水柠檬酸(50mL×2)，5％含水Na2CO3(50mL×2)，和盐水(50mL×2)洗涤，然后在Na2SO4上干燥。将溶剂蒸发掉，并快速色谱处理得到N-[(2-氨基-6-{[(苄基氧基)羰基]氨基}-9H-嘌呤-9-基)乙酰基]-N-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸叔-丁基酯(1c)
方案1
作为白色固体。Rf0.4(CH3OH/MC 1∶20)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.01(s，1H)，7.73(m，2H)，7.64(m，2H)，7.37-7.25(m，9H)，6.33(s，1H)，5.16(s，2H)，5.05和4.90(s，2H)，4.36(m，1H)，4.26(m，2H)，4.00和3.94(s，2H)，3.50(s，1H)，3.37(m，2H)，3.15(s，1H)，1.38(m，9H)。向1c(1.5g，2.1mmol)在MC(25mL)中的溶液加入三氟乙酸(TFA)(25mL)。将反应混合物搅拌5h。在溶剂蒸发掉之后，快速色谱处理得到1作为白色固体。Rf0.3(CH3OH/MC 1∶9)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.1(s，1H)，7.88(m，2H)，7.72(s，1H)，7.67(m，2H)，7.45-7.29(m，9H)，6.33(s，1H)，5.16(s，2H)，5.05和4.90(s，2H)，4.36(m，1H)，4.26(m，2H)4.00和3.94(s，2H)，3.50(s，1H)，3.37(m，2H)，3.15(s，1H)；HRMS精确质量665.6874(M+H)+，计算值C34H33N8O7 665.6854。
T’的Fmoc衍生物(N-{[2-(苄基硫基)-4-氧代嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}-N-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸(2))根据方案2合成。[2-(苄基硫基)-4-氧代嘧啶-1(4H)-基]乙酸(2a)根据文献(Lohse，J.；Dahl，O.；Nilesen，P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，11804)而合成，只是苄基基团替代甲氧基苄基基团用作S-保护基团。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.54(br s 1H)，7.69(d，1H)，7.42(d，2H)，7.38-7.25(m，3H)，5.91(d，1H)，4.68(s，2H)，4.56(s，2H)。向2a(3.6g，5.8mmol)在DMF(100mL)的搅拌溶液中加入1b(6.2g，6.4mmol)和TEA(3.6mL，12mmol)。向反应混合物中加入HBTU(5.4g，6.4mmol)并将该混合物搅拌3h。将溶剂蒸发掉并将残余物溶解在MC(100mL)中。将该溶液用5％含水柠檬酸(50mL×2)，5％含水Na2CO3(50mL×2)，盐水(50mL×2)洗涤，然后在Na2SO4上干燥。将溶剂蒸发掉，并快速色谱处理得到N-{[2-(苄基硫基)4-氧代嘧啶-1(4H)-基]乙酰基}-N-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸叔-丁基酯(2b)作为白色固体。Rf0.4(CH3OH/MC 1∶20)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.87(d，2H)，7.64(m，2H)，7.47-7.20(m，10H)，5.90(s，1H)，4.96(s，1H)，4.72(s，1H)，4.35(d，2H)，4.27(d，2H)，4.18-4.16(m，2H)，4.14(s，1H)，3.36(m，2H)，3.30(m，1H)，3.28(m，1H)，1.38(m，9H)。向2b(3.0g，4.6mmol)在MC(25mL)中的溶液加入TFA(25mL)。将反应混合物搅拌5h。在溶剂蒸发掉之后，快速色谱处理得到2作为白色固体。Rf0.3(CH3OH/MC 1∶9)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.87(d，2H)，7.64(m，2H)，7.39-7.20(m，10H)，5.90(s，1H)，4.96(s，1H)，4.76(s，1H)，4.35(m，1H)，4.23-4.16(m，3H)，4.14(s，1H)，3.39-3.35(m，2H)，3.32(m，1H)，3.15(m，1H)；HRMS精确质量599.6873(M+H)+，计算值C32H32N4O6S 599.6875。
方案2
Figure A0280882700141
[4，7，10-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酸(3)根据方案3合成。向1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三羧酸三-叔-丁基酯(3a)(10g，21mmol)(Kimura，E.；Aoki，S.；Koike，T.；Shiro，M.J.Am.Chem.Soc.1997，119，3068)，Na2CO3(2.5g，23mmol)，和CH3CN(200mL)的混合物中加入溴乙酸乙基酯(3.2mL，23mmol)。将该多相混合物回流过夜。在过滤之后，将溶剂蒸发掉，并快速色谱处理得到10-(2-乙氧基-2-氧代乙基)1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三羧酸三-叔-丁基酯(3b)作为无定形固体。Rf0.5(乙酸乙酯(EtOAc)/己烷1∶1)；1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ4.16(q，2H)，3.55-3.32(br，14H)，2.94(br s，4H)，1.45(m，27H)，1.32(t，3H)。向3b(10g，18mmol)在CH3OH(100mL)中的溶液加入含水NaOH(1N，100mL)，并将反应混合物搅拌2h。将溶剂蒸发掉之后，将残余物溶解在10％含水柠檬酸中，并将pH调节至5。在溶液用EtOAc(100mL×2)萃取并将有机层在Na2SO4上干燥和蒸发之后，3作为无定形固体而得到。1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ3.53-3.30(br，14H)，2.96(br s，4H)，1.43(m，27H)；MS(MALDI-TOF)m/z 531.75(M+H)+(C25H47N4O8计算值531.67)。
方案3
Figure A0280882700151
用fmoc基团保护的PNA单体G和C购自Applied Biosystem，用fmoc基团保护的L-赖氨酸购自Nova Biochem。用于组合文库(CycAc(Q)nLysNH2)的PNAs通过自动合成步骤使用便捷型8909核酸合成系统由A’，T’，G，C，和L-赖氨酸的fmoc-衍生物以及羧酸3而合成。在合成该文库中，假设A’，T’，G，和C的fmoc衍生物在与连接到聚合物支持载体上的成长PNA链偶联时具有同等反应性。PNA的纯度通过MALDI-TOF MS分析使用Voyager-DETM STR BiospectrometryWorkstation型而确定。将CycAc(Q)nLysNH2文库(总浓度：约7×10-5M)与CuCl2(3.5×10-4M)的水溶液混合以生成Cu(II)CycAc(Q)nLysNH2文库，其中Cu(II)结合到Cyc部分上。将蛋白质(约1×10-5M)溶液加入该混合物中以测试蛋白质的切割。对于在每个分子中包含最高8个PNA单体的Cu(II)Cyc库，在通过电泳(SDS-PAGE)检查时没有得到在37℃和pH7.0(50mM 4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(Hepes))下切割蛋白质如牛血清白蛋白，γ-球蛋白，延长因子P，明胶A，明胶B，和马心Mb的任何证据。在每个分子中包含9聚体PNAs的Cu(II)Cyc文库清楚地表现出切割Mb的活性。我们对于Cu(II)Cyc旁的已知的PNA单体合成了四组文库，并测试其对Mb切割的活性以确定最佳末端单体。通过重复查找剩下的单体，我们选择I的Cu(II)配合物(MS(MALDI-TOF)m/z 2851.49(M+H)+(C111H153N64O25S2计算值2850.58)作为催化剂。
Figure A0280882700161
I的Cu(II)配合物的原液通过将CuCl2的水溶液加入溶解在缓冲剂溶液(1mM 2-吗啉代乙烷磺酸(Mes)，pH6.0)中的I(1.2当量)中而制成。Mb被Cu(II)I降解之后是电泳(SDS-PAGE)。一个例子在图1中说明。在此，反应在pH7.5(50mM Hepes)下使用[Mb]o(Mb的起始加入浓度)7.9μM和[Cu(II)I]o(Cu(II)I的起始加入浓度)2.0μM进行。在170h中，每个Cu(II)I分子降解2.5个分子的Mb。将[Mb]的时间依赖性下降拟合成假一级动力学方程，得到假一级速率常数(ko)5.7×10-3h-1。图1所示的曲线通过将数据拟合成假一级动力学方程而得到。从反应混合物中去除氧不明显影响ko。当Mb用Cu(II)Cyc替代Cu(II)I在其它方面与上述实验相同的条件下处理时，Mb的降解不明显。
I的Co(III)配合物根据报道于文献的一般方法(Castillo-Blum，S.E.；Sosa-Torres，M.E.多面体，1995，14，223)通过将Co(III)离子引入I的Cyc部分而得到：对于Co(III)I，MS(MALDI-TOF)m/z 2908.44(M+H)+(C111H153N64O25S2Co计算值2908.51)。
Mb被Co(III)I降解之后也是电泳(SDS-PAGE)。一个例子在图1中说明。在此，反应在pH7.5(50mM Hepes)下使用[Mb]o4.7μM和[Co(III)I]o0.47μM进行。在100h中，6.0个分子的Mb被每个Co(III)I分子所降解。将[Mb]的时间依赖性下降拟合成假一级动力学方程，得到ko9.4×10-3h-1。从反应混合物中去除氧不明显影响ko。当Mb用Co(III)Cyc替代Co(III)I在其它方面与上述实验相同的条件下处理时，Mb的降解不明显。
尽管I的结构是通过使用Cu(II)配合物而寻找的，详细动力学分析使用Co(III)配合物而进行，因为Co(III)配合物的催化活性较高。在pH7.5下测定的ko对Co(催化剂的起始加入浓度)的依赖性在图2中给出。在此，[Mb]o固定为4.7μM。在图2中画出的2条直线在Co＝[Mb]o处相交。图2的动力学数据表明，当Co≥[Mb]o和因此Kc＜＜5μM时，Mb完全结合到Co(III)I上。而且，Co大于[Mb]o时测定的ko对应于kpc，其中Kc和kpc在方程式(4)中定义。在各种pHs下如此测定的kpc值在图3中给出。对根据方程式(5)的方案的钟形pH分布图的分析得到pKa1＝5.50±0.42和pKa2＝8.68±0.46。图3中的曲线构建在这些pK值的基础上。如果忽略Mb或I的离子化，这些pKa值可归因于配合到Mb上的Co(III)I的Co(III)离子的水合配体的离子化。
Figure A0280882700171
通过将Mb(12μM)与Co(III)I(3.5μM)在pH6.0和37℃下孵育85h而得到的反应混合物的MALDI-TOF MS揭示Mb被切分成2对蛋白质(一对的M.W.：7074和9892且另一对为8045和8909)，如图4所示。在图4中，具有m/z值16953和16953/2的峰是由Mb(M.W.16953)引起的。蛋白质被Co(III)I切割的可能部位是：对于这2对分别为Leu89-Ala90(产生具有M.W.7077和9894的片段)和Leu72-Gly73(产生具有M.W.8057和8914的片段)。目前还不清楚两个切割位点是否涉及催化剂的不同的结合模式。两个切割位点也可能源自在Mb和催化剂之间形成的相同的配合物。
当其它蛋白质如牛血清白蛋白，γ-球蛋白，延长因子P，明胶A，和明胶B与Cu(II)I或Co(III)I孵育时，没有观察到蛋白质切割。这表明Cu(II)I或Co(III)I对Mb是特异的。
制备Co(III)I的类似物，其中邻近CycAc单元的PNA残基是C而不是A’，如Ia所示。没有观察到Co(III)Ia在切割Mb中的催化活性，表明Mb特异地识别Co(III)I。
Figure A0280882700181
在图1的数据中，最高2.5或6个分子的Mb分别被每个分子的Cu(II)I或Co(III)I所切割，表明了Cu(II)I和Co(III)I的作用的催化性质。反应速率不受从反应混合物中去除O2的影响。这些结果以及以前对肽键被四氮杂配体的Cu(II)配合物和Co(III)配合物所水解切割的观察结果(Moon，S.-J.；Jeon，J.W.；Kim，H.；Suh，M.P.；Suh，J.J.Am.Chem.Soc.2000，122，7742：Suh，J.；Moon，S.-J.Inorg.Chem.2001，40，4890：Sutton，D.A.；Buckingham，D.A.Acc.Chem.Res.1987，20，357)支持Mb被Cu(II)I和Co(III)I切割的水解性质。
[实施例2]
化合物II根据描述于实施例1的方法而合成。
Figure A0280882700182
II的Co(III)配合物如实施例1所述而得到。当Mb(12μM)与Co(III)II(12μM)在pH7.0或pH8.0(50mM Hepes)和37℃下孵育时，Mb分别以ko1.4×10-2h-1或6.9×10-3h-1降解。实施例2的结果表明，I的Lys不是催化活性所必需的。
[实施例3]
N2，N6-二{[4，7，10-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}赖氨酸(4)根据方案4而合成。向溴乙酸(3.5g，26mmol)在氯仿(100mL)中的溶液慢慢加入N，N’-二环己基碳二亚胺(5.3g，26mmol)。将4a的HCl盐(2g，8.58mmol)通过加入二异丙基乙基胺(DIEA)(3.0mL，17mmol)而完全溶解在氯仿(50mL)中并将该溶液慢慢加入溴乙酸的溶液中。在室温搅拌8h之后，将N，N’-二环己基脲(DCU)过滤掉并将滤液蒸发。将残余物重新溶解在CH3CN(100mL)中，并将未溶解的DCU过滤掉。将滤液蒸发并快速色谱处理得到N2，N6-二(溴乙酰基)赖氨酸甲基酯(4b)作为白色固体。Rf0.7(EtOAc)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.30(br s，1H)，6.71(brs，1H)，4.55(m，1H)，4.05(d，0.7H)，3.90(m，3.4H)，3.86(s，3H)，3.30(m，2H)，1.90(m，1H)，1.76(m，1H)，1.57(m，2H)，1.37(m，2H)。向3a(3.1g，6.5mmol)，Na2CO3(2.2g，19mmol)，和CH3CN(100mL)的混合物中加入4b(1.3g，3.2mmol)。将混合物搅拌并回流2天。在过滤之后，将溶剂蒸发掉，并快速色谱处理得到N2，N6-二{[4，7，10-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}赖氨酸甲基酯(4c)作为无定形固体。Rf0.4(CH3OH/MC 1∶40)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.06(br s，1H)，6.92(br s，1H)，4.50(m，1H)，3.71(s，3H)，3.13-3.53(br m，30H)，2.79-2.63(br m，8H)，1.84-1.65(m，4H)，1.44-1.47(m，54H)，1.36(m，2H)。向4c(1.7g，1.4mmol)在CH3OH(50mL)中的溶液加入含水NaOH(1N，50mL)并将反应混合物搅拌1h。将溶剂蒸发掉，将残余物溶解在10％含水柠檬酸中，并将pH调节至4。在溶液用EtOAc(50mL×2)萃取并将有机层在Na2SO4上干燥和蒸发之后，4作为无定形固体而得到。1H NMR(300MHz，CD3OD)：4.14(m，1H)，3.17-3.46(br m，28H)，3.14(t，2H)，2.79-2.70(br m，8H)，1.73(m，1H)，1.55(m，1H)，1.36(m，54H)，1.33-1.20(m，4H)；MS(MALDI-TOF)m/z 1172.48(M+H)+(C56H103N10O16计算值1172.49)。
方案4
Figure A0280882700201
化合物III通过使用4根据描述于实施例1的方法而合成：MS(MALDI-TOF)m/z 3191.87(M+H)+(C127H185N70O28S2计算值3190.23)
Cu(II)离子与III配合作用和Mb降解的动力学测量按照实施例1所述进行。当Mb(7.9μM)与Cu(II)III(6.4μM)在pH8.0(50mMHepes)和37℃下孵育时，Mb以ko3.3×10-3h-1降解。
III的Co(III)配合物按照实施例1所述而得到。当Mb(7.9μM)与Co(III)III(4.8μM))在pH8.0(50mM Hepes)和37℃下孵育时，Mb以ko3.2×10-3h-1降解。
[实施例4]
N-({4，7，10-三[(苄基氧基)羰基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}乙酰基)甘氨酰基-N-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸(5)根据方案5合成。化合物5a({4，7，10-三[(苄基氧基)羰基]1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}乙酸)通过用于合成3的程序而合成，只是氯甲酸苄基酯用于替代二碳酸二-叔-丁基酯作为N-保护基团。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34(m，15H)，5.15(m，6H)3.53-3.30(br，14H)，2.96(br s，4H)。向5a(2g，3.2mmol)在CH3CN(100mL)中的搅拌溶液加入甘氨酸乙基酯盐酸盐(0.53g，3.8mmol)和DIEA(1.4mL，7.9mmol)。向反应混合物中加入HBTU(1.3g.3.5mmol)并将混合物搅拌2h。将溶液蒸发并将所得残余物溶解在EtOAc(100mL)中。溶液用5％含水柠檬酸(50mL×2)，5％含水Na2CO3(50mL×2)，和盐水(50mL×2)洗涤，然后在Na2SO4上干燥。在过滤器之后，将溶剂蒸发掉，并快速色谱处理得到N-({4，7，10-三[(苄基氧基)羰基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}乙酰基)甘氨酸乙基酯(5b)作为无定形固体。Rf0.5(CH3OH/MC 1∶19)；1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.29(m，15H)，7.00(s，1H)，5.28(s，6H)，4.17-4.10(m，2H)，3.90(br s，2H)，3.40-3.15(br m，14H)，2.80(br s，4H)，1.26-1.22(m，3H)。向5b(2.0g，2.8mmol)在CH3OH(50mL)中的溶液加入含水NaOH(1N，50mL)，并将反应混合物搅拌1h。将溶剂蒸发掉，残余物溶解在10％含水柠檬酸中，并将pH调节至4。在溶液用EtOAc萃取和有机层在Na2SO4上干燥和蒸发之后，N-({4，7，10-三[(苄基氧基)羰基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}乙酰基)甘氨酸(5c)作为无定形固体而得到。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.29(m，15H)，7.00(s，1H)，5.28(s，6H)，3.90(br s，2H)，3.40-3.15(br m，14H)，2.80(br s，4H)。向5c(1.5g，2.2mmol)在CH3CN(100mL)中的搅拌溶液加入1b(1.5g，2.4mmol)和DIEA(1.1mL，4.3mmol)。向反应混合物中加入HBTU(0.90g，2.4mmol)并将混合物搅拌2h。将溶液是蒸发并将残余物溶解在EtOAc(100mL)中。将溶液用5％含水柠檬酸(50mL×2)，5％含水Na2CO3(50mL×2)，和盐水(50mL×2)洗涤，并在Na2SO4上干燥。将溶剂蒸发并快速色谱处理得到N-({4，7，10-三[(苄基氧基)羰基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}乙酰基)甘氨酰基-N-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)甘氨酸叔-丁基酯(5d)作为无定形固体。Rf0.3(CH3OH/MC 1∶19)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.75(m，2H)，7.59(m，2H)，7.40-7.16(m，19H)，5.05-4.85(brs，6H)，4.37(m，2H)，4.22-4.16(m，1H)，3.95(s，2H)，3.70-3.32(br m，18H)，3.04(br s，4H)，1.47(m，9H)。向5d(1.5g，1.5mmol)在MC(25mL)中的溶液加入TFA(25mL)。反应混合物搅拌5h，溶剂蒸发掉，并快速色谱处理得到5作为无定形固体。Rf0.4(CH3OH/MC 1∶9)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.72(m，2H)，7.57(m，2H)，7.40-7.16(m，19H)，5.05-4.85(br s，6H)，4.37(m，1H)，4.20-4.18(m，2H)，4.06-3.95(br s，4H)，3.70(br s，2H)，3.40-3.10(br m，18H)，2.83-2.78(br s，4H)；HRMS精确质量1013.1403(M+H)+，计算值C55H62N7O12 1013.1370。
方案5
Figure A0280882700221
化合物IV通过使用5根据描述于实施例1的方法而合成：MS(MALDI-TOF)m/z 2879.63(M+H)+(
C117H165N68O26S2计算值2877.75)。实施例2的结果表明，I的Lys残基对识别Mb不是重要的。因此，I的PNA 9聚体部分是识别部位。为了测试具有连接在羧基末端而不是氨基末端的Cyc的PNA 9聚体是否也可用于Mb切割催化剂，合成了IV。
Figure A0280882700231
Cu(II)离子与IV的配合作用和降解Mb的动力学测量按照实施例1所述进行。当Mb(7.9μM)与Cu(II)IV(6.4μM)在pH8.0(50mMHepes)和37℃下孵育时，Mb以ko2.2×10-3h-1降解。
[实施例5]
{4，10-二[(苄基氧基)羰基]-1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷-7-基}乙酸(6)根据方案6合成。N，N-二(2-{[(2-硝基苯基)磺酰基]氨基}乙基)甘氨酸叔-丁基酯(6a)根据文献(Sasugue，J.M.；Segat-Dioury，F.；Sylvestre，I.；Favre-Reguillon，A.；Foos，J.；Madic，C.；Guy，A.四面体，2001，57，4713)合成。将溴乙基醚(1mL，7.9mmol)在DMF(100mL)中的溶液在100℃下滴加至6a和含水Na2CO3(3.0g，29mmol)在DMF(100mL)中的搅拌悬浮液。反应混合物加热过夜并浓缩。将残余物吸收在EtOAc(100mL)中。有机相用盐水(100mL×2)洗涤，在Na2SO4上干燥，并浓缩。快速色谱处理得到{4，10-二[(2-硝基苯基)磺酰基]-1-氧代-4，7，10-三氮杂环十二烷-7-基}乙酸叔-丁基酯(6b)作为无定形固体。Rf0.3(EtOAc/己烷2∶1)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.01-7.98(m，2H)，7.69(m，4H)，7.60(m，2H)，3.68(m，4H)，3.55(m，4H)，3.72-3.38(m，4H)，3.33(s，2H)，3.05(m，4H)，1.45(s，9H)。将Na2CO3(2.3g，22mmol)加入6b(1.8g，2.7mmol)和苯硫酚(0.70mL，6.8mmol)在DMF(30mL)中的溶液中。将反应混合物搅拌过夜并随后浓缩。将残余物溶解在10％含水柠檬酸中并将pH调节至3。水相用EtOAc(100mL×3)萃取。在水相pH通过加入1N含水NaOH而升至约13之后，将水相用MC(100mL×3)萃取并将有机层在Na2SO4上干燥和浓缩。该粗化合物(1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷-7-基乙酸叔-丁基酯(6c))用于下一步骤而没有进一步纯化。向6c(0.50g，1.7mmol)在氯仿(70mL)中的溶液加入TEA(0.61mL，4.3mmol)。向该搅拌溶液中慢慢加入氯甲酸苄基酯(0.43mL，3.9mmol)。将反应混合物搅拌3h，随后用5％含水柠檬酸(50mL×3)洗涤并浓缩。快速色谱处理得到7-(2-叔-丁氧基-2-氧代-乙基)-1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷-4，10-二碳酸二苄基酯(6d)作为油。Rf0.4(CH3OH/MC 1∶15)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.32-7.27(m，10H)，5.12(s，4H)，3.59-3.33(br m，14H)，2.99-2.93(br m，4H)，1.45(s，9H)。向6d(0.50g，1.0mmol)在MC(15mL)中的溶液加入TFA(10mL)。反应混合物搅拌5h。在通过蒸发去除溶剂之后，将残余物溶解在10％含水柠檬酸中并用EtOAc(50mL×3)萃取。有机层用盐水(50mL×3)洗涤，在Na2SO4上干燥，并蒸发得到6作为油。Rf0.2(CH3OH/MC 1∶10)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34-7.25(m，10H)，5.11(m，4H)，4.23-4.08(br m，4H)，3.84-3.50(br m，10H)，3.25-3.15(br m，4H)；MS(MALDI-TOF)m/z 500.50(M+H)+(C26H34N3O7计算值500.58)。
方案6
化合物V通过使用6根据描述于实施例1的方法而合成：MS(MALDI-TOF)m/z 2851.49(M+H)+(
C111H152N63O26S2计算值2850.75)。
V的Co(III)配合物按照实施例1所述而得到。当Mb(7.9μM)与Co(III)V(4.8μM)在pH8.0(50mM Hepes)或9.0(50mM三(羟基甲基)氨基甲烷)和37℃下孵育时，Mb分别以ko1.5×10-3h-1或5.3×10-3h-1降解。
[实施例6]
{4，7-二[(苄基氧基)羰基]-1，4，7-三氮杂壬烷-1-基}乙酸(7)根据方案7合成。1，4，7-三氮杂壬烷-1-基乙酸(7a)根据文献(Schulz，D.；Weyhermuler，T.；Wieghardt，K.；Nuber，B.Inorg.Chim.Acta 1995，240，217)合成。向7a(3.0g，7.4mmol)在含水NaOH(1N，50mL)和1，4-二噁烷(50mL)的混合物中的溶液慢慢加入氯甲酸苄基酯(3.0mL，22mmol)，并将溶液搅拌3h。溶剂蒸发掉，残余物溶解在1N HCl，并将pH调节至3。在溶液用EtOAc萃取之后，有机层在Na2SO4上干燥并蒸发。通过快速色谱，7作为无定形固体而得到。Rf0.4(CH3OH/MC 1∶9)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.34(m，10H)，5.15(d，4H)，3.38(m，10H)，2.74(br s，4H)；MS(MALDI-TOF)m/z 456.06(M+H)+(C24H30N3O6计算值456.52)。
方案7
Figure A0280882700261
化合物VI通过使用7根据描述于实施例1的方法而合成：MS(MALDI-TOF)m/z 2807.51(M+H)+(
C109H148N63O25S2计算值2806.69)。
Figure A0280882700262
Cu(II)离子与VI的配合作用和降解Mb的动力学测量按照实施例1所述进行。当Mb(7.9μM)与Cu(II)VI(6.4μM)在8.0(50mM Hepes)和37℃下孵育时，Mb以ko3.6×10-3h-1降解。
[实施例7]
5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]-N-[3-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基)丙基]戊酰胺(VII)(包含环楞胺的d-生物素的一种衍生物)根据方案8合成。向冷却至-60℃的MC(30mL)中顺序滴加草酰氯(1.4mL，16mmol)，DMSO(0.89mL，13mmol)，8a(2.2g，10mmol)在20mL MC中的溶液，和TEA(8.7mL，63mmol)。1小时之后，将反应混合物用50mM柠檬酸洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。硅胶(EtOAc/己烷1∶1)上柱色谱处理得到3-氧代丙基氨基甲酸苄基酯(8b)作为无色的油。向3a(2.3g，4.8mmol)在20mL THF中的溶液加入8b(1.0g，4.8mmol)在40mL THF中的溶液和NaBH(OAc)3(1.3g，6.3mmol)。反应混合物在室温下搅拌1hr。将THF蒸发并将反应混合物与50mL 0.1MNa2CO3混合并用EtOAc(50mL×2)萃取。将收集的有机相用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。在硅胶(EtOAc/己烷1∶1)上柱色谱处理得到10-(3{[(苄基氧基)羰基]氨基}丙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三羧酸三-叔-丁基酯(8c)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.32(m，5H)，5.09(s，2H)，3.56-3.16(br，14H)，2.58(br，6H)，1.66(m，6H)，1.44(m，27H)。将8c(1.0g，1.5mmol)和500mg 10％Pd/C在100mL EtOAc中的悬液在1atm H2下搅拌24hr。催化剂在Celite上过滤掉，并将溶剂蒸发掉以得到10-(3-氨基丙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三羧酸三-叔-丁基酯(8d)作为无色的油。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ3.56-3.30(br，12H)，b2.72-2.58(br，8H)，1.59(m，2H)，1.43(m，27H)。向冷却至0℃的d-生物素(0.22g，0.89mmol)在DMF(5mL)中的溶液加入HBTU(0.44g，1.2mmol)，溶解在DMF(5mL)中的8d(0.47g，0.89mmol)，和DIEA(200μl，1.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6h。将反应混合物与30mL MC混合。混合物用50mM柠檬酸(30mL×2)和盐水洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。在硅胶(CH3OH/MC 1∶9)上柱色谱处理得到10-[3-({5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)丙基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三羧酸三-叔-丁基酯(8e)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ6.52(s，1H)，5.94(s，1H)，4.50(q，1H)，4.31(t，1H)，3.53-3.33(br，12H)，3.19(m，3H)，2.90(m，2H)，2.60(br，6H)，2.25(t，2H)，1.70(m，6H)，1.44(d，27H)。向10％TFA在MC中的溶液加入8e(0.51g，0.67mmol)并将反应混合物搅拌3hr。将乙醚倒入反应混合物。收集白色沉淀物并溶解在CH3OH-二乙基醚混合物中。滴加HCl溶液以生产VII的HCl盐。将该盐从CH3OH-二乙基醚中重结晶。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ4.57(t，1H)，3.85(q，1H)，3.30-2.94(br，20H)，2.74(br，3H)，2.23(t，2H)，1.76-1.55(m，6H)，1.38(m，2H)；MS(MALDI-TOF)m/z 456.56(M+H)+(C21H42N7O2S计算值456.68)。
方案8
Figure A0280882700281
Cu(II)在Cyc部分上结合而得到VII的Cu(II)配合物(Cu(II)VII)被伴随将Cu(II)离子加入VII时的UV光谱改变所确认。考虑到生物素对抗生物素蛋白的强亲和性，测试Cu(II)VII作为用于抗生物素蛋白的蛋白质切割剂。Cu(II)VII与抗生物素蛋白的配合作用被Cu(II)VII在存在和不存在抗生物素蛋白时的凝胶渗透层析分析所确认。针对通过将抗生物素蛋白(2.5×10-5M)与Cu(II)VII(2.5×10-5M)在氩下孵育7天而得到的反应混合物在pH6(50mM Mes)在50℃下进行的脲-SDS-PAGE电泳表明，约50％抗生物素蛋白切割形成较小片段。对相同产物的MALDI-TOF MS分析表明，抗生物素蛋白(M.W.15630)切割成具有M.W.10759和4922的两种蛋白质。对抗生物素蛋白的氨基酸序列和抗生物素蛋白-生物素配合物的三维X-射线晶体学结构的检查表明，切割位点是Thr35-Ala36，得到具有M.W.10726和4922的片段。
                     工业实用性
如上所述，本发明人所设计的合成催化剂由对目标蛋白质具有亲和性的识别部位和具有切割肽键的活性的反应部位组成，并因此同时能够选择性地识别目标蛋白质和能够快速切割肽键。因此，通过使用这种合成催化剂，可以通过其在各种蛋白质混合的情况下选择性切割而抑制目标蛋白质的生物活性。

Claims (8)

1.一种能够选择性地切割目标蛋白质的表示为以下式(A)的合成催化剂：
              (R)(Z)n                (A)
其中
n表示整数1或更多，
R表示能够选择性地识别和结合目标蛋白质的物质，且
Z表示金属离子-配体配合物。
2.权利要求1的合成催化剂，其中配体是环状或无环的，且配体中包含的金属配位原子中的1-4个是氮原子。
3.权利要求1或2的合成催化剂，其中配体的骨架是选自以下的一种或多种：
Figure A028088270002C1
4.权利要求1的合成催化剂，其中金属离子是选自Ni(II)，Cu(II)，Zn(II)，Pd(II)，Cr(III)，Fe(III)，Co(III)，Rh(III)，Ir(III)，Ru(III)，Pt(IV)，Zr(IV)，和Hf(IV)的一种或多种。
5.权利要求1的合成催化剂，其中R和Z通过连接体连接在一起。
6.权利要求5的合成催化剂，其中连接体包含主链，后者具有由1-30个属于官能团如烷基，芳基，羰基，胺，醚，羟基，甲硅烷基，巯基，和/或硫醚基团以及衍生物如酰胺，二酰亚胺，酯，和/或硫代酸酯的硼，碳，氮，氧，硅，磷，和/或硫原子组成的骨架。
7.权利要求5的合成催化剂，其中连接体可包含侧链，每一个侧链具有由1-30个属于官能团如烷基，芳基，羰基，胺，醚，羟基，甲硅烷基，巯基，和/或硫醚基团以及衍生物如酸，酰胺，二酰亚胺，酯，和/或硫代酸酯的硼，碳，氮，氧，硅，磷，和/或硫原子组成的骨架。
8.一种用于选择性地切割目标蛋白质的方法，其特征在于使用在权利要求1中定义的合成催化剂。
CNA028088271A 2001-04-24 2002-04-09 用于选择性地切割蛋白质的合成催化剂和使用它选择性地切割蛋白质的方法 Pending CN1531444A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28611701P 2001-04-24 2001-04-24
US60/286,117 2001-04-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1531444A true CN1531444A (zh) 2004-09-22

Family

ID=23097153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028088271A Pending CN1531444A (zh) 2001-04-24 2002-04-09 用于选择性地切割蛋白质的合成催化剂和使用它选择性地切割蛋白质的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20020165365A1 (zh)
EP (1) EP1381392A4 (zh)
JP (1) JP2004529763A (zh)
KR (1) KR20040004578A (zh)
CN (1) CN1531444A (zh)
WO (1) WO2002085413A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3837633B2 (ja) * 2002-11-19 2006-10-25 株式会社クレディアジャパン 新規な機能性ペプチド核酸およびその製法
GB0305422D0 (en) * 2003-03-10 2003-04-16 Univ Open Detection, monitoring and treatment of cancer
PL213309B1 (pl) 2006-02-09 2013-02-28 Polska Akademia Nauk Inst Biochemii I Biofizyki Sposób hydrolizy wiazania peptydowego
WO2007104135A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Mds (Canada) Inc. Bifunctional polyazamacrocyclic chelating agents
KR20080036902A (ko) * 2006-10-24 2008-04-29 재단법인서울대학교산학협력재단 아밀로이드 형성 펩타이드 또는 단백질의 가용성 회합체에선택적으로 작용하는 절단제
KR100883132B1 (ko) * 2006-10-24 2009-02-10 재단법인서울대학교산학협력재단 아밀로이드 형성 펩타이드 또는 단백질의 가용성 회합체에선택적으로 작용하는 절단제

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5364613A (en) * 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
WO1992005804A1 (en) * 1990-09-27 1992-04-16 Brunswick Corporation Chelating agents
AU6952794A (en) * 1993-05-18 1994-12-20 Zouhair Atassi Synthetic sterically-constrained catalysts
GB9407435D0 (en) * 1994-04-14 1994-06-08 Nycomed Salutar Inc Compounds

Also Published As

Publication number Publication date
EP1381392A1 (en) 2004-01-21
EP1381392A4 (en) 2005-03-23
US20020165365A1 (en) 2002-11-07
JP2004529763A (ja) 2004-09-30
KR20040004578A (ko) 2004-01-13
WO2002085413A1 (en) 2002-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11279736B2 (en) Conformationally-preorganized, MiniPEG-containing gamma-peptide nucleic acids
CN1092662C (zh) 头孢菌素合成
AU2016210677A1 (en) Methods of Synthesis of Benzazepine Derivatives
KR20080110926A (ko) 콜레스테롤 흡수 억제 활성을 보유하는 디페닐아제티디논 유도체
Vivet et al. Synthesis of silaproline, a new proline surrogate
KR20020019325A (ko) 조절된 아민기 밀도와 공간을 제공하는 분자층을 표면에포함하는 기질 및 이의 제조방법
CN1531444A (zh) 用于选择性地切割蛋白质的合成催化剂和使用它选择性地切割蛋白质的方法
AU2022287635A1 (en) DisuIfide bond containing compounds and uses thereof
TW202112725A (zh) 肽化合物的製造方法、保護基形成用試藥及縮合多環芳香族烴化合物
JP3165698B2 (ja) チオアシル化試薬および中間体，チオペプチド，およびこれらの調製および使用法
WO2010081882A2 (en) Synthesis of new protected azahistidines, their processes and their use in synthesises
JP5399238B2 (ja) 新規な担持された酸化反応物、それらの製造方法、およびその使用
JP4008446B2 (ja) ベンゼン環上に二置換基を有するβ−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体
Khan Synthesis and Sequestrating Properties of Enterochelin Analogues
JP2552049B2 (ja) 合成ペプチド精製方法およびこれに用いるリンカー、リンカー結合用固相担体
EP4363433A1 (en) Peptide synthesis method involving sterically hindered mixed anhydride intermediate
JP2003518124A (ja) ペプチドβ−ターン構造の模倣化合物及びその製法
WO2022196797A1 (ja) アミノ酸又はペプチドの製造方法、保護基形成用試薬、及び、化合物
WO1996016333A1 (en) METHODS FOR SYNTHESIZING DIVERSE COLLECTIONS OF β-LACTAM COMPOUNDS
CN1362960A (zh) 取代的[1,4]－二氮杂䓬并[6,7,1－hi]－吲哚－4－酮类的制备方法
FR2598422A1 (fr) Pseudo-peptide comportant au moins la sequence de l'acide g-glutamyl-aspartique ou l'un de ses derives, son utilisation dans la preparation d'une composition pharmaceutique et composition pharmaceutique en resultant
De Cola Synthesis and properties of linear and cyclic peptoids
US20050176683A1 (en) Methodology for preparing combinatorial libraries based upon a bicyclic scaffold
KR19990065057A (ko) 아미노산 실릴에스터를 이용한 d-(-)-펜토락톤의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication