JP2004525902A5

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Publication number: JP2004525902A5
Application number: JP2002566203A
Authority: JP
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2022-02-21

Description

また、本発明は、リポソームに活性物質を装填する方法に関し、1つの規定されるpH値を、カプセル化のために使用し、第二のpH値を、非結合活性物質を除去するのに調節する。
また、本発明は、リポソームに活性物質を装填する方法に関し、リポソームは良好に規定されたpH値で透過性になって、封鎖される。
また、本発明は、ナノカプセルの製造でのリポソームの使用に関する。
また、本発明は、診断法における放出システムの製造でのリポソームの使用に関する。
有利には、リポソームは、活性物質の輸送及び/又は放出において使用され得る。
別の態様において、リポソームは、デポーの製剤及び/又は循環的なデポーとして適切に使用され得る。
有利には、リポソームは、静脈内又は腹膜の適用に使用され得る。
本発明の別の態様において、リポソームは、インビボ、インビトロ、エキソビボで細胞をトランスフェクションするのに、ベクターとして有効に使用される。
驚くべきことに、本発明のリポソームの脂質層の透過性は、pH値、ステロール誘導体の電荷の状態に依存する。更に、周知のCHEMSを使用すると、膜に多量のホスファチジルエタノールアミン（PE)の同時に存在するときのみ、透過性の増加を起こす。このリン脂質は、それ自体で膜を形成せず、CHEMSによって人工的に安定化される。しかしながら、このようなリポソームの１つの欠点は、安定性が低いことであり、これは、pHの変化なしで、より小さい活性物質の分子がゆっくりと拡散するという事実でわかる。
His-Cholを使用する場合、特に、ホスファチジルコリン（PC)から成る膜は、包括された活性物質又はマーカーが数分から数時間以内に拡散するような方法で、透過性になる。しかしながら、これらの膜自体は、安定であり、初期の透過性が低いことを示す。従って、本発明の構造を用いたリポソームは、放出システムを作成するのに適しており、ここで、活性物質の放出は、媒体のpH値に従って行われる。
驚くべきことに、タンパク質又はDNAの前述の平均量を、ここで述べられた化合物をリポソームの膜に含むリポソームに入れることができることも分かった。このような組み込みの効率は、使用される溶液のpH値による。従って、リポソームにタンパク質又はDNAを効率的にカプセル化する工程を、リポソームに良好に結合するであろうpH値にカーゴ分子を最初に調節することにより行うことができる。ポリアニオンであるDNAには、約４〜５の低いpH値が使用される。タンパク質には、有効なpH値はタンパク質の等電点に依存し、本発明の物質のpKa値未満であるべきである。カプセル化は、タンパク質の等電点とステロール誘導体のpKa値との間で変化するように媒体のpH値を選択する場合に特に有効である。また、タンパク質は、陰性電荷を有するが、脂質層は既に陽性総(net)電荷を有する。
もし必要であれば、外側に付着した組み込まれていないカーゴ分子を、pH値を単に上げることによって、除去することができる。この工程は、組み込まれていないカーゴ分子がリポソームの凝集を起こすであろう全ての場合に必要である。本発明の構成成分を使用する場合の１つの有利なことは、包括された活性物質が、実際封入している間に、脂質層だけと相互作用を起こすことができる条件下で維持される、ということである。一旦、脂質層がそれ自体で閉じられたままになると、他の状態に変化することが可能である。そのため、活性物質、特にタンパク質に起こり得る不活化を最小限にできる。
表面での単一の又は複数の物質の析出が、特に起こり得る場合、本発明の構成成分を含むリポソームを、当業者に周知の条件下でポリマーで被覆することができる。複数の析出において、国際特許出願第00/28972号又は国際特許出願01/64330号明細書に述べたように、任意にクロスリンカーの存在下で、リポソームのナノカプセルを形成する。
ここで述べた物質を使用する場合の１つの有利なことは、多価電解質との静電的相互作用を妨げることができることである。周知のように、多価電解質のリポソームの膜の荷電キャリアーとの相互作用は、膜構成成分の偏析及び脂質クラスターの形成を起こすことがある。多くの場合、このような偏析は、リポソームの透過化処理によって起こる。本発明の物質は、この相互作用を除き、コーティング工程が続くことを考慮に入れている。このとき、pH値を上げると、リポソームは単に立体的な様式でナノカプセルに包括されて、膜と多価電解質との間の相互作用はもはや存在しない。このようにして、脂質のクラスター形成及び関連した膜の透過化処理を避けることができる。
本発明により教授されるこの１つの変形において、透過性のこれらの変化を、装填しているリポソームにきちんと方向付けられた様式で使用する。このため、封入された活性物質を、高い透過性の条件下で媒体に添加することができ、低い透過性の状態を調節する。このような方法で、活性物質をリポソーム内に残す。その後、包括されていない活性物質を、必要に応じて除去できる。このような透過性の変化を、リポソーム又はリポソームのナノカプセルに誘導できる。

また、驚くべきことに、例えば、His-Chol又はPip-Cholを膜に含むリポソームが、金属イオンをキレート化できることが分かった。この性質によって、リポソームの正電荷の増加が起きる。この効果は、中性のpH値で特に強いことが観察され、これは、この場合、化合物の内在している電荷が低いからである。これらのキレート化の特性により、このようなリポソームを、生化学的診断及び医薬品的治療に使用することができる。
検出システムでは、このようなリポソームに、蛍光をキレート製剤で増強する金属イオン、即ち、例えばデルビウムやユーロピウムイオンで装填することができる。このような使用のためのリポソームは、特異性を測定する構成成分、即ち、抗体、レクチン、セレクチン、レセプター又はホルモン、又はRNAアプタマーを更に含む。本発明による使用の特に好ましい態様において、これらの金属イオンの存在によって、外側に付着してゆっくりと放出される金属イオンからの非特異的なシグナルを避けられるように、リポソームの量が制限される。
ピリジルジチオエチニルアミンとCHEMSのカップリングは、望ましい性質の特別な組合せを有する化合物を提供する。末端ピリジル基によって、穏やかな条件(pH６〜７）の下でも膜に有意な正の荷電が生じる。この化合物を使用して生成されたリポソームは、多量の前記平均量のタンパク質又は核酸を結合することが可能である。ジスルフィド結合の減少により、例えば、ジチオスレイトール又はトリス(2-カルボキシエチル）ホスフィンを使用することによって、遊離チオール官能基が生成され、表面の中和を起こす。これらの条件下で、タンパク質又は核酸の増強された結合が減少する。最終的に、結合は、pH値を上げると完全に失われるが、これはチオラートイオンの形成が陰性に荷電した表面で起こるからである。
生物学的高分子がそれ自体のチオール官能基を有する場合、それらの結合を維持できる。これは、多数のタンパク質を有する場合である。他の材料に関する場合、このような分子にそれらの生物学的活性を残しつつ、遊離チオール官能基を導入する手順について、当業者は詳しいであろう（G.Hermanson、バイオコンジュゲート技術）。遊離チオール官能基を含む物質を、ジスルフィド交換反応を用いて、このような脂質層の表面に共有結合で固定することができる。
タンパク質の結合及びカップリングの特に有利な特性のため、PDEA-Cholを含むリポソームは、国際特許出願第00/28972号明細書に述べられているような、リポソームのテンプレートでのナノカプセルの生成に特に好適である。

His-Cholの合成
１．３１ｇのコレステロールヘミスクシネートを、２０ｍｌのDMFに、室温で溶解した。この溶液を、２０ｍｌのDMFに溶解した４３８ｍｇのカルボニルジイミダゾールに加えた。混合物を１時間攪拌し、その後３００ｍｇのヒスタミンを加えた。この混合物を一晩攪拌し、真空で十分に濃縮した。残渣を、シリカ（Kieselgel-60)のカラムクロマトグラフィーで生成し、溶出剤としてクロロホルム／メタノール１０：１を使用した。
(収率５４％；１．４５ｍモル）、HPLCで精製、MS及び¹³C-NMRでアイデンティティを測定。

陽イオン性pH感受性リポソームの調製
５ｍｇのHis-Chol及び９．８ｍｇのPOPCを、４ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１ V/V)に溶解し、ロータリーエバポレーターで完全に乾燥した。脂質薄膜を、しばらく超音波処理（５分）を用いて５ｍＭの脂質濃度で、４．３ｍｌの対応するバッファー（１０ｍＭ Kac、１０ｍＭ HEPES、１５０ｍＭＮａＣｌ、pH７．５）で水和した。最後に、懸濁液を凍結し、続いて溶解して、複数回の押出し(extrusion)を行った（Avestine LiposoFast、ポリカーボネートフィルター、孔径２００ｎｍ）。
様々なpH値でのゼータ電位のプロフィールを、以下の表に示す。

Claims

以下の式(1)に従うステロール誘導体：
陽イオン−スペーサー２−Ｙ−スペーサー１−Ｘ−ステロール (1)
（式中、
・前記陽イオンが、イミダゾリル基、モルホリニル基、ピリジニル基及びピリジルジチオ基から成る群から選択され、
・スペーサー１が、１〜２個のＣ原子を有し、直鎖又は分枝鎖構造で、０、１又は２つのエチレン不飽和結合を有する低級アルキル残基からなる群より選択され、
・スペーサー２が、８個までのＣ原子を有し、直鎖、又は分枝鎖構造で、０、１又は２つのエチレン不飽和結合を有する低級アルキル残基からなる群より選択され、
・前記連結基Ｘが、-(C=O)-O-、-(C=O)-NH-及び-(C=O)-S-から成る群から選択され、
・前記連結基Ｙが、-O-(O=C)-、-S-(O=C)-及び-NH-(O=C)-から成る群から選択され、
・前記ステロールが、コレステロール、シトステロール、キャンペステロール、デスモステロール、フコステロール、スチグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5α-コレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール及び/又はデヒドロエルゴステロールから成る群から選択され、
・全体の分子が、pKa値３．５〜８を有する）。
前記ステロール誘導体が、pKa値４〜６．５を有する、請求項１記載のステロール誘導体。
請求項１又は２に記載のステロール誘導体を含むリポソーム。
前記リポソームが、５〜５０モル％のステロール誘導体を含む、請求項３記載のリポソーム。
前記リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及び/又はジアシルグリセロールを含む、請求項３又は４記載のリポソーム。
前記リポソームが、中性又は負に荷電している、請求項５記載のリポソーム。
前記リポソームが、平均粒径５０〜１０００ｎｍである、請求項３〜６のいずれか１項記載のリポソーム。
前記リポソームが活性物質を含む、請求項３〜７のいずれか１項記載のリポソーム。
前記活性物質が、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド及び/又はデコイヌクレオチドである、請求項８記載のリポソーム。
前記活性物質の少なくとも８０％が、リポソーム内にある、請求項８又は９記載のリポソーム。
ナノカプセルの製造における、請求項３〜１０のいずれか１項記載のリポソームの使用。
診断法での放出システムの製造における、請求項３〜１０のいずれか１項記載のリポソームの使用。
活性物質の輸送及び/又は放出のための、請求項３〜１０のいずれか１項記載のリポソームの使用。
デポー製剤及び/又は循環的なデポーとしての、請求項３〜１０のいずれか１項記載のリポソームの使用。
細胞をトランスフェクションするベクターとしての、請求項３〜１０のいずれか１項記載のリポソームの使用。
前記リポソームが、５〜４０モル％のステロール誘導体を含む、請求項３記載のリポソーム。
前記リポソームが、平均粒径５０〜３００ｎｍである、請求項３〜６のいずれか１項記載のリポソーム。