JP2004520056A5

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Publication number: JP2004520056A5
Application number: JP2002566373A
Authority: JP
Filing date: 2002-02-18
Publication date: 2005-12-22

Description

背景技術
セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）は、酵素の銅含有アミンオキシダーゼファミリーに属し（ＣｕＡＯ；ＥＣ．１．４．３．６）、そして真核および原核生物の両方に広く分布する（Buffoni, 1993）。この豊富な酵素の生理学的役割は、本質的に未知で、そして高アフィニティの内因性基質はこれまで同定されず、しかしベンジルアミンは、人工的な高アフィニティ基質である（Buffoni, 1993; Callingham et al., 1995;Lyles, 1996, Hartmann and McIntire, 1997; Holt et al., 1998）。ヒトにおいて高ＳＳＡＯ活性は、血管平滑筋細胞に見出される（Lewinsohn 1984; Nakos and Gossrau, 1994; Yu et al., 1994; Lyles and Pino, 1998; Jaakkola et al., 1999）。ＳＳＡＯ活性はまた、非血管型の平滑筋細胞におよび内皮細胞に検出された（Lewinsohn, 1984; Castillo et al., 1998; Jaakkola et al., 1999）。小量のＳＳＡＯタンパク質はまた、組織結合形態と比較して類似特性を示す血液中に見出される（Yu and Zuo, 1993; Yu et al., 1994; Kurkijaervi et al, 1998）。

多くの研究は、血漿中のＳＳＡＯ活性が、いくつかのヒトの状態、例えば心不全、アテローム性動脈硬化症および糖尿病で上昇することを実証した（Lewinsohn, 1984; Boomsma et al., 1997; Ekblom. 1998; Boomsma et al., 1999; Meszaros et al., 1999）。酵素活性のこれらの変化に横たわる機構は、現在特徴付けられていない。内因性アミンオキシダーゼによって生産される反応性アルデヒドおよび水素ペルオキシダーゼが、心臓血管疾患の進行の原因となりまたは寄与し得ること、および糖尿病におけるＳＳＡＯ活性の阻害が血管合併症を減少させ得ることを示唆した（Ekblom, 1998）。

図面の簡単な説明
図１は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯＤＮＡ構築物の概略図である。ＧＳＴ融合パートナーにおける３つのシステインからセリンへの突然変異（GenBank受託番号Ｍ１４６５４を有する配列による残基８５、１３８および１７８）は、太字で示される。ボックスを付した配列は、３Ｃプロテアーゼの認識配列を示す。
図２は、ＳＳＡＯ精製プロセスの概観である。それぞれの精製工程について決定された比活性を示す。
図３は、ｐＭＢ８８７と命名されたＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターの該略図である。

安定クローンのトランスフェクションおよび選択
３種の２５ｃｍ^２Ｔフラスコに約４ｘ１０^５ヒト胚腎臓２９３細胞（HEK293細胞、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３, Rockville, MD）を播種した。細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを補足したDulbeccoの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む増殖培地で５０％までコフルエントに増殖させた。このＦＢＳを５６℃３０分間熱不活性化し次いで、増殖培地成分と混合した。発現ベクターｐＭＢ８８７を次いで、製造者の推奨にしたがってLipofectAMINEを使用して（Life Technologies, Frederick, MD）リポソーム仲介トランスフェクションによって細胞に導入した。４８時間の増殖後、安定的にトランスフェクトした細胞の選択のために、培地を１ｍｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇ４１８）で補足した増殖培地に、全てのフラスコで培地を交換した。約２週間後、抵抗性細胞が出現し、そしてコフルエントに増殖させた。３つのＴフラスコからの細胞をプールし（クローンの混合物）、そして１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補足した増殖培地中に希釈し、そして１５ｃｍペトリ皿に播種した。個別のコロニーが２週間後に出現し、そしてＧＳＴ−ＳＳＡＯ生産の次の分析のために個別に拡張させるべくつまみ出した。拡張したクローンからの、収集した培地中のＧＳＴタンパク質の検出を、ＧＳＴ９６ウェル検出モジュール（Amersham Pharmacia Biotech)を使用して実施した。７個の陽性クローンを選択および凍結した。

サイズ排除クロマトグラフィーを、SMART System(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、Superdex 200 PC 3.2/30カラム(Amersham Pharmacia Biotech)において実施した。カラムを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファーで室温で平衡化させた。注入容量は、１０μｌであり、そしてサンプルを、０．１ｍｌ／分の流速で溶出させた。カラムキャリブレーション分子量マーカーのため、Gel Filtration HMW Calibration Kit(Amersham Pharmacia Bioech)からの、Blue Dextran 2000(〜２０００ｋＤａ）、チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）およびアルドラーゼ（１５８ｋＤａ）を使用した。

実施例４：ＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの調質された培地上での当初の分析
ＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターｐＭＢ８８７で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の小規模の培養からの調質培地におけるベンジルアミンオキシダーゼ活性は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯが培養培地中に分泌されたことを示した。更なる分析は、グルタチオン−セファロースビーズを使用して、調質培地から直接的に小量のＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質を精製し得ること（データ示さず）、そして精製された材料はベンジルアミンオキシダーゼ活性を有することが、示された。興味深いことに、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質が、グルタチオン−セファロースビーズ上に固定化されたとき、活性であることが見出された。調質培地中のＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の量は、ビーズ上に捕捉されたタンパク質の量の評価によって、〜１ｍｇ／Ｌであると計算された。

実施例５：ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の分取精製および部位特異的切断
アフィニティ精製に基づく手法の概略は、図２に示す。精製の結果は、表１にまとめる。１つの選択されたクローンは拡張し、そしてCell Factriesで生長し、より多量の、精製のためのＧＳＴ−ＳＳＡＯを生成した。収集した調質された培地を濃縮およびろ過し、グルタチオン−セファロースカラム上に負荷するための時間を減少させた。次いで、グルタチオン−アフィニティクロマトグラフィーを、濃縮およびろ過した調質された培地からＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質を精製するため適用した。カラム上に捕捉されたタンパク質を、２０ｍＭＧＳＨで溶出させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件で分析した。これは、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質が高純度を有すること、および単一の工程で培養培地中の多量の他のタンパク質から単離し得ることを示した。ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質は、分子量マーカの１１６ｋＤａタンパク質とのレベルで移動した。全８．８ｍｇのタンパク質を、グルタチオン−セファロースカラムから回収した。ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の比活性は、３４３ｎｍｏｌ・分^−１・ｍｇ^−１であると決定された。興味深いことに、比活性は、還元剤ＧＳＨを除去するバッファー交換工程によって、ほとんど２倍であった（６３４ｎｍｏｌ・分^−１・ｍｇ^−１）。

精製ＳＳＡＯタンパク質の比活性は、５２２ｎｍｏｌ・分^−１・ｍｇ^−１であると決定された。これは切断前に決定された比活性よりも小さかった。ＤＴＴを使用して、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の切断中の３Ｃプロテアーゼ活性を確保したから、我々は、切断バッファーがＳＳＡＯホモダイマー中の可能なジスルフィド架橋に影響したかいなか見るため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元性）を作成した（Kurkijaervi et al., 1998; Smith et al., 1998; Salminen et al., 1998）。推定されたＳＳＡＯモノマー（〜９７ｋＤａ）のみが、みられ得る（データ示さず）。しかし、ＳＳＡＯタンパク質は、５℃での貯蔵中に、〜１７０ｋＤａのサイズにトランスフォームし（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した）、このことは、１またはいくつかのジスルフィドが形成されたことを示した。切断バッファーを、透析ろ過（diafiltration）によって除去し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、該ＳＳＡＯタンパク質がなお明らかにダイマー性であり、分子量が〜１７０ｋＤａであることを示した。全部で３．６ｍｇの組換えＳＳＡＯを、８０９ｎｍｏｌ・分^−１・ｍｇ^−１の比活性を有する９，４リットルの調質培地から取得した。プロセスの全体収率は、決定されたベンジルアミンオキシダーゼ活性に基づいて２２％であった。

興味深いことに、ＧＳＴ融合パートナーは、ＳＳＡＯタンパク質のベンジルアミンオキシダーゼ活性に顕著には影響がなかった。バッファー交換工程後の精製ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の比活性は、６３４ｎｍｏｌ・分^−１・ｍｇ^−１と決定された。ＧＳＴ融合パートナーの除去後、ＳＳＡＯの比活性は、８０９ｎｍｏｌ・分^−１・ｍｇ^−１と決定された。しかし、ＧＳＴ融合パートナーの分子質量は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の〜２５％であり、そしてＧＳＴの除去後の比活性の増加は、同じ範囲であった。これは、該融合タンパク質を酵素特性把握のために使用する可能性を開く。さらに、アフィニティ融合パートナー、例えばＧＳＴを使用して、固体支持体上に有向の態様で組換えタンパク質を結合または固定化し、例えばタンパク質−タンパク質相互作用および酵素特性把握を研究することができる(Nilsson et al., 1997)。ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質は、それをグルタチオン−セファロースビーズに結合させたとき、実際に活性であった。

図１は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯＤＮＡ構築物の概略図である。ＧＳＴ融合パートナーにおける３つのシステインからセリンへの突然変異（GenBank受託番号Ｍ１４６５４を有する配列による残基８５、１３８および１７８）は、太字で示される。ボックスを付した配列は、３Ｃプロテアーゼの認識配列を示す。図２は、ＳＳＡＯ精製プロセスの概観である。それぞれの精製工程について決定された比活性を示す。図３は、ｐＭＢ８８７と命名されたＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターの概略図である。

Claims

（ｉ）宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を指令するシグナルペプチド、
（ｉｉ）ヒトセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）の可溶性形態、
（ｉｉｉ）ヒトＳＳＡＯの可溶性形態のダイマー化を、可能とする融合パートナー、および
（ｉｖ）該ヒトＳＳＡＯの可溶性形態と該融合パートナーの間に位置するプロテアーゼ切断部位、
を含む、分泌される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
該ヒトＳＳＡＯの可溶性形態が、配列番号２のアミノ酸２９ないし７６３またはそのフラグメントを含む、請求項１の核酸。
該融合タンパク質が、ベンジルアミンオキシダーゼ活性を有する、請求項２の核酸。
該ヒトＳＳＡＯの可溶性形態が配列番号２のアミノ酸２９ないし７６３を含む、請求項２の核酸。
該融合タンパク質がヒトＳＳＡＯの膜横断部分を欠く、請求項１の核酸。
該融合タンパク質が配列番号２のアミノ酸６ないし２６を欠く、請求項１の核酸。
該融合パートナーがヒトＳＳＡＯの可溶性形態のＮ末端部分に融合されている、請求項１の核酸。
該融合パートナーがグルタチオンＳトランスフェラーゼまたはその機能的に同等の変異体である、請求項１の核酸。
該融合パートナーがSchistosoma japonicumグルタチオンＳトランスフェラーゼの変異体であって、該変異体は他のアミノ酸残基によって置換された８５、１３８および１７８位の少なくとも１つのシステイン残基を有する、請求項８の核酸。
該融合パートナーが配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項８の核酸。
該シグナルペプチドがマウスＩｇＧ１重鎖シグナルペプチドである、請求項１の核酸。
該プロテアーゼ切断部位が３Ｃプロテアーゼ切断部位である、請求項１の核酸。
該３Ｃプロテアーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＥＡＬＦＱＧ（配列番号６）を含む、請求項１２の核酸。
該融合タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１の核酸。
請求項１の核酸を含む発現ベクター。
請求項１４の核酸を含む、発現ベクター。
組換えヒトＳＳＡＯの精製のための方法であって、
（ｉ）請求項１５の発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、
（ｉｉ）培養培地中で、かつ該発現ベクターによってコードされた融合タンパク質が、該培養培地に分泌される条件下で培養すること、
（ｉｉｉ）分泌された融合タンパク質を、融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンドに結合させること、
（ｉｖ）該融合パートナーおよびヒトＳＳＡＯの可溶性形態を分離すること、および
（ｖ）ヒトＳＳＡＯの可溶性形態を回収すること
を含む方法。
融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンドがグルタチオンまたはその誘導体である、請求項１７の方法。
該融合パートナーを、プロテアーゼ切断によってヒトＳＳＡＯの可溶性形態から分離する、請求項１７の方法。
該プロテアーゼがピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼである、請求項１９の方法。
該プロテアーゼがライノウイルス３Ｃプロテアーゼである、請求項２０の方法。
該プロテアーゼを融合パートナーに融合させて融合プロテアーゼを得る、請求項１９の方法。
該融合プロテアーゼが、ヒトＳＳＡＯの可溶性形態から、該融合プロテアーゼを該融合プロテアーゼに対してのアフィニティを有するリガンドに結合させることを含む方法によって分離される、請求項２２の方法。
固定化された組換えヒトＳＳＡＯの製造のための方法であって、
（ｉ）細胞を請求項１５の発現ベクターでトランスフェクトすること、
（ｉｉ）該細胞を、培養培地中で、かつ該発現ベクターによってコードされる融合タンパク質を該培養培地中へ分泌させる条件下で培養すること、
（ｉｉｉ）該分泌された融合タンパク質を、融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンドへ結合させ、これによって該融合タンパク質を固定化すること、
を含む方法。
請求項１の核酸によってコードされる融合タンパク質。
該融合タンパク質が、該融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンド上に固定化される、請求項２５の融合タンパク質。