JP2004510752A - アンタゴニスト抗cd40抗体を用いるb細胞悪性腫瘍の治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、悪性B細胞およびB細胞由来の腫瘍によって特徴付けられる疾患に対する、アンタゴニスト抗CD40抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いた治療の方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
B細胞はインビボでの通常の免疫応答の間に、重要な役割を果たす。外来の抗原は特定B細胞の免疫グロブリン表面に結合し、エンドサイトーシス、プロセシング、クラスII−MHC分子上にプロセシングされたペプチドの提示、およびB細胞表面上へのB7抗原の上方調節を含む一連の事象を誘発する。その後、特定のT細胞は、クラスII−MHC分子上への提示されたプロセシングされた抗原のT細胞受容体(TCR)認識を介してB細胞に結合する。TCRを介した刺激によって、T細胞が活性化され、T細胞がサイトカインの産生を開始する。T細胞をさらに活性化する二番目のシグナルは、T細胞上のCD28抗原とB細胞上のB7抗原との間の相互作用である。上記シグナルが受容されると、CD40リガンド(これは休止ヒトT細胞上には提示されていない)が、T細胞表面上で上方調節される。CD40リガンドが、B細胞表面上のCD40抗原に結合することにより、B細胞が刺激され、B細胞を可溶性免疫グロブリンを高レベルで分泌する形質細胞へ成熟させる。
【0003】
CD40は、正常ヒトB細胞および新生物ヒトB細胞の両方、樹状細胞、単核細胞および上皮細胞、いくつかの上皮癌ならびに抗原提示細胞(APC)の表面に存在する細胞表面性抗原である。APC上でのCD40の発現は、ヘルパーTリンパ球および細胞傷害性Tリンパ球両方の活性化において重要な、同時刺激の役割を果たす。CD40受容体は、好酸球、慢性関接リウマチにおける滑膜、活性化血小板、炎症を起こした血管内皮細胞、表皮繊維芽細胞、およびその他の非リンパ球性細胞型の上にもみられる。このCD40受容体は、活性化T細胞、活性化血小板、および炎症を起こした血管性平滑筋細胞上で発現されている。CD40は、低レベルで血管内皮細胞上でも発現されていて、局所的な炎症の領域では、上方調節されている。
【0004】
ヒトCD40は、推定分子量30,600である277アミノ酸のペプチドで、主に疎水性アミノ酸を含む19アミノ酸の分泌シグナルペプチドを有する。このCD40受容体は、細胞表面に高度に改変された糖タンパク状態で存在し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル中で約50kDaのポリペプチドとして移動する。
【0005】
CD40抗原は、ヒト神経成長因子(NGF)受容体、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)受容体、およびFasに関係することが知られている。このことは、CD40がB細胞の活性化に重要な機能を有するリガンドに対する受容体であることを示唆する。B細胞の分化において、その分子はプレB細胞上にまず発現され、その後、B細胞が形質細胞に変化したとき細胞表面から消失する。そのCD40細胞表面抗原は、B細胞の増殖および分化において重要な役割を果たす。
【0006】
そのリガンド(CD40LまたはCD154と呼ぶ)のCD40受容体への結合は、B細胞の増殖および分化、抗体の産生、アイソタイプスイッチ、ならびにB細胞記憶生成を刺激する。ヒトCD40L(CD40受容体)遺伝子およびマウスCD40L遺伝子はクローン化されている(Spriggsら(1992)J.Exp.Med.176:1543;Armitageら(1992)Nature 357:80;および米国特許第6,264,951号)。APC、(例えば、マクロファージおよび樹状細胞など)の上のCD40リガンドによるCD40受容体の結合は、MHCクラスIIおよびCD80/86の細胞表面での発現を上方調節し、IL−8、IL−12、およびTNFのようなプロ炎症性サイトカインの分泌を誘導し、これらすべてはT細胞への抗原提示能を増強する。
【0007】
すべてのB細胞は、CD40を含む共通の分子表面マーカーを発現している。低悪性度およびに高悪性度のB細胞リンパ腫、急性Bリンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、ならびにホジキン病の患者由来の形質転換細胞は、CD40を発現する。CD40の発現は、急性骨髄芽球性白血病の三分の二の症例およびAIDS関連のリンパ腫の50%でも、検出されている。さらに、B細胞系統のいくつかの腫瘍由来の悪性B細胞は、高度のCD40を発現し、生存および増殖に対するCD40のシグナル伝達に依存するようである。
【0008】
さらに、免疫芽球性B細胞リンパ腫は、例えば同種移植片レピシエントおよび長期の免疫抑制療法を受けている他患者、AIDS患者、ならびに例えばX連鎖性リンパ増殖症候群またはヴィスコット−オルドリッチ症候群(Thomasら(1991)Adv.Cancer Res.57:329;Strausら(1993)Ann.Intern.Med.118:45)のような、一次免疫不全症候群の患者のような、免疫システムが損なわれた患者に発生する。これらの腫瘍は、潜在性エプスタインバールウイルス(EBV)感染による損傷T細胞の制御の結果として生じるようである。同様のヒト由来リンパ腫は、健康なEBV陽性個体から採取された末梢血リンパ球(PBL)をマウスに接種することにより(Mosierら(1988)Nature 335:256;Roweら(1991)J.Exp.Med.173:147)、重症複合免疫不全症(SCID)とともに、誘導されうる。
【0009】
非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病を含む、低悪性度のB細胞系統悪性疾患の病原論は、CD40による成長/生存シグナルおよびFasによる不良細胞死シグナルの不均衡に強く影響される。低悪性度の非ホジキンリンパ腫の研究によって、その疾患はFas媒介性アポトーシスの減少によるリンパ腫性細胞の蓄積およびCD40をとおした生存シグナルの増加の結果であることが示唆される。CD40は、非ホジキンB細胞リンパ腫患者から採取したリンパ腫細胞の生存シグナルを提供し、それらのインビトロでの増殖を刺激する(Romanoら(2000)Leuk.Lymphoma 36:255−262;Furmanら(2000)J.Immunol.164:2200−2206、Kitadaら(1999)Br.J.Haematol.106:995−1004;Romanoら(1998)Blood 92:990−995、Jacobら(1998)Leuk.Res.22:379−382;Wangら(1997)Br.J.Haematol.97:409−417;Plankenら(1996)Leukemia 10:488−493;およびGreinerら(1997)Am J.Pathol.150:1583−1593)。
【0010】
非ホジキンリンパ腫および悪性疾患の多様なグループの約85%は、B細胞起源である。非ホジキンリンパ腫は、脾臓、胸腺、およびリンパ節の構成物起源である。作用方式(Working Formulation)分類スキーム中に、これらのリンパ腫は、これらの自然な歴史によって、低悪性度、中悪性度、および高悪性度の範疇に分類されてきた(「非ホジキンリンパ腫病理学分類プロジェクト」,Cancer 49(1982):2112−2135参照)。低レベルまたは快方に向かっているリンパ腫は、進行が遅く、メジアンは、5年から10年生存である(HorningおよびRosenberg(1984)N.Engl.J.Med.311:1471−1475)。化学療法によって、進行の遅いリンパ腫の大部分で寛解を誘導し得るが、回復はまれで、ほとんどの患者は結局再発し、さらなる治療を必要とする。中悪性度および高悪性度のリンパ腫は、より攻撃的な腫瘍であるが、これらは化学療法によって回復するより高い可能性がある。しかし、これら患者のかなりの数は、やはり再発し、寛解を誘導するさらなる治療が必要である。さらに、化学療法を受けた患者らは、毒性効果を経験しうる。従って、悪性腫瘍B細胞の疾患を処置するための新しい治療法が必要である。
【0011】
(発明の要旨)
非ホジキンリンパ腫(高悪性度リンパ腫、中悪性度リンパ腫、および低悪性度リンパ腫)、ホジキン病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、および骨髄芽球性白血病のようなリンパ腫を含む、悪性B細胞を含む疾患の患者を処置する方法を、提供する。本方法は、抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて患者を処置する工程を含む。この抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントは、正常ヒトB細胞上のCD40抗原に結合した場合、有意なアゴニスト活性がなく、悪性のヒトB細胞上のCD40抗原に結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。本発明の方法での使用に適したモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、以下の性質を示す:1)ヒト細胞の表面に発現されているヒトCD40抗原へ特異的に結合し得る、2)正常ヒトB細胞上のCD40抗原へ結合した場合、有意なアゴニスト活性がない、および3)悪性ヒトB細胞上のCD40抗原へ結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。いくつかの実施形態において、本抗CD40抗体またはそのフラグメントはまた、正常ヒトB細胞上のCD40抗原へ結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。モノクローナル抗体は、CD40へ強い親和性を示し、少なくとも10−5M、好ましくは少なくとも約10−8Mから約10−20M、より好ましくは少なくとも約5×10−9Mから約10−16Mの解離定数(Kd)によって特徴付けられる。適切なモノクローナル抗体は、ヒト定常領域を有する。その定常領域は、好ましくは、全体的または部分的にヒト化したフレームワークを有し、および、最も好ましくは、完全にヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを有する。そのようなモノクローナル抗体の例は、本明細書中で15B8と記載されている抗体、15B8と記載されているハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、配列番号1および配列番号3からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体;およびヒトCD40への特異的な結合能を有している、これらモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントである。
【0012】
本発明の一つの実施形態において、治療法は、適切な抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物の治療的有効用量を患者に投与する工程を含む。抗CD40抗体またはそのフラグメントの治療的有効用量は、約0.01mg/kgから約40mg/kgの範囲内、約0.01mg/kgから約30mg/kgの範囲内、約0.1mg/kgから約30mg/kgの範囲内、約1mg/kgから約30mg/kgの範囲内、約3mg/kgから約30mg/kgの範囲内、約3mg/kgから約25mg/kgの範囲内、約3mg/kgから約20mg/kgの範囲内、約5mg/kgから約15mg/kgの範囲内、または約7mg/kgから約12mg/kgの範囲内である。処置は、抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントの単一の治療的有効用量の投与または複数回の治療的有効量の投与を含み得ることが認識される。
【0013】
本発明の方法において使用に適した抗CD40抗体は、改変され得る。抗CD40抗体の改変として、免疫学的に活性なキメラ抗CD40抗体、ヒト化抗CD40抗体、および免疫学的に活性なマウス抗CD40抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0014】
(発明の詳細な説明)
本発明は、悪性B細胞由来の疾患を有するヒト患者を治療するための方法に関する。本方法は、抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた処置を含み、その処置法において、抗体またはその抗原結合フラグメントの投与が、この治療法を受けた患者内に正の治療上の応答を促進する。本発明の方法での使用に適切な抗CD40抗体は、以下の特徴を有する:1)これらはヒト細胞表面上に発現しているヒトCD40抗原に特異的に結合する;2)これらは、正常ヒトB細胞上のCD40抗原へ結合した場合、有意なアゴニスト活性がない;および3)これらは、悪性ヒトB細胞上のCD40抗原へ結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。これら抗CD40抗体およびその抗原結合フラグメントは、本明細書では、アンタゴニスト抗CD40抗体として、参照されている。このような抗体は、以下に記載されている完全なヒトモノクローナル抗体15B8およびモノクローナル抗体15B8の結合特性を有するモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。以下により詳細に議論されているように、これら抗体は、CD40受容体に特異的である。正常なヒトB細胞表面上に提示されたCD40に、これら抗体が結合した場合、その抗体は有意なアゴニストの活性がない。いくつかの実施形態において、正常なヒトB細胞表面上に提示されたCD40へのそれら抗体の結合は、結果として、これら正常なヒトB細胞の増殖および分化を阻害する。従って、本発明の方法における使用に適切なアンタゴニスト抗CD40抗体は、細胞表面にCD40抗原を発現している正常なヒトB細胞へのアンタゴニスト活性を示し得るこれらのモノクローナル抗体を含む。アンタゴニスト抗CD40抗体が悪性ヒトB細胞表面上に提示されているCD40に結合した場合、抗体は本明細書中の他の箇所で定義されたアンタゴニスト活性を示す。
【0015】
「処置」は、本明細書中で抗CD40抗体アンタゴニストまたはその抗原結合フラグメントの患者に対する適用または投与として、あるいはアンタゴニスト抗CD40抗体またはそのフラグメントの患者から単離された組織または患者由来の細胞株に対する適用または投与として、定義される。この場合、その患者は疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因を有し、その目的は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因に対する治療、回復、緩和、軽減、改変、矯正、改善、好転、または作用である。「処置」によってもまた、アンタゴニスト抗CD40抗体あるいはそのフラグメントを含む薬学的組成物の患者に対する適用または投与、あるいは抗CD40抗体あるいはそのフラグメントを含む薬学的組成物の患者から単離された組織または患者由来の細胞株に対する適用または投与を意図されている。ここで、その患者は疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因を有し、その目的は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因に対する治療、回復、緩和、軽減、改変、矯正、改善、好転、または作用である。
【0016】
「抗腫瘍活性」によって、悪性B細胞増殖もしくは蓄積の速度の減少、それによる既存の腫瘍の成長速度の減少もしくは治療中に生じた腫瘍の減少、および/または既存の新生物(腫瘍)細胞もしくは新たに形成された新生物細胞の破壊、それによる治療中の腫瘍全体のサイズの減少、が意図される。少なくとも一つの抗CD40抗体(または、その抗原結合フラグメント)を用いた処置によって、ヒトの悪性B細胞を含む疾患の状態の処置に関して有益な、生理学的応答が生じる。
【0017】
モノクローナル抗体15B8は、本発明の方法における使用に適切なアンタゴニスト抗CD40抗体を表す。この抗体は、2000年10月2日に「ヒト抗CD40抗体」と題して出願された米国仮特許出願番号、第60/237,556、および2001年10月2日に「ヒト抗CD40抗体」と題して出願されたPCT国際出願番号PCT/US01/___(代理人登録番号PP16092.003)に記載されている。両参考文献はその全体が参考として本明細書中に援用される。15B8抗体は、15B8ハイブリドーマ細胞株から産生されるIgG2アイソタイプの完全なヒト抗CD40モノクローナル抗体である。その細胞株は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座Abgenixを含む、免疫された異種型のマウス由来の脾細胞を使用して生成された。その脾臓細胞を、マウス骨髄腫SP2/0細胞(Sierra BioSource)と融合させた。結果としてできたハイブリドーマは、安定なモノクローナル細胞株15B8を作るために、数回サブクローニングされた。
【0018】
15B8細胞株は無タンパク質培地中での生育に適応させられており、これはマスター細胞バンクの生成に使われた。マスター細胞バンクを同一性と、偶発的および外来性夾雑物に対して試験した。マスター細胞バンクは、所望のヒトIgG2の製造に使われた。各々の15B8抗体は、クロマトグラフィーおよびろ過の手順を経て精製した。モノクローナル抗体15B8を生成するハイブリドーマ細胞株は、2001年10月25日付けで、Patent Depository of the American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,Virginiaに寄託にされ、そして特許受託番号PTA−3814が割り当てられた。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて維持される。この寄託物は、当業者にとって単に好都合なように作製され、そして寄託物が米国特許法第112条の下で要求されるという承認ではない。
【0019】
抗CD40抗体15B8は1,284アミノ酸残基からなり、推定分子量149,755およびヘテロ二量体の配置中に二本の重鎖および二本の軽鎖を有するポリペプチドである。アミノ酸分析により、抗体は等モル量の重鎖および軽鎖からなる。軽鎖の可変領域についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号1および配列番号2に示す。重鎖の可変領域についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号3および配列番号4に示す。15B8モノクローナル抗体は、ELISA型アッセイにおける可溶性CD40に結合する。数々の霊長類由来のB細胞の増殖における効果をインビトロでテストした場合、15B8はカニクイザル、ヒヒ、およびアカゲザルにおいてアゴニスト性抗CD40抗体としてはたらく。ヒト、チンパンジー、およびマーモセットに対するアッセイ中で、15B8はアンタゴニスト抗CD40抗体である。ヒトCD40への15B8の結合親和性は、BiacoreTMアッセイによって決定されるように、3.1×10−9Mである。
【0020】
本発明の方法における使用に適切なアンタゴニスト抗CD40抗体は、CD40細胞表面抗原に対して強い単一部位結合親和性を示す。本発明のモノクローナル抗体は、BiacoreTMのような標準アッセイを使用して測定すると、少なくとも10−5M、少なくとも3×10−5M、好ましくは少なくとも10−6Mから10−7M、より好ましくは少なくとも10−8Mから約10−20M、さらに好ましくは少なくとも5×10−9Mから約10−18M、最も好ましくは少なくとも約5×10−9Mから約10−16M、例えば10−8M、5×10−9M、10−9M、5×10−10M、10−10M、5×10−11M、10−11M、5×10−12M、10−12M、5×10−13M、10−13M、5×10−14M、10−14M、5×10−15M、10−15M、5×10−16M、または10−16MのCD40に対する解離定数を示す。ビアコア解析は、当該技術分野において公知で、詳細は「BIAアプリケーション ハンドブック」に提供されている。
【0021】
「CD40抗原」によって、グリコシル化された膜貫通ペプチドまたはそのフラグメントのどれかが意図される(GenBank登録番号第X60592;米国特許第5,674,492および4,708,871;Stamenkovicら(1989)EMBO 8:1403;Clark(1990)Tissue Antigen 36:33;Barclayら(1997)The Leucocyte Antigen Facts Book(第二版;Academic Press、サンディエゴ))。CD40受容体は、本明細書中の他の箇所に記載されているように、種々の細胞型の表面上に提示されている。「表面上に提示される」および「表面上に発現される」によって、CD40抗原のすべてまたは一部が細胞の外側にされされることが意図される。提示または発現されるCD40抗原は、完全にまたは部分的にグリコシル化される。
【0022】
「アゴニスト活性」によって、物質がアゴニストとして機能することが意図される。アゴニストは細胞上の受容体に結合し、この受容体の天然のリガンドにより開始される反応もしくは活性と似たまたは同様の、反応または活性を開始する。CD40のアゴニストは、以下の応答のいくつかまたはすべてを誘導するが、それらに限定されない:B細胞増殖および分化、抗体の産生、細胞間接着、B細胞記憶創生、アイソタイプスイッチ、クラスII MHCまたはCD80/86の細胞表層発現の上方調節、ならびにIL−8、IL−12、およびTNFのようなプロ炎症性サイトカインの分泌。「アンタゴニスト活性」によって、物質がアンタゴニストとして機能することが意図される。CD40のアンタゴニストは、アゴニストリガンド、特にCD40L、のCD40受容体への結合によって誘導された任意の応答の誘導を防止あるいは減少する。アンタゴニストは、アゴニストの結合に対する任意の1以上の応答の誘導を、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、好ましくは40%、45%、50%、55%、60%、より好ましくは70%、80%、または85%、最も好ましくは90%、95%、99%、または100%減少し得る。B細胞の応答を測定する方法は、当業者に公知であり、これらの方法としては、B細胞増殖アッセイ、バンチェロー(Banchereau)様B細胞増殖アッセイ、抗体産出に対するヘルパーT細胞アッセイ、B細胞増殖アッセイの共誘導、およびB細胞活性化マーカーの上方調節に対するアッセイが挙げられるが、それらに限定されない。これらのアッセイのいくつかは、本明細書の他の箇所でより詳細に議論される。
【0023】
「有意な」アゴニスト活性によって、B細胞応答のアッセイ中に測定されるように、中立物質またはネガティブコントロールによって誘導されたアゴニスト活性より、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%より大きな、アゴニスト活性が意図される。「有意なアゴニスト活性がない」物質は、中立物質またはネガティブコントロールによって誘導されたアゴニスト活性の、約25%以下のアゴニスト活性、好ましくはB細胞応答のアッセイにおいて測定されるように、中立物質またはネガティブコントロールによって誘導されたアゴニスト活性の、約20%以下で、約15%以下、約10%以下、約5%以下、約1%以下、約0.5%以下、または約0.1%以下でさえ、示す。本発明の方法で有用なアンタゴニスト抗CD40抗体は、正常なヒトB細胞上のCD40抗原に結合した場合、上記のように、有意なアゴニスト活性がない。本発明の一つの実施形態において、アンタゴニスト抗CD40抗体は、一つのB細胞の応答において、有意なアゴニスト活性がない。本発明の他の実施形態において、アンタゴニスト抗CD40抗体は、一を超えるB細胞の応答(例えば、増殖および分化、または増殖、分化、および抗体産生)のアッセイにおいて、主要なアゴニスト活性がない。
【0024】
本明細書中で使用されたように、「抗CD40抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一鎖抗体、およびFab、F(ab’)2、Fvのようなこれらのフラグメント、ならびに親抗CD40抗体の抗原結合能を保持している他のフラグメントを含む、特異的にCD40B細胞抗原を認識するどの抗体でも含む。ポリクローナル血清は、通常の方法で調製され得る。一般的には、CD40抗原を含む溶液を、適切な動物、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、またはヤギ、を最初に免疫するのに用いた。入手可能な血清の量および標識された抗ウサギおよび抗ヤギ抗体の有効性のために、ウサギまたはヤギは、ポリクローナル血清の調製に好まれる。ポリクローナル血清は、トランスジェニック動物、好ましくはヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス内で調製され得る。好ましい実施形態において、CD40を発現しているSf9細胞は、免疫原として使用される。免疫は、生理食塩水中に、好ましくはフロイントの完全アジュバンドのようなアジュバンド中に、抗原含有溶液を混合または乳化し、非経口的(一般的には皮下または筋肉内に)この混合物または乳濁物を注射することによって実行され得る。一投与あたり50−200μgの投与量は、代表的には十分量である。免疫は、生理食塩水中、好ましくはフロイント不完全アジュバンドを用いて、タンパク質の一度以上の注射によって、一般的に2−6週間後に増強される。あるいは、当該技術分野中で公知の方法を使用したインビトロでの免疫によって、当業者は抗体を産生し得る。本発明の目的に対して、この方法は、インビトロ免疫と等価であると考えられている。ポリクローナル抗血清は、ガラスまたはプラスチック容器へ免疫された動物から採血し、25度で1時間血液をインキュベーションし、続いて4度で2−18時間インキュベーションすることによって得られる。その血清は遠心分離(例えば、1000×gで10分間)によって回収される。1回の採血あたり約20−50mlがウサギから得られ得る。
【0025】
好ましくは、抗体は本質的にモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」によって、実質的に均質な抗体、すなわち、少量しか存在しないかもしれないが、天然に存在し得る変異をのぞいて、同じ集団を含む個々の抗体の集団から得られる抗体が意図される。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、それは単一の抗原部位、例えば、本発明におけるCD40B細胞表面抗原、に対して方向付けられている。さらに、異なる抗原決定基(エピトープ)に対して方向付けられている異なった抗体を代表的に含む通常の(ポリクローナル)抗体の調製とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の一つの抗原決定基に対して方向付けられている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られたものとしての、抗体の性質を示し、そして、いずれかの特定の方法による抗体の産出が要求されるとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、最初にKohlerら(1975)Nature 256:495によって記載された、ハイブリドーマ法によって作製され得るか、または、組換えDNA法によって作製され得る(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonら(1991)Nature 352:624−628;Marksら(1991)J.Mol.Biol.222:581−597;および米国特許第5,514,548号中に、記載されている技術を用いることにより、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【0026】
モノクローナル抗体は、Kohlerら(1975)Nature 256:495−496の方法またはその改変法を用いることによって、調製され得る。代表的には、マウスを、抗原を含む溶液を用いて免疫する。免疫は、生理食塩水中に、好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバントに、抗原含有溶液を混合または乳化し、この混合液または乳化液の非経口的注射によって実行され得る。当該技術分野において公知の、任意の免疫方法が、本発明のモノクローナル抗体を得るために用いられ得る。動物の免疫後、脾臓(および選択肢として、いくつかの大きなリンパ節)を取り出し、単一の細胞へと分離した。脾臓細胞を、細胞懸濁液を目的の抗原を用いてコーティングしたプレートまたはウェルへ適用することによりスクリーニングし得る。抗原に対して特異的な免疫グロブリンに結合する膜を発現しているB細胞は、プレートに結合し、洗い落とされない。次いで、結果として生じるB細胞またはすべての分離された脾臓細胞は、ハイブリドーマを形成するために骨髄腫細胞と融合するように誘導され、選択培地中で培養される。その結果として生じた細胞を、連続的希釈液によって培養し、目的の抗原に特異的に結合する(および関連のない抗原には結合しない)抗体の産生に対してアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体(mAb)を分泌するハイブリドーマを、インビトロ(例えば、組織培養液ボトル中または中空繊維反応器中)またはインビボ(マウス内の腹水として)どちらかで培養する。
【0027】
ハイブリドーマの使用法に代わるものとして、本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,545,403号、同第5,545,405号、および同第5,998,144号に開示されるように、CHO細胞株のような細胞株中で、抗体が産生され得る。簡単に言えば、その細胞株を、軽鎖および重鎖それぞれを発現しうるベクターを用いてトランスフェクトする。別々のベクター上の二つのタンパク質をトランスフェクトすることにより、キメラ抗体が産生され得る。もう一つの利点は、抗体の正確なクリコシル化である。
【0028】
CD40に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。例えば、McMichael編(1987;および1989)Leukocyte Typing IIIおよびIV(Oxford University Press,New York)中の、B細胞抗原へ取り分けられた部、米国特許第5,674,492号、同第5,874,082号、同第5,677,165号、同第6,056,959号、WO00/63395号、2000年10月2日に、「ヒト抗CD40抗体」と題して出願された、同時係属中の米国仮特許出願番号第60/237,556、Gordonら(1988)J.Immunol.140:1425、Valleら(1989)Eur.J.Immunol.19:1463、Clarkら(1986)PNAS 83:4494、Paulieら(1989)J.Immunol.142:590、Gordonら(1987)Eur.J.Immunol.17:1535、Jabaraら(1990)J.Exp.Med.172:1861、Zhangら(1991)J.Immunol.146:1836、Gascanら(1991)J.Immunol.147:8、Banchereauら(1991)Clin.Immunol.Spectrum 3:8、およびBanchereauら(1991)Science 251:70を参照のこと。これら全ての文献は、参考文献として本明細書中に援用される。
【0029】
さらに、本明細書で使用されているように、用語「抗CD40抗体」は、キメラ抗CD40抗体を含む。「キメラ」抗体によって、組換えデオキシリボ核酸技術を使用することによって最も好ましく誘導され、ヒト(免疫学的に「関連した」種、例えばチンパンジーを含む)および非ヒトの構成部分の両方を含む抗体、が意図される。従って、キメラ抗体の定常領域は、最も好ましくは、天然のヒト抗体の定常領域と事実上同一である。キメラの抗体の可変領域は、好ましくは非ヒト供給源から誘導され、CD40細胞表面抗原に対して望まれた抗原特異性を有する。その非ヒト供給源は、ヒトCD40細胞表面抗原またはヒトCD40細胞表面抗原を含む物質に対する抗体を生成するために使用され得る、任意の脊椎動物であり得る。そのような非ヒト供給源としては、齧歯類(例えば、ウサギ、ラット、マウスなど;例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第4,816,567号を参照のこと)および非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿など、例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第5,750,105号および同第5,756,096号)が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書中で使用されるように、句「免疫学的に活性な」は、キメラ抗CD40抗体に関して使用するとき、ヒトCD40を結合するキメラ抗体を意味する。
【0030】
ヒト化抗CD40抗体はまた、本明細書中で使用されているように、用語抗CD40抗体に含まれる。「ヒト化」によって、非ヒト免疫グロブリン配列由来の最小限の配列を含む抗CD40抗体の型が、意図される。そのほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンで(レシピエント抗体)あり、レシピエントの超可変領域(相補性決定領域またはCDRとして公知)の残基は、望まれた特異性、親和性、および受容力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置き換えられる。齧歯類または変異型齧歯類のCDRまたはヒト抗体の対応する配列についてのCDR配列を置換することによって、ヒト化は、本質的に、Winterおよびその共同研究者らの方法(Jonesら(1986)Nature 321:522−525、Riechmannら(1988)Nature 332:323−327、Verhoeyenら(1988)Science 239:1534−1536)に従って実行され得る。参考として本明細書中に援用される、米国特許第5,225,539号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、同第5,859,205号もまた参照のこと。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンの1以上の可変領域のフレームワーク領域中の残基は、対応する非ヒト残基(例えば、米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照のこと)で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体またはドナー抗体中にみられない残基を含み得る。これらの改変は、さらに抗体の能力を精密にするために(例えば、望まれる親和性を得るために)行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、および代表的に二つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。その可変ドメイン中の、超可変領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが、ヒトヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域(Fc)、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、参考として本明細書中に援用される、Jonesら(1986)Nature 331:522−525、Riechmannら(1988)Nature 332:323−329、およびPresta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596を参照のこと。よって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にあまりインタクトではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている抗体を含み得る。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのCDR残基および可能ならばいくつかのフレームワーク領域の残基が、齧歯類の抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。例えば、米国特許第5,225,539号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、および同第5,859,205号を参照のこと。ヒト化抗体および所定の抗原に対する改善された親和性を有するヒト化抗体を産生する技術が開示されている、米国特許第6,180,370号、および国際公開WO01/27160号もまた参照のこと。
【0031】
用語、抗CD40抗体によって含まれるものは、不活性化された内性免疫グロブリン(Ig)遺伝子座によって特徴付けられる異種のまたは非ヒト哺乳動物宿主、より具体的には、トランスジェニックマウスにおいて産生されている、改変抗CD40抗体である。そのようなトランスジェニック動物において、宿主免疫グロブリンの軽鎖サブユニットおよび重鎖サブユニットの発現について能力のある内性遺伝子を非機能的にし、類似したヒト免疫グロブリン遺伝子座と置換した。これらのトランスジェニック動物は、宿主の免疫グロブリン軽鎖サブユニットまたは重鎖サブユニットの実質的非存在下で、ヒト抗体を産生する。例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第5,877,397号および同第5,939,598号を参照のこと。
【0032】
抗CD40抗体のフラグメントは、これらが全長抗体の望まれる親和性を保持している限り、本発明の方法において用いるのに適している。従って、抗CD40抗体のフラグメントは、CD40B細胞表面抗原に結合する能力を保持する。このようなフラグメントは、対応する全長のアンタゴニスト抗CD40抗体と似ている性質によって特徴づけられる。すなわち、このフラグメントは、1)ヒト細胞の表面に発現しているヒトCD40抗原に特異的に結合する;2)正常ヒトB細胞上のCD40抗原に結合した場合、有意なアゴニスト活性がない;および3)悪性のヒトB細胞上のCD40抗原に結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。全長のアンタゴニスト抗CD40抗体が、正常ヒトB細胞の表面上のCD40抗原に結合したときにアンタゴニスト活性を示す場合、そのフラグメントもまた、そのようなアンタゴニスト活性を示す。そのようなフラグメントは、本明細書中で「抗原結合」フラグメントといわれる。
【0033】
抗体の適切な抗原結合フラグメントは、全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合性領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、およびFvフラグメントならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「単鎖Fv」抗体フラグメントまたは「sFv」抗体フラグメントによって、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含むフラグメントが意図され、ここでこれらドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第4,946,778号;同第5,260,203号;同第5,455,030号;同第5,856,456号を参照のこと。一般的に、Fvポリペプチドはさらに、sFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。sFvの概説については、Pluckthun(1994)in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113巻、RosenburgおよびMoore編(Springer−Verlag,New York),269−315頁を参照のこと。
【0034】
抗体または抗体フラグメントは、例えばMcCaffertyら (1990)Nature 348:552−554(1990) そして米国特許第5,514,548号に記載された技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーより単離され得る。Clacksonら((1991)Nature 352:624−628)およびMarksら((1991)J.Mol.Biol.222:581−597)は、ファージライブラリーを使用したマウスおよびヒト抗体のそれぞれの単離を記載する。次の刊行物は、チェーンシャッフリングによる高アフィニティー(nM範囲)のヒト抗体の生産(Marksら、(1992)Bio/Technology 10:779−783)、および、非常に大きなファージライブラリーの構築のためのストラテジーとしてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え(Waterhouseら、(1993)Nucleic.Acids Res.21:2265−2266)を記載する。このように、これらの技術はモノクローナル抗体を単離するための、従来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの技術に対する実現可能な代替手段である。
【0035】
抗体フラグメントを生産するための実現可能な技術が進みつつある。伝統的に、これらフラグメントはインタクトな抗体のプロテアーゼ消化を介して誘導された(例えば、以下を参照のこと、Morimotoら、(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)そしてBrennanら、(1985)Science 229:81)。しかし、これらフラグメントは現在では組換え宿主細胞より直接生産され得る。例えば、抗体フラグメントは上記の抗体ファージライブラリーより単離され得る。あるいは、Fab’−SHフラグメントはE.coliより直接回収され得、そしてF(ab’)2フラグメントを形成するよう化学的に結合し得る(Carterら、(1992)Bio/Technology 10:163−167)。別の取組みによると、F(ab’)2フラグメントは組換え宿主細胞培養物より直接単離され得る。抗体フラグメント生産のための他の技術は当業者に明らかである。
【0036】
本方法に有益なアンタゴニスト抗CD40抗体は、本明細書にて開示される15B8モノクローナル抗体およびこの抗体とは異なる抗体だが、CDRを保有する抗体;そして一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を持つ抗体を含み、ここで、アンタゴニスト活性は、悪性B細胞の増殖および/または分化の阻害により測定される。また本発明は、脱免疫された(de−immunize)アンタゴニスト抗CD40抗体を含み、この抗体は例えば本明細書で参考として援用される国際公開第WO 98/52976およびWO 0034317に記載されるように生産され得る。この様式において、本発明のアンタゴニスト抗CD40抗体中の残基は、抗体がヒト悪性B細胞に対するアンタゴニスト活性を保持しながら、ヒトに対しては全く、またはほとんど免疫原性ではないよう改変される。ここで、その活性は本明細書のいずれか記載されたアッセイで測定される。また、特許請求の範囲の範囲内に含まれるのは、本発明のアンタゴニスト抗CD40抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であり、そしてこの融合タンパク質は、当該分野で公知のように、合成されるかまたは対応するポリヌクレオチドベクターより発現され得る。そのような融合タンパク質は、以下に記す抗体の結合体化に関して記載される。
【0037】
本発明の抗体は、例えば本明細書で参考として援用される欧州特許公開第0 983 303 Al号、WO 00/34317号およびWO 98/52976号に記載される方法を用いて生産される配列バリエーションを有し得る。例えば、CDR内の配列は、抗体をMHCクラスIIと結合させ、そして所望されないヘルパーT細胞応答を引き起こし得ることが示されてきた。保存的置換は、抗体が結合活性を保持するが、所望されないT細胞応答を引き起こす能力を喪失することを可能にし得る。このような、任意の保存的置換または非保存的置換は、当該分野で認識される方法(例えば、本明細書の他所に記載するような方法)を使用して作製され得る。そして生じる抗体は本発明の範囲内に帰属する。改変抗体は本明細書に記載される方法を用いて、アンタゴニスト活性、アフィニティーおよび特異性について慣用的に検査され得る。
【0038】
任意の上記方法、または本明細書で開示されない他の任意の方法により生産された抗体は、次の生物学的活性のうち少なくとも一つの活性を有する場合、本発明の範囲内に帰属する:T細胞により刺激された正常ヒト末梢B細胞による免疫グロブリン分泌の阻害;Jurkat T細胞により刺激された正常ヒト末梢B細胞の増殖阻害;CD40L発現細胞により刺激された正常ヒト末梢B細胞の増殖阻害;以下に記されるようなヒト悪性B細胞の増殖阻害。これらのアッセイは本明細書の実施例に記載されるよう実施され得る。次の文献にも記載されるアッセイについてもまた参照のこと:Schultzeら、(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8200−8204;Dentonら、(1998)Pediatr.Transplant.2:6−15;Evansら、(2000)J.Immunol.164:688−697;Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49:17−22;Ledermanら、(1996)Curr.Opin.Hematol.3:77−86;Coliganら、(1991)Current Protocols in Immunology 13:12;Kwekkeboomら、(1993)Immunology 79:439−444;そして米国特許第5,674,492号および同第5,847,082号;これらは本明細書で参考として援用される。
【0039】
これまで記載された任意のアンタゴニスト抗CD40抗体またはその抗体フラグメントは、本発明の方法での使用に先立ち、結合体化され得る。結合体化した抗体の生産方法は当該分野で公知である。従って、抗CD40抗体は、間接的な標識か、または間接的に標識する手法を使用して標識され得る。「間接的な標識」または「間接的に標識する手法」により、キレート剤は共有結合で抗体に結合し、そして少なくとも一つの放射性核種がキレート剤に挿入されることが意図される。例えば、本明細書で参考として援用されるSrivagtavaおよびMease(1991)Nucl.Med.Bio.18:589−603に記載されたキレート剤および放射性核種を参照のこと。あるいは、抗CD40抗体が「直接標識」、または「直接的に標識する方法」を使用して標識され得、ここで放射性核種は直接(典型的にはアミノ酸残基を介して)抗体と共有結合される。好まれる放射性核種は上記のSrivagtavaおよびMease(1991)に提供される。間接的に標識する手法が特に好ましい。また、例えば国際公開WO 00/52031およびWO 00/52473も参照のこと。そこには放射性標識を抗体に結合させるためにリンカーが使用され;そして抗CD40抗体の標識された形状が米国特許第6,015,542号(本明細書で参考として援用される)に記載される。
【0040】
さらに、抗体(またはそのフラグメント)は、例えば細胞毒、治療薬剤または放射性金属イオンといった、治療の部分と結合体化され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤とは、細胞に有害な全ての薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン,マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン ジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療薬剤としては、代謝拮抗物質(例えばメトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシル、デカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラシン)、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得る;薬剤部分は、古典的な化学療法剤に限定されるように解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は例えば、アブリン、リシンA,シュードモナス属エンドトキシン、またはジフテリア毒素を例とする毒素;腫瘍壊死因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子を例とするタンパク質;または、例えばリンフォカイン、インターロイキン−1(「IL−1」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)、または他の増殖因子を例とする生物学的応答調節物質、を含み得る。
【0041】
以上のような治療的な部分を抗体に結合体化させる技術は周知である。例えば、Arnonら(1985)「Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeldら、編(Alan R.Liss,Inc.),243−256頁;Hellstromら、編(1987)「Antibodies for Drug Delivery」Controlled Drug Delivery,Robinsonら、編(第2版;Marcel Dekker,Inc.),623−653頁;Thorpe(1985)「Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review」Monoclonal Antibodies ’84:Biological and Clinical Applications,Pincheraら、編、475−506頁(Editrice Kurtis,Milano,Italy,1985);「Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,Baldwinら編(Academic Press,New York,1985),303−316頁;および Thorpeら(1982)Immunol.Rev.62:119−158を参照のこと。
【0042】
あるいは、Segalが米国特許第4,676,980号に記載したように、抗体が二次抗体と結合体化され抗体ヘテロ結合体を形成し得る。さらに、標識と本発明の抗体との間にリンカーが使用され得る(米国特許第4,831,175号参照のこと)。抗体または抗原に結合する抗体フラグメントは、放射性のヨウ素、インジウム、イットリウム、または当該分野で公知の他の放射性分子を用いて直接標識され得る(米国特許第5,595,721号)。処置は、同時にまたは連続して投与する、結合体化された抗体または結合体化されていない抗体を用いた治療の組み合せから成り得る(WO 00/52031号およびWO 00/52473号)。
【0043】
本発明の方法は、悪性B細胞を含む疾患を抱える患者の処置するためのアンタゴニスト抗CD40抗体に関する。「悪性」B細胞とは、任意の腫瘍性のB細胞のことを意味し、これには、低悪性度、中悪性度および高悪性度のB細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス(EBV)誘導性リンパ腫、およびAIDS関連リンパ腫、ならびにB細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄芽球性白血病などを含むリンパ腫に由来するB細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
本発明の方法は、異常で制御不能なB細胞増殖または蓄積に関係する非ホジキン型リンパ腫の処置における使用を見出す。本発明のために、B細胞リンパ腫を低悪性度、中悪性度および高悪性度に分類する「Working Formulation」の分類図式に従って、このようなリンパ腫を称する(「The Non−Hodgkin’s Lymphoma Pathologic Classification Project」Cancer 49(1982):2112−2135参照のこと)。従って、低悪性度B細胞リンパ腫は、小さなリンパ球性の、濾胞状の小切れ込み核細胞リンパ腫、ならびに濾胞状の小切れ込み核細胞および大細胞の混ざったリンパ腫を含む;中悪性度リンパ腫は、濾胞状大細胞リンパ腫、びまん性核切れ込み小細胞リンパ腫、びまん性の小細胞および大細胞の混合リンパ腫、ならびにびまん性大細胞型リンパ腫を含む;そして高悪性度リンパ腫は、大細胞免疫芽球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、ならびにバーキット型および非バーキット型の非小切れ込み核細胞リンパ腫を含む。
【0045】
本発明の方法は、Revised European and American Lymphoma Classification(REAL)系に従って分類されたB細胞リンパ腫の治療的処置において有用であることが認識される。そのようなB細胞リンパ腫としては、前駆体B細胞新生物(例えば、リンパ芽球性白血病/リンパ芽球性リンパ腫);末梢B細胞新生物(B細胞慢性リンパ性白血病/小リンパ性リンパ腫、リンパプラズマ細胞性リンパ腫/免疫担当細胞腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞中心リンパ腫(濾胞性)(びまん性小細胞、びまん性の小細胞と大細胞の混合物、およびびまん性大細胞のリンパ腫が挙げられる)、辺縁層B細胞リンパ腫(節外性型、節性型、および脾性型が挙げられる)、毛様細胞白血病、プラズマ細胞腫/骨髄腫、原発性縦隔(胸腺)のサブタイプのびまん性大細胞B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、およびバーキット様高悪性度B細胞リンパ腫が挙げられる);急性白血病;急性リンパ性白血病;骨髄芽球性白血病;急性骨髄性白血病;前骨髄球性白血病;骨髄単球性白血病;単球性白血病;赤白血病;顆粒球性白血病(慢性骨髄性白血病);慢性リンパ性白血病;真性赤血球増加症;多発性骨髄腫:ヴァルデンストレームマクログロブリン血症;重鎖病;および分類されない低悪性度または高悪性度のB細胞リンパ腫のように分類されるリンパ腫が挙げられるが、それらに限定されない。
【0046】
本発明の方法は、治療中に生じるさらなる腫瘍増殖を防ぐことに有用であり得ることが認識される。本発明の方法は、低悪性度のB細胞リンパ腫を有する被験体、特に標準的な化学療法の後の再発を有する被験体、の処置において特に有用である。低悪性度B細胞リンパ腫は、中悪性度および高悪性度のB細胞リンパ腫よりもより無痛であり、そして再発/経過の軽減によって特徴付けられる。従って、再発のエピソードが数値および重度において減少するので、これらリンパ腫の処置は本発明の方法を使用することで改善される。
【0047】
本明細書に記載されたアンタゴニスト抗CD40抗体はまた、炎症性疾患および免疫系の不全または免疫系の障害(これらとしては、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、CREST症候群、炎症性筋炎、シェーグレン症候群、複合結合組織病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、肺性の炎症、特発性肺線維症、骨粗鬆症、遅延型過敏症、喘息、原発性胆汁性肝硬変、および特発性血小板減少性紫斑病が挙げられるが、それらに限定されない)の処置においても使用を見出し得る。
【0048】
本発明の方法に従って、本明細書の他の箇所にて定義したような、少なくとも一つのアンタゴニスト抗CD40抗体(またはその抗原結合性フラグメント)は、悪性ヒトB細胞に関して正の治療応答を促進させるために使用される。「正の治療応答」によって、これら抗体またはそのフラグメントの抗腫瘍活性に関係する疾患の改善、および/または疾患に関係する症状の改善が意図される。すなわち、抗増殖効果、さらなる腫瘍の増殖の防止、および/またはB症状の減少、が観察され得る。従って、例えば疾患の改善は完全な応答として特徴付けられる。「完全な応答」とは、それまでの異常であった任意の、X線写真調査、骨髄および脳脊髄液(CSF)を正常化させ、臨床的に検出可能な疾患の消失が意図される。そのような応答は、本発明の方法に従った処置後、少なくとも1ヶ月間持続しなければならない。あるいは、疾患の改善は、部分的な応答として分類され得る。「部分的な応答」とは、新たな病変の非存在下で、全ての測定可能な全身腫瘍組織量(すなわち、被験体中に存在する腫瘍細胞の数)における、少なくとも約50%の減少、および少なくとも1ヶ月間の持続が意図される。そのような応答は、測定可能な腫瘍に対してのみ適用可能である。これら正の治療応答に加え、アンタゴニスト抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて治療を受ける被験体は、疾患に関係した症状について、有益な改善効果を経験し得る。従って、被験体はいわゆるB症状、すなわち、寝汗、熱、体重減少および/または蕁麻疹の減少を経験し得る。
【0049】
「治療有効用量または治療有効量」によって、投与される場合、悪性B細胞を含む疾患を有する患者の処置に関して正の治療応答をもたらす量の、アンタゴニスト抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントが意図される。治療有効用量または治療有効量を含む薬学的組成物の投与は、当該分野で公知である任意の許容される投与方法を使用して達成され得る。好ましくは、アンタゴニスト抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物は、静脈内に投与され、好ましくは、約1時間〜約10時間の期間にわたる注入、より好ましくは約1時間〜約8時間の期間にわたる注入、さらにより好ましくは約2時間〜約7時間の期間にわたる注入、なおより好ましくは、約4時間〜約6時間の期間にわたる注入であり、投与される抗CD40抗体に依存する。薬学的組成物の初期注入は、約4時間〜約6時間の期間にわたり投与され得、後の注入はより早く送達される。後の注入は約1時間〜約6時間の期間、好ましくは約1時間〜約4時間の期間、より好ましくは約1時間〜約3時間の期間、なおより好ましくは約1時間〜約2時間の期間にわたる投与であり得る。
【0050】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路に適するよう処方される。投与経路の例としては、非経口(例えば、静脈内、皮内、皮下、口腔(例えば吸入)、経皮(局所的)、経粘膜、および直腸の投与)が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、次の成分が挙げられ得る:滅菌希釈剤(例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒);抗菌剤(例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン);酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム);キレート剤、(例えば、エチレンジアミン四酢酸);緩衝剤(例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート)、そして張度調整剤(例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース)。pHは酸または塩基を用いて調整され得る(例えば、塩酸または水酸化ナトリウム)。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数の用量のバイアルに充填され得る。
【0051】
抗CD40抗体は、代表的に、薬学的に許容される緩衝液(例えば、滅菌生理食塩水、滅菌緩衝水溶液、プロピレングリコール、上記のものの物質の組み合わせなど)中で、標準技術により、提供され得る。非経口で投与され得る薬剤の調製方法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版;Mack Publishing Company,Eaton,Pennsylvania,1990)(本明細書では参考として援用される)に記載される。また、本発明の方法における使用に適した、安定化抗体の薬学的処方物を記載した、例えばWO 98/56418も参照のこと。
【0052】
少なくとも一つの抗CD40抗体またはそのフラグメントの投与される量は、当業者により、過度の実験なく容易に決定される。少なくとも一つのアンタゴニスト抗CD40抗体(またはそのフラグメント)の、投与様式およびそれぞれの量に影響する要因としては、治療を受ける特定のリンパ腫、疾患の重篤度、病歴、ならびに治療を受ける個人の年齢、身長、体重、健康、および身体状態が挙げられるが、それらに限定されない。同様に、アンタゴニスト抗CD40抗体またはそのフラグメントの投与される量は、投与様式に依存し、そして被験体がこの抗腫瘍剤を単一の用量を受けるか、または複数の用量を受けるか否かに依存する。一般的に、高投薬量の抗CD40抗体またはそのフラグメントは、治療を受ける患者の体重増加に合わせることが好まれる。投与される抗CD40抗体またはそのフラグメントの用量は、約0.003mg/kg〜約50mg/kgの範囲内であり、好ましくは0.01mg/kg〜約40mg/kgの範囲である。従って例えば、用量は0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、または50mg/kgであり得る。
【0053】
本発明の別の実施形態において、この方法は、アンタゴニスト抗CD40抗体またはそのフラグメントの複数用量の投与を包含する。その方法は、アンタゴニスト抗CD40抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の治療有効用量の、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、15回、20回、25回、30回、35回、40回またはそれより多い回数の投与を含み得る。抗CD40抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の複数用量を投与する頻度および期間は、当業者により過度の実験なしに容易に決定され得る。さらに、治療有効量の抗体を用いた被験体の処置は、単一の処置を含み得るか、または、好ましくは一連の処置を含み得る。好ましい例において、被験体はアンタゴニスト抗CD40抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて、約0.1mg/kg〜20mg/kg体重の間の範囲で、約1〜10週間の間に週1回、好ましくは約2〜8週間の間に、より好ましくは約3〜7週間の間に、そしてさらにより好ましくは約4週間、5週間または6週間に週1回、処置される。再発防止のため年1回、または再発の兆候のときに、処置が生じ得る。処置に使用される有効投薬量の抗体またはその抗原結合フラグメントは、特定の処置の過程にわたって、増加あるいは減少され得ることもまた認識される。本明細書に記載されるように、投薬量の変更は、診断アッセイの結果より導かれ、そして明らかになり得る。従って、一つの実施形態では、投与レジメンは、処置期間の1日、7日、14日および21日に、少なくとも一つの抗CD40抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する。別の実施形態では、投与レジメンは、処置期間中の1週間のうちの1日、2日、3日、4日、5日、6日および7日に、少なくとも一つの抗CD40抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する。さらなる実施形態は、処置期間中の1週間のうちの1日、3日、5日および7日に、少なくとも一つの抗CD40抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を有する、投与レジメン;処置期間中の1週間のうちの1日、および3日に、少なくとも一つの抗CD40抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する、投与レジメン;そして、処置期間中の1週間のうちの1日に、少なくとも一つの抗CD40抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する、好ましい投与レジメンを包含する。処置期間は、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、または1年を含み得る。処置期間は続いてでもよいし、互いに1日、1週、2週、1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月または1年間隔で分割されてもよい。
【0054】
本明細書に記載した、本発明の方法における使用のための薬学的組成物中に存在するアンタゴニスト抗CD40抗体は、ネイティブであっても、組換え技術によって得られてもよく、そして哺乳動物生物供給源(例えばマウス、ラット、ウサギ、霊長類、ブタ、およびヒト)を含む任意の供給源に由来し得る。好ましくは、そのようなポリペプチドはヒト供給源に由来し、そしてより好ましくは、ハイブリドーマ細胞株由来の組換えヒトタンパク質である。
【0055】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、本発明のアンタゴニスト抗CD40抗体の生物学的に活性な改変体を含み得る。そのような改変体は、改変体ポリペプチドを含む薬学的組成物が被験体に投与された場合に、ネイティブのポリペプチドを含む薬学的組成物と同じ治療効果を有するように、ネイティブのポリペプチドの所望される生物学的活性を保持するべきである。つまり、改変体の抗CD40抗体は、ネイティブのアンタゴニスト抗体(例えばハイブリドーマ細胞株15B8により発現される15B8)に観察される様式と同様の様式で、薬学的組成物中の治療活性成分として役立つ。改変体抗CD40抗体が所望される生物学的活性を保持するかを決定する方法は、当該分野で利用可能であり、ゆえに、薬学的組成物中の治療活性成分として役立つ。抗体改変体の生物学的活性は、本発明で記載されるアッセイを含め、ネイティブのアンタゴニスト抗体の活性を測定するよう特別に設計したアッセイを使用して測定され得る。
【0056】
ネイティブのアンタゴニスト抗CD40抗体の適切な生物学的に活性な改変体、または天然に存在する抗CD40抗体の適切な生物学的に活性な改変体の改変体は、フラグメント、アナログ、そしてそのポリペプチドの誘導体であり得る。「フラグメント」によって、本明細書の他所に記載したように、インタクトなポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドが意図される。「アナログ」によって、ネイティブポリペプチドまたはネイティブポリペプチドのフラグメントのいずれかのアナログが意図され、そこでアナログは一つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有するネイティブのポリペプチド配列および構造を含む。「誘導体」によって、ネイティブのポリペプチドの所望される生物学的活性が保持される限り、目的のネイティブのポリペプチド、もしくはネイティブのポリペプチドのフラグメント、またはそれらそれぞれのアナログの任意の適切な改変(例えば、グリコシル化、リン酸化、ポリマー結合体化(例えばポリエチレングリコールと)、または他の外来部分の付加)、が意図される。ポリペプチドフラグメント、アナログ、および誘導体の作製方法は、当該分野で一般的に利用可能である。
【0057】
例えば、アンタゴニスト抗CD40抗体のアミノ酸配列改変体は、目的の抗体をコードするクローンDNA配列中の変異により、調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当該分野で周知である。例えば、WalkerおよびGaastra編(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York);Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488−492;Kunkelら(1987)Methods Enzymol.154:367−382;Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,New York);米国特許第4,873,192号;およびそれらに引用される参考文献を参照のこと;これらは本明細書で参考として引用される。目的のポリペプチドの生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、本明細書にて参考として援用される、Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)中のDayhoffら(1978)のモデルに見出され得る。保存的置換(例えばあるアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸に交換すること)が好まれ得る。保存的置換の例として、Gly⇔Ala、Val⇔Ile⇔Leu、Asp⇔Glu、Lys⇔Arg、Asn⇔Gln、およびPhe⇔Trp⇔Tyrが挙げられるが、それらに限定されない。
【0058】
目的のアンタゴニスト抗CD40抗体ポリペプチド改変体の構築において、所望される活性(すなわち、同様の結合親和性および次の特性を有する:1)ヒトの細胞表面に発現されるヒトCD40抗原に特異的に結合可能である;2)正常なヒトB細胞上のCD40抗原に結合している場合に有意なアゴニスト活性を有さない;および3)ヒトB細胞悪性腫瘍上のCD40抗原に結合している場合にアンタゴニスト活性を示す)を、改変体が有し続けるように、改変が施される。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするDNAになされる任意の変異は、読み枠外に配列を配置してはならず、且つ好ましくはmRNAの二次構造を作り得る相補的な領域を生じない。欧州特許出願公開番号75,444を参照のこと。
【0059】
抗CD40抗体の生物学的に活性な改変体は、一般的に、少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは約90%〜95%以上、および最も好ましくは、約98%以上のアミノ酸配列同一性を、比較の基準となる参照ポリペプチド分子のアミノ酸配列に対して有する。本明細書に記載される特異性特性および結合特性を有する参照アンタゴニスト抗CD40抗体の生物学的に活性な改変体は、参照ポリペプチドとは、僅か約1〜15アミノ酸、僅か約1〜10アミノ酸(例えば6〜10アミノ酸)、僅か5アミノ酸、僅か4アミノ酸、3アミノ酸、2アミノ酸または1アミノ酸残基だけ異なり得る。「配列同一性」によって、改変体のアミノ酸配列の特定の連続するセグメントが、参照分子のアミノ酸配列と並べられ且つ比較される場合、その改変体ポリペプチドと参照となるポリペプチド分子との間に同一のアミノ酸残基が見い出されることが、意図される。二つのアミノ酸配列間の配列同一性のパーセントは、一致する位置数を得るように、両配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置数を決定し、参照分子と比較されるセグメント内の総位置数で一致する位置数を除算し、そして配列同一性のパーセントを得るように、その結果を100培することによって、計算される。
【0060】
この二つの配列の最適なアライメントのため、改変体のアミノ酸残基の連続するセグメントは、参照分子のアミノ酸配列に対してさらなるアミノ酸残基または欠失アミノ残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に使用される連続するセグメントは、少なくとも20個連続するアミノ酸残基を含み、30残基、40残基、50残基、100残基またはそれ以上の残基であり得る。改変体のアミノ酸配列中にギャップを含むことに関係するよう増加した配列同一性の訂正は、ギャップペナルティ(gap penalty)を割り当てることによってなされ得る。配列アライメントの方法は、アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の双方に関して、当該分野で周知である。
【0061】
従って、任意の2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な一つの好ましい例は、MyersおよびMillerのアルゴリズム(1998)CABIOS4:11−17である。そのようなアルゴリズムは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)にて利用され、このプログラムはGCG配列アライメントのソフトウェアーパッケージの一部である。PAM120重み付き残基テーブル(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ(gap length penalty)12、およびギャップペナルティ(gap penalty)4が、アミノ酸配列を比較する場合にALIGNプログラムと共に使用され得る。2つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な別の好ましい例は、KarlinおよびAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877におけるように改変された、KarlinおよびAltschulのアルゴリズム(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264である。そのようなアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム(1990)J.Mol.Biol.215:403に組み込まれている。目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相同性のあるヌクレオチド配列を得るため、BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で実行され得る。目的のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて、BLASTタンパク質検索は実施され得る。比較のためにギャップアライメント(gap alignment)を得るために、Gapped BlastがAltschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されるように使用され得る。あるいは、PSI−Blastは、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行するように、使用され得る。上記Altschulら(1997)参照のこと。BLASTプログラム、Gapped BLASTプログラムおよびPSI−Blastプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが使用され得る。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。ALIGNプログラム(Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.中のDayhoff(1978))、および、プログラムの標準パラメーターが利用される場合、Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsinより使用可能)(例えばGAPプログラム)も参照のこと。
【0062】
アミノ酸配列同一性の割合を考慮する場合、タンパク質機能の特質に影響しない保存的なアミノ酸置換の結果として、いくつかのアミノ酸残基の位置は異なり得る。これらの場合、配列同一性パーセントは、保存的に置換されたアミノ酸の類似性を計上して上方修正され得る。このような調整は、当該分野で周知である。例えば、MyersおよびMiller(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4:11−17を参照のこと。
【0063】
CD40に特異的に結合可能であり、かつ特にB細胞悪性腫瘍上のCD40に結合している場合にアンタゴニスト活性を保持する、ポリペプチドの正確な化学構造は、多数の要素に依存する。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が分子内に存在するため、特定のポリペプチドが、酸性塩もしくは塩基性塩として、または中性形態で得られ得る。適切な環境状況に配置された場合に生物活性を有するそのような調製物すべてが、本明細書にて使用されるアンタゴニスト抗CD40抗体の定義に包含される。さらに、そのポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分(グリコシル化)を使用するか、または他の追加分子(例えば脂質、リン酸、アセチル基など)による誘導体化により、増強され得る。糖類との結合によっても、その一次アミノ酸配列は増強され得る。そのような増強のある局面は、産生宿主の翻訳後修飾系を通じて達成され得る;他のこのような改変はインビトロで導入され得る。いずれの場合でも、そのような改変は、抗CD40抗体のアンタゴニスト特性を破壊しない限り、本明細書で使用される抗CD40抗体の定義に包含される。そのような改変は、様々なアッセイにおいてポリペプチドの活性の増強または減少のいずれかによって量的または質的に活性に影響し得ると予期される。さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって改変され得、そしてポリペプチドは、活性を保持するフラグメントを得るために切断され得る。アンタゴニスト活性を破壊しないこのような改変は、本明細書で使用される目的の抗CD40抗体の定義から、そのポリペプチド配列を除かない。
【0064】
当該技術は、ポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的な指針を提供する。抗CD40抗体改変体の調製において、天然のタンパク質ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対するどの改変が、本発明の方法にて使用される薬学的組成物の治療上活性な成分としての使用に適した改変体を生じ得るかを、当業者は容易に決定し得る。
【0065】
治療上活性な成分としてアンタゴニスト抗CD40抗体を含む、任意の薬学的組成物が、本発明の方法にて使用され得る。従って、当該分野で公知であるアンタゴニスト抗CD40抗体またはその改変体を含む、液体組成物、凍結乾燥組成物または噴霧乾燥組成物は、本発明の方法に従って被験体に後で投与するための、水溶液もしくは非水溶液または水性懸濁液もしくは非水性懸濁液として、調製され得る。これらの組成物の各々は、治療的または予防的に活性な成分として、抗CD40抗体またはその改変体を含む。「治療的または予防的に活性な成分」により、抗CD40抗体またはその改変体が、被験体における疾患または健康状態の処置、予防または診断に関して、薬学的組成物がその被験体に投与される場合、所望される治療的応答または予防的応答をもたらすために、その組成物に特に組み込まれることが、意図される。好ましくは、その薬学的組成物は、調製中および保存中のタンパク質の安定性の消失および生物学的活性の消失に関係する問題を最小限にするため、適切な安定化剤、充填剤、またはその両方を含む。
【0066】
製剤化剤(formulant)は、本発明の抗CD40抗体を含む薬学的組成物に加えられ得る。これら製剤化剤としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤または充填剤が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、炭水化物としては、糖または糖アルコール(例えば単糖類、二糖類もしくは多糖類)または水溶性グルカンが挙げられる。糖類またはグルカンとしては、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ショ糖、デキストラン、プルラン、デキストリン、αシクロデキストリンおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルスターチ、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物が挙げられ得る。「糖アルコール」はヒドロキシ基を有するC4〜C8の炭化水素として定義され、そして、この「糖アルコール」としては、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールが挙げられる。これらの糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて使用され得る。糖または糖アルコールの濃度は、1.0%〜7%(W/V)の間であり、より好ましくは2.0%〜6.0%(W/V)の間である。好ましくは、アミノ酸としては、左旋性(L)型のカルニチン、アルギニン、およびベタインが挙げられる。;しかし、他のアミノ酸も加えられ得る。好ましいポリマーとしては、平均分子量2,000〜3,000の間のポリビニルピロリドン(PVP)、または平均分子量3,000〜5,000の間のポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。この処方物に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第270,799号および同第268,110号に示される。
【0067】
さらに、抗体は、例えば循環中の半減期を増加させるため、ポリマーとの共有結合により化学的に改変され得る。好ましいポリマー、およびペプチドにポリマーを結合させる方法は、米国特許第4,766,106号;同4,179,337号;同第4,495,285号;および同第4,609,546号(これらは全て本明細書により参考としてその全体が援用される)に示される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは、室温で水に可溶であり、そして一般式:R(O−CH2−CH2)nO−Rを有し、ここでRは水素または保護基(例えばアルキル基またはアルカノール基)で有り得る。好ましくは、この保護基は、1と8との間の個数の炭素であり、より好ましくは、メチル基である。記号nは自然数であり、好ましくは1と1,000との間、より好ましくは2と500との間である。PEGは、好ましい平均分子量1,000と40,000との間を有し、より好ましくは2,000と20,000との間を有し、最も好ましくは3,000と12,000との間を有する。好ましくは、PEGは、少なくとも一つのヒドロキシ基、より好ましくは末端ヒドロキシ基を有する。好ましくは活性化されて、インヒビターの遊離アミノ基と反応するものが、このヒドロキシ基である。しかし、本発明の共有結合PEG/抗体が達成されるように、反応基の型および量は変更され得ることが理解される。
【0068】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール(POG)などを含む。POGが好ましい一つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロール中のグリセロール骨格は、例えば動物およびヒトにおいてモノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド中に天然に存在するものと同じ骨格であるからである。POGは、PEGと同範囲の好ましい平均分子量を有する。POGの構造は、Knaufら(1988)J.Bio.Chem.263:15064−15070に示され、そしてPOG/IL−2結合体についての議論は、米国特許第4,766,106号に見出され、両方とも本明細書によりその全体が参考として援用される。
【0069】
循環中の半減期を増加させる別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系の調製方法は、Gabizonら(1982)Cancer Research 42:4734;Cafiso(1981)Biochem Biophys Acta 649:129;およびSzoka(1980)Ann.Rev.Biophys.Eng.9:467に論じられる。他の薬物送達系は、当該分野では公知であり、例えば、Poznanskyら(1980)Drug Delivery Systems(R.L.Juliano編,Oxford,N.Y.)253−315頁;Poznansky(1984)Pharm Revs 36:277に記載される。
【0070】
本発明のさらなる実施形態は、臨床試験手順の一部として、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するための、組織中のタンパク質レベルを診断モニターするための、アンタゴニスト抗CD40抗体の使用である。抗体を検出可能な物質と結合させることにより、検出は容易になり得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる;適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる;適切な蛍光物質の例としては、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる;発光物質の例としてルミノールが挙げられる;生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる;そして適切な放射性物質の例としては、125I、131I、35S、または3Hが挙げられる。
【0071】
アンタゴニスト抗CD40抗体は、悪性B細胞を含む疾患状態の処置のための、公知の化学療法剤およびサイトカインと組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の抗CD40抗体は、サイトカイン(例えばインターロイキン2)と組み合わせて使用され得る。別の実施形態では、本発明の抗CD40抗体は、Rituximab(IDEC−C2B8;Rituxan(登録商標);IDEC Pharmaceuticals Corp.,San Diego,California)と組み合わせて使用され得る。Rituximabは、ヒトIgG1およびヒトκ鎖の定常領域を、マウス抗CD20モノクローナル抗体IDEC−2B8(Reffら(1994)Blood 83:435−445)より単離されたマウス可変領域と共に含む、キメラ抗CD20モノクローナル抗体である。
【0072】
本明細書に記載された抗CD40抗体は、試薬(例えば、(例えばCD40を発現する細胞の同定に)使用され得る、標識抗体または標識され得る抗体)を提供するために、さらに使用され得る。このような抗体は、未知試料の細胞型を決定する場合に非常に有用であり得る。複数のモノクローナル抗体は、種別におよび/または器官型別に組織を同定するために使用され得る。同様の様式で、これらの抗CD40抗体は、混入物について組織培養細胞をスクリーニングするため、すなわち、培養物中のCD40発現細胞およびCD40非発現細胞の混合物についてスクリーニングするために使用され得る。
【0073】
次の実施例は、例示のために提供されるが、限定のためには提供されるものではない。
【0074】
(実験)
下記の実施例において使用されるアンタゴニスト抗CD40抗体は、15B8である。15B8は、ヒトIgG2重鎖の遺伝子座およびヒトK軽鎖の遺伝子座を有するトランスジェニックマウス(Xenomouse、Abgenix)の免疫により生産される、ヒトIgG2サブタイプの抗ヒトCD40モノクローナル抗体である。FACS分析により示されるように、15B8は、ヒトCD40に特異的に結合し、かつサル(カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒ)およびチンパンジー由来の末梢血B細胞上のCD40と交差反応する。15B8は、霊長類でない動物種由来のCD40と交差反応せず、ELISAおよびFACS分析により実証されるように、TNFレセプターファミリーの他のメンバーと結合もしない。ヒトCD40に対する15B8の結合親和力は、BIACoreアッセイにより測定した場合、3.1×10−9Mである。
【0075】
(実施例1:インビトロにおけるCD40/CD40L相互作用に対する15B8の影響)
CD40結合との直接競合が15B8のアンタゴニスト活性の機構であるか否かを決定するために、競合結合アッセイを実施した。
【0076】
CD40Lをコードする遺伝子を含みかつ細胞表面上にCD40Lを発現する、チャイニーズハムスター卵母細胞(CHO)株を作製した。このCD40L発現CHO細胞を、15B8とCD40とのインキュベーションの前および後に、精製されたCD40と共にインキュベートした。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識した抗huIgGを、上記細胞に添加した。FACS分析を実施し、CD40を介してこのCHO細胞に結合した15B8を検出した。CD40への15B8の結合は、その後のCD40へのCD40Lの結合を阻害した。しかし、CD40LおよびCD40を、15B8の添加前に一緒にインキュベートした場合、15B8は、その後CD40への結合が可能であった。いかなる作用機構にも結び付けられないが、このことは15B8がCD40上の結合部位に対してCD40Lと直接は競合しないこと、そしてCD40への15B8の結合は、おそらくCD40分子内にCD40へのCD40Lの結合を妨げる高次構造変化を引き起こしたことを、示唆する。15B8の結合により誘導されるCD40分子の推定構造変化もまた、上記細胞にネガティブシグナルを伝達し得、アンタゴニスト効果を起こし得る。
(実施例2:NHL患者由来のリンパ腫細胞における15B8の薬理作用)
非ホジキンリンパ腫(NHL)の前臨床インビトロモデルにおいて、15B8の可能な効力を実証するために、Rituximab処置されたNHL患者または未処置のNHL患者のいずれかより採取された悪性B細胞(NHL細胞)を使用して、15B8を試験した。Rituximab(IDEC−C2B8;Rituxan(登録商標);IDEC Pharmaceuticals Corp.,San Diego,California)は、再発性または治療抵抗性の、低悪性度または濾胞性の、NHL処置用抗CD20モノクローナル抗体である。
【0077】
初代リンパ腫細胞は通常の培養培地で増殖せずそして培養2〜3日後にアポトーシスを受けるので、腫瘍細胞を、B細胞増殖因子であるインターロイキン−4(IL−4)の存在下または非存在下で、CD40リガンド(CD40L)でトランスフェクトした照射フィーダー細胞(Arpinら(1995)Science 268:720−722)と共に、共培養した。指示された濃度(0.01μg/ml〜10μg/ml)の抗体(アゴニスト抗CD40 MS81、アンタゴニスト抗CD40 15B8、またはアイソタイプコントロールヒトIgG2(huIgG2))を、その後その培養物に添加した。37℃で48時間のインキュベーションの後、培養細胞を、3H−チミジンで18時間パルスした。その後細胞を収集し、そして3H−チミジン取り込み量を分析した(Schultzeら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8200−8204)。全てのサンプル条件は、3組あった。
【0078】
これらのNHL細胞の初代培養アッセイにおいて、15B8単独、またはIL−4と組み合わせた15B8は、インビトロにおいてNHL細胞を刺激して増殖させなかった。対照的に、アゴニスト抗CD40 MS81は、同じ条件下でNHL細胞増殖を誘導した。15B8は、CD40Lにより刺激されたNHL細胞増殖、およびIL−4添加CD40Lにより刺激されたNHL細胞増殖の、統計的に有意な阻害(前者:P=0.05、後者:P<0.05)をインビトロで示した。それぞれ1μg/ml〜10μg/mlまたは0.1μg/ml〜10μg/mlの範囲の濃度で、15B8は、CD40LによりまたはIL−4添加CD40Lにより刺激されたNHL細胞増殖を、統計的に有意に用量相関的な阻害(P<0.005)を示した(データは示さず)。
【0079】
リンパ腫の治療法の開発において、ヒト抗原特異的モノクローナル抗体(Mab)の評価のため通常使用される、2つのタイプの前臨床モデルがある。一つのモデルは、異種移植マウスのインビボにおけるモデルであり、そのモデルでは、EBVにより形質転換させたリンパ腫細胞株(例えばDaudi細胞(バーキットリンパ腫)またはRaji細胞(バーキットリンパ腫))が、SCID/ヌードマウスに異種移植される。これらのモデルの欠点は、その結果が、特定の不死化細胞株(あるEBVにより形質転換した細胞に由来するもの)に対する影響のみを反映することである。バーキットリンパ腫細胞がリンパ芽球様細胞であることは公知であり(Ambinderら(1999)Cancer Treat.Res.99:27−45;Quintanilla−Martinezら(1998)Leuk.Lymphoma 30:111−121;Klein(1996)Acta Microbiol.Immunol.Hung.43:97−105)、一方、NHL患者由来のリンパ腫細胞は、成熟B細胞の段階であると考えられている(Ghiaら(2000)Adv.Cancer Res.79:157−173)。B細胞のEBV形質転換は、CD40シグナル伝達経路において多くの成分の変化をもたらす(Uchidaら(1999)Science 286:300−303;Farrelら(1997)Biomed.Pharmacother.51:258−267)。NHL細胞および正常B細胞におけるCD40シグナル伝達とは対照的に、CD40シグナル伝達は、EBV形質転換バーキットリンパ腫細胞株において増殖阻止をもたらす(Fukudaら(2000)Viral Immunol.13:215−229;Bakerら(1998)Blood 92:2830−2843)。従って、この異種移植モデルにおけるアンタゴニスト抗CD40 MAb(15B8)の試験の結果から、NHL患者によるこの抗体(15B8)に対する応答を推定することは、不可能である。
【0080】
もう1つのモデルは、上で使用したNHL患者由来のリンパ腫細胞の、インビトロにおける増殖阻害アッセイである。その有利な点は、その結果により、試験される因子(15B8)に対するNHL患者由来のリンパ腫細胞の感受性が予想されることである。しかし、その結果は、限定された条件下でのインビトロにおける研究から得られる。これまでに開示された研究は、ラット抗マウスCD40抗体は、インビトロにおいてADCCおよびCDCを誘導不能であるが、2つの同系マウスB細胞リンパ腫モデル(BCL1およびA31)において、良好な有効性を示したことを記した(Tuttら(1998)J.Immunol.161:3176−3185)。抗マウスCD40の抗腫瘍効果は、試験された抗Idより時間的に遅く生じた。仮説の一つは、試験されたマウスモデルにおいて、抗マウスCD40は、抗Idのように直接のシグナル伝達をブロックするのではなく、表面上のCD40発現に依存した主要増殖シグナルをブロックすることにより作用したことであった。15B8は、ヒトIgG2サブタイプであるので、試験した場合、インビトロにおいてFcγレセプターに結合せず、そしてインビトロにおいてADCCおよびCDCを誘導しなかった(データは示さず)。15B8は、ラット抗マウスCD40と類似の特性を有する。これらのデータは、15B8が、NHL患者(特にRituxan(登録商標)抵抗性患者)に利益をもたらすという仮説を支持する。
【0081】
(実施例3:インビトロでの悪性B細胞の増殖に対する15B8の効果)
15B8がインビトロにおいてCD40L様の増殖シグナルを提供するかどうかを試験するため、腫瘍に浸潤されたリンパ節由来のB細胞(NHL細胞)を、抗体未処置のNHL患者1人、Rituximab感受性のNHL患者1人およびRituximab抵抗性のNHL患者1人より、採取した。これらのNHL細胞を、以下の4つの異なる培養条件下で研究した:抗体の添加なし(培地);ヒトアイソタイプ抗体IgGの2添加(コントロール;huIgG2と呼ぶ);抗CD40抗体MS81(アゴニスト抗体)の添加;および15B8の添加。IL−4の存在下または非存在下にて、全ての抗体を1μg/ml、2μg/mlおよび5μg/mlで試験した。2人の患者由来のNHL細胞を、上記のように同じ4つの条件下でIL−4(2ng/ml)の存在下で、培養した。B細胞増殖を、上記の3H−チミジン取り込みにより測定した。
【0082】
抗CD40抗体15B8は、1μg/ml、2μg/mlおよび5μg/mlの濃度では、IL−4の存在下または非存在下のどちらでも、NHL細胞が増殖するように刺激しなかった。対照的に、同じ濃度で試験したアゴニスト抗CD40抗体(MS81)は、IL−4の存在下および非存在下の両方で、全ての患者のサンプルにおいてNHL細胞増殖を刺激した。1人の患者からの代表的な結果を、図1および図2に示す。上記2人の患者由来のNHL細胞のIL−4存在下での結果、および3人の患者由来のNHC細胞のIL−4非存在下での結果は、同等であった。これらの結果は、15B8が、アゴニスト抗CD40抗体ではなく、そしてインビトロにおいてRituximab感受性のNHL患者、Rituximab抗体未処理のNHL患者またはRituximab抵抗性のNHL患者由来のNHL細胞の増殖を刺激しないことを、示す。
【0083】
NHL細胞のFACS分析を、直接標識した15B8−FITCまたは15B8+抗huIgG2−FITCの一方を用いて実施し、試験されたNHL細胞表面にCD40が発現されていること、および15B8がNHL細胞に結合することを確認した。Rituximab感受性の患者2人およびRituximab抵抗性の患者4人(合計6人の患者)由来のNHL細胞を試験した。全ての患者由来のNHL細胞は、CD40を発現し、そして15B8に結合した。所定のどの患者における15B8結合陽性細胞集団も、約66%〜91%であった。
【0084】
(実施例4:15B8は、インビトロにおけるNHL細胞のCD40L刺激性増殖を阻害する)
インビトロにおいてCD40Lによって提供される増殖シグナルをブロックする15B8の能力を評価するため、患者由来のNHL細胞を、4つの異なる条件下で上記のようにCD40L発現フィーダー細胞上の懸濁物中にて培養した:抗体の添加なし(medium);ヒトアイソタイプ抗体IgG2の添加(コントロール);抗CD40抗体MS81(アゴニスト抗体)の添加;および15B8の添加。全ての抗体を、IL−4存在下または非存在下で1μg/ml、2μg/mlおよび5μg/mlの濃度で添加した。抗体未処置の患者1人、Rituximab感受性の患者2人、およびRituximab抵抗性の患者5人(合計8人の患者)由来のNHL細胞を、上記と同じ4つの条件下で、IL−4の存在下(2ng/ml)にて培養した。Rituximab感受性の患者3人およびRituximab抵抗性の患者4人(合計7人の患者)由来のNHL細胞を、同様の条件下でIL−4の非存在下にて培養した。NHL細胞の増殖を、3H−チミジン取り込みにより測定した。
【0085】
以下の表1は、インビトロにおいてCD40L単独で刺激した、Rituximab感受性の患者2人(一方の患者からのデータは、2回の別々の実験において再現性があった)、およびRituximab抵抗性の患者4人(合計6人の患者)由来のNHL細胞の増殖に対する15B8の阻害効果を示す。1人の患者(A)由来の細胞の代表的な結果を、図3に示す。6人の患者において15B8は、コントロールと比較した場合、増殖を約12%〜68%阻害した。15B8による阻害の程度は、患者のサンプルおよび15B8の用量レベルに依存して変動した。試験した7人の患者サンプル中6サンプルからのデータの統計的な解析は、CD40L刺激性のNHL細胞増殖の15B8による阻害は、1μg/mlで有意である(p=0.05)ことを示す。阻害効果が15B8の用量の増加に伴って増加するので、統計的に有意な用量応答(p<0.005)が存在する。
【0086】
(表1:IL−4非存在下でのCD40L刺激によるNHL患者細胞増殖に対する15B8 MAbの効果1)
【0087】
【表1】
1.患者由来のNHL細胞を、培地、アゴニスト抗CD40(MS81)、アンタゴニスト抗CD40(15B8)またはhuIgG2アイソタイプコントロールの存在下で、ヒトCD40Lを発現するマウスL細胞と共にインビトロにて培養した。NHL細胞の増殖を、3H−チミジン取り込みにより測定した(Rituximab感受性の1人の患者由来のデータは、CD40LのCPM<2000であるので表にはない)
2.抗CD20 MAb治療に対する患者の応答;CR、完全な応答を示す患者;NR、応答のない患者
3.15B8 %阻害=100−(15B8 cpm/huIgG2 cpm × 100);3つの結果の平均を示す。
【0088】
(以下の)表2は、インビトロにおいてCD40LおよびIL−4の両方によって刺激された、抗体未処置の患者1人、Retuximab感受性の患者2人(両患者のサンプルからのデータを2回繰り返した)、およびRituximab抵抗性の患者5人(合計8人の患者)由来のNHL細胞の増殖に対する15B8の阻害効果を示す。15B8は、1μg/mlの濃度で、NHL細胞のCD40LおよびIL−4を介した増殖を有意に(p<0.05)阻害した。阻害の程度は、インビトロにおいて8人全ての患者由来のサンプルにおいて、高用量(5μg/mlまたは10μg/ml)で、18%〜69%の範囲であった。15B8の濃度範囲0.01μg/ml〜10μg/mlで、15B8によるこの阻害効果の統計的に有意な(p<0.005)用量応答が存在した。図4は、1つの代表的な用量応答曲線を示す。これらのインビトロにおける結果は、15B8を用いた処置が患者のNHL細胞に対するCD40媒介性増殖シグナルをブロックし得ることを、示唆する。
【0089】
(表2:IL−4存在下での、CD40L刺激されたNHL患者細胞に対する15B8 MAbの効果1)
【0090】
【表2】
1.患者由来のNHL細胞を、表1に記載した条件下で、ヒトCD40Lを発現するマウスL細胞と共にIL−4(ヒトインターロイキン−4)(2ng/ml)存在下で培養した
2.抗CD20 MAb治療に対する患者の応答;CR、完全な応答を示す患者;NR、応答のない患者;未処置、未処置の患者
3.huIgG2と比較した%阻害。15B8 %阻害=100−(15B8 cpm/huIgG2 cpm × 100)。
【0091】
(実施例5:15B8は、ヒト末梢血B細胞を活性化せず、そしてヒト、チンパンジー、およびマーモセットではインビトロにおけるPBMC増殖を引き起こさない)
15B8がアゴニスト抗CD40であるか、またはアンタゴニスト抗CD40であるかを決定するために、15B8を、ヒトおよび5つの異なる霊長類種(チンパンジー(chimp)、マーモセット、カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒを含む)由来の細胞を用いて、以下に記載するいくつかのインビトロアッセイにて試験した。
【0092】
(表3:15B8抗体による、ヒト、チンパンジー(chimp)、およびマーモセットにおけるPBMC/B細胞増殖の刺激1)
【0093】
【表3】
1.B細胞/PBMCを、CD40L、15B8またはhuIgG2アイソタイプコントロールの存在下でインビトロにおいて培養した
2.細胞増殖の結果を、huIgG2コントロールに対する15B8の3H−チミジン取り込みの比として記録する。いくつかのサンプルからのデータは、CD40L(陽性コントロール)により誘導されるCPMが<2000のため、表中に含まれない
3.表中に示すCD40Lの増加倍数は、5μg/mlでのhuIgG2のcpmに対するCD40Lのcpmの比である。
【0094】
B細胞活性化の際に、多くの細胞表面タンパク質が上方制御される(Dentonら(1998)Pediatr.Transplant.2:6−15;Evansら(2000)J.Immnol.164:688−697;Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49:17−22;Ledermanら(1996)Curr.Opin.Hematol.3:77−86)。15B8が、CD40に結合する場合に、ヒトB細胞を活性化せず、そしてアゴニストシグナルを誘導しないことを確認するために、B細胞活性化マーカーを上方制御するその能力を、精製されたヒトPBMCを使用するFACS分析により試験した。15B8処置したヒトB細胞において、活性化マーカー(例えば、CD25、CD69、CD86、HLA−DR、およびICAM−1(CD54))の発現における上方制御はなかった(表4)。これらのマーカーのレベルは、細胞を15B8またはhuIgG2コントロールのいずれかを用いて処置した場合と同様であった(表4)。対照的に、CD69は、試験された3人の健常提供者由来のPBMCサンプルにおいて、CD40Lにより常に上方制御された。
【0095】
(表4:FACSによる、インビトロにおけるB細胞活性化マーカーの上方制御に対する15B8の効果)
【0096】
【表4】
1.「−」は上方制御なしを意味する
2.「N/A」は測定されなかったか、または成功しなかったことを意味する。
【0097】
B細胞活性化のさらなる意義は、表面上のFasLおよびアポトーシスの上方制御である(Revyら(1998)Eur.J.Immunol.28:3648−3654;Careyら(2000)Immunol.Rev.176:105−115;Juら(1999)Int.Rev.Immunol.18:485−513;Baumgarthら(2000)Immunol.Rev.176:171−180)。15B8がアゴニスト性の抗CD40抗体ではないことを確認するために、ヒトB細胞のFasL発現およびアポトーシスを誘導するその能力についてもまた、試験した。細胞表面上のアネキシンV染色を、初期アポトーシスマーカーとして使用し得る(Juら(1999)Int.Rev.Immunol.18:485−513)。ヒトB細胞を末梢血より精製し、そして15B8と共にインキュベートした。FACS分析を使用して、アネキシンVおよび抗FasLの陽性染色を伴う細胞を同定した。15B8またはアイソタイプコントロール(huIgG2)抗体とともにインキュベートした細胞間では、その2つの試薬による表面染色における有意な差異はなかった(データは示さず)。この結果は、15B8がインビトロにおいてヒトB細胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。これらのデータは、15B8がヒトB細胞に対してアゴニスト抗CD40抗体ではないというさらなる証拠を提供する。
【0098】
15B8は、霊長類由来のCD20陽性PBMCの表面上に発現するCD40と交差反応する。15B8が、他の霊長類種(例えば、チンパンジーおよびマーモセット)由来のB細胞上のCD40を活性化するか否かを試験するために、15匹のチンパンジー(chimp)および5匹のマーモセットから新たに単離したチンパンジーPBMCおよびマーモセットPBMCを使用して、同一の増殖アッセイを実行した。ヒトPBMCを用いた結果と同様に、15B8は、1μg/mlおよび5μg/mlの濃度では、6匹のチンパンジーおよび5匹のマーモセット由来のPBMCのインビトロにおける増殖を、刺激しなかった(上記の表3)。15B8はまた、試験された3つのチンパンジーPBMCサンプルにおいて、活性化マーカーCD69の発現を上方制御しなかった(表4)。15B8は、試験された6匹のチンパンジー由来のサンプル全てにおいて、インビトロでの24時間および48時間の刺激後、ヒトPBMCコントロールと同様に、チンパンジーPBMCにおけるFasL発現およびアポトーシスに対して全く影響を示さなかった(データは示さず)。
【0099】
プラスチック表面に固定化された二次抗体によって架橋されている15B8は、B細胞増殖を刺激するその効力を増加しなかった(データは示さず)。この架橋アッセイにてヒトおよびチンパンジー由来のPBMCを用いて試験した場合、15B8は、細胞の増殖を刺激しなかった。この観察は、インビボで投与される場合で、他のFcレセプターを発現する細胞に対して抗15B8(HAHA)またはFcの結合を導入する場合、15B8がB細胞増殖に対して刺激性である(すなわち、アゴニスト性であるかまたはアゴニスト活性を有する)危険性が減少されたことを示す。
【0100】
要約すると、15B8は、インビトロにおいてヒトB細胞/PBMCにおいても、チンパンジーPBMC/マーモセットPBMCにおいても活性化シグナルを開始しない。従って、15B8は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてアゴニスト抗CD40抗体ではない。
【0101】
(実施例6:15B8は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおけるインビトロでのアンタゴニスト抗CD40抗体である)
15B8がアンタゴニスト抗CD40であるか否かを決定するために、CD40−CD40L相互作用を阻害するその能力を、CD40L媒介性のヒトB細胞増殖アッセイ(Kwekkeboomら(1993)Immunology 79:439−444)にて試験した。ヒトCD40Lを発現するトランスフェクトされたCHO細胞株を使用して、精製されたヒト末梢血B細胞またはPBMCの増殖を刺激した。10人の健常提供者由来のヒトB細胞および3人の健常提供者由来のヒトPBMCを試験した。試験されたサンプル全てにおいて、15B8は、濃度範囲0.2〜5μg/mlで、CD40L発現CHO細胞媒介性の増殖を42%〜88%抑制した(表5)。図5は、3人の個体由来の細胞を使用した代表的な用量応答曲線を示す。15B8の無効用量は0.008μg/mlであり、そして0.2μg/mlで飽和用量に達する(図5)。この観察は、アンタゴニスト抗CD40抗体としての15B8がヒトB細胞およびPBMCにて細胞表面に発現されたCD40Lにより提供される増殖信号を阻害し得ることを示す。
【0102】
(表5:15B8抗体を用いるPBMC/B細胞のCD40L誘導性増殖の阻害1)
【0103】
【表5】
1.B細胞/PBMCを、15B8またはhuIgG2コントロールの存在下でCD40L発現CHO細胞と共にインビトロにおいて培養した
CD−40LをトランスフェクトしたCHO細胞を、実験前にホルムアルデヒドを用いて固定化した
細胞増殖を、3H−チミジン取り込みにより測定した
2.「15B8 %阻害」=100−(15B8 cpm/CD40L cpm × 100)
いくつかのサンプルからのデータは、CD40L(陽性コントロール)によって誘導される増殖が<5倍なので、表中にはない。
【0104】
9匹のチンパンジーおよび3匹のマーモセットより新たに単離されたPBMCを使用して、さらなるアッセイを実行した。ヒトPBMCと同様に、15B8は、1μg/mlの濃度レベルで、CD40L発現CHO細胞により刺激されたチンパンジーPBMCおよびマーモセットPBMCの増殖を阻害し得た(上記の表5)。3匹のチンパンジーおよび3匹のマーモセット由来のPBMCサンプルにて、15B8による阻害は、それぞれおよそ55%〜73%および68%〜84%であった(上記の表5)。
【0105】
活性化されたB細胞は、多くの生物学的応答(例えば、増殖および抗体生産)を受ける。T細胞依存性抗原によるB細胞の活性化は、CD4+Tヘルパー(Th)細胞を含む。このT細胞ヘルパープロセスは、他の同時刺激因子およびサイトカインの相互作用と一緒に、B細胞上のCD40とTh細胞表面上のCD40Lとの相互作用の協調的な作用により媒介される(Dentonら(1998)Pediatr.Transplant.2:6−15;Evansら(2000)J.Immunol.164:688−697;Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49:17−22;Lendermanら(1996)Curr.Opin.Hematol.3:77−86;Mackeyら(1998)J.Leukoc.Biol.63:418−428)。15B8がTヘルパー細胞媒介性のB細胞抗体生産をブロックし得るか否かを試験するために、精製されたヒト末梢血B細胞を、抗CD3抗体を用いて活性化された、精製され、照射されたT細胞の存在下で培養した。ELISAアッセイを使用してIgM生産のレベルを測定した。このアッセイにおいて、15B8は、IgM生産を約30%減少させた(データは示さず)。従って、15B8は、T細胞媒介性のB細胞免疫グロブリン生産を減少させ得る。
【0106】
要約すると、15B8は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおけるCD40L誘導性のB細胞/PBMCの増殖を阻害し、そして、精製されたヒトB細胞によるT細胞誘導性の抗体生産をインビトロにおいて阻害する。これらのデータは、15B8がヒトB細胞ならびにチンパンジーおよびマーモセット由来のPBMCにおいてインビトロでのアンタゴニスト抗CD40抗体であることを実証する。
【0107】
(実施例7:15B8は、インビトロでのアゴニスト抗サル(カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ)CD40抗体である)
FACS分析は、15B8がサル(カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ)末梢血由来のB細胞表面上に発現されたCD40に結合することを実証する。新たに単離されたカニクイザルPBMCに対する15B8の効果を、ヒトおよびチンパンジーについて上記した同一の増殖アッセイ(Coliganら(1998)Current Protocols in Immunology 13:12;Kwekkeboomら(1993)Immunology 79:439−444)にて、試験した。3H−メチルチミジン取り込みにより測定する場合、ヒトPBMCとは対照的に、15B8が、カニクイザルPBMCを刺激してインビトロにおいて増殖させることを見出した(下記の表6)。1μg/mlのレベルで、15B8は、試験された17匹のサル由来の22サンプル(5匹のサル由来のサンプルを2回試験した)にて、huIgG2コントロールと比較してPBMCの増殖を6倍〜129.7倍刺激した(下記の表6)。5μg/mlのレベルで、15B8により刺激された増殖は、2匹のサル由来の4つのサンプルにおいて14倍〜24倍、および2匹のサル由来の2つのサンプルにおいて約1.25倍または約1.85倍である(表6)。このことは、15B8が5μg/mlの濃度レベルで、カニクイザル由来のPBMCに対するその増殖刺激効果についての飽和用量を超える限界であり得ることを、示唆する。表面マーカーによる活性化状態についてのB細胞のさらなるFACS分析は、15B8がサルB細胞に対してCD69、CD86およびHLA−DRの上方制御を誘導することを示した(表7)。こららのデータは、15B8が、カニクイザル由来の末梢血B細胞上に発現されるCD40に対するインビトロでのアゴニスト抗体であることを、示唆する。
【0108】
15B8のこのアゴニスト性の効果がカニクイザル特異的ではないことを確認するために、同一のアッセイを、アカゲザルおよびヒヒ由来のPBMCを用いて実施した。表6に示すように、カニクイザルの細胞より得られた結果と同等の結果を、観察した。15B8は、インビトロにおいてアカゲザルおよびヒヒ由来のPBMCの増殖を刺激した(表6)。15B8のアゴニスト活性を、5匹のアカゲザルおよび3匹のヒヒ由来のPBMCを使用して示した(表6)。
【0109】
(表6:15B8により刺激された、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザル、ならびにヒヒ由来のPBMCの増殖1)
【0110】
【表6】
1.PBMCを、CD40L、15B8またはhuIgG2コントロールの存在下でインビトロにおいて培養した
2.細胞増殖の結果を、huIgG2コントロールに対する15B8の3H−チミジン取り込みの比として記録する
いくつかのサンプルからのデータは、CD40L(陽性コントロール)により誘導されたCPMが<2000のため、表中にはない
3.表中に示されるCD40Lについての増加倍数は、5μg/mlでのhuIgG2のcpmに対するCD40Lのcpmの比である
CD40LをトランスフェクトしたCHO細胞を、実験前にホルムアルデヒドを用いて固定化した。
【0111】
(表7:FACS分析によるインビトロにおけるB細胞活性化マーカーの上方制御に対する15B8の影響)
【0112】
【表7】
1.「−」は、上方制御なしを意味する
2.「N/A」は、測定されなかったか、または成功しなかったことを意味する。
3.細胞数が制限されたので、1匹のカニクイザル由来の細胞のみをFACSによって3日目に分析した。
【0113】
(実施例8:15B8は、カニクイザルにおけるインビボでのアゴニスト抗CD40抗体である)
15B8は、カニクイザル由来のPBMCにて、インビトロで増殖を刺激し得、そして細胞表面の活性化マーカーを上方制御し得る。15B8がこれらのサルにおいてインビボでのアゴニスト抗CD40抗体であるか否かを決定するために、15B8の生体分布および影響を受けた末梢血B細胞の運命(すなわち、血管外分布、アポトーシス、状態の活性化、または補体の溶解)を試験するため、研究を実施した「Biodistribution of 15B8.72 Antibodies following Intravenous Administration to Non−Naive Male and Female Cynomologus Monkeys(SNBL.218.3、SNBL(USA))」。
【0114】
カニクイザル(雌1匹および雄2匹)は、3mg/kgの15B8の静脈投与を1回受けた。以下のパラメーターを、モニターした:臨床徴候、食物消費、体重、薬物動態、血清補体(CH50)、B細胞(アポトーシス様B細胞を含む)、T細胞および単球についてのフローサイトメトリー。15B8を用いるB細胞CD40レセプター飽和もまた、測定した。動物を、単回用量の15B8を受けた24時間後に剖検し、そして標準的な器官を秤量した。脾臓および腋窩リンパ節の外科的生検の予備研究を、基準線コントロールとして用いた。剖検にて、リンパ組織および非リンパ組織を、組織病理学および免疫組織化学のためにサンプリングした。組織を、CD3抗原、CD40抗原、CD20抗原、CD27抗原およびCD38抗原に対する抗体を用いて免疫染色した。その研究の予備的な結果を、以下に論じる。
【0115】
全ての動物は、予定された剖検まで生存し、そして摂食量、体重、CH50レベルに対しても、末梢血のT細胞数または単球数にも影響がなかった。器官重量にも変化がなかった。脾臓の顕微鏡検査は、15B8処置された動物全ての胚中心において、ネクローシスを伴う中程度のびまん性濾胞の過形成および/または好中球の浸潤を示した。腸間膜リンパ節および鼡径部リンパ節の検査は、3匹の動物中2匹において軽度の濾胞の過形成を示した。処置に関連した顕微鏡下での効果は、他の組織(肝臓、皮膚、脳、胸腺、胚、骨髄、副腎および腎臓)では見られなかった。
【0116】
CD20抗体、CD27抗体、CD40抗体およびCD86抗体を用いた免疫染色は、脾臓およびリンパ節濾胞においてこれらのマーカーの増加を明らかにし、このことは、これら同一の組織において見られた濾胞の過形成と相関した。CD20およびCD40の増加された染色は、脾臓およびリンパ節に限定されるが、CD27を用いる肝組織の幾分かのさらなる染色があり、そしてCD86による肝臓のクップファー細胞および炎症細胞の幾分かのさらなる染色があった。CD86染色はまた、胸腺髄質細胞および副腎間隙白血球においても増加された。15B8処置動物におけるCD3免疫染色では、コントロールと比較した場合、変化がなかった。
【0117】
これらの発見は、カニクイザルに投与された3mg/kgの15B8の単回用量が、24時間の期間内に脾臓およびリンパ節において、リンパ濾胞の増殖および/または末梢血由来のB細胞の再拡散を起こし得ることを示す。CD20、CD27、CD40およびCD86に対する抗体は、他の細胞型の認識に伴い、B細胞上および/あるいは活性化B細胞上に発現される抗原を認識する。これら抗原を発現する細胞数の増加が、処置された動物の脾臓およびリンパ節に見られ、このことは活性化されたCD20+ B細胞数の増加を示唆する。この研究は、カニクイザルにてインビボにおいて15B8がアゴニスト抗CD40抗体であることを示唆する。カニクイザルにおいてインビボおよびインビボで得られた結果は一致している。
【0118】
(実施例9:チンパンジーにおける、末梢B細胞に対する15B8の影響)
3匹の雄チンパンジーの2つの集団は、静脈内投与により0.03mg/kgまたは3mg/kgのいずれかの15B8を受けた。血清15B8濃度および末梢B細胞数を、15B8の投与直後より投与後29日にかけてモニターした。この実験結果を図6に示す。3mg/kgでの15B8の投与後、血清15B8濃度は、短期拡散期、対数線形性の消失期および非線形性の消失期を含む3相の様式で減少した。およそ10μg/ml未満の濃度では、非線形性の消失期が優先的であった。対数線形期中の半減期はおよそ4日であった。末梢B細胞数は15B8投与後直ぐに減少し、そして3〜4週間以内に回復した。15B8は、血清中において検出され、循環しているB細胞上の表面CD40レセプターに結合した。結合の程度は、2日目から投与後8日まで相対的に変わらないままであり、そしてそれから投与後29日にかけて消失するようであった。
【0119】
0.03mg/kgの15B8の投与後、B細胞は30分までは僅かに減少するようであるが、4時間以内に投与前の値に復帰した。血清15B8濃度は、投与後30分に検出限界未満であった。
【0120】
(実施例10:免疫グロブリン定量のためのELISAアッセイ)
ヒトIgMおよびヒトIgGの濃度をELISAアッセイにより測定した。96−ウェルELISAプレートを、4μg/mlの抗ヒトIgG mAb、または1.2μg/mlの抗ヒトIgM mAbを用いて、0.05Mの炭酸緩衝液(pH=9.6)中で16時間4℃でコートした。プレートをPBS−0.05%Tween−20(PBS−Tween)を用いて3回洗浄し、BSAで1時間飽和させた。2回洗浄後、プレートを1時間37℃で希釈率の異なる試験サンプルと共にインキュベートした。3回洗浄後、1μg/mlのペルオキシダーゼ標識された、マウス抗ヒトIgG mAbまたはマウス抗ヒトIgM mAbと共に1時間37℃でインキュベートすることにより、結合したIgを検出した。プレートを4回洗浄し、そして結合したペルオキシダーゼ活性をo−フェニレンジアミンを基質として添加することにより示した。
【0121】
(結論)
(インビトロアッセイの要約)
本結果は、15B8が、カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒにおいて、アゴニスト性の抗CD40抗体であること、および、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてアンタゴニスト性の抗体であることを示唆する。実施された実験を以下の表に要約する。
【0122】
(表8:アゴニスト活性を測定したアッセイ)
【0123】
【表8】
(表9:アンタゴニスト活性を測定したアッセイ)
【0124】
【表9】
15B8は、ヒトIgG2サブタイプを有し、そして非ヒト霊長類のみに由来するCD40に対して交差反応性を有する、抗ヒトCD40特異的モノクローナル抗体である。インビトロにおける広範な試験を通して、15B8が、ヒトB細胞、ヒトPBMC、チンパンジー(chimp)PBMCおよびマーモセットPBMCにおいて発現されるCD40に対する、アンタゴニスト抗CD40抗体であることを示した。しかし15B8は、インビトロにおいてサル(カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ)由来のPBMCにおいて発現されるCD40に結合する場合、アゴニスト活性を有することが示された。この15B8のアゴニスト活性は、インビボにおいてカニクイザルにて確認された。Rituxan感受性およびRituxan抵抗性のNHL患者由来のリンパ腫細胞の初代培養において試験した場合、15B8は、IL−4存在下または非存在下においてアゴニスト活性を全く有さない。15B8はまた、両条件下で同様の集団の患者のからのリンパ腫細胞のCD40L刺激性増殖を阻害し得る。15B8は、CD40/CD40L経路が疾患の病因において役割を果たし得るB細胞悪性腫瘍(例えば非ホジキンリンパ腫(NHL))を緩和する潜在能を有する。
【0125】
本明細書に言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明の帰属する分野の当業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、各々個別の刊行物または特許出願が、特定におよび個別に参考として援用されることが示される場合と同程度に、本明細書において参考として援用される。
【0126】
当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの等価物を認め、または慣用的な実験法以上のものは使用せずに突きとめ得る。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、インターロイキン4(IL−4)非存在下で、インビトロでの非ホジキンリンパ腫(NHL)細胞の増殖に対する、アゴニスト(MS81)およびアンタゴニスト(15B8)抗CD40抗体の濃度、1μg/ml、2μg/ml、または5μg/mlでの効果の代表的結果を示す。悪性B細胞を、NHL患者の腫瘍が浸潤したリンパ節から得た。NHL細胞のFACS解析により、これらの細胞はCD40を発現し、アンタゴニスト抗CD40抗体15B8に結合することが確認された。詳細は、上記の実施例3を参照のこと。
【図2】
図2は、IL−4存在下(2ng/ml)で、インビトロでの非ホジキンリンパ腫(NHL)細胞の増殖に対する、アゴニスト(MS81)およびアンタゴニスト抗CD40抗体(15B8)の濃度、1μg/ml、2μg/ml、または5μg/mlでの効果の代表的結果を示す。悪性B細胞を、NHL患者の腫瘍が浸潤したリンパ節から得た。NHL細胞のFACS解析により、これらの細胞はCD40を発現し、アンタゴニスト抗CD40抗体に結合することが確認された。詳細は、上記の実施例3を参照のこと。
【図3】
図3は、IL−4非存在下で、インビトロでのCD40L刺激NHL細胞の増殖に対する、アゴニスト(MS81)およびアンタゴニスト抗CD40抗体(15B8)の濃度、1μg/ml、2μg/ml、または5μg/mlでの効果の代表的結果を示す。NHL細胞をRituximab感受性NHL患者から得た。詳細は、上記の実施例4を参照のこと。
【図4】
図4は、CD40LおよびIL−4(2ng/ml)によってインビトロで刺激されたNHL細胞の増殖に対するアンタゴニスト抗CD40抗体15B8による代表的な用量応答曲線を示す。NHL細胞をRituximab感受性NHL患者から得た。詳細は、上記の実施例4を参照のこと。
【図5】
図5は、CD40L発現CHO細胞媒介性ヒトB細胞増殖アッセイにおいて、インビトロで刺激された精製ヒト末梢血B細胞の増殖に対するアンタゴニスト抗CD40抗体、15B8についての用量応答曲線を示す。B細胞を健康な3名の個体から得た。詳細は、上記の実施例6を参照のこと。
【図6】
図6は、0.03mg/kgまたは3mg/kgの投与量の15B8を投与後の、雄性チンパンジーにおける末梢B細胞数に対する効果を示す。3体のチンパンジーに、各々の投与レベルを静脈内投与し、平均末梢B細胞数(μlあたり)を決定した(右y軸)。血清中の15B8の平均濃度(ng/ml)を、左y軸に示す。4回目の投与に対して、日数で測定した時間をX軸に示す。3mg/kgでの15B8の投与後、血清15B8濃度は、短い分布期、対数線形減衰期、および非線形減衰期の3相のパターンで、減衰した。対数線形減衰期中の半減期は、約4日であった。末梢B細胞数は、15B8投与後ただちに減少し、3−4週間以内に回復した。詳細は、上記の実施例9を参照のこと。
Claims (17)
- 悪性B細胞を含む疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は、治療有効量のヒト抗CD40モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、該患者に投与する工程を包含し、ここで、該抗体またはそのフラグメントが正常ヒトB細胞上のCD40抗原に結合する場合、該抗CD40モノクローナル抗体またはそのフラグメントには有意なアゴニスト活性がなく、かつ該抗体またはそのフラグメントが、悪性ヒトB細胞上のCD40抗原に結合する場合、該抗CD40モノクローナル抗体またはそのフラグメントがアンタゴニスト活性を示し、ここで、該ヒト抗CD40モノクローナル抗体は、以下:
a)ハイブリドーマ細胞株15B8により生成されるモノクローナル抗体;
b)配列番号2および配列番号4からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体;
c)配列番号1および配列番号3からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体;ならびに
d)モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、a)、b)、またはc)に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであり、かつ該フラグメントが、ヒトCD40に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体からなる群より選択され、ここで、該患者を処置する方法が、該患者における望ましい治療応答を促進する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記抗体またはそのフラグメントが、前記正常ヒトB細胞上の前記CD40抗原に結合する場合、該ヒト抗CD40モノクローナル抗体またはそのフラグメントがアンタゴニスト活性を示す、方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、少なくとも約10−5Mの解離定数(Kd)を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、少なくとも約10−8M〜約10−20MのKdを有する、請求項3に記載の方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、少なくとも約5×10−9M〜約10−16MのKdを有する、請求項4に記載の方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株15B8により生成されるモノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記悪性B細胞が、B細胞リンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、高悪性度B細胞リンパ腫細胞、中悪性度B細胞リンパ腫細胞、低悪性度B細胞リンパ腫細胞、B細胞急性リンパ芽球性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞およびホジキン病細胞からなる群より選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記処置が、前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の、少なくとも1治療有効用量を、前記患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体またはそのフラグメントの治療有効用量が、約0.01mg/kg〜約40mg/kgの範囲内である、請求項8に記載の方法。
- 前記処置が、複数の治療有効用量の前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメントおよび単鎖Fvフラグメントからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- B細胞系統の悪性細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、ヒト抗CD40モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を、該悪性細胞に接触させる工程を包含し、該抗体またはそのフラグメントには有意なアゴニスト活性がなく、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該悪性細胞上のCD40抗原に結合する場合、該悪性細胞の増殖は阻害され、ここで、該ヒト抗CD40モノクローナル抗体は以下:
a)ハイブリドーマ細胞株15B8により生成されるモノクローナル抗体;
b)配列番号2および配列番号4からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体;
c)配列番号1および配列番号3からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体;ならびに
d)モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、a)、b)、またはc)に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであり、かつ該フラグメントが、ヒトCD40に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体からなる群より選択される、方法。 - 請求項12に記載の方法であって、前記悪性細胞が、B細胞リンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、高悪性度B細胞リンパ腫細胞、中悪性度B細胞リンパ腫細胞、低悪性度B細胞リンパ腫細胞、B細胞急性リンパ芽球性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞およびホジキン病細胞からなる群より選択される、方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、少なくとも約10−5Mの解離定数(Kd)を有する、請求項12に記載の方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、少なくとも約10−8M〜約10−20MのKdを有する、請求項12に記載の方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、少なくとも約5×10−9M〜約10−16MのKdを有する、請求項15に記載の方法。
- 前記ヒト抗CD40モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株15B8により生成されるモノクローナル抗体である、請求項12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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