JP2004508826A - ヒトおよびラットｐｇｃ−３、ｐｐａｒ−ガンマ共活性化および該分子のスプライスバリアント - Google Patents

Abstract

遺伝子ＰＧＣ−３　ＰＰＡＲガンマ活性化補助因子―３、および脂肪組織におけるペルオキシソーム増殖活性化受容体−Ｙ、ＰＰＡＲ−Ｙの転写活性を制御する際のその役割。ＰＧＣ−３は、ヒト白色脂肪組織で高発現され、そして肥満、並びにインスリン非依存性糖尿病、インスリン抵抗性症候群、異常脂質血症、およびアテローム性動脈硬化症などの他の関連する障害の治療に使用するための、新規療法剤の開発に有用性を有する。

Description

【０００１】
本発明は、代謝制御に、そして特に、肥満に関与するヒト遺伝子に関する。本発明はさらに、該遺伝子にコードされるタンパク質に、そしてその生物学的活性を制御する手段に関する。さらに、本発明は、肥満、並びにインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン抵抗性症候群、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、およびアテローム性動脈硬化症などの他の関連する障害を調節する療法剤を同定するための、該遺伝子およびタンパク質の使用に関する。
【０００２】
肥満は、脂肪組織の過剰な集積から生じ、そして先進国および発展途上国において、増大しつつある公衆衛生上の問題である。非常に太り過ぎの個体は、ＮＩＤＤＭ、冠動脈心疾患、いくつかの癌および消化疾患発生の有意な増加を示す。
【０００３】
現在の治療は満足できるものではなく、そして新規薬剤を開発する必要がある。主要な問題は、肥満を制御する機構、および代謝機能障害の発展における体脂肪蓄積増加の役割が不明であることである。明らかであるのは、肥満が、エネルギー摂取および消費間の不均衡から生じることである。エネルギー消費は、基礎代謝、身体活動および順応性熱産生の改変によって、影響を受ける可能性がある。
【０００４】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）は、核ホルモン受容体のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ファミリーの最近同定されたメンバーである（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．（１９９４）８，　１２２４−１２３４）。このタンパク質の発現は、脂肪細胞分化過程の非常に早い時期に誘導され、そして線維芽細胞で異所的に発現された際、該受容体の活性化因子に反応して、脂肪生成を誘導する。ＰＰＡＲγの合成および天然存在リガンドが同定されてきている。ＮＩＤＤＭの治療に用いられるインスリン増感剤の一種であるチアゾリジンジオン類（ＴＺＤ類）は、ＰＰＡＲγに結合し、そしてこれを活性化することが示されてきている。ＴＺＤ類は、ネズミおよびヒト前脂肪細胞が、脂肪を貯蔵する成熟した脂肪細胞に分化するのを促進する。ＰＰＡＲγのＴＺＤ活性化はまた、多くの脂肪細胞遺伝子の転写を制御することも示されてきている。リガンドの存在に加え、ＰＰＡＲγの活性は、活性化補助因子および抑制補助因子の存在によっても影響を受けることが示されてきている。ＰＰＡＲγと共に、細胞で共発現すると、これらのタンパク質は、ＰＰＡＲγの転写活性を非常に増加させるかまたは抑制することが示されてきている。細胞タイプ間でのこれらの活性化補助因子および抑制補助因子の発現の相違は、異なる組織由来の細胞間でＰＰＡＲγが仲介する転写活性の相違が観察されることを説明する可能性がある。
【０００５】
１つのこうした活性化補助因子がＰＧＣ−１である（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒら，　Ｃｅｌｌ（１９９８）９２，　８２９−８３９）。この９０ｋＤａ核タンパク質の発現は、低温への曝露に際して、マウスの筋肉および褐色脂肪で非常に増加する。ＰＧＣ−１とＰＰＡＲγの共発現は、順応性熱産生プログラムの側面を活性化することが示されてきている。
【０００６】
しかし、ＰＧＣ−１は、ヒトに見られる脂肪組織の大部分を構成する白色脂肪組織では発現されない。したがって、白色脂肪組織において、ＰＰＡＲγの活性を制御するタンパク質の同定は、ヒト肥満の進展を理解するのに非常に重要である。
【０００７】
本発明において、我々は、ＰＧＣ−３のクローニングおよび同定、並びに脂肪組織におけるＰＰＡＲγの転写活性を制御する際のその役割を開示する。ＰＧＣ−３は、ヒト白色脂肪組織において高発現され、そして該タンパク質の特徴的な活性に関与することが知られるドメインにおいて、ＰＧＣ−１と配列相同性を共有する。ＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂと称するＰＧＣ−３の２つの別個の変異体が同定されており、これらはＰＧＣ−３遺伝子の選択的スプライシングから生じる。ＰＧＣ−３ｃと称するさらなるスプライスバリアントが同定された。スプライスバリアントの各々の全長ｃＤＮＡおよびタンパク質配列を提供する。本発明はさらに、ＰＧＣ−３が、肥満、並びにインスリン非依存性糖尿病、インスリン抵抗性症候群、異常脂質血症、およびアテローム性動脈硬化症などの他の関連する障害の治療に使用するための、新規療法剤の開発に有用性を有することを開示する。本発明はさらに、こうした療法剤を同定する方法を提供する。
【０００８】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同一の意味を有する。本明細書に引用するすべての刊行物および特許は、本明細書に援用される。
【０００９】
用語「ＰＧＣ−３」は、本明細書において、スプライスバリアント、ＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂ両方と共に、ＰＧＣ−３ｃを含む。
本発明の１つの側面にしたがって、我々は、
（ａ）（配列番号２、配列番号２の１−６００位、配列番号２の４００−１００２位、および配列番号２の２００−８００位）
または
（ｂ）（配列番号４、配列番号４の１−６００位、配列番号４の４００−９９６位、および配列番号４の２００−８００位）
または
（ｃ）（配列番号８、配列番号８の１−６００位、配列番号４の４００−１０２３位、および配列番号４の２００−８００位）
のいずれか１つから選択されるメンバーに、少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離されそして精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
本発明の単離され、そして精製されたポリヌクレオチドには、配列番号１に示すヒトＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡ配列および配列番号３に示すヒトＰＧＣ−３ｂ　ｃＤＮＡ配列および配列番号７に示すヒトＰＧＣ−３ｃ　ｃＤＮＡ配列を含んでなる配列が含まれる。
【００１１】
さらに、我々は、ＰＧＣ−３に高い度合いの相同性を有するラットクローンもまた同定し、そして配列決定した（実施例５を参照されたい）。ラットＰＧＣ−３配列に基づくポリヌクレオチドおよびポリペプチド分子は、ヒト配列との類似性により使用してもよい。ラット配列は、高い度合いの配列相同性（７８％配列同一性）を示し、そしてしたがって、ラットは、代謝の動物モデルとして有用であると期待される。
【００１２】
したがって、本発明のさらなる側面において、我々は、配列番号９、配列番号９の１−６００位、配列番号２の４００−９９０位、および配列番号９の２００−８００位のいずれか１つに、少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離されそして精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる側面において、我々は、単離されそして精製された本発明のポリヌクレオチド分子の断片を提供する。「断片」によって、例えば約８−５０塩基の（例えば１０−３０塩基または１５−３５塩基の）プローブまたはプライマーとして有用な短い配列から始まって、５０、１００、２００、５００または１０００塩基までのより長い配列までの、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む、ポリヌクレオチド分子の近接領域を意味する。実際、ポリヌクレオチド分子のいかなる好適な断片も、さらなる研究、療法または診断目的のため、有用な断片である可能性がある。さらなる好適な断片には、その末端が、分子内で、Ｒｓａ１、Ａｌｕ１およびＨｉｎｆ１のいずれかの組み合わせのような、１種類以上の制限部位によって規定されるものが含まれる。
【００１４】
さらなる側面において、我々は、本発明の単離されそして精製されたポリヌクレオチド分子の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）およびオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）を提供する。好ましい相同体およびオルソログは、配列番号１および配列番号３に示すＰＧＣ−３　ｃＤＮＡ配列に８０％を超える、好適には８５％を超える、例えば９０％の配列相同性を示す、ポリヌクレオチド分子である。相同体は、同一種由来のポリヌクレオチド分子、すなわち相同ファミリーメンバーであってもよく、あるいは、相同体は、ＩＲＳ、並びにＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症などの他の関連する障害の新規療法を開発するのに有用な、ヒトなどの異なる種由来の類似のポリヌクレオチド分子であってもよい。オルソログという用語によって、別の種において、機能的に同等である分子を意味する。個々の相同体およびオルソログの全配列は、配列番号１または配列番号３に示す配列のいずれかの好適な部分から出発し、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよび配列決定技術などの慣用技術を用いて決定してもよい。
【００１５】
本発明のさらなる側面において、我々は、本発明のポリヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズ可能な、単離されそして精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。「特異的ハイブリダイズ」によって、ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で、塩基対相互作用により、本発明のポリヌクレオチド分子または対応する相補配列にハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションのための実験法は、当業者に公知である。例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中で、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションフィルターをインキュベーションし；その後、フィルターを０．１ｘＳＳＣ中、約６５℃で洗浄してもよい。ハイブリダイゼーション技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ　Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９に完全に記載される。
【００１６】
さらなる側面において、我々は、本発明のポリヌクレオチド分子を含んでなる発現ベクターを提供する。
多様な哺乳動物発現ベクターを用いて、本発明の組換えポリペプチドを発現することが可能である。組換え発現に適した、商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ　３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ　３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ　３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ　３７４６０）、ｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ　３７５６５）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、およびｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）が含まれる。
【００１７】
バキュロウイルス発現系もまた、本発明で用いて、生物学的に活性であるポリペプチドを高収量で産生することが可能である。好ましいベクターには、商業的に入手可能な、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、ＢａｃＰａｋ^ＴＭバキュロウイルス発現系およびプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、カリフォルニア州パロアルト）が含まれる。
【００１８】
さらに好ましいベクターには、ヒト・ベータグロビン遺伝子座調節領域を含んでなる、マウス赤白血病細胞（ＭＥＬ細胞）発現系と共に使用するためのベクターが含まれる（Ｄａｖｉｅｓら，　Ｊ．　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３３，　１５３−１５８）。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチド分子を１以上含んでなるベクターは、その後、精製し、そして適切な宿主細胞に導入してもよい。したがって、さらなる側面において、我々は、本発明のポリヌクレオチド分子を含んでなる形質転換宿主細胞を提供する。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、細菌、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、並びにヒトおよび動物細胞などの、多様な宿主で発現させることが可能である。真核組換え宿主細胞が特に好ましい。例には、酵母、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株を含む哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ（ｓｉｌｋｗｏｒｍ）由来細胞株を含む昆虫細胞が含まれる。使用可能であり、そして商業的に入手可能な哺乳動物種由来の細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．２）、ＨＥＫ　２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）が含まれる。
【００２１】
リン酸カルシウム形質転換、ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換、陽イオン脂質仲介リポフェクション、エレクトロポレーションまたは感染を含む、いくつかの技術のいずれか１つを介して、発現ベクターを宿主細胞に導入し、本発明のポリペプチドを発現してもよい。
【００２２】
形質転換宿主細胞は、増殖させ、そして例えば限界希釈によってクローニングし、そして解析して、組換えポリペプチドの発現レベルを決定する。本発明のポリペプチドを発現する形質転換宿主細胞の同定は、本明細書に記載する抗体との免疫学的反応性および／または生物学的活性の検出を含む、いくつかの手段によって、達成してもよい。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、例えば、タンパク質精製を容易にするために付加する、１以上のさらなるポリペプチドドメインとの、融合タンパク質として発現してもよい。こうしたさらなるポリペプチドの例には、固定金属上での精製を可能にする、ヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，　Ｊ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐ．　Ｐｕｒｉｆ．　３：２６３（１９９２））、固定免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、ワシントン州シアトル）で利用するドメインが含まれる。精製ドメインおよびコード領域の間に因子ＸＡまたはエンテロキナーゼなどの切断可能リンカー配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を含むと、精製を容易にするのに有用である。好ましいタンパク質精製系は、未変性条件下で、６ｘＨｉｓタグ化タンパク質を精製するためのＣＬＯＮＴＥＣＨ、ＴＡＬＯＮ^ＴＭ非変性タンパク質精製キットである（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、カリフォルニア州パロアルト）。
【００２４】
したがって、さらなる側面において、我々は、本発明のポリペプチドを産生する方法であって、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる形質転換宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる側面において、我々は、配列番号２に示すヒトＰＧＣ−３ａアミノ酸配列、または（配列番号２の１−６００位、配列番号２の４００−１００２位、配列番号２の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号２の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチドを提供する。
【００２６】
本発明のさらなる側面において、我々は、配列番号４に示すヒトＰＧＣ−３ｂアミノ酸配列、または（配列番号４の１−６００位、配列番号４の４００−９９６位、配列番号４の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号４の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチドを提供する。
【００２７】
本発明のさらなる側面において、我々は、配列番号８に示すヒトＰＧＣ−３ｃアミノ酸配列、または（配列番号８の１−６００位、配列番号８の４００−１０２３位、配列番号８の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号８の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチドを提供する。
【００２８】
本発明のさらなる側面において、我々は、配列番号１０に示すラットＰＧＣ−３アミノ酸配列、または（配列番号１０の１−６００位、配列番号１０の４００−９９０位、配列番号１０の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号１０の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチドを提供する。
【００２９】
変異体は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、その本質的な特性のいくつかを保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。例えば、ＰＧＣ−３ポリペプチドの変異体は、１以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって異なるアミノ酸配列を有していてもよい。変異体は、保存的変化（アミノ酸類似性）を有してもよく、ここで、置換されたアミノ酸は、類似の構造的または化学的特性を有する（例えばイソロイシンでのロイシンの置換の場合である）。あるいは、変異体は、非保存的変化を有してもよい（例えばトリプトファンでのグリシンの置換の場合である）。どのそしてどのくらい多くのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失していてもよいか、そして生物学的活性に対してこれが有するであろう影響を決定する際の手引きは、当業者によって、本開示から無理なく推論可能であるし、そして当該技術分野に公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて、さらに見出すことが可能である。
【００３０】
アミノ酸置換は、例えば、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて、行ってもよい。陰性荷電アミノ酸には、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；陽性荷電アミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ；そして類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を持つアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【００３１】
アミノ酸の適切な置換には、非誘導体化残基の代わりの、化学的に誘導体化した残基の使用が含まれる。Ｄ−異性体および他の既知の誘導体もまた、天然存在アミノ酸に対して置換することが可能である。例えば、米国特許第５，６５２，３６９号、アミノ酸誘導体、１９９７年７月２９日発行を参照されたい。置換例を表１に示す。
【００３２】
「相同性」は、本説明において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の類似性または同一性の尺度である。相同性を性質決定するため、最も高次の同一性マッチが得られるよう、対象配列を並列させる。同一性は、公表されている技術を用いて計算可能である。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム法には、例えばＤＮＡＳｔａｒソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ　Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）；ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，　Ｊ．ら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９８４，　１２（１）：３８７）；およびＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．ら，　Ｊ　Ｍｏｌｅｃ　Ｂｉｏｌ　１９９０，　２１５：４０３）が含まれる。本明細書に定義するような相同性は、公知のコンピュータープログラム、ＢＥＳＴＦＩＴ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，　５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　Ｗｉｓ．　５３７１１）を用いて、慣用的に決定される。ＢＥＳＴＦＩＴまたは別の配列並列プログラムを用いて、特定の配列の参照配列への類似性を決定する際、典型的には、同一性パーセンテージが、参照ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の全長に渡って計算され、そして相同性において、参照配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基総数の約１０％までのギャップが許容されるように、パラメーターを設定する。
【００３３】
さらなる側面において、我々は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの多型変異体を提供する。多型は、１個体および別の個体間のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における変動である。ＤＮＡ多型は、アミノ酸配列の変動につながるかもしれず、そしてその結果、タンパク質構造および機能的活性の改変につながる。多型はまた、ｍＲＮＡ合成、成熟、輸送および安定性にも影響を与える可能性がある。アミノ酸変化を生じない（サイレント多型）かまたはいかなる既知のコンセンサス配列も改変しない多型は、それにもかかわらず、例えば、ｍＲＮＡフォールディングまたは安定性を改変することによって、生物学的影響を有する可能性がある。
【００３４】
多型の知識を用いて、特定の薬学的剤を用いた療法に最も適した患者を同定するのを補助してもよい（これはしばしば薬理遺伝学と呼ばれる）。薬理遺伝学はまた、薬剤選択過程を補助する薬学的研究で用いてもよい。多型は、ヒトゲノムをマッピングし、そして疾患の遺伝子構成要素を解明するのに用いてもよい。薬理遺伝学に関する詳細な背景および多型検出の他の使用に関しては、以下の参考文献を参照されたい：Ｌｉｎｄｅｒら（１９９７），　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　４３，　２５４；Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９７），　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１５，　１２４９；国際特許出願ＷＯ　９７／４０４６２、Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；およびＳｃｈａｆｅｒら（１９９８），　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１６，　３３。
【００３５】
本発明のポリペプチドを、他の細胞内および膜関連タンパク質との相互作用は維持されるが、そのエフェクター機能および生物学的活性は除去されるように、遺伝的に操作してもよい。この方式で遺伝的に修飾したポリペプチドは、優性ネガティブ突然変異体として知られる。優性ネガティブ突然変異体の構築において、天然ペプチドの活性に必要な部位で少なくとも１つのアミノ酸残基位を変化させ、活性が減少しているかまたは検出可能な活性を欠くペプチドを産生する。適切な細胞タイプにおける優性ネガティブ突然変異体の過剰発現は、内因性ポリペプチドの影響を下方制御し、それによって、代謝調節に関与する生物学的機構を明らかにする。
【００３６】
同様に、本発明のポリペプチドは、そのエフェクター機能および生物学的活性を増進するように、遺伝的に操作することが可能である。生じた過剰活性ポリペプチドは、優性ポジティブ突然変異体として知られる。天然ペプチドの活性に必要な部位で、少なくとも１つのアミノ酸残基位を変化させて、増進した活性を有するペプチドを産生する。適切な細胞種における優性ポジティブ突然変異体の過剰発現は、内因性天然ポリペプチドの反応を増幅し、細胞代謝を調節する制御機構を強調する。
【００３７】
したがって、さらなる側面において、我々は、本発明のポリペプチドの優性ネガティブおよび優性ポジティブ突然変異体を提供する。
本明細書に開示する新規配列を、本発明の別の態様で用い、アンチセンス構築物の使用によって、細胞におけるＰＧＣ−３遺伝子の発現を制御することが可能である。例えば、アンチセンス発現構築物は、ｐＲＥＰ１０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、容易に構築可能である。転写物は、該構築物でトランスフェクションした細胞において、遺伝子の翻訳を変調すると予期される。アンチセンス転写物は、天然遺伝子転写物の翻訳を変調するのに有効であり、そして本明細書に記載する影響（例えば組織生理の制御）を改変することが可能である。本明細書に開示するｍＲＮＡのいずれかの部分に相補的であり、そしてハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが、療法使用に意図される。ｉｎ　ｖｉｖｏ活性を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法を詳細に記載する、米国特許第５，６３９，５９５号、「新規薬剤および試薬の同定」、１９９７年７月１７日発行が、本明細書に援用される。アンチセンス分子はまた、当業者に知られる技術を用いて、アンチセンス療法に使用するために合成してもよい。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエート類またはメチルホスホネート類などのＤＮＡの安定誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどのＲＮＡの安定誘導体、あるいは他のオリゴヌクレオチド擬似体であることが可能である。生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果を記載する、米国特許第５，６５２，３５５号、「ハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロチオエート」、１９９７年７月２９日発行、および米国特許第５，６５２，３５６号、「逆位キメラおよびハイブリッドオリゴヌクレオチド」、１９９７年７月２９日発行が、本明細書に援用される。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム被包によって、または該アンチセンス配列を宿するベクターからの発現によって、細胞に導入してもよい。
【００３８】
さらなる側面において、我々は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を提供する。
抗体は、適切な方法いずれかを用いて調製可能であり、例えば精製ポリペプチドを利用して特異的抗体を調製してもよい。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、並びに例えばＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂおよび一本鎖Ｆｖなどの多様な種類の抗体構築物が含まれる。抗体は、約１０^７Ｍ^−１以上のＫ_ａで抗原に結合するならば、特異的に結合すると定義される。結合の親和性は、慣用的な技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら，　Ａｎｎ．　Ｎ．Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　５１：６６０（１９４９）に記載されるものを用いて、測定可能である。
【００３９】
ポリクローナル抗体は、多様な供給源、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ，マウスまたはラットから、当該技術分野に公知の方法を用いて、容易に生成することが可能である。一般的に、抗原は、典型的には、非経口注射を通じて宿主動物に投与する。抗原の免疫原性は、アジュバント（例えばフロイントの完全または不完全アジュバント）の使用により増強可能である。追加免疫後、少量の血清試料を収集し、そして抗原に対する反応性に関して試験する。こうした測定に有用な多様なアッセイの例には：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（監修），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８８に記載されるもの；それと共に、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、およびサンドイッチアッセイなどの方法が含まれる。米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号を参照されたい。
【００４０】
モノクローナル抗体は、公知の方法を用いて、容易に調製可能である。例えば、米国特許第ＲＥ　３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号および第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｋｅｎｎｅｔｔ，　ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（監修），（１９８０）に記載される方法を参照されたい。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、本明細書に援用される、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら，　「モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイブリドーマに代わる迅速法」，　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３：１−９（１９９０）に記載されるものなどの、別の技術を用いて、産生可能である。同様に、組換えＤＮＡ技術を用い、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込んで、結合パートナーを構築することが可能である。こうした技術は、Ｌａｒｒｉｃｋら，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７：３９４（１９８９）に記載される。
【００４２】
単離・精製後の抗体を用い、確立されたアッセイプロトコルを用いて、試料中の抗原の存在を検出することが可能である。
本発明のさらなる側面において、我々は、代謝制御に使用するための、ＰＧＣ−３の活性を変調可能な療法剤を同定する方法であって：
（ｉ）（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、または（配列番号２の１−６００位、配列番号２の４００−１００２位、配列番号２の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号２の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片；
または
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列、または（配列番号４の１−６００位、配列番号４の４００−９９６位、配列番号４の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号４の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片；
または
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列、または（配列番号８の１−６００位、配列番号８の４００−９９６位、配列番号８の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号８の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片；
のいずれか１つを含んでなるＰＧＣ−３ポリペプチドと、候補化合物モジュレーターとを接触させ
そして
（ｉｉ）ＰＧＣ−３ポリペプチドの活性に対する、候補化合物モジュレーターの影響を測定する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００４３】
本明細書において、「活性」は、療法剤が、インスリン抵抗性症候群、並びにインスリン非依存性糖尿病、異常脂質血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症などの他の関連障害に関連する細胞過程を媒介する能力を指す。
【００４４】
ＰＧＣ−３活性の変調は、刺激または阻害いずれかを含んでなる。したがって、ＰＧＣ−３の活性を変調可能な療法剤は、ＰＧＣ−３の活性を刺激するかまたは阻害するかいずれかの剤である。用語「ＰＧＣ−３活性のモジュレーター」および「ＰＧＣ−３モジュレーター」もまた、本明細書において、ＰＧＣ−３の活性を刺激するかまたは阻害するかいずれかの剤を指す。本発明の療法剤は、代謝の制御に；特に肥満に、そしてインスリン抵抗性症候群、並びにインスリン非依存性糖尿病、異常脂質血症、およびアテローム性動脈硬化症などの他の関連する障害の調節に、有用性を有する。
【００４５】
本発明のさらなる側面において、我々は、ＰＧＣ−３の活性を変調する化合物を同定するスクリーニングを提供し、本発明は、こうしたスクリーニング、およびｉｎ　ｖｉｖｏでＰＧＣ−３の活性を変調するための、該スクリーニングから得ることが可能な化合物の使用に及ぶ。
【００４６】
スクリーニングにおいて試験することが可能な潜在的な療法剤には、一般的に「小分子」として知られる単純な有機分子、例えば２０００ダルトン未満の分子量を有するものが含まれる。スクリーニングはまた、合成ペプチドライブラリーおよびペプチドファージライブラリーを含む、ペプチドライブラリーなどの化合物ライブラリーをスクリーニングするのにも使用可能である。他の適切な分子には、抗体、ヌクレオチド配列およびＰＧＣ−３の活性を変調するいかなる他の分子も含まれる。
【００４７】
ＰＧＣ−３活性の阻害剤または刺激剤が同定されたら、医薬化学技術を適用して、その特性をさらに洗練し、例えば有効性を増進し、そして／または副作用を減少させることが可能である。
【００４８】
本発明を行うのに使用可能な多くのスクリーニング法があることが認識されるであろう。代謝制御に使用するためのＰＧＣ−３モジュレーターを同定するのに使用可能な、適切なスクリーニング法の例には、平衡状態の結合混合物の迅速なろ過、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＦＲＥＴ）が含まれる。ＦＲＥＴに関するさらなる情報については、国際特許出願ＷＯ　９４／２８１６６（Ｚｅｎｅｃａ）を参照されたい。潜在的な薬剤候補を同定する方法は、Ｂｅｖａｎ　Ｐら，　１９９５，　ＴＩＢＴＥＣＨ　１３　１１５に概説されている。
【００４９】
ＰＧＣ−３の活性を変調可能な化合物を同定するのに好ましい方法は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）である。ＳＰＡは、リガンドが可逆的な方式で選択的に結合するであろう、受容体などのアクセプター分子でコーティングされた蛍光微小球体（ｆｌｕｏｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）の使用を伴う（Ｎ　ＢｏｓｗｏｒｔｈおよびＰ　Ｔｏｗｅｒｓ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３４１，　１６７−１６８，　１９８９）。該技術は、水性媒体に容易に放散する、低エネルギー放射を放つ同位体で標識したリガンドの使用を要する。アッセイ中のいかなる時点でも、結合した標識リガンドは蛍光微小球体にごく近接し、放出されたエネルギーが蛍光を活性化して光を生じるのを可能にするであろう。対照的に、非結合標識リガンドの大部分は、エネルギー移動を可能にするには、蛍光微小球体から遠すぎるであろう。結合したリガンドは光を生じるが遊離リガンドは生じず、これにより結合リガンドおよび遊離リガンドを分離する必要を伴わずに、リガンド結合の度合いを測定することを可能にする。
【００５０】
細胞アッセイ系を用いて、代謝制御に使用するためのＰＧＣ−３モジュレーターをさらに同定してもよい。
したがって、本発明のさらなる側面においては、（本明細書に定義するような）ＰＧＣ−３ポリペプチドを発現する宿主細胞と、候補化合物モジュレーターとを接触させる。
【００５１】
本発明の方法で使用するのに好ましい細胞アッセイ系は、２ハイブリッドアッセイ系である。２ハイブリッド系は、相互作用するタンパク質対が、転写因子の活性化ドメインをそのＤＮＡ結合ドメインとごく近接させることで転写因子の機能的活性を回復してレポーター遺伝子の発現を誘導する能力、を利用する（Ｓ　ＦｉｅｌｄｓおよびＯ　Ｓｏｎｇ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３４０，　２４５−２４６，　１９８９）。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ^ＴＭ系などの商業的に入手可能な系およびプロトコルを、本発明で使用可能である。
【００５２】
他の好ましい細胞アッセイ系には、サイクリックＡＭＰ、細胞内カルシウムイオン、またはアラキドン酸代謝産物遊離などの、細胞内シグナル伝達分子のレベル変化を測定することが含まれる。これらはすべて、公表された標準法および商業的に入手可能な試薬を用いて、測定可能である。さらに、これらの細胞内変化を「レポートする」であろう、細菌ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、エクオリンまたは緑色蛍光タンパク質などの「レポーター」遺伝子でトランスフェクションされている適切な細胞株に、本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクションしてもよい（Ｅｇｅｒｔｏｎら，　Ｊ．　Ｍｏｌ，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，　１９９５，　１４（２），　１７９−１８９）。
【００５３】
本発明のさらなる側面において、我々は、療法による、ヒトまたは動物身体の代謝性疾患の治療法で使用するための、新規ＰＧＣ−３モジュレーターまたは薬学的に許容しうるその塩を提供する。
【００５４】
本発明の化合物を用いて治療可能な代謝性疾患の例には、インスリン抵抗性症候群、インスリン非依存性糖尿病、異常脂質血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００５５】
本発明のさらなる側面にしたがって、我々は、新規ＰＧＣ−３モジュレーター、または薬学的に許容しうるその塩を、薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーと組み合わせて含んでなる、薬剤組成物を提供する。
【００５６】
該組成物は、経口使用に適した形、例えば錠剤、カプセル、水性または油性溶液、懸濁物またはエマルジョン；局所使用に適した形、例えばクリーム、軟膏、ゲルまたは水性もしくは油性溶液もしくは懸濁物；鼻使用に適した形、例えば吹入剤（ｓｎｕｆｆ）、鼻スプレーまたは点鼻液；直腸使用に適した形、例えば座薬；吸入による投与に適した形、例えば乾燥粉末などの細分割粉末、微小結晶型または液体エアロゾルとして；舌下または頬側使用に適した形、例えば錠剤またはカプセル；あるいは非経口使用（静脈内、皮下、筋内、血管内または注入を含む）に適した形、例えば無菌水性または油性溶液または懸濁物であってもよい。一般的に、上記組成物は、慣用的賦形剤を用いて、慣用的方式で調製してもよい。
【００５７】
本発明はまた、ＰＧＣ−３に単独でまたは部分的に媒介される代謝性疾患または医学的異常を治療する方法であって、こうした治療を必要とする温血動物に、上に定義するようなＰＧＣ−３モジュレーターの有効量を投与することを含んでなる、前記方法も提供する。
【００５８】
本発明はまた、代謝性疾患の治療に使用するための医薬品産生における、ＰＧＣ−３モジュレーターの使用も提供する。
単一剤形を作り出すために１以上の賦形剤と組み合わせられる活性成分の量は、治療する被験者および特定の投与経路に応じて必然的に変わるであろう。例えば、ヒトへの経口投与に意図する処方は、一般的に、例えば、総組成物重量の約５から約９８パーセントの間で変化してもよい、適切でそして好適な量の賦形剤と共に配合された、０．５ｍｇから２ｇの活性剤を含有するであろう。投薬単位型は、一般的に、約１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分を含有するであろう。
【００５９】
ＰＧＣ−３モジュレーターの療法的または予防目的のための用量サイズは、当然、免疫疾患の性質および重症度、患者の年齢および性別、並びに投与経路にしたがい、医学の公知の原理にしたがって、多様であろう。
【００６０】
一般的には、療法または予防目的にＰＧＣ−３モジュレーターを用いる際、必要な場合には分割用量で投与される、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから７５ｍｇの範囲の一日用量が与えられるように投与されるであろう。一般的に、非経口経路を使用する場合、より低い用量が投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内投与には、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから３０ｍｇの範囲の用量を、一般的に使用するであろう。同様に、吸入による投与には、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから２５ｍｇの範囲の用量を使用するであろう。
【００６１】
以下の表、実施例および図に言及することによって、本発明をここで例示するが、本発明はこれに限定されない。別に示さない限り、用いる技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　第２版，　１９８９，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓなどの公知の分子生物学教科書に詳細に記載されるものである。
【００６２】
配列番号１は、全長ヒトＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡを示す。
配列番号２は、ヒトＰＧＣ−３ａタンパク質配列を示す。
配列番号３は、ヒトＰＧＣ−３ｂ　ｃＤＮＡを示す。
【００６３】
配列番号４は、ヒトＰＧＣ−３ｂタンパク質配列を示す。
配列番号５は、ヒト脂肪細胞ｃＤＮＡから単離した３’ＲＡＣＥ産物の配列を示す。
【００６４】
配列番号６は、ヒト心臓ｃＤＮＡから単離した５’ＲＡＣＥ産物の配列を示す。
配列番号７は、ヒトＰＧＣ−３ｃ　ｃＤＮＡを示す。
【００６５】
配列番号８は、ヒトＰＧＣ−３ｃタンパク質配列を示す。
配列番号９は、全長ラットＰＧＣ−３　ｃＤＮＡを示す。
配列番号１０は、ラットＰＧＣ−３タンパク質配列を示す。
【００６６】
表
表１
保存的アミノ酸置換の例
【００６７】
【表１】

【００６８】
表２
プライマー配列
【００６９】
【表２】

【００７０】
表３
実施例４で用いるプライマー
【００７１】
【表３】

【００７２】
表４
ラットＰＧＣ−３を配列決定するのに用いたプライマーの詳細
【００７３】
【表４】

【００７４】
【実施例】
実施例１
部分的ＰＧＣ−３　ｃＤＮＡの単離
方法：
表２に列挙するＰＣＲプライマーＣＭＥ９７４８およびＣＭＥ９７４９を合成し、そしてヒト脂肪ｃＤＮＡ（ヒト脂肪細胞Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　カタログ＃７４４７−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、英国ベージングストーク）から３４７ｂｐ産物を増幅するのに用いた。
【００７５】
その後、ｃＤＮＡ端迅速増幅（ＲＡＣＥ）として知られる技術を用いて、ＰＧＣ−３　ｃＤＮＡの３’端を増幅した。ＲＡＣＥは一般的に用いられる分子生物学技術であり、使用者が、ｃＤＮＡテンプレートに沿って一方に配列を伸長し、そして同定するのを可能にする。これによって、使用者が、ｃＤＮＡ配列の小片から出発して、完全ｃＤＮＡ配列を得ることが可能になる。該方法のより完全な説明については、Ｃｈｅｎｃｈｉｃｋ　Ａ，　Ｍｏｑａｄａｍ　ＦおよびＳｉｅｂｅｒｔ　Ｐ．　１９９６　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ＲＮＡ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ　Ｉｎｃ．　ｐ２７３−３２１を参照されたい。今回我々は、商業的に入手可能なＲＡＣＥ　ＰＣＲキット、ヒト脂肪細胞Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ^ＴＭ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、英国ベージングストーク）を用いた。これは、同一テンプレートから５’および３’ＲＡＣＥ両方を行う準備ができた、アダプター連結二本鎖ｃＤＮＡの既製のヒト脂肪細胞「ライブラリー」である。Ｍａｒａｔｈｏｎ　ＲＡＣＥ反応においては、製造者の指示にしたがい、ＡＰ１アダプタープライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより）（表２）およびＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ^ＴＭ　ｃＤＮＡと共に、ＰＧＣ−３遺伝子特異的プライマーＣＭＥ９７４８（表２）を用いた。
【００７６】
結果：
この反応で１．５ｋｂ　ＰＣＲ産物が増幅され、そして該産物を、１．５％アガロースゲルを用いたアガロースゲル電気泳動によって非特異的ＤＮＡから分離し、エチジウムブロミド染色によって視覚化した。そして製造者の指示にしたがって、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｅｘ　ＩＩ^ＴＭ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから１．５ｋｂ　ＰＣＲ産物を単離し、ＴＯＰＯ　ＴＡ^ＴＭクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ２．１^ＴＭベクターに精製ＰＣＲ産物をクローニングした。クローニングしたＰＣＲ産物は、キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に供給されるベクターＭ１３配列決定プライマー、並びにＰＧＣ−３遺伝子特異的配列決定プライマーＣＭＥ９７２６、ＣＭＥ９７２７、ＣＭＥ９７７８およびＣＭＥ９７７６（表２に列挙）を用いて、完全に配列決定した。３’ＲＡＣＥ産物の配列を図５に示す（配列番号５）。配列番号７の３’端の予測されるタンパク質配列は、１３５ａａ領域に渡って、ヒトＰＧＣ−１の配列に５０％同一であることが見出された（図７を参照されたい）。配列番号７のこの小さい領域はまた、ラットＰＧＣ−１配列（ＥＭＢＬ寄託番号：ＡＢ０２５７８４）とも５３％の同一性を共有した。
【００７７】
３’端が異なるｃＤＮＡ配列を持つ、ＰＧＣ−３の２つの変異体が見出された。これらの２つの変異体を、ＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂと名づけた。
実施例２
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーからの全長ＰＧＣ−３ａクローンの単離
方法：
プライマーＣＭＥ９８３０およびＣＭＥ９８５０（表２）は、ＰＧＣ−３ａ　３’ＲＡＣＥ産物配列に基づいて合成した。これらを用い、製造者の指示にしたがって、Ｏｒｉｇｅｎｅヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーマスタープレート（ＯＲＩＧＥＮＥ　ＬＨＴ−１００１、Ｏｒｉｇｅｎｅ、米国）をＰＣＲスクリーニングした。
【００７８】
結果：
マスタープレートのＰＣＲスクリーニングによって、ＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡに関して陽性である、いくつかのウェルが同定された。これらのウェルに対応するサブプレートをＯｒｉｇｅｎｅから得て、そして続いて、ＰＣＲスクリーニングの周期を行い、ＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡを含有する個々のクローンを同定した。
【００７９】
ＰＧＣ−３ａを含有するクローンを同定しそして配列決定した。こうして、ＰＧＣ−３ａの完全ｃＤＮＡ配列（配列番号１）が単離された。ＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡ配列は、３００９ヌクレオチドのコード領域を含んでなり、該領域は１００２アミノ酸のタンパク質をコードし、その計算される分子量は１１０ｋＤａであり、そして推定される等電点は４．９３３である。ＰＧＣ−３ａのタンパク質配列を配列番号２に示す。
【００８０】
実施例３
ヒト乳房脂肪細胞ｃＤＮＡからのＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂのＰＣＲ増幅
方法：
ＰＧＣ−３ａまたはＰＧＣ−３ｂいずれかを特異的に増幅するであろうＰＣＲプライマーを合成した（ＣＭＥ９８３０、ＣＭＥ９８３１、ＣＭＥ９８５０、表２）。
【００８１】
ヒト乳房脂肪細胞によって、ＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂが両方発現されるかどうか調べるため、上記プライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒト乳房脂肪細胞ｃＤＮＡからＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂを増幅した。用いたＰＣＲ条件は、９４℃１分間、その後、３０周期の９４℃３０秒間、その後、６８℃４分間であった。用いたＤＮＡポリメラーゼは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥｘｔｅｎｓｏｒ^ＴＭであった。ＰＣＲは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，　第２版，　１９８９に記載される標準法にしたがって行った。順方向ＰＣＲプライマー（ＣＭＥ９８３０）を、ＰＧＣ−３ｂ（配列２）を特異的に増幅するように設計した逆方向ＰＣＲプライマーＡ（ＣＭＥ９８３１）または配列３のＰＧＣ−３ａ（３’ＲＡＣＥ産物）を特異的に増幅するように設計した逆方向プライマーＢ（ＣＭＥ９８５０）いずれかと組み合わせて用いた。
【００８２】
結果：
それぞれ、図１のレーン１および２に示すように、ＰＧＣ−３ｂの５６１ｂｐ（ＣＭＥ９８３０／ＣＭＥ９８３１）およびＰＧＣ−３ａの４９１ｂｐ（ＣＭＥ９８３０／ＣＭＥ９８５０）の特異的ＰＣＲ産物を得た。
【００８３】
ＰＧＣ−３ｂの完全ｃＤＮＡ配列を配列番号３に示す。ＰＧＣ−３ｂ　ｃＤＮＡ配列は、９９６アミノ酸のタンパク質をコードする２９９１ヌクレオチドのコード領域を含んでなる。ＰＧＣ−３ｂのタンパク質配列を配列番号４に示す。
【００８４】
実施例４
部分的ＰＧＣ−３ｃ　ｃＤＮＡの単離
実施例１に記載するようなＲＡＣＥとして知られる技術を用いて、ＰＧＣ−３ｃ　ｃＤＮＡの５’端を増幅した。この方法は、Ｒｏｃｈｅ　５’／３’ＲＡＣＥキット（カタログ番号１　７３４　７９２）を用い、そして製造者の指示にしたがって行った。遺伝子特異的プライマー（ＳＰ１Ａ、表３に列挙）、ＡＭＶ逆転写酵素（キット中に供給）およびデオキシヌクレオチドミックス（キット中に供給）を用いて、総ヒト心臓ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１２−４１）から第一鎖ｃＤＮＡを合成した。製造者の指示にしたがい、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ産物精製キット（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国インディアナ州インディアナポリス、カタログ番号１　７３２　６６８）を用いて、第一鎖ｃＤＮＡを精製した。その後、キットと共に供給される試薬および指示を用い、末端トランスフェラーゼを用いて、ｃＤＮＡの３’端に、ホモポリマーＡ−テールを付加した。その後、遺伝子特異的プライマー（ＳＰ２Ａ、表３を参照されたい）およびオリゴｄＴアンカープライマー（表３を参照されたい）を用いたＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅した。得たｃＤＮＡは、入れ子式特異的プライマー（ＳＰ３Ａ、表３を参照されたい）およびＰＣＲアンカープライマー（表３を参照されたい）を用いた第二のＰＣＲによって、さらに増幅した。生じた５’ＲＡＣＥ産物をベクターにクローニングした。クローニングしたＰＣＲ産物を完全に配列決定した。５’ＲＡＣＥ産物の配列を図、配列番号６に示す。ＰＧＣ−３ｃの全長ｃＤＮＡ配列を配列番号７に示す。ＰＧＣ−３ｃの予測されるタンパク質配列を配列番号８に示す。
【００８５】
実施例５
全長ラットＰＧＣ−３　ｃＤＮＡの単離
ヒトＰＧＣ−３　ｃＤＮＡ配列を用いた相同性検索によって、ＰＧＣ−３に高レベルの相同性を有する、専売データベース中のラットクローンを同定した。このクローンを得て、そしてプライマーＣＶＧＩ１６９、ＣＶＧＩ１７０、ＣＶＧＩ１７１、ＣＶＧＩ１７２、ＣＶＧＩ２８１、ＣＶＧＩ２８２、ＣＶＧＩ２８３、ＣＶＧＩ３９０、ＣＶＧＩ３９１、ＣＶＧＩ４５７、ＣＶＧＩ４５８、ＣＶＧＩ５３５（配列情報に関しては表４を参照されたい）を用いて配列決定した。全長ラットＰＧＣ−３　ｃＤＮＡ配列を配列番号９に示す。ラットＰＧＣ−３の予測されるタンパク質配列を図、配列番号１０に示す。図１３は、ヒトＰＧＣ−３ａおよびラットＰＧＣ−３タンパク質配列の比較を示し、該分子が、高い度合いの（７８％同一性より高い）配列相同性を有することを示す。
【００８６】
実施例６
ヒトＰＧＣ−３　ｍＲＮＡ発現の組織間比較
製造者が示唆するプロトコルにしたがって、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ヒト脂肪細胞から総ＲＮＡを抽出した。各脂肪細胞試料由来の総ＲＮＡ２μｇを用い、製造者の指示にしたがってＰｒｏｍｅｇａ逆転写系（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ａ３５００）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。心臓、骨格筋、腎臓、肝臓、肺、心臓および膵臓ｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号Ｋ１４２０−１およびＫ１４２１−１）から得た。プローブおよびプライマー配列をＰＧＣ−３用に設計し、そしてこれらは：ＰＧＣ−３順方向プライマー；５’−ＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡ−３’、ＰＧＣ−３逆方向プライマー；５’−ＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣ−３’、ＰＧＣ−３プローブ；５−ＦＡＭ−ＣＧＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴ−ＴＡＭＲＡ−３’であった。ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の９６ウェルプレートにおいて、各標的遺伝子に関するＴａｑｍａｎ　ＰＣＲアッセイを四つ組で行った。各２５□ｌ　Ｔａｑｍａｎ反応に関して、０．０１−１ｎｇ　ｃＤＮＡを、最終濃度１ｘＴａｑｍａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、並びに２００ｎＭのプローブと混合した。ＰＣＲパラメーターは、５０℃２分間、９５℃１０分間、４０周期の９５℃１５秒間および６０℃１分間であった。ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ７７００使用者広報＃２（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に先に記載されるように、比較Ｃｔ法によって、結果を解析した。簡単に言えば、各ＰＣＲに関して、閾値周期（Ｃｔ）を計算した。これは、増幅されたＤＮＡが、任意の閾値より高く検出可能である場合のＰＣＲ周期を指す。Ｃｔ値は、半定量的であり、そして特定のｃＤＮＡ試料内に存在する標的配列の量に関連する。四つ組Ｃｔ試料を平均し、そしてハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ；ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給）に関して得たＣｔ値で割ることによって規準化した。こうして、各ｃＤＮＡに関する平均□Ｃｔ値を得る。これらの値を、異なるｃＤＮＡ試料間で直接比較して、各標的遺伝子に関する相対発現値を得ることが可能である。図４は、上に列挙するヒト組織におけるＰＧＣ−３　ｍＲＮＡの平均相対発現を示す。同一組織種の多数の試料をアッセイした場合には試料番号が付けられており、例えば、大網脂肪細胞Ｓ２４は、大網脂肪細胞試料番号２４から得たデータを指す。これらの結果は、ＰＧＣ−３がヒト乳房脂肪細胞、大網脂肪細胞および皮下脂肪細胞で高発現されることを立証する。ＰＧＣ−３の高レベル発現はまた、肺および心臓試料でも観察された。ＰＧＣ−３の発現は、ヒト腎臓、骨格筋、膵臓および肝臓試料ではより低かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、それぞれレーン１および２に、乳房脂肪組織ｃＤＮＡから単離した、ＰＧＣ−３ｂの５６１ｂｐおよびＰＧＣ−３ａの４９１ｂｐの特異的ＰＣＲ産物を示す。ＰＧＣ−３ｂ特異的ＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマーＣＭＥ９８３０およびＣＭＥ９８３１（表２）を用いて得た。ＰＧＣ−３ａ特異的ＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマーＣＭＥ９８３０およびＣＭＥ９８５０（表２）を用いて得た。
【図２】図２は、ＰＧＣ−３ａおよびＰＧＣ−３ｂとＰＧＣ−１との比較を示し、これらの分子が生物学的活性に重要であると考えられる特定の位置において配列相同性領域を共有することを示す。
【図３】図３は、ヒトＰＧＣ−３ａおよびラットＰＧＣ−３タンパク質配列の比較を示し、これらの分子が高い度合いの配列相同性を共有することを示す。
【図４】図４は、ある範囲のヒト組織におけるＰＧＣ−３　ｍＲＮＡの平均相対発現を示す。Ｔａｑｍａｎ^ＴＭ蛍光ＰＣＲ技術（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、列挙したヒト組織由来のｃＤＮＡ試料に対して、四つ組で定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対してＰＧＣ−３の発現を規準化した比を、すべての組織に関して計算した。ＳＣ＝皮下。同一組織タイプの多数の試料をアッセイした場合には、試料番号を付した（例えば、大網脂肪細胞Ｓ２４は、大網脂肪細胞試料番号２４から得たデータを指す）。ＡＵ＝任意の単位。

Claims (23)

1. （ａ）（配列番号２、配列番号２の１−６００位、配列番号２の４００−１００２位、および配列番号２の２００−８００位）
   または
   （ｂ）（配列番号４、配列番号４の１−６００位、配列番号４の４００−９９６位、および配列番号４の２００−８００位）
   または
   （ｃ）（配列番号８、配列番号８の１−６００位、配列番号４の４００−１０２３位、および配列番号４の２００−８００位）
   のいずれか１つから選択されるメンバーに、少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離されそして精製されたポリヌクレオチド。
2. 配列番号１に示すヒトＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡ配列または少なくとも８塩基からなるその断片を含んでなるポリヌクレオチド。
3. 配列番号３に示すヒトＰＧＣ−３ｂ　ｃＤＮＡ配列または少なくとも８塩基からなるその断片を含んでなるポリヌクレオチド。
4. 配列番号７に示すヒトＰＧＣ−３ｃ　ｃＤＮＡ配列または少なくとも８塩基からなるその断片を含んでなるポリヌクレオチド。
5. 前記請求の範囲のいずれか１項記載のポリヌクレオチドの相同体またはオルソログであって、配列番号１に示すＰＧＣ−３ａ　ｃＤＮＡ配列に８０％より高い配列相同性を有する、ポリヌクレオチドの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）またはオルソログ。
6. 前記請求の範囲のいずれか１項記載のポリヌクレオチドの相同体またはオルソログであって、配列番号３に示すＰＧＣ−３ｂ　ｃＤＮＡ配列に８０％より高い配列相同性を有する相同体またはオルソログ。
7. 前記請求の範囲のいずれか１項記載のポリヌクレオチドの相同体またはオルソログであって、配列番号７に示すＰＧＣ−３ｃ　ｃＤＮＡ配列に８０％より高い配列相同性を有する、ポリヌクレオチドの相同体またはオルソログ。
8. 配列番号１０の１−６００位、配列番号１０の４００−９９０位、および配列番号１０の２００−８００位のいずれか１つに少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、単離されそして精製されたポリヌクレオチド分子。
9. 前記請求の範囲のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
10. 前記請求の範囲のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含んでなる形質転換宿主細胞。
11. 配列番号２に示すヒトＰＧＣ−３ａアミノ酸配列、または（配列番号２の１−６００位、配列番号２の４００−１００２位、配列番号２の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号２の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチド。
12. 配列番号４に示すヒトＰＧＣ−３ｂアミノ酸配列、または（配列番号４の１−６００位、配列番号４の４００−９９６位、配列番号４の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号４の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチド。
13. 配列番号８に示すヒトＰＧＣ−３ｃアミノ酸配列、または（配列番号８の１−６００位、配列番号８の４００−１０２３位、配列番号８の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号８の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチド。
14. 配列番号１０に示すラットＰＧＣ−３アミノ酸配列、または（配列番号１０の１−６００位、配列番号８の４００−９９０位、配列番号１０の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号１０の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片を含んでなる精製ポリペプチド。
15. 請求項１１−１４のいずれか１項記載のポリペプチドの優性ネガティブ突然変異体。
16. 請求項１１−１４のいずれか１項記載のポリペプチドの優性ポジティブ突然変異体。
17. 請求項１１−１５のいずれか１項記載のポリペプチドに特異的な抗体。
18. 代謝制御に使用するための、ＰＧＣ−３の活性を変調可能な療法剤を同定する方法であって：
    （ｉ）（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、または（配列番号２の１−６００位、配列番号２の４００−１００２位、配列番号２の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号２の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片；
    または
    （ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列、または（配列番号４の１−６００位、配列番号４の４００−９９６位、配列番号４の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号４の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片；
    または
    （ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列、または（配列番号８の１−６００位、配列番号８の４００−９９６位、配列番号８の２００−８００位）から選択されるメンバーに少なくとも約９０％の相同性を有する配列番号８の変異体、あるいは生物学的に活性であるその断片；
    のいずれか１つを含んでなるＰＧＣ−３ポリペプチドと、候補化合物モジュレーターとを接触させ
    そして
    （ｉｉ）ＰＧＣ−３ポリペプチドの活性に対する、候補化合物モジュレーターの影響を測定する
    ことを含んでなる方法。
19. 候補化合物モジュレーターをＰＧＣ−３ポリペプチドを発現する宿主細胞と接触させる、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１８または請求項１９に記載の方法により同定されるＰＧＣ−３モジュレーター。
21. 請求項２０に記載のＰＧＣ−３モジュレーターまたは薬学的に許容しうるその塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と組み合わせて含んでなる薬剤組成物。
22. ＰＧＣ−３に単独でまたは部分的に媒介される代謝性疾患または医学的状態を処置する方法であって、こうした処置を必要とする温血動物に、請求項２０または請求項２１に記載のＰＧＣ−３モジュレーターの有効量を投与することを含んでなる方法。
23. 代謝性疾患の処置に使用するための医薬品産生における、請求項２０に記載のＰＧＣ−３モジュレーターの使用。

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