JP2004506439A - カリシン - Google Patents

Abstract

本発明は、カリシンの使用、特に、基質に対するリガンドの輸送および／または結合におけるリポカリンの使用に関し、ここで、この基質は、髪でも皮膚でもなく；そしてまた、この基質および／またはリガンドに対するこのカリシンの特異性および／または親和性を変更するための、カリシンの改変に関する。改変されたカリシンマルチマーの使用であって、該カリシンマルチマーは、リガンドを結合するように適合された結合ドメイン；および基質を結合するように適合された標的化ドメイン、を含み、該改変されたカリシンマルチマーが基質に対してリガンドを標的化するために使用され、該基質は髪でも皮膚でもなく、かつ該リガンドは、天然には該基質に結合しないという点で特徴付けられる、使用。

Description

【０００１】
本発明は、カリシン（ｃａｌｙｃｉｎ）の使用に関し、特に、基質に対するリガンドの輸送および／または結合におけるリポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）の使用に関し（ここで、この基質は、髪でも皮膚でもない）；そしてまた、この基質および／またはリガンドに対するこのカリシンの特異性および／または親和性を変更するための、カリシンの改変に関する。
【０００２】
リポカリンは、生物において見出される細胞外タンパク質の多様なファミリーである。これらは、リガンドの結合および輸送に関する種々の機能を示す。例えば、これらは、フェロモン活性、嗅覚、味覚、視覚、免疫調節、および細胞の恒常性に関する一般的機能の媒介に関与する。
【０００３】
おそらく最も広く研究されたリポカリンは、レチノールを体中に輸送するレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）である。レチノール（すなわちビタミンＡ）は、視覚の正常な機能、生殖系および免疫系、ならびに造血にとって必須の、非常に重要な物質である。レチノールの代謝物はまた、発生、分化および抗癌細胞において活性である。
【０００４】
ＲＢＰの三次元構造は、１９８４年に決定され（Ｎｅｗｃｏｍｅｒ，Ｍ．Ｅ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．、Ａｑｖｉｓｔ，Ｊ．、Ｓｕｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｕ．、Ｒａｓｋ，Ｌ．およびＰｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３　１４５１−１４５４）、新規構造が明らかになった。多くのリポカリンが同定および特徴付けされるにつれ、この塩基性の８−β鎖構造が、アミノ酸配列同一性の全体的なレベルは低いものの、全ての構造的ホモログにおいて保存されていることが明らかになった。このファミリーのタンパク質は、リポカリン（ギリシャ語の単語、脂肪を意味するｌｉｐｏおよび萼を意味するｃａｌｙｘに由来する）として公知になった。１０−β鎖の細胞内タンパク質の密接に関連するファミリーもまた見出され、この２つの群が一緒になってカリシンを構成する。
【０００５】
リポカリンは、全生物で見出され、分子量は約１８ｋＤａ〜４５ｋＤａの範囲である。しかし、これは、モノマー分子形態を示す；多くのリポカリンは、マルチマーとして存在する。例えば、ビリン結合タンパク質は、１９．５ｋＤａのモノマーサブユニットのホモテトラマーとして存在する。アポリポタンパク質Ｄは、ダイマーとして存在するが、他のタンパク質とも会合する。ＲＢＰは、１：１までの比で、ＴＴＲと複合体化して見出されるが、クラストシアニン（ｃｒｕｓｔａｃｙａｎｉｎ）は、その安定な分子形態において１６個のサブユニットを含むようである。
【０００６】
上記のように、リポカリンは、アミノ酸レベルではそれほど保存されていないが、これらをリポカリンとして認識可能にしている特定の構造的特徴を保持する。コア構造は、直交して配置されたβシートによって示され、これらのβ鎖は、互いに連結して、一方の端が閉じたバレル様構造を形成し、それによって、「萼形状」構造を生じる。このように生成される空洞は、リポカリンによるリガンド輸送／結合のための結合ポケットを示す。リポカリンとしてタンパク質を同定するための助けとなるいくつかの短い配列相同領域が存在する。ＧＸＷモチーフおよびＴＤＹモチーフは、２つの最も決定的であるが必須ではないモチーフである。
【０００７】
リポカリンの主要な機能は、（少なくとも１つは酵素活性を有するが）通常は小さい疎水性分子である特定のリガンドの結合および輸送である。結合の特異性は、リポカリンポケットの立体配座および構成側鎖によって決定される。多くのリポカリンが、インビトロで、通常、天然では出会うことのない範囲の疎水性分子に高親和性で結合し得ることが注目される。このことは、リポカリンが、特定の生物学的特性および構造的特性を有する分子に結合する固有の能力を示し得る。
【０００８】
広く研究されてきたリポカリンの別の例は、β−ラクトグロブリンである。β−ラクトグロブリンは、哺乳動物の乳汁中に見出される非常に豊富なタンパク質である。ウシβ−ラクトグロブリンのモノマー分子量は、１８ｋＤａであり、１６２アミノ酸に相当する。多くの研究者が、β−ラクトグロブリンが、インビトロでレチノールおよび脂肪酸を結合することを示した。しかし、インビトロでβ−ラクトグロブリンが果たす正確な役割は、いまだ理解されていない。
【０００９】
簡単にいうと、カリシンは、「結合ドメイン」と「標的化ドメイン」とに、機能的に分けられ得る。「結合ドメイン」は、リガンドと相互作用するように機能し、そして「標的化ドメイン」は、結合したリガンドを規定された部位に輸送する際の特異性を提供するように機能する。
【００１０】
いくつかの例において、この結合ドメインはまた、標的化機構の一部であり得る。
【００１１】
本発明者らの同時係属中の出願、ＰＣＴ／ＧＢ００／００５１７において、本発明者らは、β−ラクトグロブリンが非天然の部位で脂肪酸を結合する能力を議論した。この用語、非天然は、リポカリンが天然には出会うことのない標的化部位として定義される。この結合ドメインおよび／または標的化ドメインが、このカリシンに対して内因性であり得ることが、当業者に明らかである。しかし、カリシンがこの薬剤を天然には結合しないいくつかの例において、対応する結合ドメインおよび／または標的化ドメインは、しかるべく適合される。この適合は、存在する結合ドメインおよび／または標的化ドメインの変更か、あるいは必要な機能性を有するドメインでの、これらのドメインの置換のいずれかを含み得る。
【００１２】
毛小皮は、脂肪酸によって被覆されると考えられ、これらの脂肪酸は、水に対する疎水性障壁として機能し得、そしてまた、髪に天然の艶および風合いを与える。化粧品のヘアコンディショナーは、髪のこれらの特徴を強調するように機能する。しかし、コンディショナーは、現在、毛小皮との一時的な会合を有するもののみが入手可能であり、従って、使用者は、髪の艶および髪本体を維持するために、定期的にコンディショナーを適用しなければならない。本発明者らの同時係属中の出願、ＰＣＴ／ＧＢ００／００５１７は、リポカリン（例えば、β−ラクトグロブリン、マウス尿タンパク質（ＭＵＰ）および他種由来の等価物）は、髪に対するコンディショニング特性を提供するように適合され得ることを実証する。
【００１３】
さらに、またはあるいは、リポカリンのマルチマー複合体は、１以上の薬剤を保有するように適合され得る。例えば、限定としてではなく、マルチマーリポカリン複合体は、髪に対するコンディショニング剤および香料の両方を保有するために使用され得る。香料分子は、一般に、揮発性である。リポカリンに対する香料分子の結合は、遅延された放出および／または制御された放出を提供する。このようなリポカリンの１つの例は、ピーマンの臭気物質（ｏｄｏｕｒａｎｔ）でる３−イソブチル−３−メトキシピラジンを結合する、ピラジン結合タンパク質である。他の例は、ＭＵＰおよび等価物である。
【００１４】
あるいは、リポカリンは、選択された臭気物質を結合するように、ライブラリーから選択され得る。組換えＤＮＡ技術によって作製される、ランダムに変異したカリシンの膨大なライブラリーが、選択された遺伝子に変異を導入するように設計される。これらのライブラリーから、特定のリガンド（例えば、香料、薬物、抗生物質、色素）に対する特定の結合特異性が、検出および単離される。
【００１５】
色素性リポカリン、クラスタシアニンは、本発明者らによって配列決定およびモデリングされた。この例において、リガンドは、カロチノイド、アスタキサンチンであり、このようなリポカイン−カロチノイド複合体が天然に多数存在する。カロチノイドとリポカインとの間の相互作用は、アスタキサンチンの吸光特徴に変化を生じ、その結果、この複合体は今や異なる色を装う。この系は、異なる波長で吸収し得、そして環境条件の変化（例えば、温度、時間、ｐＨ、微生物培養、薬剤の添加または除去）に対して感受性である、色に基づいたセンサーを提供する。上記のように生成される変異は、リガンドおよび環境条件に対する感受性を規定し得る。
【００１６】
（発明の説明）
本発明に従って、以下：
ｉ）リガンドに結合するように適合された結合ドメイン；および
ｉｉ）基材に対して結合するように適合された標的化ドメイン
を含む改変されたカリシンモノマーが提供され、ここで、改変されたカリシンモノマーが天然では結合しない基材に対してリガンドを標的化させるために使用される点で特徴付けられる。
【００１７】
リガンド結合ドメインは、リガンド（代表的に、決して排他的にではなく、疎水性分子を含む）を結合する。このリガンドは、通常天然では遭遇しないリガンドであり得る。
【００１８】
カリシンが配置される基材としては、髪または皮膚を除く任意の基材が挙げられ得る。例として、カリシンが配置される基材としては、衣服の繊維（特に、カリシンが芳香剤結合カリシンであり、かつ、粉末洗剤および他のこのような洗濯製品に使用される場合）が挙げられ得る。カリシンが治療分子の結合および送達に使用される場合、カリシンが配置され得る基材としては、細胞表面が挙げられ得る。
【００１９】
他の潜在的な基材は、紙（セルロース）、キチン、コラーゲン、ガラス、金属、合成ポリマーなど（これら全ては、ネイティブリポカリンもしくは変異リポカリンによって結合され得る部分、またはリポカリンに結合する特異的な結合タンパク質／ドメインによって結合され得る部分を含む）によって提供されるような表面を含む。
【００２０】
操作されたカリシンモノマーは、化学的方法または分子生物学的な方法によって融合された２つのネイティブモノマーで構成され得、それによって２つ以上の特異性を生成するか、または別のポリマー基材上の１つの実体／部分に結合し得る古典的なモノマー形態を生成する。本発明の好ましい実施形態において、改変されたカリシンモノマーは、少なくとも２つのリガンドを結合するように適合され得る。好ましくは、これらのリガンドは同じである。あるいは、改変されたカリシンモノマーは、少なくとも２つの異なるリガンドを結合するように適合される。
【００２１】
本発明のさらに好ましい実施形態において、改変されたカリシンモノマーは、マルチマー複合体である。好ましくは、このマルチマー複合体は、同じカリシンモノマーを含む。あるいは、この複合体は、異なるカリシンモノマーを含む。
【００２２】
カリシン複合体は、異なるリガンドを結合するが同じ標的化ドメインを含み、同一表面に対する異なるリガンドの標的化を促進するモノマーを含み得る。あるいは、この複合体は、同じリガンドを結合するが異なる標的化ドメインを含み、異なる表面に対する同じリガンドの標的化を促進するモノマーを含み得る。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、改変されたカリシンモノマーはさらに、複合体中のカリシンモノマーのマルチマー化を促進する相互作用ドメインを含む。例としては、サブユニット：サブユニット相互作用に関与するさらなるエレメントを有する、ウシＯＢＰおよびクラスタシアニン（ｃｒｕｓｔａｃｙａｎｉｎ）様グル−プのメンバーが挙げられる。
【００２４】
好ましくは、カリシンモノマーの複合体へのマルチマー化は、ペプチド連結を介して達成される。従って、相互作用ドメインの性質は、好ましくは、少なくとも２つのモノマー間のそのような連結の形成が促進されるような性質である。相互作用ドメインは、カリシンの天然に存在する部分であり得るか、または合成技術もしくは組換え技術（例えば、従来の技術）を用いて挿入され得る。
【００２５】
本発明の代替の好ましい実施形態において、改変されたカリシンモノマーは、架橋剤によってマルチマー化される。好ましくは、この架橋剤は、二官能性のタンパク質架橋剤である。架橋剤は、ホモ二官能性またはへテロ二官能性であり得る。
【００２６】
ＤＳＳ、ＤＭＡ、ＥＤＣのような架橋剤は、当該分野で周知であり、そして官能基を介してタンパク質を互いに架橋させるために使用される。代表的に、架橋剤は、遊離のアミノ基を通してタンパク質を連結するか、またはシステインのような硫黄含有アミノ酸中のスルフヒドリル基の間を連結する。架橋剤は、共有結合連結または非共有結合連結のいずれか（これらは、架橋されたタンパク質複合体の周囲の環境を変更することによって（例えば、還元剤の添加によって）壊され得る）を生成し得る。
【００２７】
本発明のさらなる局面に従って、以下の工程を包含する、改変されたカリシンモノマをマルチマー化させるための方法が提供される：
ｉ）マルチマー複合体に改変されたカリシンモノマーを架橋させるのに十分な条件および架橋試薬と共に、改変されたカリシンモノマーを提供する工程；および必要に応じて、
ｉｉ）架橋された複合体を試薬混合物から精製する工程。
【００２８】
本発明のさらなる局面において、少なくとも１アミノ酸残基の欠失、置換または付加によって変更された、改変されたカリシンモノマーが提供され、ここで、この変更は、少なくとも１つのリガンドに対する結合ドメインの特異性を変更する。あるいは、またはさらに、この変更は、少なくとも１つのリガンドに対するこの結合ドメインの親和性を変更する。
【００２９】
図４は、天然の単離されたタンパク質であるｒＥＲＡＰＢおよびｒＭＵＰのタンパク質マップを示す。これらのタンパク質は、示されるようないくつかの組換えタンパク質を構築するための鋳型として使用された。
【００３０】
精巣上体レチノイン酸結合タンパク質（ＥＲＡＢＰ）におけるＡｒｇ８０およびＧｌｕ６３のイソロイシンへの変異は、レチノイン酸に対する親和性を低減させ、そして変異体タンパク質のレチノールおよびレチナールへの結合を引き起こす。このネイティブタンパク質は、これら後者２つのリガンドに結合することができない（図５）。
【００３１】
本発明のなおさらなる局面において、少なくとも１アミノ酸残基の欠失、置換または付加によって変更された、改変されたカリシンモノマーが提供され、ここで、この変更はいずれも、選択された表面に対するこの改変されたカリシンモノマーの標的化ドメインの特異性を変更する。あるいは、またはさらに、この変更は、選択された表面に対する標的化ドメインの親和性を変更する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、この変更された改変されたカリシンモノマーは、本発明の上記の実施形態のうちのいずれかに従って、複合体にマルチマー化される。
【００３３】
上記の変更カリシンを作製するための方法は、当該分野で周知であり、そしてカリシンモノマーおよび融合タンパク質の作製における組換えＤＮＡ技術を含む。薬剤に対するカリシンの親和性が、例えば、結合ドメインを遺伝子改変し、その薬剤に対するより高い親和性を有する適合されたカリシンを作製することによって変更され得ることもまた、当業者に明らかである。さらに、結合ドメインは、薬剤結合の特異性を変更するように遺伝子改変され得る。標的化ドメインの特異性が、標的化の特異性を変更するか、あるいは選択された表面上のその結合部位に対する標的化ドメインの親和性を増大または低減させるかのいずれかで変更され得ることもまた、明らかである。この型の遺伝子改変は、当該分野で周知であり、そして例えば、薬剤結合部位および／または標的化ドメインの特性を変更するための点変異の導入が挙げられる。
【００３４】
１つより多くの型の薬剤結合ドメインを有する分子複合体の産生が生成され得ることもまた、明らかである。これは、複数成分の遺伝子および遺伝子産物を生成するための適切な連結領域を用いて、カリシンに対する遺伝子の互いの融合によって達成され得る。あるいは、相互作用部位がカリシンの個々のモノマーに導入され得、その結果、個々のタンパク質を混合する際に、分子が、類似の官能基または異なる官能基を有する複数サブユニットの複合体に集合する。この型の遺伝子改変は、当該分野で周知であり、そしてタンパク質の特性を変更するための点変異、付加、欠失などの導入が挙げられる。
【００３５】
本発明のさらなる局面に従って、本発明の上記の局面または実施形態のうちのいずれかに従う改変されたカリシンモノマーをコードする核酸を含むベクターが、提供される。例としてであり限定ではなく、ｐＱＥ−３０ベクターは、ネイティブカリシン配列または変異カリシン配列を含むＥ．Ｃｏｌｉ株（例えば、ＳＧ１３００９）における発現のために使用され得る。ｐＰＩＣ３．５ベクターは、ネイティブカリシン配列または変異カリシン配列を含む酵母株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ株（例えば、ＭＳＤ１１６８−ｈｉｓ４またはＧＳ１１５−ｈｉｓ４））における発現のために使用され得る。これらは全て、市販のベクター／株である。
【００３６】
好ましくは、上記のベクターは、上記改変されたカリシンモノマーの組換え産生に対して適合される。
【００３７】
代表的に、上記適合としては、例としてであり限定ではないが、細胞／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給が挙げられる。これらのプロモーター配列は、誘導性、抑制性または構成性であり得る。適合としてはまた、選択マーカーおよび自律複製配列（これらの両方は、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を促進する）の供給が挙げられる。遺伝子をコードするベクターの発現を促進する適合としては、転写終了配列／ポリアデニル化配列の提供が挙げられる。これはまた、二シストロン発現カセットまたは複数シストロン発現カセットに配置される遺伝子をコードするベクターの発現を最大化するように機能する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の供給を含む。
【００３８】
これらの適合は、当該分野で周知である。一般的に、発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術に関する公開された文献は、有意な量で存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹおよびその中に引用される参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｖｏｌ　ＩＩＩ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　ＵＫ；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ　Ｍ　Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００３９】
特定の部位特異定変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能であるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭ部位指向型変異誘発と称される市販の方法論の使用によって作製される。
【００４０】
変異体リポカリンライブラリーは、「ＤＮＡシャッフリング」（ＳＴＥＭＭＥＲ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　３７０　３８９−３９１、ＳＴＥＭＭＥＲ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１　１０７４７−１０７５１）として公知の公開された方法論によって作製される。
【００４１】
特定の変異体リポカリンを特定のレセプターに標的化する目的のために、リポカリン分子の３つのループ領域（標的化を担う）が、オリゴヌクレオチドプライマー対を使用するＰＣＲに基づく方法論を使用して変更され、このオリゴヌクレオチドプライマー対は、挿入されるループ領域に対する配列をその間に含む。このような反応において、取り出されるループの配列は、除去され、そしてオリゴヌクレオチドプライマー中にコードされる配列によって置換される。
【００４２】
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明に従ってベクターで形質転換またはトランスフェクトされる細胞または細胞株が、提供される。例示のためであり限定ではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＳＧ１３００９を含む）および酵母菌株（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓを含む）が、使用され得る。
【００４３】
本発明のなおさらなる局面において、以下の工程を包含する、本発明に従う改変されたカリシンモノマーを組み換え的に製造するための方法が提供される：
ｉ）上記ポリペプチドの製造の助けとなる条件下で、本発明に従うベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた細胞または細胞株を増殖させる工程；および
ｉｉ）上記細胞または上記細胞の増殖環境から改変されたカリシンモノマーを精製する工程。
【００４４】
本発明の好ましい方法において、ベクターは、分泌シグナルまたは親和性タグ（例えば、Ｈｉｓ_６またはストレプトアビジンペプチド）をコードし、従って、この改変されたカリシンモノマーが、これらの分泌シグナルまたは親和性タグを伴なって提供され、モノマーの精製を促進する。
【００４５】
本発明の上記の局面または実施形態のいずれかに従って、改変されたカリシンモノマーまたは改変されたカリシンマルチマーは、洗濯物の表面繊維に対して少なくとも１つの薬剤を標的化させる際の使用のために適合される。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、薬剤は、洗濯物に所望の臭気を与える芳香を含む。使用される芳香分子は、図６に列挙され、そして単に例示として、β−イオノン、ジャスモン、ダマスコーン（ｄａｍａｓｃｏｎｅ）および関連する分子が挙げられる。
【００４７】
さらに好ましい実施形態において、薬剤は、洗濯物に心地よい風合いを与えるコンディショナー（例えば、シリコーン）を含む。
【００４８】
なおさらなる好ましい実施形態において、薬剤は、洗濯物に対する保護特性を与える保護剤（例えば、殺虫剤、駆虫剤またはＵＶ保護剤）を含む。
【００４９】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、カリシンは、図７に列挙されるもののうちのいずれかから選択され、最も好ましくは、以下から選択される：マウス尿タンパク質（ＭＵＰ）およびその等価物、ラットα２ミクログロブリン臭気結合タンパク質（ＯＢＰ）、他の臭気結合タンパク質およびそれらの等価物、β−ラクトグロブリン、レチナールおよびレチノイド結合タンパク質、α１ミクログロブリン、脂肪酸結合タンパク質、細胞内レチノイド結合タンパク質のいずれかから選択され、これらは全て、疎水性リガンド結合に関与し、そして他の特異性を含むように改変され得る（例えば、抗生物質、薬物、顔料など）。クラスタシアニン（ｃｒｕｓｔａｃｙａｎｉｎ）、インセクタシアニン（ｉｎｓｅｃｔａｃｙａｎｉｎ）が、色素性リポカリンの好ましい例である。
【００５０】
これらのうちのいずれかが、モノマーであり得、そして化学的方法論または分子生物学的方法論を用いてマルチマー形成に関与し得る。
【００５１】
本発明の上記の局面または実施形態のうちのいずれかに従って、改変されたカリシンモノマーまたは改変されたカリシンマルチマーは、バイオセンサーとしての使用のためのものである。本明細書中において特に重要なものは、色素性リポカリン（ネイティブバージョンまたは変異バージョン）であり、これは、例として、熱感受性、光感受性または気体感受性であり、そしてその応答は、色の変化を含む。上記のように作製された変異体はまた、リガンドおよび環境条件に対する感度を規定し得る。
【００５２】
本発明の上記の局面または実施形態のうちのいずれかに従って、改変されたカリシンモノマーまたは改変されたカリシンマルチマーは、少なくとも１つの表面（例えば、細胞表面）に対する少なくとも１つの治療剤の標的化における使用のためのものだる。次いで、治療剤は、細胞中に移され得、それによって薬物の標的化、送達および取り込みをもたらす。治療剤の性質は、非常に変化し得る。例としては、抗癌剤、抗生物質およびチャネル改変因子が挙げられる。
【００５３】
標的化の特定の実施例は、以下；
（ｉ）レセプター認識配列を通じた細胞表面への標的化、それによる、その表面を通じた治療因子（例えば、抗癌薬、抗生物質、神経薬、レセプター、およびイオンチャネルモジュレーター）の取り込みの促進、
（ｉｉ）生物学的に活性な因子（例えば、ビタミン、成長因子、抗生物質、およびシグナル分子）の緩やかな送達をもたらすパッチまたは創傷仕上げ材料（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）のような表面への接着、
を含む。
【００５４】
リポカリン（例えば、ＭＵＰ）の変異体のライブラリーから、規定された治療因子に対する特定の特異性を有するタンパク質が単離され得る。次いで、このリポカリンは、さらなる変異誘発に供され、その結果、ＲＢＰの残基３０〜４１、５６〜６９、および８７〜１０１、またはＭＵＰにおけるそれらの等価物が、上記ライブラリーから単離されたリポカリンに挿入される。次いで、これらの再構築されたリポカリンは、リガンドの送達のために使用される。これらのリポカリンは、適切なレセプターを含む生物学的膜に輸送する。
【００５５】
従って、本発明は、（ｉ）カリシン／リポカリンのその細胞膜レセプターおよび他のキャリアへの結合に影響を与えるためのカリシンの領域の変更、または（ｉｉ）異なるレセプターにリポカルシンコアを再度指示するためのキメラの生成（例えば、ＥＲＡＢＰおよびＲＢＰおよびＭＵＰの生成）によるカリシンの領域の変更を包含する。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態は、ＲＢＰに含まれる残基３０〜４１、５６〜６９、および８７〜１０１による、ＥＲＡＢＰにおけるそれぞれ、残基２１〜３７、５４〜５９、および７７〜８４の置換を包含する。この置換により、ここでは、リガンド依存的な様式で、トランスサイレチンおよびＲＢＰレセプターと相互作用するＥＲＡＢＰ変異体が生じる。
【００５７】
同様に、ＲＢＰに含まれる残基５９〜６８および８７〜１０１による、ＭＵＰにおけるそれぞれ残基５８〜６３および８２〜８７の置換は、リガンド依存的な様式で、トランスサイレチンおよびＲＢＰレセプターと相互作用するＭＵＰ／ＲＢＰキメラを生じる。リポカリンからリポカリンへ移され得るこれらの領域は、特異的な標的化の例である。
【００５８】
本発明の実施形態を、ここで、単に例示として、以下の図面、方法、および材料を参照して記載する。
【００５９】
（材料および方法）
（カリシンマルチマーを生成する方法）
カリシン分子のマルチマーを生成するための多くの可能性のあるアプローチが存在する。生成されるマルチマーは、ホモマーおよびヘテロマーであり得、そして２つのカリシン分子（ダイマー）またはより高次の複合体（トリマー以上）を含み得る。キメラ手段によりヘテロダイマーを生成するための好ましい経路を、以下に概説する。
【００６０】
（Ｎ末端を通じたへテロダイマーの架橋）
（ジスクシンイミジル−スベリミデート（ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）−ジヒドロクロリド（ＤＳＳ））
ＤＳＳは、ホモ二官能性試薬（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）であり、Ｎ末端アミンまたは表面に露出したリジンアミノ基を通じてそれらに連結したタンパク質中の１級アミノ基と反応する。ＤＳＳを、氷冷した２５ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４／１ｍＭ−ＭｇＣｌ_２（ｐＨ８．０）中の２０ｍｇ／ｍｌの新鮮なストック溶液として調製し、そして同一の緩衝液中の１ｍｇ／ｍｌカリシン調製物に添加して、０．５、２．０、および１０ｍｇ／ｍｌの使用濃度（ｗｏｒｋｉｎｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を与えた。この反応を、室温（２１℃）にて１時間進行させ、そして反応混合物１ｍｌ当たり５０μｌの１．０Ｍ−酢酸アンモニウムを添加することによりクエンチした。
【００６１】
（ジメチル−アジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）−ジヒドロクロリド−（ＤＭＡ））
条件を、ＤＳＳ処理と同一にした。
【００６２】
（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）
ＤＦＤＮＢを、１．０Ｍストック溶液として調製し、そして２５ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４／１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２（ｐＨ８．０）中のカリシン懸濁物に添加し、終濃度５．０ｍＭを与えた。この反応を、室温にて３０分間後、大量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）に対して透析することにより停止させた。
【００６３】
（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオネート（ＳＤＢＰ）
ＳＤＢＰは、カリシン間で架橋を形成するための連続反応において使用される、ヘテロ二官能性試薬（ジブロモプロピオネートおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）である。ＳＤＢＰを、製造者の説明書に従いストック溶液として調製した。１ｍｇ／ｍｌの濃度の第１のカリシンを、ＳＤＢＰの至適濃度で１時間の間、４℃にてｐＨ７のリン酸緩衝液中で絶えず攪拌しながら添加したＳＤＢＰのＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分と反応させた。過剰な架橋剤を、ゲル濾過により除去し、そして誘導体化したカリシン（ここでは、その表面にアルキルジブロミド基を含むカリシン）を、温度を２１℃まで上昇させることにより第２のカリシン（総タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）と反応させた。この反応もまた、第１の反応と同一の緩衝液およびｐＨ条件下で絶えず攪拌しながら実施した。
【００６４】
（アミノ基およびカルボキシル基を通じたヘテロダイマーの架橋）
（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ））
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）は、所望のヘテロダイマーを形成するための、１つのカリシンのＮ末端アミノ基（またはリジンの側鎖アミノ基）と第２のカリシンのＣ末端カルボキシル基との間のアミド結合の形成を触媒するために使用される。ＥＤＣを、製造者の説明書に従い、ストック溶液として調製した。タンパク質を、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で２−［Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５〜５．０）中に懸濁し、そして２５℃にて１６時間、ＥＤＣの至適濃度で攪拌しながらＥＤＣを添加した。
【００６５】
（１つのアミノ基および１つの遊離システイン残基を通じたへテロダイマーの架橋）
（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ））
スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）は、１つのカリシンのＮ末端アミノ基（またはリジンの側鎖アミノ基）および他のカリシンの遊離スルヒドリル基と連続的に反応させるために使用される、ヘテロ二官能性架橋剤（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびマレイミド）である。ＳＭＣＣを、製造者の説明書に従いストック溶液として調製した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分との反応を、４℃で６０分間、ＳＭＣＣの至適濃度で絶えず攪拌しながら、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液中で実施した。過剰な架橋剤を、ゲル濾過により除去し、そして誘導体化したカリシン（ここでは、結合したマレイミド部分を有するカリシン）を、第２のカリシンにおける表面が露出したシステイン側鎖と反応させた。このマレイミド反応を、４℃で２０時間、０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度で絶えず攪拌しながら、ｐＨ６．５〜７．５のリン酸緩衝液中で実施した。この反応は、第１のカリシンが遊離のシステインを欠き、第２のカリシンがそれを含む場合に好ましい。
【００６６】
望ましくないカリシンホモダイマーおよび所望のカリシンへテロダイマーの混合物を、両方のカリシンの結合特性を認識する２つのアフィニティークロマトグラフィー工程の組み合わせにより単離する。上述されるほとんどの架橋剤について、必要な場合使用され得る異なるスペーサーアーム長を有する類似物が利用可能である。
【００６７】
一般的に、上述のほとんどの架橋反応について、架橋試薬は、タンパク質よりも２〜５０倍モル過剰で用いられる；用いられる架橋剤の実際の濃度もまた、用いられるタンパク質濃度に依存する。当該分野で十分に確立された方法に従い、架橋反応の完了後、過剰の架橋剤または加水分解した架橋剤を、ゲル濾過、透析、または遠心分離濃縮によりクエンチおよび除去する。任意の特定の架橋反応の正確な条件（反応ｐＨ、温度、時間、ならびにタンパク質および架橋剤の濃度の面で）は、実験を通して特定の反応のために最適化される必要がある。
【００６８】
（α−クラスタシアニン由来のホモダイマー、ヘテロダイマー、およびオリゴマーの形成）
ロブスター組織から単離したネイティブのα−クラスタシアニン（約０．３ｍｇ／ｍＬ）を、室温にて２０時間、ｐＨ４．５で種々の濃度のＥＤＣ（２０μＭ〜１０ｍＭの範囲）と共にインキュベートした。サンプルを、ＳＤＳゲル電気泳動により分析した。得られたクマシーブルー染色したゲルを、図３に示す。
【００６９】
図３は、このカリシンが、非常に効果的に架橋されて、非常に大きなオリゴマー種を形成することを示し、これらは、そのネイティブタンパク質自体のオリゴマー性質を反映しているようである（すなわち、モノマー、Ｃ１およびＡ２を含むヘテロダイマーが非共有結合したオクトマーであると考えられる）。
【００７０】
図３は、未処理サンプルにおける完全に分離した２つのモノマーを示し、そしてＥＤＣ架橋剤の濃度が増加するにつれて、Ａ２モノマーが優先的に架橋され、その後Ｃ１サブユニットが増加したサイズのオリゴマーに架橋されることを示す。１０ｍＭ　ＥＤＣにより、実質的に全てのモノマーが架橋されており、そして少量のダイマーが見られる。
【００７１】
本明細書に示されるデータは、カリシンモノマーが、ホモダイマー、ヘテロダイマー、およびよりより高次のオリゴマーに容易に架橋され得ることを示す。このような反応は、２つ以上の異なり、かつ特異的な結合ポケットを有するカリシン種の形成を可能にする。ホモダイマー、ヘテロダイマー、およびオリゴマーが形成される程度は、特定のカリシンに依存する。カリシンモノマーが、最初に、互いに非共有的に関連し合うほど近接している場合（α−クラスタシアニンの場合のように）、非常に効率的な架橋が達成され得る。
【００７２】
（リガンド−リポカリン複合体の調製）
代表的に、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中のリポカリンタンパク質を、２倍モル過剰のリガンドと共に、３７℃で１時間インキュベートする。リガンド−リポカリン複合体を、例えば、２ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で平衡化し、そして展開したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（２０×１ｃｍカラム）を用いたゲル濾過により、非結合リガンドから分離する。
【００７３】
（細胞膜および細胞に結合する放射標識リポカリンの測定）
細胞膜および細胞への放射標識リポカリンの結合を、油遠心分離技術を用いてか、またはフィルターを通じた濾過および洗浄により測定する。油遠心分離について、ＰＢＳ（オボアルブミンを含む）中の標的細胞膜（１〜２ｍｇタンパク質／ｍｌ）または細胞（１〜２×１０^６細胞／ｍｌ）を、放射標識リポカリン（２〜１０ｎＭ）と共に、最終容量１００μｌでインキュベートする。所望の温度および所望の時間のインキュベーションの後、サンプルを、微量遠心分離において、２分間、１２，５００ｇで遠心分離する。次いで、サンプルに、ジブチルフタレートおよびジノニルフタレートの適切な混合物（代表的に、３：２、ｖ／ｖ）を上乗せし、そして１２，５００ｇで２分間、再度遠心分離する。このチューブをドライアイス中で凍結させ、そしてチューブの底（細胞または膜ペレットを含む）を切り取り、放射活性を測定する。放射標識リポカリンの非特異的結合を、少なくとも２μＭの非標識リポカリンの存在下で測定する。
【００７４】
膜濾過方法について、細胞膜または細胞を伴う放射標識リポカリンのインキュベーションの完了後、サンプルを、ガラス線維膜フィルターを通して吸引により濾過し、そしてフィルターを、数ｍｌのＰＢＳを用いて３〜４回同様に洗浄する。次いで、フィルターの放射活性を決定する。
【００７５】
（リポカリンからのリガンド取り込みアッセイ）
膜小胞または細胞による放射標識リガンド−リポカリン複合体からのリガンドの取り込みアッセイを、上記と同様の油遠心分離法（今回は、リガンドを放射標識したことを除く）により実施した。トリチウム標識リガンドを使用したいくつかの場合、油混合物を、５０μｌアリコートの５％スクロース含有ＰＢＳ上に重ね、そして標識した試験サンプルを、遠心分離前に油層上に置いた。ドライアイスで凍結させた後、チューブを油／スクロース界面で切断した。チューブの底を、室温にて一晩、２００μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中でインキュベートし、そしてそれらの放射標識リガンド含有量を測定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、多くのカリシンにおいて見出される保存された特徴の概略図である。
【図２】図２は、ＥＤＣにより誘導されるβ−ＬＧ／ｒＭＵＰヘテロダイマーの形成のさらなる証拠を示すオートラジオグラフを示す。ここで、レーン１は［^３５Ｓ］Ｍｅｔ標識ｒＭＵＰ＋β−ＬＧおよび０．５ｍＭ　ＥＤＣを表わし、レーン２は［^３５Ｓ］Ｍｅｔ標識ｒＭＵＰおよび０．５ｍＭ　ＥＤＣを表わし、そしてレーン３は［^３５Ｓ］Ｍｅｔ標識ｒＭＵＰ（未処理）を表わす。Ｍは、分子量マーカーを含むゲルのレーンを示す。
【図３】図３は、ＥＤＣにより誘導される、α−クラスタシアニンのオリゴマー化を示すタンパク質ゲルを示す。Ｍは、分子量マーカーを含むゲルのレーンを示す。
【図４】図４は、天然の単離されたタンパク質ｒＥＲＡＰＢおよびｒＭＵＰならびにいくつかの組換えタンパク質のタンパク質マップを示す。
【図５】図５は、選択されたリガンドについての種々のタンパク質のリガンド結合親和性を示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態において用いられ得る例示的な芳香分子のリストを提供する。
【図７】図７は、本発明の実施形態において用いられ得る例示的なカリシンのリストを提供する。

Claims (34)

1. 改変されたカリシンマルチマーの使用であって、該カリシンマルチマーは、以下：
   ｉ）リガンドを結合するように適合された結合ドメイン；および
   ｉｉ）基質を結合するように適合された標的化ドメイン、を含み、
   該改変されたカリシンマルチマーが基質に対してリガンドを標的化するために使用され、該基質は髪でも皮膚でもなく、かつ該リガンドは、天然には該基質に結合しないという点で特徴付けられる、使用。
2. 前記改変されたカリシンマルチマーが、少なくとも２つのリガンドに結合するように適合される、請求項１に記載の使用。
3. 前記リガンドが同じである、請求項２に記載の使用。
4. 前記リガンドが、２つの異なるリガンドである、請求項２に記載の使用。
5. 前記マルチマーが、同一のカリシンモノマーを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
6. 前記マルチマーが、異なるカリシンモノマーを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
7. 前記改変されたカリシンマルチマーが、カリシンモノマーの複合体へのマルチマー化を容易にする相互作用ドメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
8. 前記改変されたカリシンモノマーが、架橋剤によってマルチマー化される、請求項７に記載の使用。
9. 前記架橋剤が、二官能性のタンパク質架橋剤である、請求項８に記載の使用。
10. 前記架橋剤が、ホモ二官能性である、請求項９に記載の使用。
11. 前記架橋剤が、ヘテロ二官能性である、請求項９に記載の使用。
12. 請求項１０に記載の使用であって、前記架橋剤が、以下：ジスクシンイミジル−スベリミデート−ジヒドロクロリド；ジメチル−アジピミデート−ジヒドロクロリド；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンからなる群より選択される、使用。
13. 請求項１１に記載の使用であって、前記架橋剤が、以下：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオネート；１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレートからなる群より選択される、使用。
14. 少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、置換または付加によって変更された、改変されたカリシンマルチマーであって、該変更が、少なくとも１つのリガンドに対する前記結合ドメインの特異性を変更する点で特徴付けられる、改変されたカリシンマルチマー。
15. 前記改変が、少なくとも１つのリガンドに対する前記結合ドメインの親和性を変更する点で特徴付けられる、請求項１４に記載の改変されたカリシンマルチマー。
16. 少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、置換または付加によって変更された、改変されたカリシンマルチマーであって、該変更が、選択された表面に対する前記標的化ドメインの特異性を変更する点で特徴付けられる、改変されたカリシンマルチマー。
17. 前記改変が、選択された表面に対する前記標的化ドメインの親和性を変更する点で特徴付けられる、請求項１６に記載の改変されたカリシンマルチマー。
18. 請求項１４〜１７のいずれかに記載の改変されたカリシンマルチマーをコードする核酸を含む、ベクター。
19. 前記ベクターが、前記改変されたカリシンマルチマーの組換え的産生のために適合される、請求項１８に記載のベクター。
20. 請求項１８または１９に記載のベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、細胞。
21. 請求項１４〜１７のいずれかに記載の改変されたカリシンを製造するための方法であって、該方法は、以下：
    ｉ）請求項２０に記載の細胞を、該カリシンの製造をもたらす条件下で増殖させる工程；および
    ｉｉ）該細胞またはその増殖環境から該カリシンを精製する工程、
    を包含する、方法。
22. 前記ベクターが、前記モノマーの精製を容易にするための分泌シグナルまたは親和性タグをコードし、従って、前記カリシンが、該分泌シグナルまたは親和性タグと共に提供される、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１〜１３のいずれかに記載の使用、または請求項１４〜１７のいずれかに記載のカリシンであって、前記カリシンが、洗濯物の表面繊維に対する少なくとも１つの薬剤の標的化のために適合される、使用またはカリシン。
24. 改変されたカリシンモノマーの使用であって、該カリシンモノマーは、以下：
    ｉ）リガンドを結合するために適合された結合ドメイン；および
    ｉｉ）基質を結合するために適合された標的化ドメイン、を含み、
    該改変されたカリシンモノマーが、洗濯物の表面繊維に対して少なくとも１つの薬剤を標的化するために使用される点で特徴付けられる、使用。
25. 前記薬剤が、前記洗濯物に所望の香りを付与する香料を含む、請求項２３および／または２４に記載の使用。
26. 前記薬剤が、前記洗濯物に所望の風合いを付与するコンディショナーを含む、請求項２３〜２５のいずれかに記載の使用。
27. 前記薬剤が、前記洗濯物に保護特性を付与する保護剤を含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の使用。
28. 請求項２３〜２７のいずれかに記載の使用であって、前記改変されたカリシンが、以下：マウス尿タンパク質（ＭＵＰ）およびその等価物、ラットα２ミクログロブリン臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、他の臭気物質結合タンパク質およびその等価物、β−ラクトグロブリン、レチナール結合タンパク質およびレチノイド結合タンパク質、α１ミクログロブリン、脂肪酸結合タンパク質、細胞内レチノイド結合タンパク質ならびに色素性リポカリン、からなる群より選択される、使用。
29. 請求項１〜１３のいずれかに記載の使用、または請求項１４〜１７のいずれかに記載のカリシンであって、前記カリシンマルチマーが、バイオセンサーである、使用またはカリシン。
30. 前記カリシンが、色素性リポカリンである、請求項２９に記載の使用。
31. 請求項１〜１３のいずれかに記載の使用、または請求項１４〜１７のいずれかに記載のカリシンマルチマーであって、少なくとも１つの表面に対する少なくとも１つの治療剤の標的化のための、使用またはカリシンマルチマー。
32. 前記治療剤が、薬物の標的化、送達および取り込みをもたらすために細胞内に移入される、請求項３１に記載の使用。
33. 前記治療剤が、以下：化学療法剤、抗生物質、神経学的薬剤、レセプターおよびイオンチャネルモジュレーターからなる群より選択される、請求項３１または請求項３２に記載の使用。
34. 改変されたカリシンモノマーをマルチマー化するための方法であって、該方法は、以下：
    ｉ）モノマーをマルチマー複合体に架橋するために十分な条件および架橋試薬と共に、カリシンモノマーを提供する工程；および、必要に応じて、
    ｉｉ）該試薬混合物から該架橋複合体を精製する工程、
    を包含する、方法。

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