JP2004361198A - 試料分離装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】キャピラリーの長さが短くても試料の分離能が高く、しかも電気泳動時間を短くすることができる試料分離装置を提供する。
【解決手段】キャピラリー２１内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置において、前記ゲル状の媒体を一の方向に送液するゲル送液手段と、前記ゲル送液方向と対向する方向に前記試料を電気泳動させる電気泳動手段とを具備する。キャピラリーは円盤状ディスク基板１の内径から外径に向かって延びる遠心送液領域を有し、前記ゲル送液手段は前記ディスク基板の回転と前記遠心送液領域を利用して前記キャピラリー内にゲルの流れを形成し、前記電気泳動手段は前記ゲルの流れと逆行する方向に前記試料を泳動させることが好ましい。
【選択図】 図１
【解決手段】キャピラリー２１内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置において、前記ゲル状の媒体を一の方向に送液するゲル送液手段と、前記ゲル送液方向と対向する方向に前記試料を電気泳動させる電気泳動手段とを具備する。キャピラリーは円盤状ディスク基板１の内径から外径に向かって延びる遠心送液領域を有し、前記ゲル送液手段は前記ディスク基板の回転と前記遠心送液領域を利用して前記キャピラリー内にゲルの流れを形成し、前記電気泳動手段は前記ゲルの流れと逆行する方向に前記試料を泳動させることが好ましい。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、生化学、医科薬学に関連する生体関連高分子物質や薬剤等の分離検出に用いられる試料分離装置に関し、特にキャピラリー内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命科学の分野ではヒトを始めとする様々な生物のゲノム（全遺伝子情報）の解読が急ピッチで進んでおり、その解読結果により新しい動植物品種の品種改良が期待されている。
【０００３】
また、単一生物種の中でも、その多様性を反映して個体によってそのゲノムの塩基配列がわずかに異なっていることが知られており（このような多様性はゲノム多型又は単に多型と称されている。）、例えば、ヒトにおいては、個人によって塩基配列の異なる確率は０．１％程度とされている。これは１０００塩基毎に１ヶ所で多型が見られることを意味しており、ヒトゲノム全体（約３０億塩基）の中で３００万塩基ほどに現れることになる。
【０００４】
したがって、個々のヒトの遺伝子情報を解析することによって、これまでの対症療法の域を出ない医療技術を超えた、各自の遺伝情報に基づいた最も適切な治療・投薬を施す、いわゆるテーラーメード医療の実現が可能になり、投薬や治療の無駄をなくしつつ、極めて効果的な病気予防と投薬と治療が実現できると期待されている。例えば、１塩基だけが異なる１塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、遺伝子の発現量に影響を与えたり、アミノ酸変異を起こす場合があることから、膨大な塩基配列の中からＳＮＰを検出・解析することにより、個人にあった治療や薬がわかり、テーラーメード医療の確立につながると期待されている。
【０００５】
一方、ヒトゲノムのシークエンシングの技術発展の歴史は塩基解読の絶対量増大の歴史でもある。すなわち、７０年代には世界中で年間１００塩基以下しか解読できなかったにもかかわらず、わずか３０年間に、サンガー法、キャピラリーアレイ電気泳動法等が開発され、世界中で年間ギガ（Ｇ＝１０９）塩基のシークエンシングが可能になった。特にキャピラリー電気泳動法は、ＤＮＡ解析を高速かつ高感度、高精度で行える解析法であり、しかも測定は簡便で複数の試料の同時解析が可能で自動化が容易であるという利点を有している。
【０００６】
キャピラリー電気泳動法を利用した装置として、下記特許文献１には、蛍光標識された試料が泳動する泳動媒体を含む複数のキャピラリーと、前記複数のキャピラリーの前記試料の泳動方向の端部を、間隔をおいて直線上に配置して保持するキャピラリー保持手段と、前記端部がその内部に配置される光学セルと、前記端部の少なくとも近傍及び前記端部の下部にシースフローを形成するために、前記光学セルの内部にシース液を導入する手段と、前記光学セルから前記シース液を排出する排出口と、前記試料から蛍光を励起する励起光を、前記末端の下部で前記直線にほぼ平行に照射する手段と、前記蛍光を検出する手段とを有することを特徴とする電気泳動装置が開示されている。また、下記特許文献２，３，４にも同様な方式の電気泳動装置が開示されている。
【０００７】
更に、下記特許文献５には、第１の平坦な二次元の面とそれに向かい合う第２の平坦な二次元の面を持つ基板を含み、第１面がその中に埋め込まれる複数のマイクロチャネルと検体入力手段を含み、検体入力手段とマイクロチャネルが接続され、流体接触し、プラットホームの第１の平坦な二次元の面に向かい合う第２の平坦な二次元の面が、プラットホームの回転の速度、期間、又は方向を制御するための電磁的に読取り可能な命令セットで符号化されるマイクロシステム・プラットホームと、回転手段がマイクロシステム・プラットホームに機能的に作用するように連結され、それと回転接触する、基部、回転手段、電源及びユーザ・インタフェースを含む微小操作装置と操作制御手段と、の組み合わせである向心的に動かされる流体微小操作機器であって、プラットホームのマイクロチャネル内の多量の流体が、流体をマイクロチャネルを通して移動させるのに十分な時間の間、及び回転速度でプラットホームの回転運動から生じる向心力によって前記マイクロチャネルを通して移動される、向心的に動かされる流体微小操作機器が開示され、マイクロシステム・プラットホームとして、約１ｃｍから２５ｃｍの半径のディスクが用いられている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平７−３１８４９４号公報
【特許文献２】
特開平６−１３８０３７号公報
【特許文献３】
特開平１０−１７０４８０号公報
【特許文献４】
特開２００２−２５７７８６号公報
【特許文献５】
特表２００２−５０３３３１号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
キャピラリー電気泳動法においては、流路や電極など周辺の微細化が進んでいるが、試料の泳動距離は、それを短くすると、試料の分離能が十分に得られなくなってしまうため、ある程度の長さが必要とされる。すなわち、分子量の近いもの同士を分離するためには、原理的により長い距離を泳動しなければならない。
【００１０】
上記特許文献１〜４の装置では、蛍光標識された試料が泳動する泳動媒体を含む複数のキャピラリーの前記試料の泳動方向の端部を、直線状に配列して光学セル内に配置し、光学セルの内部にシース液を流しながら、前記キャピラリーの端部から流出する試料に蛍光を励起する励起光を照射し、それによって発光する蛍光を検出する方法を採用しているが、キャピラリー中のゲルを固定した状態で電気泳動を行っており、試料の分離能を十分に得るためには、キャピラリーの長さを十分にとる必要があり、キャピラリーや装置の小型化には限度があった。
【００１１】
また、上記特許文献５の装置では、ディスクの回転を利用してキャピラリー内にゲルを充填しているが、電気泳動を行う際には、ディスクの回転を停止させている。このため、試料の分離能を十分に得るためには、キャピラリーの長さを十分にとる必要があり、ディスクを大きくしなければならない。
【００１２】
そして、キャピラリーの長さが長いということは、電気泳動に要する時間もそれだけ長くかかることを意味し、分析効率を向上させるネックとなる。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、キャピラリーの長さが短くても試料の分離能が高く、しかも電気泳動時間を短くすることができる試料分離装置を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の試料分離装置は、キャピラリー内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置において、前記ゲル状の媒体を一の方向に送液するゲル送液手段と、前記ゲル送液方向と対向する方向に前記試料を電気泳動させる電気泳動手段とを具備することを特徴とする。
【００１５】
本発明によれば、ゲル状の媒体を一の方向に送液すると共に、ゲル送液方向と対向する方向に試料を電気泳動させることにより、ゲルに対して試料が相対的に泳動する距離を長くすることができる。その結果、ゲルを固定した状態で同じ長さのキャピラリーを用いて電気泳動を行う場合に比べて、試料の分離能力を高めることができる。また、ゲルを固定した状態でキャピラリーの長さを長くして同等の分離能力を付与する場合と比べて、電気泳動時間を短くすることができると共に、印加電圧を低減することができる。
【００１６】
本発明の試料分離装置の好ましい態様においては、前記試料は負に帯電した試料であり、前記電気泳動手段は前記キャピラリー上の一の位置に正の電荷を印加すると共に、他の位置に負の電荷を印加することで、前記試料の泳動方向を決定し、前記ゲル送液手段は前記正の電荷が印加される位置から前記負の電荷が印加される位置に向けて前記ゲル状の媒体を送液する。
【００１７】
これによれば、例えば、ＤＮＡ断片、界面活性剤を用いて負に帯電させた蛋白質などの負に帯電した試料を効率よく分離することができる。
【００１８】
本発明の試料分離装置の別の好ましい態様においては、前記試料は正に帯電した試料であり、前記電気泳動手段は前記キャピラリー上の一の位置に正の電荷を印加すると共に、他の位置に負の電荷を印加することで、前記試料の泳動方向を決定し、前記ゲル送液手段は前記負の電荷が印加される位置から前記正の電荷が印加される位置に向けて前記ゲル状の媒体を送液する。
【００１９】
これによれば、例えば、蛋白質、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸やその誘導体のポリマー、低分子の薬品成分などの正に帯電した試料を効率よく分離することができる。
【００２０】
本発明の試料分離装置の更に好ましい態様によれば、前記キャピラリーは円盤状ディスク基板の内径から外径に向かって延びる遠心送液領域を有し、前記ゲル送液手段は前記ディスク基板の回転と前記遠心送液領域を利用して前記キャピラリー内にゲルの流れを形成し、前記電気泳動手段は前記ゲルの流れと逆行する方向に前記試料を泳動させる。
【００２１】
これによれば、ディスク基板の回転によってキャピラリーの遠心送液領域にゲルの流れを形成し、電気泳動手段によってゲルの流れと逆行する方向に試料を泳動させることにより、キャピラリーの長さが短くても試料の分離能を高めることができ、泳動時間も比較的短くすることができる。また、ディスク基板を回転するだけでゲルの流れを形成できるので、装置が簡略化されると共に、分析操作も容易となる。
【００２２】
本発明の試料分離装置の更に好ましい態様によれば、前記キャピラリーと交差する位置に連通接続された流路をさらに具備し、該流路に第２の媒体を送液させることで、前記ゲル状の媒体と該第２の媒体との混合界面を前記キャピラリー中に形成する。
【００２３】
これによれば、試料を注入したときに、試料がゲル状の媒体と第２の媒体との混合界面に移動して濃縮されるので、その状態で電気泳動を開始することによって、分離された試料のシグナル（検出バンド）の幅を変化させずに、その検出強度を高めることができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明において、試料とは、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ・ＲＮＡ断片、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、糖鎖、医薬成分等の生化学に関連した物質が好ましく適用される。
【００２５】
また、試料の電気泳動を行うために、マイクロキャピラリー内に注入するゲルとしては、例えばメチルセルロース（ＭＣ）、ハイドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ハイドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ハイドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等のセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリアクリルアミド、アガロース、アクリルアミド誘導体のポリマー等を含む緩衝液が好ましく用いられる。緩衝液としては、１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液をリン酸、酢酸、ホウ酸等でｐＨ ８〜９に調整し、またＥＤＴＡ等を１〜１０ｍＭの濃度で加え試料成分を安定に保持できるよう調整したものなどが好ましく用いられる。
【００２６】
更に、ゲル送液手段としては、マイクロシリンジや圧電ポンプ等、基板の外部あるいは内部に形成された送液装置を用いることができる。また、基板の回転によって生じる遠心力を利用してゲルの貯蔵溝からキャピラリー内へゲルを送液する手段を採用することもできる。
【００２７】
本発明においては、ゲル送液手段によってゲル状の媒体を一の方向に送液すると共に、電気泳動手段によってゲルの送液方向と対向する方向に試料を電気泳動させることにより、ゲルに対して試料が相対的に泳動する距離を長くして、試料の分離能力を高めると共に、電気泳動時間を短くし、印加電圧を低減するようにしている。
【００２８】
試料が負に帯電した試料である場合には、ゲル送液手段は正の電荷が印加される位置から負の電荷が印加される位置に向けてゲル状の媒体を送液する。負に帯電した試料としては、例えば、ＤＮＡ断片、界面活性剤を用いて負に帯電させた蛋白質などの負に帯電した試料などが挙げられる。
【００２９】
試料が正に帯電した試料である場合には、ゲル送液手段は負の電荷が印加される位置から正の電荷が印加される位置に向けてゲル状の媒体を送液する。正に帯電した試料としては、例えば、蛋白質、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸やその誘導体のポリマー、低分子の薬品成分などが挙げられる。
【００３０】
試料分離用キャビラリーと交差する別のキャピラリーを設け、この別のキャピラリーから、送液装置や基板の回転によって生じる遠心力によって、試料分離用キャピラリーに、濃度の薄いゲルや、緩衝液や、純水などからなる第２の媒体（以下、濃縮用溶液という）を送液することによって、ゲル濃／淡界面もしくは水層／ゲル層界面を試料分離用キャピラリー内に形成することができる。
【００３１】
これによれば、試料を注入したときに、試料が上記ゲル濃／淡界面もしくは水層／ゲル層界面に移動して濃縮されるので、その状態で電気泳動を開始することによって、分離された試料のシグナル（検出バンド）の幅を変化させずに、その検出強度を高めることができる。
【００３２】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明する。
図１〜９には、本発明の試料分離装置の一実施形態が示されている。図１はディスク基板の平面図、図２は同ディスク基板の部分断面図、図３は同ディスク基板のマイクロキャピラリー部を示す説明図、図４は同ディスク基板の上基板を示す底面図、図５は同ディスク基板の下基板を示す平面図、図６は同ディスク基板の下基板を示す底面図、図７は電力供給機構の一例を示す説明図、図８は電力供給機構の他の例を示す説明図、図９は試料分離装置の全体構成を示す説明図である。
【００３３】
図１、２に示すように、このディスク基板１は、上基板１１ａと、下基板１１ｂとを接合して構成されている。下基板１１ｂは、ディスク基板１を保持するための中心穴１２を有している。上基板１１ａは、上記中心穴１２よりも大きな内径の中心穴１２ａを有し、この中心穴１２ａ内周に露出する下基板１１ｂ上面には、保持部１３が形成されている。
【００３４】
図４を併せて参照すると、上基板１１ａの底面には、マイクロキャピラリー２１を形成するための溝３１が形成されている。この溝３１は、下基板１１ｂで覆われて上記マイクロキャピラリー２１を構成する。溝３１の両端部は、拡径された円形の凹部をなし、その一部にゲル注入口兼空気孔３２が形成されている。上記円形の凹部は下基板１１ｂで覆われて、一端がゲルリザーバー２４、他端がゲルレシーバー２３を構成している。更に、マイクロキャピラリー２１のゲルレシーバー２３の近傍には、試料注入口２２が形成されている。
【００３５】
こうして構成されるマイクロキャピラリー２２は、基板１１ａ、１１ｂに対して、その中心から外周方向に向けて放射状に複数個形成されている。ここで放射状とは、図示する実施形態に示されるように半径方向外方に直線状に向かう形状だけでなく、半径方向に対して傾斜した角度で外方に向かう形状や、螺旋状をなして外方に向かう形状なども含む意味である。
【００３６】
そして、ゲルリザーバー２４のゲル注入口兼空気孔３２からゲルを注入し、ディスク基板１を回転させると、遠心力によってゲルリザーバー２４に貯えられたゲルが、マイクロキャピラリー２２を通ってゲルレシーバー２３へ流れ込むようになっている。
【００３７】
また、図５に示すように、下基板１１ｂの上面には、マイクロキャピラリー２１の両端部に接する環状の電気泳動用電極２５、２６が形成され、それらが下基板１１ｂを貫通しているビア３３ａ、３３ｂを介して前記下基板１１ｂの裏面に導出され、そこから更に配線２５ａ、２６ａを介してビア３３ｃ、３３ｄに連結されている。更に、ビア３３ｃ、３３ｄは、再び下基板１１ｂを貫通して、前記保持部１３上に形成された環状電極２８，２７に接続されている。環状電極２８，２７は、下基板１１ｂを上から押さえる後述する基板支持具７０（図７参照）によって、電極端子７１に当接するようになっている。そして、前記試料注入口２２から試料を注入し、前記上記電気泳動用電極２５、２６間に電圧を印加すると、試料が前記マイクロキャピラリー２２内のゲル中を電気泳動するようになっている。
【００３８】
なお、前記上下の基板１１ａ、１１ｂの材料は、耐熱性、耐薬品性に優れ、かつ微細な構造を形成できる加工性を保持するものが好ましく、例えばポリカーボネート樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂等の有機樹脂、ガラス、石英、シリコンなどが好ましい。また、基板上で用いられる薬品、試料成分の性質に応じ、前記マイクロキャピラリーを形成後に適当な表面処理を施すことが好ましい。例えば、マイクロキャピラリー形成後、該基板１１ａ、１１ｂ表面を薄いポリエチレン、ポリプロピレン等でコートすることによってＤＮＡ、蛋白質等が該基板１１ａ、１１ｂへ表面吸着することを抑制し、かつエタノール等有機溶媒への耐性を向上させることが好ましい。
【００３９】
また、前記マイクロキャピラリー２１は、該ディスク基板１の回転による遠心力によって試料や緩衝液を滞り無く移送するために、マイクロキャピラリー２１全体にわたって均一な深さを有することが好ましく、また経路の幅も均一であることが好ましい。具体的には幅：１００〜３００μｍ、深さ：１００〜３００μｍが好ましく、幅：１５０〜２００μｍ、深さ：１５０〜２００μｍがより好ましい。
【００４０】
更に、ゲルリザーバー２４及びゲルレシーバー２３の大きさと深さは、該ディスクの回転の遠心力によって試料や緩衝液を滞り無く移送するために、マイクロキャピラリーと同じ均一な深さを有することが好ましく、またゲルを保持あるいは流入させるため１〜４μｌの容積を有することが好ましい。より具体的には、深さ：１５０〜２００μｍ、半径：１．５ｍｍ〜３ｍｍの円筒形が好ましい。
【００４１】
次に、前記下基板１ｂの保持部１３に形成された環状電極２８，２７に電力を供給する機構について説明する。
【００４２】
図７に示すように、下基板１ｂの保持部１３を上から押さえる基板支持具７０には、該環状電極２７、２８にそれぞれ接続される複数の支持具側電極端子７１が形成されており、基板支持具７０が下基板１ｂを押さえる際に、環状電極２７、２８と支持具側電極端子７１とが接触することによって電気的に接続される。更に、支持具側電極端子７１は、基板支持具７０の内部もしくは外部を通って支持軸７２の外周あるいは内周に形成された支持具側環状電極７３へと配線されている。支持具側電極端子７１の一つ一つはそれぞれ独立して支持具側環状電極７３の一つへと接続し、支持具側環状電極７３はブラシ電極７５によって図示しない外部回路へと接続されている。
【００４３】
したがって、図７に示すように、下基板１ｂと基板支持具７０が接続された状態では、電気泳動用電極２５、２６からの配線が、環状電極２７、２８、支持具側電極端子７１を経て支持具側環状電極７３へと接続され、更に支持具側環状電極７３からブラシ電極７５を経て外部回路へと接続されているため、ディスク基板１を回転させたままでも電気泳動用電極２５、２６等に電力を供給することができる。
【００４４】
また、図８にはディスク基板１を回転させたまま電気泳動用電極２５、２６等に電力を供給するための別形態が示されている。図７と同様、前記マイクロキャピラリー２１の両端部の電気泳動用電極２５，２６等が前記下基板１ｂの保持部１３に形成された電力供給のための環状電極２７，２８等へと配線によって引き出されている。なお、この例では、環状電極が合計４本同心円状に形成されており、４つのラインに電極が供給されるようになっている。
【００４５】
そして、基板１１ｂの保持部１３上に形成された該環状電極２７、２８は、図７に示すような支持具７０を介した接続ではなく、直接ブラシ電極７５を経て図示しない外部回路へと接続されている。なお、該環状電極２７、２８は該基板１１の中央部に形成することによって回転半径を小さくし、環状電極２７、２８の回転速度をなるべく低くすることが好ましい。
【００４６】
次に、図９を参照して本発明の試料分離装置の全体構成について説明する。
本発明の試料分離装置は、上記のディスク基板１を用いて試料成分の分離、検出を行うものであり、基板１を支持して回転させる図示しないターンテーブルと、この基板１にレーザー光を照射して、その反射光を取り出し、検出を行う光検出手段５０を有している。
【００４７】
光検出手段５０は、基板１に対して、半径方向に移動可能に取付けられている。この光検出手段５０は、レーザー駆動回路６０によってレーザー光を射出するレーザー光源５１と、このレーザー光を平行ビームとするマルチレンズ５２と、レーザー射出光を通過させ、反射光を取り出すためのビームスプリッタ５３と、コリメータ５４と、対物レンズ５５と、ビームスプリッタ５３で分岐された反射光を集光するする集光レンズ５６と、集光レンズ５６で集光された反射光を受光する光検出素子５７と、光検出素子５７で検出された光信号を増幅させる増幅回路５８と、この増幅回路を通して入力された光信号を処理するサーボ・信号処理ＬＳＩ５９とから構成されている。
【００４８】
また、基板１の上下面の所定位置を撮像するように指向されたＣＣＤ（電荷結合型）カメラ６１が設置されている。
【００４９】
したがって、レーザー光源５１から射出されたレーザー光は、マルチレンズ５２、ビームスプリッタ５３、コリメータ５４、及び対物レンズ５５を通して、基板１の所定位置に照射される。このレーザー光は、例えば、マイクロキャピラリー２１で分離された成分を発光させる光源として利用される。
【００５０】
この試料分離装置により試料成分を分離する際には、基板１を回転してゲルリザーバー２４からゲルレシーバー２３に向けてマイクロキャピラリー２１にゲルを送液しながら、前記ゲルの送液方向とは反対方向に試料成分が泳動するように電極２５，２６間に電圧を印加する。この状態で試料注入口２２から試料を添加し、試料成分を分離させた後、該マイクロキャピラリー２１にレーザー光を照射して、レーザー光によって発光したパターンをＣＣＤカメラ６１で撮像し、その発光パターンを図示しないコンピューターによって画像解析することによって成分の検出を行うことができる。
【００５１】
次に、図１０，１１を参照して、本発明で用いられるディスク基板の他の実施形態について説明する。なお、前記図１〜９に示した実施形態と実質的に同一部分には同符号を付してその説明を省略することにする。
【００５２】
この実施形態では、前記マイクロキャピラリー２１と所定の角度で交差する試料輸送用マイクロキャピラリー２１’が形成されている。その交差部分は、マイクロキャピラリー２１の外周側端部に近い部分に設けられている。試料輸送用マイクロキャピラリー２１’は、その一端にゲルリザーバー２４’が形成されており、他端には及びゲルレシーバー２３’が形成されている。そして、基板１１ａ、１１ｂの回転に伴う遠心力によって、ゲルリザーバー２４’から試料移送用キャピラリー２１’にゲルが注入でき、かつ、試料移送用キャピラリー２１’から押し出されたゲルはゲルレシーバー２３’に流れ込むことができるようになっている。
【００５３】
また、試料輸送用マイクロキャピラリー２１’の両端部には、それらに電圧を印加するための電極２５’、２６’が形成され、これらの電極２５’、２６’は、ビア３３ｅ、３３ｆを介して下基板１１ｂの裏面に導出され、更に配線２５ａ’、２６ａ’を介して、下基板１１ｂの保持部１３上に形成された環状電極２７’２８’に接続されている。
【００５４】
更に、前記マイクロキャピラリー２１の両端部には、それらに電圧を印加するための電極２５，２６が形成され、これらの電極２５，２６は、前記実施形態と同様に、ビア３３ａ、３３ｂを介して下基板１１ｂの裏面側に同移出され、更に配線２５ａ、２６ａを介して、下基板１１ｂの保持部１３上に形成された環状電極２７，２８に接続されている。したがって、この実施形態の場合は、保持部１３上の環状電極が４本形成されている。
【００５５】
この実施形態においては、試料注入口２２が試料移送用キャピラリー２１’のゲルリザーバー２４’近傍に形成されている。そして、試料注入口２２から試料移送用キャピラリー２１’に注入された試料は、該試料移送用キャピラリー２１’に印加される電圧によって該試料が有する電荷に従ってゲル中を泳動することができる。
【００５６】
このようにして、試料移送用キャピラリー２１’によってマイクロキャピラリー２１へ試料を移送し、所定の時間後に電圧をマイクロキャピラリー２１の両端で印加することによって、該試料移送用キャピラリー２１’に流れていた試料を切り取り、マイクロキャピラリー２１で電気泳動することができる。また、この場合も、前述の実施形態と同様、基板１を回転させることによって生じる遠心力で、ゲルリザーバー２４からゲルレシーバー２３に向けてゲルを送液しながら電気泳動を行うことができ、基板１の回転数に従って分離能を制御することができる。
【００５７】
次に、図１２、１３を参照して、本発明で用いられるディスク基板の他の実施形態について説明する。
【００５８】
図１２に示すように、この実施形態では、水バンド形成用キャピラリー２９が、試料分離用キャピラリー２１と試料移送用キャピラリー２１’の交点から上流側に所定の角度で交差するように形成されており、前記基板１の回転によって生じる遠心力によって、水バンド形成用キャピラリー２９内に充填された水を移送し、試料分離用キャピラリー２１の途中で、ゲルと水の界面を形成することができるようになっている。また、前記実施形態と同様に、基板１の回転による遠心力によってゲルを送液出来るように、前記試料分離用キャピラリー２１は前記基板上に放射状に複数個形成されている。
【００５９】
また、図１３に示すように、試料分離用キャピラリー２１の途中にゲルと水の界面を形成するにあたっては、前記基板の回転によって生じる遠心力Ｃ１、Ｃ２で試料分離用キャピラリー２１中のゲルおよび水バンド形成用キャピラリー２９の水が下流へと送液されることによって、ゲル・水界面の平坦な水バンドの形成が妨げられてしまうため、前記電極２６以外の電極２５、２５’、２６’に正の電圧を印加して、ゲルリザーバー２４へ向かう電気浸透流Ｐを生じさせ、基板の回転によって生じる遠心力によるゲルの流れを相殺することによって、ゲル・水界面Ｓを平坦に形成することが好ましい。
【００６０】
更に、該水バンド形成用キャピラリー２９の端部Ｅ１は、前記ゲルリザーバー２４の端部Ｅ２よりも前記基板における内周側にあり、前記試料分離用キャピラリー２１よりも該水バンド形成用キャピラリー２９の方が基板の回転によって生じる圧力が高くなって、ゲルが該水バンド形成用キャピラリー２９に逆流することを防ぐようになっていることが好ましい。
【００６１】
図１４には、本発明の試料分離装置の他の実施形態を示す概略構成図が示されている。
【００６２】
図１４において、基板１１０は、図示しない上記テーブルによって支持される。この基板１１０に対して、ｘ−ｙ方向に移動可能に、図示しない光検出手段が設置されている。該光検出手段の構成は、前述した試料分離装置の実施形態と同様である。また、マイクロシリンジ等の送液手段６３によって送液管６２を通って、基板１１０に形成された図示しないマイクロキャピラリーにゲルを送液できるようになっている。更に、マイクロキャピラリーには、前記実施形態と同様に電圧を印加して試料成分を電気泳動できるようになっている。
【００６３】
したがって、送液手段６３によってマイクロキャピラリーにゲルを送液しながら、マイクロキャピラリーに電圧を印加して、試料を前記ゲルの送液方向とは反対方向に電気泳動させることにより、試料を分離することができる。そして、該マイクロキャピラリーにレーザー光を照射して、レーザー光によって発光したパターンをＣＣＤカメラで撮像し、その発光パターンを図示しないコンピューターによって画像解析することによって成分の検出を行うことができる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。なお、以下の実施例において使用したディスクは、予め基板の所定領域に機械加工によりキャピラリー等を形成して用いた。
【００６５】
実施例１
図１０、１１に示す構造の基板（基本構造は図１〜６に示した基板と同じなので、図１〜６に記載された符号を援用して説明する）を用いてＤＮＡ断片を分離、検出した。
【００６６】
ポリカーボネート製の基板は、所定の領域にキャピラリーを形成するための溝３１を形成した上基板１１ａと、該上基板１１ａと同じ形状で溝を含まない下基板１１ｂとを貼り合わせることによって形成した。
【００６７】
図１１に示すように試料移送用キャピラリー２１’（長さ３．５ｍｍ、幅１００μｍ、深さ１５０μｍ）と、試料分離用キャピラリー２１（長さ２０．５ｍｍ、幅１００μｍ、深さ１５０μｍ）は、９０度の角度で交差し、試料分離用キャピラリー２１のディスク内径側端部にゲルリザーバー２４、外径側端部にゲルレシーバー２３を形成した。また、試料移送用キャピラリー２１’の両端には、ゲルリザーバー２４’及びゲルレシーバー２３’を形成した。また、上基板１１ａには、ゲルリザーバー２４’の近傍に試料注入口２２を形成した。また、前記各リザーバー及びレシーバーに相当する位置にはゲル注入口兼空気孔３２を形成した。
【００６８】
また、下基板１１ｂの表面には図１１に示すような配線を白金スパッタによって形成した。そして、図２に示すように、溝を形成した上基板１１ａと、配線を形成した下基板１１ｂとを、紫外線硬化接着剤を用いて接着した。
【００６９】
本実施例中において使用した検体、及び試薬（以下において製造元の記載がない試料は関東化学株式会社製）を以下に示した。
【００７０】
試料：２０ｂｐラダーＤＮＡ（２ｎｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 製）
泳動用ゲル：０．７％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． 製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．製）
キャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記の実験条件１にて電気泳動を行った。
【００７１】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色し、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。得られた結果を図１５に示した。
【００７２】
＜実験条件１＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
分離時
５５０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００７３】
なお、試料の泳動速度に対して最適な送液速度を得るため、下記のハーゲン・ポアズイユの式の変形式（１）に従って送液速度を最適化した回転数で回転させた。
【００７４】
【数１】
【００７５】
即ち、本実施例における各パラメータを代入することによって送液速度と回転数の関係式（２）を得る。
【００７６】
【数２】
【００７７】
５５０ｒｐｍの回転数は、毎秒９．２回転であり、従ってこのときゲルの送液速度は下記式で求められる。
【００７８】
【数３】
【００７９】
比較例１
ゲルを送液し試料の泳動速度を制御することによって分離能が向上できることを明確に示すため、実施例１と同条件で基板回転をかけないことを唯一の条件変更とし、下記実験条件２によって電気泳動を行った場合の実験結果を、図１６に示した。
【００８０】
＜実験条件２＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
分離時
０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００８１】
図１５と図１６比較すると、図１５は検出された各ピークの時間間隔が広く、また５００ｂｐ以上の鎖長のＤＮＡも分離することができており、従って実施例１に記載した条件で試料を前記分離用キャピラリー２１で電気泳動させながら基板１を回転させてゲルを送液することによってゲルの送液速度分だけ試料の泳動速度が減速され、速度に差がある成分同士の速度の比を大きくすることによって、分離能を向上することが可能であることが実施例１と比較例１の比較によって明らかとなった。
【００８２】
比較例２
ゲルを送液し試料の泳動速度を制御することによって、キャピラリー自体の長さを長くした場合と同等の分離能を得ながら泳動にかかる時間はキャピラリーを長くした場合よりも短縮することができ、さらに印加電圧はキャピラリーを長くした場合よりも小さくできることを明確に示すため、分離用キャピラリーの長さを３７．５ｍｍに変え、それに伴って印加電圧を下記の通りに変更し、かつ電気泳動中に遠心力を印加しないで、下記実験条件３によって電気泳動を行った場合の実験結果を図１７に示した。図１７において縦軸は時間（単位：秒）であり、横軸はＤＮＡ分子の大きさ（単位：ｂｐ）である。
【００８３】
＜実験条件３＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：５００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
分離時
０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００８４】
図１７中の系列２（図１５のデータをプロットしたもの）、系列３（比較例２の実験条件３で行った実験結果をプロットしたもの）を比較すると、系列２は、５００ｂｐのＤＮＡが検出されるまでにかかる時間は１５０秒であるのに対し、系列３は同じく５００ｂｐのＤＮＡが検出されるまでに２１０秒かかった。系列２及び系列３は、いずれも２０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡが検出される時間間隔が１００秒程度で、両者の分離能が同程度であることを示している。
【００８５】
更に、本比較例２では、実験条件１や実験条件２で用いた１５ｍｍの分離用キャピラリーと同じ電界を印加するために印加電圧が５００Ｖとなっており、分離用キャピラリーの長さを長くすることによって、印加電圧が大幅に上昇している。
【００８６】
図１７では、系列１（図１６のデータをプロットしたもの）も併せて示してあり、２０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡが検出される時間間隔が４０秒程しかなく、系列２と比較すると分離能の面で劣っていることを示している。すなわち、試料の泳動分離時、分離用キャピラリーに遠心力を印加しゲルを送液してゲルの送液速度分だけ試料の泳動速度を減速し、速度に差がある成分同士の速度の比を大きくすることによって、キャピラリー自体の長さを長くした場合と同等の分離能を得ながら泳動にかかる時間はキャピラリーを長くした場合よりも短縮することができ、さらに印加電圧はキャピラリーを長くした場合よりも小さくできることが、本比較例を持って明確に示された。
【００８７】
実施例２
本実施例では、実施例１と同じ基板を用い、ゲルの送液に基板の回転ではなく、マイクロシリンジによる送液を用いた。それ以外の条件は全て同じとした。
【００８８】
図２に示したゲルリザーバー２４に形成されたゲル注入口兼空気孔３２に図１３に示したマイクロシリンジ６３からの送液管６２を接続し、ゲルを送液した。
【００８９】
本実施例中において使用した検体、及び試薬を以下に示した。
試料：２０ｂｐラダーＤＮＡ（２ｎｇ／μｌ）
泳動用ゲル：０．７％メチルセルロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３
【００９０】
キャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記実験条件４にて電気泳動を行った。
【００９１】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色され、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。
【００９２】
＜実験条件４＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（マイクロシリンジによる送液）
試料移送時
０ ｍｍ／ｓ
分離時
０．０９ ｍｍ／ｓ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００９３】
測定の結果、図１５とほぼ同様の結果が得られた。従って、ゲルの送液を行わなかった比較例１の結果や、キャピラリーの長さを長くした比較例２の結果と比較することによって、ゲルの送液手段によらずマイクロシリンジによる送液も遠心力による送液と同様、ゲルの送液速度分だけ試料の泳動速度を減速し、速度に差がある成分同士の速度の比を大きくすることができ、キャピラリー自体の長さを長くした場合と同等の分離能を得ながら泳動にかかる時間はキャピラリーを長くした場合よりも短縮することができ、さらに印加電圧はキャピラリーを長くした場合よりも小さくできることが、本実施例を持って明確に示された。
【００９４】
実施例３
以下に、キャピラリー中に水の層を形成して、水／ゲル界面で試料を濃縮する効果が得られ、かつその水の層が基板の回転による遠心力を利用して形成することができることを示す。
【００９５】
図１２に示す構造の基板を用いてＤＮＡ断片を分離、検出した。基板１上に各キャピラリー等を形成する手段は実施例１と同様であり、本実施例における構造上の変更点は、試料分離用キャピラリー２１の途中の図１２に示すような位置、すなわち試料分離用キャピラリー２１と試料移送用キャピラリー２１’の交差点から基板中央方向側、かつゲルリザーバー２４よりも基板の中心に近い位置までに水リザーバー２９（経路の長さ１８ｍｍ、幅７０μｍ、深さ３０μｍ）が形成されていることである。
【００９６】
本実施例中において使用した検体、及び試薬を以下に示した。
試料：２ μｇ／ｍｌ ｆｘ１７４−Ｈａｅ ＩＩＩ（２ｎｇ／μｌ）
泳動用ゲル：０．３％メチルセルロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３
【００９７】
水リザーバーの注入口より純水を、またキャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記の実験条件５にて電気泳動を行った。
【００９８】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色され、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。得られた結果を図１８（ａ）に示した。
【００９９】
＜実験条件５＞
（電圧印加）
水バンド形成時
２３’・２４’・２３：１００Ｖ
２４：ｇｒｏｕｎｄ
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
水バンドにおいて試料濃縮時
正方向
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
逆方向
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：２００Ｖ
２４：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
水バンド形成時
３００ ｒｐｍ
試料移送時
０ ｒｐｍ
水バンドにおいて試料濃縮時
０ ｒｐｍ
分離時
５５０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【０１００】
比較例３
試料の泳動路に水バンドを形成し、ゲル／水の界面で試料を濃縮することによって感度と分離能の向上を行うことが出来ることを明確に示すため、実施例２のマイクロキャピラリーと同一の構造で、水バンドの形成過程及びゲル／水界面での濃縮過程を行わず、それ以外の条件は実施例２と全く同じ下記実験条件６により、試料の分離・検出を行った。
【０１０１】
本比較例中において使用した検体、及び試薬を以下に示した。
試料：２ μｇ／ｍｌ ｆｘ１７４−Ｈａｅ ＩＩＩ（２ｎｇ／μｌ）
泳動用ゲル：０．３％メチルセルロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３
キャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記の実験条件６にて電気泳動を行った。
【０１０２】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色され、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。得られた結果を図１８（ｂ）に示した。
【０１０３】
＜実験条件６＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
水バンド形成部通過時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
水バンド形成部通過時
０ ｒｐｍ
分離時
５５０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【０１０４】
実施例３において、水バンド形成時に実験条件５に示したような電圧印加を行うのは、電気浸透流の力を利用し、水バンド形成時に水とゲルが水バンド形成部よりも下流へ流れないようにするためである。試料がゲル／水界面に濃縮され、電界によって界面よりも上流へ泳動された後は、ゲルや水が基板回転による遠心力で基板の外側へ向かって流れるが試料の泳動には影響しない。
【０１０５】
また、比較例３において、水バンド形成部を試料が通過するまで基板回転を行わないのは、基板回転による遠心力で試料泳動用マイクロキャピラリー２１に水が流入することを防ぐためである。この操作は実施例３との比較を行うために行ったものであり、実施例３において水バンドを形成してゲル／水界面に試料を濃縮する際の試料の移動分に相当するだけの泳動を行ったものである。
【０１０６】
図１８（ａ）は実施例３における水バンド形成時、図１８（ｂ）は比較例３における水バンドを形成しなかった場合の電気泳動の結果である。図１８（ｂ）と比較して図１８（ａ）は明らかにシグナル強度が増大し、それにも関わらずシグナルの幅はほとんど変化していない。仮に図１８（ｂ）において試料濃度を高くしたとしても、シグナル強度は増大するが、それに伴いシグナルの幅も大きくなり、結果として分離能は低下することは自明である。また、図１８（ａ）では検出時間９０秒の前後にシグナルが２つ存在していることが非常に明らかであるが、図１８（ｂ）ではその存在は不確かである。
【０１０７】
以上のような観点で図１８（ａ）と図１８（ｂ）とを比較することによって、ゲル／水界面における濃縮効果によって感度と分離能が向上していることが示され、本発明は感度と分離能の向上に置いて好ましいゲル／水界面を基板の遠心力によって容易に形成することができることが示された。
【０１０８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ゲル状の媒体を一の方向に送液すると共に、ゲル送液方向と対向する方向に試料を電気泳動させることにより、ゲルに対して試料が相対的に泳動する距離を長くすることができる。その結果、ゲルを固定した状態で同じ長さのキャピラリーを用いて電気泳動を行う場合に比べて、試料の分離能力を高めることができる。また、ゲルを固定した状態でキャピラリーの長さを長くして同等の分離能力を付与する場合と比べて、電気泳動時間を短くすることができると共に、印加電圧を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試料分離装置に用いられるディスク基板の平面図である。
【図２】同ディスク基板の部分断面図である。
【図３】同ディスク基板のマイクロキャピラリー部を示す説明図である。
【図４】同ディスク基板の上基板を示す底面図である。
【図５】同ディスク基板の下基板を示す平面図である。
【図６】同ディスク基板の下基板を示す底面図である。
【図７】本発明の試料分離装置に用いられる電力供給機構の一例を示す説明図である。
【図８】電力供給機構の他の例を示す説明図である。
【図９】試料分離装置の全体構成を示す説明図である。
【図１０】本発明で用いられるディスク基板の他の実施形態を示す平面図である。
【図１１】同ディスク基板のマイクロキャピラリー部を示す説明図である。
【図１２】本発明で用いられるディスク基板の更に他の実施形態におけるマイクロキャピラリー部を示す説明図である。
【図１３】同ディスク基板において試料分離用キャピラリー２１の途中にゲルと水の界面を形成する状態を示す説明図である。
【図１４】本発明の試料分離装置の他の実施形態を示す概略構成図である。
【図１５】実施例１の方法によりＤＮＡ断片を分離、検出した結果を示す図表である。
【図１６】比較例１の方法によりＤＮＡ断片を分離、検出した結果を示す図表である。
【図１７】実施例１、比較例１、２の方法によりＤＮＡ断片を分離、検出した場合の泳動時間とＤＮＡ分子の大きさとの関係を示す図表である。
【図１８】実施例３と比較例３の方法でＤＮＡ断片を分離、検出した結果を示す図表である。
【符号の説明】
１ ディスク基板
１１ａ 上基板
１１ｂ 下基板
１２ 中心穴
１３ ディスク保持部
２１ マイクロキャピラリー
２２ 試料注入口
２３ ゲルレシーバー
２４ ゲルリザーバー
２５，２６ 電気泳動用電極
２５ａ、２６ａ 配線
２８，２７ 環状電極
３１ 溝
３２ ゲル注入口兼空気孔
３３ａ、３３ｂ、３３ｃ、３３ｄ ビア
５１ レーザー光源
５２ マルチレンズ
５３ ビームスプリッタ
５４ コリメータ
５５ 対物レンズ
５６ 集光レンズ
５７ 光検出素子
５８ 増幅回路
５９ サーボ・信号処理ＬＳＩ
６０ レーザ駆動回路
６１ ＣＣＤカメラ
７０ 基板支持具
７１ 電極端子
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、生化学、医科薬学に関連する生体関連高分子物質や薬剤等の分離検出に用いられる試料分離装置に関し、特にキャピラリー内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命科学の分野ではヒトを始めとする様々な生物のゲノム（全遺伝子情報）の解読が急ピッチで進んでおり、その解読結果により新しい動植物品種の品種改良が期待されている。
【０００３】
また、単一生物種の中でも、その多様性を反映して個体によってそのゲノムの塩基配列がわずかに異なっていることが知られており（このような多様性はゲノム多型又は単に多型と称されている。）、例えば、ヒトにおいては、個人によって塩基配列の異なる確率は０．１％程度とされている。これは１０００塩基毎に１ヶ所で多型が見られることを意味しており、ヒトゲノム全体（約３０億塩基）の中で３００万塩基ほどに現れることになる。
【０００４】
したがって、個々のヒトの遺伝子情報を解析することによって、これまでの対症療法の域を出ない医療技術を超えた、各自の遺伝情報に基づいた最も適切な治療・投薬を施す、いわゆるテーラーメード医療の実現が可能になり、投薬や治療の無駄をなくしつつ、極めて効果的な病気予防と投薬と治療が実現できると期待されている。例えば、１塩基だけが異なる１塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、遺伝子の発現量に影響を与えたり、アミノ酸変異を起こす場合があることから、膨大な塩基配列の中からＳＮＰを検出・解析することにより、個人にあった治療や薬がわかり、テーラーメード医療の確立につながると期待されている。
【０００５】
一方、ヒトゲノムのシークエンシングの技術発展の歴史は塩基解読の絶対量増大の歴史でもある。すなわち、７０年代には世界中で年間１００塩基以下しか解読できなかったにもかかわらず、わずか３０年間に、サンガー法、キャピラリーアレイ電気泳動法等が開発され、世界中で年間ギガ（Ｇ＝１０９）塩基のシークエンシングが可能になった。特にキャピラリー電気泳動法は、ＤＮＡ解析を高速かつ高感度、高精度で行える解析法であり、しかも測定は簡便で複数の試料の同時解析が可能で自動化が容易であるという利点を有している。
【０００６】
キャピラリー電気泳動法を利用した装置として、下記特許文献１には、蛍光標識された試料が泳動する泳動媒体を含む複数のキャピラリーと、前記複数のキャピラリーの前記試料の泳動方向の端部を、間隔をおいて直線上に配置して保持するキャピラリー保持手段と、前記端部がその内部に配置される光学セルと、前記端部の少なくとも近傍及び前記端部の下部にシースフローを形成するために、前記光学セルの内部にシース液を導入する手段と、前記光学セルから前記シース液を排出する排出口と、前記試料から蛍光を励起する励起光を、前記末端の下部で前記直線にほぼ平行に照射する手段と、前記蛍光を検出する手段とを有することを特徴とする電気泳動装置が開示されている。また、下記特許文献２，３，４にも同様な方式の電気泳動装置が開示されている。
【０００７】
更に、下記特許文献５には、第１の平坦な二次元の面とそれに向かい合う第２の平坦な二次元の面を持つ基板を含み、第１面がその中に埋め込まれる複数のマイクロチャネルと検体入力手段を含み、検体入力手段とマイクロチャネルが接続され、流体接触し、プラットホームの第１の平坦な二次元の面に向かい合う第２の平坦な二次元の面が、プラットホームの回転の速度、期間、又は方向を制御するための電磁的に読取り可能な命令セットで符号化されるマイクロシステム・プラットホームと、回転手段がマイクロシステム・プラットホームに機能的に作用するように連結され、それと回転接触する、基部、回転手段、電源及びユーザ・インタフェースを含む微小操作装置と操作制御手段と、の組み合わせである向心的に動かされる流体微小操作機器であって、プラットホームのマイクロチャネル内の多量の流体が、流体をマイクロチャネルを通して移動させるのに十分な時間の間、及び回転速度でプラットホームの回転運動から生じる向心力によって前記マイクロチャネルを通して移動される、向心的に動かされる流体微小操作機器が開示され、マイクロシステム・プラットホームとして、約１ｃｍから２５ｃｍの半径のディスクが用いられている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平７−３１８４９４号公報
【特許文献２】
特開平６−１３８０３７号公報
【特許文献３】
特開平１０−１７０４８０号公報
【特許文献４】
特開２００２−２５７７８６号公報
【特許文献５】
特表２００２−５０３３３１号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
キャピラリー電気泳動法においては、流路や電極など周辺の微細化が進んでいるが、試料の泳動距離は、それを短くすると、試料の分離能が十分に得られなくなってしまうため、ある程度の長さが必要とされる。すなわち、分子量の近いもの同士を分離するためには、原理的により長い距離を泳動しなければならない。
【００１０】
上記特許文献１〜４の装置では、蛍光標識された試料が泳動する泳動媒体を含む複数のキャピラリーの前記試料の泳動方向の端部を、直線状に配列して光学セル内に配置し、光学セルの内部にシース液を流しながら、前記キャピラリーの端部から流出する試料に蛍光を励起する励起光を照射し、それによって発光する蛍光を検出する方法を採用しているが、キャピラリー中のゲルを固定した状態で電気泳動を行っており、試料の分離能を十分に得るためには、キャピラリーの長さを十分にとる必要があり、キャピラリーや装置の小型化には限度があった。
【００１１】
また、上記特許文献５の装置では、ディスクの回転を利用してキャピラリー内にゲルを充填しているが、電気泳動を行う際には、ディスクの回転を停止させている。このため、試料の分離能を十分に得るためには、キャピラリーの長さを十分にとる必要があり、ディスクを大きくしなければならない。
【００１２】
そして、キャピラリーの長さが長いということは、電気泳動に要する時間もそれだけ長くかかることを意味し、分析効率を向上させるネックとなる。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、キャピラリーの長さが短くても試料の分離能が高く、しかも電気泳動時間を短くすることができる試料分離装置を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の試料分離装置は、キャピラリー内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置において、前記ゲル状の媒体を一の方向に送液するゲル送液手段と、前記ゲル送液方向と対向する方向に前記試料を電気泳動させる電気泳動手段とを具備することを特徴とする。
【００１５】
本発明によれば、ゲル状の媒体を一の方向に送液すると共に、ゲル送液方向と対向する方向に試料を電気泳動させることにより、ゲルに対して試料が相対的に泳動する距離を長くすることができる。その結果、ゲルを固定した状態で同じ長さのキャピラリーを用いて電気泳動を行う場合に比べて、試料の分離能力を高めることができる。また、ゲルを固定した状態でキャピラリーの長さを長くして同等の分離能力を付与する場合と比べて、電気泳動時間を短くすることができると共に、印加電圧を低減することができる。
【００１６】
本発明の試料分離装置の好ましい態様においては、前記試料は負に帯電した試料であり、前記電気泳動手段は前記キャピラリー上の一の位置に正の電荷を印加すると共に、他の位置に負の電荷を印加することで、前記試料の泳動方向を決定し、前記ゲル送液手段は前記正の電荷が印加される位置から前記負の電荷が印加される位置に向けて前記ゲル状の媒体を送液する。
【００１７】
これによれば、例えば、ＤＮＡ断片、界面活性剤を用いて負に帯電させた蛋白質などの負に帯電した試料を効率よく分離することができる。
【００１８】
本発明の試料分離装置の別の好ましい態様においては、前記試料は正に帯電した試料であり、前記電気泳動手段は前記キャピラリー上の一の位置に正の電荷を印加すると共に、他の位置に負の電荷を印加することで、前記試料の泳動方向を決定し、前記ゲル送液手段は前記負の電荷が印加される位置から前記正の電荷が印加される位置に向けて前記ゲル状の媒体を送液する。
【００１９】
これによれば、例えば、蛋白質、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸やその誘導体のポリマー、低分子の薬品成分などの正に帯電した試料を効率よく分離することができる。
【００２０】
本発明の試料分離装置の更に好ましい態様によれば、前記キャピラリーは円盤状ディスク基板の内径から外径に向かって延びる遠心送液領域を有し、前記ゲル送液手段は前記ディスク基板の回転と前記遠心送液領域を利用して前記キャピラリー内にゲルの流れを形成し、前記電気泳動手段は前記ゲルの流れと逆行する方向に前記試料を泳動させる。
【００２１】
これによれば、ディスク基板の回転によってキャピラリーの遠心送液領域にゲルの流れを形成し、電気泳動手段によってゲルの流れと逆行する方向に試料を泳動させることにより、キャピラリーの長さが短くても試料の分離能を高めることができ、泳動時間も比較的短くすることができる。また、ディスク基板を回転するだけでゲルの流れを形成できるので、装置が簡略化されると共に、分析操作も容易となる。
【００２２】
本発明の試料分離装置の更に好ましい態様によれば、前記キャピラリーと交差する位置に連通接続された流路をさらに具備し、該流路に第２の媒体を送液させることで、前記ゲル状の媒体と該第２の媒体との混合界面を前記キャピラリー中に形成する。
【００２３】
これによれば、試料を注入したときに、試料がゲル状の媒体と第２の媒体との混合界面に移動して濃縮されるので、その状態で電気泳動を開始することによって、分離された試料のシグナル（検出バンド）の幅を変化させずに、その検出強度を高めることができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明において、試料とは、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ・ＲＮＡ断片、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、糖鎖、医薬成分等の生化学に関連した物質が好ましく適用される。
【００２５】
また、試料の電気泳動を行うために、マイクロキャピラリー内に注入するゲルとしては、例えばメチルセルロース（ＭＣ）、ハイドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ハイドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ハイドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等のセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリアクリルアミド、アガロース、アクリルアミド誘導体のポリマー等を含む緩衝液が好ましく用いられる。緩衝液としては、１０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液をリン酸、酢酸、ホウ酸等でｐＨ ８〜９に調整し、またＥＤＴＡ等を１〜１０ｍＭの濃度で加え試料成分を安定に保持できるよう調整したものなどが好ましく用いられる。
【００２６】
更に、ゲル送液手段としては、マイクロシリンジや圧電ポンプ等、基板の外部あるいは内部に形成された送液装置を用いることができる。また、基板の回転によって生じる遠心力を利用してゲルの貯蔵溝からキャピラリー内へゲルを送液する手段を採用することもできる。
【００２７】
本発明においては、ゲル送液手段によってゲル状の媒体を一の方向に送液すると共に、電気泳動手段によってゲルの送液方向と対向する方向に試料を電気泳動させることにより、ゲルに対して試料が相対的に泳動する距離を長くして、試料の分離能力を高めると共に、電気泳動時間を短くし、印加電圧を低減するようにしている。
【００２８】
試料が負に帯電した試料である場合には、ゲル送液手段は正の電荷が印加される位置から負の電荷が印加される位置に向けてゲル状の媒体を送液する。負に帯電した試料としては、例えば、ＤＮＡ断片、界面活性剤を用いて負に帯電させた蛋白質などの負に帯電した試料などが挙げられる。
【００２９】
試料が正に帯電した試料である場合には、ゲル送液手段は負の電荷が印加される位置から正の電荷が印加される位置に向けてゲル状の媒体を送液する。正に帯電した試料としては、例えば、蛋白質、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸やその誘導体のポリマー、低分子の薬品成分などが挙げられる。
【００３０】
試料分離用キャビラリーと交差する別のキャピラリーを設け、この別のキャピラリーから、送液装置や基板の回転によって生じる遠心力によって、試料分離用キャピラリーに、濃度の薄いゲルや、緩衝液や、純水などからなる第２の媒体（以下、濃縮用溶液という）を送液することによって、ゲル濃／淡界面もしくは水層／ゲル層界面を試料分離用キャピラリー内に形成することができる。
【００３１】
これによれば、試料を注入したときに、試料が上記ゲル濃／淡界面もしくは水層／ゲル層界面に移動して濃縮されるので、その状態で電気泳動を開始することによって、分離された試料のシグナル（検出バンド）の幅を変化させずに、その検出強度を高めることができる。
【００３２】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明する。
図１〜９には、本発明の試料分離装置の一実施形態が示されている。図１はディスク基板の平面図、図２は同ディスク基板の部分断面図、図３は同ディスク基板のマイクロキャピラリー部を示す説明図、図４は同ディスク基板の上基板を示す底面図、図５は同ディスク基板の下基板を示す平面図、図６は同ディスク基板の下基板を示す底面図、図７は電力供給機構の一例を示す説明図、図８は電力供給機構の他の例を示す説明図、図９は試料分離装置の全体構成を示す説明図である。
【００３３】
図１、２に示すように、このディスク基板１は、上基板１１ａと、下基板１１ｂとを接合して構成されている。下基板１１ｂは、ディスク基板１を保持するための中心穴１２を有している。上基板１１ａは、上記中心穴１２よりも大きな内径の中心穴１２ａを有し、この中心穴１２ａ内周に露出する下基板１１ｂ上面には、保持部１３が形成されている。
【００３４】
図４を併せて参照すると、上基板１１ａの底面には、マイクロキャピラリー２１を形成するための溝３１が形成されている。この溝３１は、下基板１１ｂで覆われて上記マイクロキャピラリー２１を構成する。溝３１の両端部は、拡径された円形の凹部をなし、その一部にゲル注入口兼空気孔３２が形成されている。上記円形の凹部は下基板１１ｂで覆われて、一端がゲルリザーバー２４、他端がゲルレシーバー２３を構成している。更に、マイクロキャピラリー２１のゲルレシーバー２３の近傍には、試料注入口２２が形成されている。
【００３５】
こうして構成されるマイクロキャピラリー２２は、基板１１ａ、１１ｂに対して、その中心から外周方向に向けて放射状に複数個形成されている。ここで放射状とは、図示する実施形態に示されるように半径方向外方に直線状に向かう形状だけでなく、半径方向に対して傾斜した角度で外方に向かう形状や、螺旋状をなして外方に向かう形状なども含む意味である。
【００３６】
そして、ゲルリザーバー２４のゲル注入口兼空気孔３２からゲルを注入し、ディスク基板１を回転させると、遠心力によってゲルリザーバー２４に貯えられたゲルが、マイクロキャピラリー２２を通ってゲルレシーバー２３へ流れ込むようになっている。
【００３７】
また、図５に示すように、下基板１１ｂの上面には、マイクロキャピラリー２１の両端部に接する環状の電気泳動用電極２５、２６が形成され、それらが下基板１１ｂを貫通しているビア３３ａ、３３ｂを介して前記下基板１１ｂの裏面に導出され、そこから更に配線２５ａ、２６ａを介してビア３３ｃ、３３ｄに連結されている。更に、ビア３３ｃ、３３ｄは、再び下基板１１ｂを貫通して、前記保持部１３上に形成された環状電極２８，２７に接続されている。環状電極２８，２７は、下基板１１ｂを上から押さえる後述する基板支持具７０（図７参照）によって、電極端子７１に当接するようになっている。そして、前記試料注入口２２から試料を注入し、前記上記電気泳動用電極２５、２６間に電圧を印加すると、試料が前記マイクロキャピラリー２２内のゲル中を電気泳動するようになっている。
【００３８】
なお、前記上下の基板１１ａ、１１ｂの材料は、耐熱性、耐薬品性に優れ、かつ微細な構造を形成できる加工性を保持するものが好ましく、例えばポリカーボネート樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂等の有機樹脂、ガラス、石英、シリコンなどが好ましい。また、基板上で用いられる薬品、試料成分の性質に応じ、前記マイクロキャピラリーを形成後に適当な表面処理を施すことが好ましい。例えば、マイクロキャピラリー形成後、該基板１１ａ、１１ｂ表面を薄いポリエチレン、ポリプロピレン等でコートすることによってＤＮＡ、蛋白質等が該基板１１ａ、１１ｂへ表面吸着することを抑制し、かつエタノール等有機溶媒への耐性を向上させることが好ましい。
【００３９】
また、前記マイクロキャピラリー２１は、該ディスク基板１の回転による遠心力によって試料や緩衝液を滞り無く移送するために、マイクロキャピラリー２１全体にわたって均一な深さを有することが好ましく、また経路の幅も均一であることが好ましい。具体的には幅：１００〜３００μｍ、深さ：１００〜３００μｍが好ましく、幅：１５０〜２００μｍ、深さ：１５０〜２００μｍがより好ましい。
【００４０】
更に、ゲルリザーバー２４及びゲルレシーバー２３の大きさと深さは、該ディスクの回転の遠心力によって試料や緩衝液を滞り無く移送するために、マイクロキャピラリーと同じ均一な深さを有することが好ましく、またゲルを保持あるいは流入させるため１〜４μｌの容積を有することが好ましい。より具体的には、深さ：１５０〜２００μｍ、半径：１．５ｍｍ〜３ｍｍの円筒形が好ましい。
【００４１】
次に、前記下基板１ｂの保持部１３に形成された環状電極２８，２７に電力を供給する機構について説明する。
【００４２】
図７に示すように、下基板１ｂの保持部１３を上から押さえる基板支持具７０には、該環状電極２７、２８にそれぞれ接続される複数の支持具側電極端子７１が形成されており、基板支持具７０が下基板１ｂを押さえる際に、環状電極２７、２８と支持具側電極端子７１とが接触することによって電気的に接続される。更に、支持具側電極端子７１は、基板支持具７０の内部もしくは外部を通って支持軸７２の外周あるいは内周に形成された支持具側環状電極７３へと配線されている。支持具側電極端子７１の一つ一つはそれぞれ独立して支持具側環状電極７３の一つへと接続し、支持具側環状電極７３はブラシ電極７５によって図示しない外部回路へと接続されている。
【００４３】
したがって、図７に示すように、下基板１ｂと基板支持具７０が接続された状態では、電気泳動用電極２５、２６からの配線が、環状電極２７、２８、支持具側電極端子７１を経て支持具側環状電極７３へと接続され、更に支持具側環状電極７３からブラシ電極７５を経て外部回路へと接続されているため、ディスク基板１を回転させたままでも電気泳動用電極２５、２６等に電力を供給することができる。
【００４４】
また、図８にはディスク基板１を回転させたまま電気泳動用電極２５、２６等に電力を供給するための別形態が示されている。図７と同様、前記マイクロキャピラリー２１の両端部の電気泳動用電極２５，２６等が前記下基板１ｂの保持部１３に形成された電力供給のための環状電極２７，２８等へと配線によって引き出されている。なお、この例では、環状電極が合計４本同心円状に形成されており、４つのラインに電極が供給されるようになっている。
【００４５】
そして、基板１１ｂの保持部１３上に形成された該環状電極２７、２８は、図７に示すような支持具７０を介した接続ではなく、直接ブラシ電極７５を経て図示しない外部回路へと接続されている。なお、該環状電極２７、２８は該基板１１の中央部に形成することによって回転半径を小さくし、環状電極２７、２８の回転速度をなるべく低くすることが好ましい。
【００４６】
次に、図９を参照して本発明の試料分離装置の全体構成について説明する。
本発明の試料分離装置は、上記のディスク基板１を用いて試料成分の分離、検出を行うものであり、基板１を支持して回転させる図示しないターンテーブルと、この基板１にレーザー光を照射して、その反射光を取り出し、検出を行う光検出手段５０を有している。
【００４７】
光検出手段５０は、基板１に対して、半径方向に移動可能に取付けられている。この光検出手段５０は、レーザー駆動回路６０によってレーザー光を射出するレーザー光源５１と、このレーザー光を平行ビームとするマルチレンズ５２と、レーザー射出光を通過させ、反射光を取り出すためのビームスプリッタ５３と、コリメータ５４と、対物レンズ５５と、ビームスプリッタ５３で分岐された反射光を集光するする集光レンズ５６と、集光レンズ５６で集光された反射光を受光する光検出素子５７と、光検出素子５７で検出された光信号を増幅させる増幅回路５８と、この増幅回路を通して入力された光信号を処理するサーボ・信号処理ＬＳＩ５９とから構成されている。
【００４８】
また、基板１の上下面の所定位置を撮像するように指向されたＣＣＤ（電荷結合型）カメラ６１が設置されている。
【００４９】
したがって、レーザー光源５１から射出されたレーザー光は、マルチレンズ５２、ビームスプリッタ５３、コリメータ５４、及び対物レンズ５５を通して、基板１の所定位置に照射される。このレーザー光は、例えば、マイクロキャピラリー２１で分離された成分を発光させる光源として利用される。
【００５０】
この試料分離装置により試料成分を分離する際には、基板１を回転してゲルリザーバー２４からゲルレシーバー２３に向けてマイクロキャピラリー２１にゲルを送液しながら、前記ゲルの送液方向とは反対方向に試料成分が泳動するように電極２５，２６間に電圧を印加する。この状態で試料注入口２２から試料を添加し、試料成分を分離させた後、該マイクロキャピラリー２１にレーザー光を照射して、レーザー光によって発光したパターンをＣＣＤカメラ６１で撮像し、その発光パターンを図示しないコンピューターによって画像解析することによって成分の検出を行うことができる。
【００５１】
次に、図１０，１１を参照して、本発明で用いられるディスク基板の他の実施形態について説明する。なお、前記図１〜９に示した実施形態と実質的に同一部分には同符号を付してその説明を省略することにする。
【００５２】
この実施形態では、前記マイクロキャピラリー２１と所定の角度で交差する試料輸送用マイクロキャピラリー２１’が形成されている。その交差部分は、マイクロキャピラリー２１の外周側端部に近い部分に設けられている。試料輸送用マイクロキャピラリー２１’は、その一端にゲルリザーバー２４’が形成されており、他端には及びゲルレシーバー２３’が形成されている。そして、基板１１ａ、１１ｂの回転に伴う遠心力によって、ゲルリザーバー２４’から試料移送用キャピラリー２１’にゲルが注入でき、かつ、試料移送用キャピラリー２１’から押し出されたゲルはゲルレシーバー２３’に流れ込むことができるようになっている。
【００５３】
また、試料輸送用マイクロキャピラリー２１’の両端部には、それらに電圧を印加するための電極２５’、２６’が形成され、これらの電極２５’、２６’は、ビア３３ｅ、３３ｆを介して下基板１１ｂの裏面に導出され、更に配線２５ａ’、２６ａ’を介して、下基板１１ｂの保持部１３上に形成された環状電極２７’２８’に接続されている。
【００５４】
更に、前記マイクロキャピラリー２１の両端部には、それらに電圧を印加するための電極２５，２６が形成され、これらの電極２５，２６は、前記実施形態と同様に、ビア３３ａ、３３ｂを介して下基板１１ｂの裏面側に同移出され、更に配線２５ａ、２６ａを介して、下基板１１ｂの保持部１３上に形成された環状電極２７，２８に接続されている。したがって、この実施形態の場合は、保持部１３上の環状電極が４本形成されている。
【００５５】
この実施形態においては、試料注入口２２が試料移送用キャピラリー２１’のゲルリザーバー２４’近傍に形成されている。そして、試料注入口２２から試料移送用キャピラリー２１’に注入された試料は、該試料移送用キャピラリー２１’に印加される電圧によって該試料が有する電荷に従ってゲル中を泳動することができる。
【００５６】
このようにして、試料移送用キャピラリー２１’によってマイクロキャピラリー２１へ試料を移送し、所定の時間後に電圧をマイクロキャピラリー２１の両端で印加することによって、該試料移送用キャピラリー２１’に流れていた試料を切り取り、マイクロキャピラリー２１で電気泳動することができる。また、この場合も、前述の実施形態と同様、基板１を回転させることによって生じる遠心力で、ゲルリザーバー２４からゲルレシーバー２３に向けてゲルを送液しながら電気泳動を行うことができ、基板１の回転数に従って分離能を制御することができる。
【００５７】
次に、図１２、１３を参照して、本発明で用いられるディスク基板の他の実施形態について説明する。
【００５８】
図１２に示すように、この実施形態では、水バンド形成用キャピラリー２９が、試料分離用キャピラリー２１と試料移送用キャピラリー２１’の交点から上流側に所定の角度で交差するように形成されており、前記基板１の回転によって生じる遠心力によって、水バンド形成用キャピラリー２９内に充填された水を移送し、試料分離用キャピラリー２１の途中で、ゲルと水の界面を形成することができるようになっている。また、前記実施形態と同様に、基板１の回転による遠心力によってゲルを送液出来るように、前記試料分離用キャピラリー２１は前記基板上に放射状に複数個形成されている。
【００５９】
また、図１３に示すように、試料分離用キャピラリー２１の途中にゲルと水の界面を形成するにあたっては、前記基板の回転によって生じる遠心力Ｃ１、Ｃ２で試料分離用キャピラリー２１中のゲルおよび水バンド形成用キャピラリー２９の水が下流へと送液されることによって、ゲル・水界面の平坦な水バンドの形成が妨げられてしまうため、前記電極２６以外の電極２５、２５’、２６’に正の電圧を印加して、ゲルリザーバー２４へ向かう電気浸透流Ｐを生じさせ、基板の回転によって生じる遠心力によるゲルの流れを相殺することによって、ゲル・水界面Ｓを平坦に形成することが好ましい。
【００６０】
更に、該水バンド形成用キャピラリー２９の端部Ｅ１は、前記ゲルリザーバー２４の端部Ｅ２よりも前記基板における内周側にあり、前記試料分離用キャピラリー２１よりも該水バンド形成用キャピラリー２９の方が基板の回転によって生じる圧力が高くなって、ゲルが該水バンド形成用キャピラリー２９に逆流することを防ぐようになっていることが好ましい。
【００６１】
図１４には、本発明の試料分離装置の他の実施形態を示す概略構成図が示されている。
【００６２】
図１４において、基板１１０は、図示しない上記テーブルによって支持される。この基板１１０に対して、ｘ−ｙ方向に移動可能に、図示しない光検出手段が設置されている。該光検出手段の構成は、前述した試料分離装置の実施形態と同様である。また、マイクロシリンジ等の送液手段６３によって送液管６２を通って、基板１１０に形成された図示しないマイクロキャピラリーにゲルを送液できるようになっている。更に、マイクロキャピラリーには、前記実施形態と同様に電圧を印加して試料成分を電気泳動できるようになっている。
【００６３】
したがって、送液手段６３によってマイクロキャピラリーにゲルを送液しながら、マイクロキャピラリーに電圧を印加して、試料を前記ゲルの送液方向とは反対方向に電気泳動させることにより、試料を分離することができる。そして、該マイクロキャピラリーにレーザー光を照射して、レーザー光によって発光したパターンをＣＣＤカメラで撮像し、その発光パターンを図示しないコンピューターによって画像解析することによって成分の検出を行うことができる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。なお、以下の実施例において使用したディスクは、予め基板の所定領域に機械加工によりキャピラリー等を形成して用いた。
【００６５】
実施例１
図１０、１１に示す構造の基板（基本構造は図１〜６に示した基板と同じなので、図１〜６に記載された符号を援用して説明する）を用いてＤＮＡ断片を分離、検出した。
【００６６】
ポリカーボネート製の基板は、所定の領域にキャピラリーを形成するための溝３１を形成した上基板１１ａと、該上基板１１ａと同じ形状で溝を含まない下基板１１ｂとを貼り合わせることによって形成した。
【００６７】
図１１に示すように試料移送用キャピラリー２１’（長さ３．５ｍｍ、幅１００μｍ、深さ１５０μｍ）と、試料分離用キャピラリー２１（長さ２０．５ｍｍ、幅１００μｍ、深さ１５０μｍ）は、９０度の角度で交差し、試料分離用キャピラリー２１のディスク内径側端部にゲルリザーバー２４、外径側端部にゲルレシーバー２３を形成した。また、試料移送用キャピラリー２１’の両端には、ゲルリザーバー２４’及びゲルレシーバー２３’を形成した。また、上基板１１ａには、ゲルリザーバー２４’の近傍に試料注入口２２を形成した。また、前記各リザーバー及びレシーバーに相当する位置にはゲル注入口兼空気孔３２を形成した。
【００６８】
また、下基板１１ｂの表面には図１１に示すような配線を白金スパッタによって形成した。そして、図２に示すように、溝を形成した上基板１１ａと、配線を形成した下基板１１ｂとを、紫外線硬化接着剤を用いて接着した。
【００６９】
本実施例中において使用した検体、及び試薬（以下において製造元の記載がない試料は関東化学株式会社製）を以下に示した。
【００７０】
試料：２０ｂｐラダーＤＮＡ（２ｎｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 製）
泳動用ゲル：０．７％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． 製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．製）
キャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記の実験条件１にて電気泳動を行った。
【００７１】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色し、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。得られた結果を図１５に示した。
【００７２】
＜実験条件１＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
分離時
５５０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００７３】
なお、試料の泳動速度に対して最適な送液速度を得るため、下記のハーゲン・ポアズイユの式の変形式（１）に従って送液速度を最適化した回転数で回転させた。
【００７４】
【数１】
即ち、本実施例における各パラメータを代入することによって送液速度と回転数の関係式（２）を得る。
【００７６】
【数２】
５５０ｒｐｍの回転数は、毎秒９．２回転であり、従ってこのときゲルの送液速度は下記式で求められる。
【００７８】
【数３】
比較例１
ゲルを送液し試料の泳動速度を制御することによって分離能が向上できることを明確に示すため、実施例１と同条件で基板回転をかけないことを唯一の条件変更とし、下記実験条件２によって電気泳動を行った場合の実験結果を、図１６に示した。
【００８０】
＜実験条件２＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
分離時
０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００８１】
図１５と図１６比較すると、図１５は検出された各ピークの時間間隔が広く、また５００ｂｐ以上の鎖長のＤＮＡも分離することができており、従って実施例１に記載した条件で試料を前記分離用キャピラリー２１で電気泳動させながら基板１を回転させてゲルを送液することによってゲルの送液速度分だけ試料の泳動速度が減速され、速度に差がある成分同士の速度の比を大きくすることによって、分離能を向上することが可能であることが実施例１と比較例１の比較によって明らかとなった。
【００８２】
比較例２
ゲルを送液し試料の泳動速度を制御することによって、キャピラリー自体の長さを長くした場合と同等の分離能を得ながら泳動にかかる時間はキャピラリーを長くした場合よりも短縮することができ、さらに印加電圧はキャピラリーを長くした場合よりも小さくできることを明確に示すため、分離用キャピラリーの長さを３７．５ｍｍに変え、それに伴って印加電圧を下記の通りに変更し、かつ電気泳動中に遠心力を印加しないで、下記実験条件３によって電気泳動を行った場合の実験結果を図１７に示した。図１７において縦軸は時間（単位：秒）であり、横軸はＤＮＡ分子の大きさ（単位：ｂｐ）である。
【００８３】
＜実験条件３＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：５００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
分離時
０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００８４】
図１７中の系列２（図１５のデータをプロットしたもの）、系列３（比較例２の実験条件３で行った実験結果をプロットしたもの）を比較すると、系列２は、５００ｂｐのＤＮＡが検出されるまでにかかる時間は１５０秒であるのに対し、系列３は同じく５００ｂｐのＤＮＡが検出されるまでに２１０秒かかった。系列２及び系列３は、いずれも２０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡが検出される時間間隔が１００秒程度で、両者の分離能が同程度であることを示している。
【００８５】
更に、本比較例２では、実験条件１や実験条件２で用いた１５ｍｍの分離用キャピラリーと同じ電界を印加するために印加電圧が５００Ｖとなっており、分離用キャピラリーの長さを長くすることによって、印加電圧が大幅に上昇している。
【００８６】
図１７では、系列１（図１６のデータをプロットしたもの）も併せて示してあり、２０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡが検出される時間間隔が４０秒程しかなく、系列２と比較すると分離能の面で劣っていることを示している。すなわち、試料の泳動分離時、分離用キャピラリーに遠心力を印加しゲルを送液してゲルの送液速度分だけ試料の泳動速度を減速し、速度に差がある成分同士の速度の比を大きくすることによって、キャピラリー自体の長さを長くした場合と同等の分離能を得ながら泳動にかかる時間はキャピラリーを長くした場合よりも短縮することができ、さらに印加電圧はキャピラリーを長くした場合よりも小さくできることが、本比較例を持って明確に示された。
【００８７】
実施例２
本実施例では、実施例１と同じ基板を用い、ゲルの送液に基板の回転ではなく、マイクロシリンジによる送液を用いた。それ以外の条件は全て同じとした。
【００８８】
図２に示したゲルリザーバー２４に形成されたゲル注入口兼空気孔３２に図１３に示したマイクロシリンジ６３からの送液管６２を接続し、ゲルを送液した。
【００８９】
本実施例中において使用した検体、及び試薬を以下に示した。
試料：２０ｂｐラダーＤＮＡ（２ｎｇ／μｌ）
泳動用ゲル：０．７％メチルセルロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３
【００９０】
キャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記実験条件４にて電気泳動を行った。
【００９１】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色され、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。
【００９２】
＜実験条件４＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（マイクロシリンジによる送液）
試料移送時
０ ｍｍ／ｓ
分離時
０．０９ ｍｍ／ｓ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【００９３】
測定の結果、図１５とほぼ同様の結果が得られた。従って、ゲルの送液を行わなかった比較例１の結果や、キャピラリーの長さを長くした比較例２の結果と比較することによって、ゲルの送液手段によらずマイクロシリンジによる送液も遠心力による送液と同様、ゲルの送液速度分だけ試料の泳動速度を減速し、速度に差がある成分同士の速度の比を大きくすることができ、キャピラリー自体の長さを長くした場合と同等の分離能を得ながら泳動にかかる時間はキャピラリーを長くした場合よりも短縮することができ、さらに印加電圧はキャピラリーを長くした場合よりも小さくできることが、本実施例を持って明確に示された。
【００９４】
実施例３
以下に、キャピラリー中に水の層を形成して、水／ゲル界面で試料を濃縮する効果が得られ、かつその水の層が基板の回転による遠心力を利用して形成することができることを示す。
【００９５】
図１２に示す構造の基板を用いてＤＮＡ断片を分離、検出した。基板１上に各キャピラリー等を形成する手段は実施例１と同様であり、本実施例における構造上の変更点は、試料分離用キャピラリー２１の途中の図１２に示すような位置、すなわち試料分離用キャピラリー２１と試料移送用キャピラリー２１’の交差点から基板中央方向側、かつゲルリザーバー２４よりも基板の中心に近い位置までに水リザーバー２９（経路の長さ１８ｍｍ、幅７０μｍ、深さ３０μｍ）が形成されていることである。
【００９６】
本実施例中において使用した検体、及び試薬を以下に示した。
試料：２ μｇ／ｍｌ ｆｘ１７４−Ｈａｅ ＩＩＩ（２ｎｇ／μｌ）
泳動用ゲル：０．３％メチルセルロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３
【００９７】
水リザーバーの注入口より純水を、またキャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記の実験条件５にて電気泳動を行った。
【００９８】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色され、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。得られた結果を図１８（ａ）に示した。
【００９９】
＜実験条件５＞
（電圧印加）
水バンド形成時
２３’・２４’・２３：１００Ｖ
２４：ｇｒｏｕｎｄ
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
水バンドにおいて試料濃縮時
正方向
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
逆方向
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：２００Ｖ
２４：ｇｒｏｕｎｄ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
水バンド形成時
３００ ｒｐｍ
試料移送時
０ ｒｐｍ
水バンドにおいて試料濃縮時
０ ｒｐｍ
分離時
５５０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【０１００】
比較例３
試料の泳動路に水バンドを形成し、ゲル／水の界面で試料を濃縮することによって感度と分離能の向上を行うことが出来ることを明確に示すため、実施例２のマイクロキャピラリーと同一の構造で、水バンドの形成過程及びゲル／水界面での濃縮過程を行わず、それ以外の条件は実施例２と全く同じ下記実験条件６により、試料の分離・検出を行った。
【０１０１】
本比較例中において使用した検体、及び試薬を以下に示した。
試料：２ μｇ／ｍｌ ｆｘ１７４−Ｈａｅ ＩＩＩ（２ｎｇ／μｌ）
泳動用ゲル：０．３％メチルセルロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．１％ ＴＯＴＯ−３
キャピラリーの各注入口より泳動用ゲルを充填した後、前記試料注入口２２より前記試料をマイクロピペットで１μｌ注入し、下記の実験条件６にて電気泳動を行った。
【０１０２】
ＤＮＡは緩衝液に含まれるＴＯＴＯ−３によって染色され、試料分離用キャピラリー２４上の所定の位置でレーザー光により励起し、蛍光をＣＣＤカメラ６１によって検出した。得られた結果を図１８（ｂ）に示した。
【０１０３】
＜実験条件６＞
（電圧印加）
試料移送時
２３’：８０Ｖ
２３・２４・２４’：ｇｒｏｕｎｄ
水バンド形成部通過時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
分離時
２３’・２４’：４０Ｖ
２３：ｇｒｏｕｎｄ
２４：２００Ｖ
（基板回転）
試料移送時
０ ｒｐｍ
水バンド形成部通過時
０ ｒｐｍ
分離時
５５０ ｒｐｍ
（検出）
レーザー：励起波長 ６３５ｎｍ 検出波長 ６８０ｎｍ
【０１０４】
実施例３において、水バンド形成時に実験条件５に示したような電圧印加を行うのは、電気浸透流の力を利用し、水バンド形成時に水とゲルが水バンド形成部よりも下流へ流れないようにするためである。試料がゲル／水界面に濃縮され、電界によって界面よりも上流へ泳動された後は、ゲルや水が基板回転による遠心力で基板の外側へ向かって流れるが試料の泳動には影響しない。
【０１０５】
また、比較例３において、水バンド形成部を試料が通過するまで基板回転を行わないのは、基板回転による遠心力で試料泳動用マイクロキャピラリー２１に水が流入することを防ぐためである。この操作は実施例３との比較を行うために行ったものであり、実施例３において水バンドを形成してゲル／水界面に試料を濃縮する際の試料の移動分に相当するだけの泳動を行ったものである。
【０１０６】
図１８（ａ）は実施例３における水バンド形成時、図１８（ｂ）は比較例３における水バンドを形成しなかった場合の電気泳動の結果である。図１８（ｂ）と比較して図１８（ａ）は明らかにシグナル強度が増大し、それにも関わらずシグナルの幅はほとんど変化していない。仮に図１８（ｂ）において試料濃度を高くしたとしても、シグナル強度は増大するが、それに伴いシグナルの幅も大きくなり、結果として分離能は低下することは自明である。また、図１８（ａ）では検出時間９０秒の前後にシグナルが２つ存在していることが非常に明らかであるが、図１８（ｂ）ではその存在は不確かである。
【０１０７】
以上のような観点で図１８（ａ）と図１８（ｂ）とを比較することによって、ゲル／水界面における濃縮効果によって感度と分離能が向上していることが示され、本発明は感度と分離能の向上に置いて好ましいゲル／水界面を基板の遠心力によって容易に形成することができることが示された。
【０１０８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ゲル状の媒体を一の方向に送液すると共に、ゲル送液方向と対向する方向に試料を電気泳動させることにより、ゲルに対して試料が相対的に泳動する距離を長くすることができる。その結果、ゲルを固定した状態で同じ長さのキャピラリーを用いて電気泳動を行う場合に比べて、試料の分離能力を高めることができる。また、ゲルを固定した状態でキャピラリーの長さを長くして同等の分離能力を付与する場合と比べて、電気泳動時間を短くすることができると共に、印加電圧を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試料分離装置に用いられるディスク基板の平面図である。
【図２】同ディスク基板の部分断面図である。
【図３】同ディスク基板のマイクロキャピラリー部を示す説明図である。
【図４】同ディスク基板の上基板を示す底面図である。
【図５】同ディスク基板の下基板を示す平面図である。
【図６】同ディスク基板の下基板を示す底面図である。
【図７】本発明の試料分離装置に用いられる電力供給機構の一例を示す説明図である。
【図８】電力供給機構の他の例を示す説明図である。
【図９】試料分離装置の全体構成を示す説明図である。
【図１０】本発明で用いられるディスク基板の他の実施形態を示す平面図である。
【図１１】同ディスク基板のマイクロキャピラリー部を示す説明図である。
【図１２】本発明で用いられるディスク基板の更に他の実施形態におけるマイクロキャピラリー部を示す説明図である。
【図１３】同ディスク基板において試料分離用キャピラリー２１の途中にゲルと水の界面を形成する状態を示す説明図である。
【図１４】本発明の試料分離装置の他の実施形態を示す概略構成図である。
【図１５】実施例１の方法によりＤＮＡ断片を分離、検出した結果を示す図表である。
【図１６】比較例１の方法によりＤＮＡ断片を分離、検出した結果を示す図表である。
【図１７】実施例１、比較例１、２の方法によりＤＮＡ断片を分離、検出した場合の泳動時間とＤＮＡ分子の大きさとの関係を示す図表である。
【図１８】実施例３と比較例３の方法でＤＮＡ断片を分離、検出した結果を示す図表である。
【符号の説明】
１ ディスク基板
１１ａ 上基板
１１ｂ 下基板
１２ 中心穴
１３ ディスク保持部
２１ マイクロキャピラリー
２２ 試料注入口
２３ ゲルレシーバー
２４ ゲルリザーバー
２５，２６ 電気泳動用電極
２５ａ、２６ａ 配線
２８，２７ 環状電極
３１ 溝
３２ ゲル注入口兼空気孔
３３ａ、３３ｂ、３３ｃ、３３ｄ ビア
５１ レーザー光源
５２ マルチレンズ
５３ ビームスプリッタ
５４ コリメータ
５５ 対物レンズ
５６ 集光レンズ
５７ 光検出素子
５８ 増幅回路
５９ サーボ・信号処理ＬＳＩ
６０ レーザ駆動回路
６１ ＣＣＤカメラ
７０ 基板支持具
７１ 電極端子
Claims (5)
- キャピラリー内にゲル状の媒体を充填し、該ゲル状の媒体中で検出対象試料を電気泳動させることにより該試料を固有の集合に分離する試料分離装置において、
前記ゲル状の媒体を一の方向に送液するゲル送液手段と、
前記ゲル送液方向と対向する方向に前記試料を電気泳動させる電気泳動手段とを具備することを特徴とする試料分離装置。 - 前記試料は負に帯電した試料であり、前記電気泳動手段は前記キャピラリー上の一の位置に正の電荷を印加すると共に、他の位置に負の電荷を印加することで、前記試料の泳動方向を決定し、前記ゲル送液手段は前記正の電荷が印加される位置から前記負の電荷が印加される位置に向けて前記ゲル状の媒体を送液することを特徴とする請求項１記載の試料分離装置。
- 前記試料は正に帯電した試料であり、前記電気泳動手段は前記キャピラリー上の一の位置に正の電荷を印加すると共に、他の位置に負の電荷を印加することで、前記試料の泳動方向を決定し、前記ゲル送液手段は前記負の電荷が印加される位置から前記正の電荷が印加される位置に向けて前記ゲル状の媒体を送液することを特徴とする請求項１記載の試料分離装置。
- 前記キャピラリーは円盤状ディスク基板の内径から外径に向かって延びる遠心送液領域を有し、前記ゲル送液手段は前記ディスク基板の回転と前記遠心送液領域を利用して前記キャピラリー内にゲルの流れを形成し、前記電気泳動手段は前記ゲルの流れと逆行する方向に前記試料を泳動させることを特徴とする請求項１記載の試料分離装置。
- 前記キャピラリーと交差する位置に連通接続された流路をさらに具備し、該流路に第２の媒体を送液させることで、前記ゲル状の媒体と該第２の媒体との混合界面を前記キャピラリー中に形成することを特徴とする請求項１記載の試料分離装置。
Priority Applications (1)
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| JP2003158893A JP2004361198A (ja) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | 試料分離装置 |
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|---|---|---|---|
| JP2003158893A JP2004361198A (ja) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | 試料分離装置 |
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2003
- 2003-06-04 JP JP2003158893A patent/JP2004361198A/ja not_active Ceased
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