JP2004344506A

JP2004344506A - 再構成皮膚の構築方法

Info

Publication number: JP2004344506A
Application number: JP2003146637A
Authority: JP
Inventors: Teru Yatani; 輝八谷; Hideko Kaiho; 英子海保
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2003-05-23
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2023-05-23
Also published as: US20050043795A1; JP3638589B2; US7736894B2

Abstract

【課題】ヒト培養細胞を用いて、組織学的及び機能的にヒト皮膚に類似し且つ的数量的及び利便性に優れたヒト再構成皮膚を構築する方法を提供する。
【解決手段】ヒト皮膚組織を非ヒト動物の体表面で再構成する方法であって、（ａ）下部にツバ部を有し、頂上部に細胞注入用の小孔を有する帽子型のチャンバーを免疫不全非ヒト動物の背部皮膚に縫合埋植し、（ｂ）チャンバー内にヒト培養線維芽細胞及びヒト培養ケラチノサイトを含有する細胞懸濁液を注入し、（ｃ）細胞移植後７〜２０日までに、当該チャンバーの上底部を少なくとも２回に分けて切断することにより円筒部を全面開口せしめ、次いで、（ｄ）１４〜２１日経過後にチャンバーを固定する縫合糸を切断し、当該チャンバーを自発的に脱離させる、ことを特徴とするヒト皮膚組織の構築方法。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は実験動物を用いたヒト皮膚組織の構築方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、再生医学、再生医療に注目が集まっている。再生医療は、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器に対して、細胞を利用することにより、その機能再生をはかる医療である。再生医学の分野ではほとんどの臓器・組織が研究対象となっており、すでに実用化に至っている領域もある。その中で、自己複製する組織、器官を再構成するテクノロジーが最初に確立された器官は皮膚である。
【０００３】
従来、研究分野において、皮膚モデルとして最も広く使われているのはｉｎｖｉｔｒｏ系における再構成皮膚である（例えば、非特許文献１〜３参照）。この皮膚モデルはハンドリングの良さから広く使用されている反面、短期間でしかその形質を維持できず、また、薬剤に対しての耐性も弱いという欠点がある。そのような問題を解決できる利用可能なヒト皮膚モデルとして、ヒト皮膚片を免疫不全動物に直接移植する技術（例えば、非特許文献４参照）が存在するが、この方法は、生体のヒト皮膚にかなり近い皮膚モデルである反面、新鮮なヒト皮膚の入手が重要なファクターであり、数量的な問題を抱えているのが現状である。
【０００４】
このような状況を打開するために開発されてきたものが、ヒトの培養細胞を免疫不全動物の皮膚中に移植し、再構成皮膚を構築する方法である。その手法としては複数の方法が存在するが、中でも近年注目されている方法にｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｓｏｒｔｉｎｇ法（例えば、非特許文献５、６参照）がある。この手法は、新鮮なヒト皮膚から単離した初代培養のケラチノサイト及び線維芽細胞を混合して、実験動物の皮膚状で再構成皮膚を構築するものである。このため、細胞が自由に動くことができ、細胞間相互作用が起こりやすく、より生体皮膚に近い構造をとりうるという利点がある。
【０００５】
しかしながら、これまでの報告では、移植後最長でも４週間という短い期間でしか評価を行っておらず、この時点では少なくとも表面状態はヒト皮膚に類似した滑らかな状態には至っていない。しかも、再構成皮膚構築における一般的でかつ大きな問題点の一つである時間経過に伴う再構成皮膚面積の縮小という点が解決されていない（例えば、非特許文献７参照）。
【０００６】
本発明は、ヒト培養細胞を用いて、組織学的及び機能的にヒト皮膚に類似し且つ数量的及び利便性に優れたヒト再構成皮膚を構築する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【非特許文献１】
ＢｅｌｌＥ，ＥｈｒｌｉｃｈＨＰ，ＢｕｔｔｌｅＤＪ，ＮａｋａｔｓｕｊｉＴ．，ＳｃｉｅｎｃｅＭａｒ６；２１１（４４８６）：１０５２−４，１９８１
【非特許文献２】
常長誠，堀井和泉，黒木登志夫，組織培養２０（８），２８２−２８５，１９９４
【非特許文献３】
ＴｓｕｎｅｎａｇａＭ，ＫｏｈｎｏＹ，ＨｏｒｉｉＩ，ＹａｓｕｍｏｔｏＳ，ＨｕｈＮＨ，ＴａｃｈｉｋａｗａＴ，ＹｏｓｈｉｋｉＳ，ＫｕｒｏｋｉＴ．，ＪｐｎＪＣａｎｃｅｒＲｅｓＭａｒ；８５（３）：２３８−４４，１９９４
【非特許文献４】
ＹａｎＨＣ，ＪｕｈａｓｚＩ，ＰｉｌｅｗｓｋｉＪ，ＭｕｒｐｈｙＧＦ，ＨｅｒｌｙｎＭ，ＡｌｂｅｌｄａＳＭ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔＭａｒ；９１（３）：９８６−９６，１９９３
【非特許文献５】
ＷａｎｇＣＫ，ＮｅｌｓｏｎＣＦ，ＢｒｉｎｋｍａｎＡＭ，ＭｉｌｌｅｒＡＣ，ＨｏｅｆｆｌｅｒＷＫ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．２０００Ａｐｒ；１１４（４）：６７４−８０．
【非特許文献６】
国際公開第９９／４５７７０号パンフレット
【非特許文献７】
ＢｏｙｃｅＳＴ，ＳｕｐｐＡＰ，ＳｗｏｐｅＶＢ，ＷａｒｄｅｎＧＤ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ２００２Ａｐｒ；１１８（４）：５６５−７２
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、実験動物の皮膚上で、ヒト皮膚を再構成する方法について検討したところ、下記に示す（ａ）〜（ｄ）の工程を行うことにより、よりヒト皮膚に類似した滑らかなツヤを有し、一定以上の大きさのヒト再構成皮膚を構築できることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、ヒト皮膚組織を非ヒト動物の体表面で再構成する方法であって、（ａ）下部にツバ部を有し、頂上部に細胞注入用の小孔を有する帽子型のチャンバーを免疫不全非ヒト動物の背部皮膚に縫合埋植し、（ｂ）チャンバー内にヒト培養線維芽細胞及びヒト培養ケラチノサイトを含有する細胞懸濁液を注入し、（ｃ）細胞移植後７〜２０日までに、当該チャンバーの上底部を少なくとも２回に分けて切断することにより円筒部を全面開口せしめ、次いで、（ｄ）１４〜２１日経過後にチャンバーを固定する縫合糸を切断し、当該チャンバーを自発的に脱離させることを特徴とするヒト皮膚組織の構築方法を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記方法により得られるヒト皮膚組織及びヒト皮膚組織を保持する実験動物を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明方法を施行する免疫不全非ヒト動物としては、例えばＳＣＩＤマウス、ＢＡＬＢｃＡ−ｎｕ／ｓｃｉｄ、Ｂ−１７／Ｉｃｒ−Ｓｃｉｄ等の免疫不全マウス、Ｆ３４４Ｊｃ１−ｒｎｕ等の免疫不全ラット等が挙げられ、特に用いる細胞数とチャンバーの大きさとの兼ね合い、またチャンバー縫合埋植の簡便性の点から、上記の免疫不全マウスを用いることが好ましい。
これらの動物は、ＳＰＦの環境下で１匹／１ケージの条件下で飼育することが好ましい。
斯かる動物は、日本クレア株式会社より入手可能である。
【００１２】
本発明において用いられるチャンバーは、下部にツバ部を有し、頂上部に細胞注入用の小孔を有する帽子型形状をなす。図１に当該チャンバーの平面図、図２に断面図を示す。
また、本発明のチャンバーは、図３に示すように、同様の形状を有する上側チャンバーａと下側チャンバーｂを組み合わせる（ｃ）ことが好ましい。この場合には、チャンバーのずれ防止、チャンバー内からの細胞の漏洩の防止という利点がある。
図１及び図２において、１はツバ部、２は円筒部、３は上底部、４は頂上部を示す。頂上部には、細胞懸濁液を注入するための直径２〜４ｍｍの小孔５が開けられている。
【００１３】
斯かるチャンバーの材質は、特に制限されるものではなく、例えばシリコン、テフロン（登録商標）、ポリプロピレン製のものが使用できる。また、チャンバーの大きさは、移植する動物の大きさによっても異なるが、通常内径７〜１２ｍｍ、外径１６〜２４ｍｍのものを使用するのが好ましい。
市販のチャンバーとしては、上記図３で示す上側チャンバーａ（内径１２ｍｍ，外径２４ｍｍ）と下側チャンバーｂ（内径１１ｍｍ，外径２４ｍｍ）（Ｒｅｎｎｅｒ
ＧＭＢＨ社）が挙げられ、これらを嵌合して使用することができる。
【００１４】
チャンバーの動物皮膚への埋植（工程（ａ））は、例えば、動物の背部の皮膚を円状に切除し、上記のチャンバーを挿入し、チャンバーの周辺部の皮膚を巾着の口のように縫合して、チャンバーを固定することにより行われる。
【００１５】
本発明方法において移植される皮膚細胞は、ヒト培養線維芽細胞及びヒト培養ケラチノサイトの混合物が用いられる。
ヒト培養繊維芽細胞としては、例えば成人皮膚（乳房）由来、新生児皮膚（包皮）由来のものを用いることができ、以下のような方法により得ることができる。例えば、包皮の表皮と真皮を物理的に分離し、真皮を細かくばらばらにして、１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養する。真皮組織から成長してくる細胞が繊維芽細胞である。
斯かるヒト培養繊維芽細胞は、市販品、例えば正常ヒト新生児包皮皮膚繊維芽細胞を購入し、培養、継代して用いることもできる。
【００１６】
ヒト培養ケラチノサイトとしては、例えばヒト新生児包皮由来のものが用いられ、例えば、包皮の真皮と表皮を物理的に分離し、表皮を細かくばらばらにして０．３％のトリプシン内で３０分放置する（３７℃）。その後トリプシンを中和し、表皮組織を外科用ピンセットでさらに細かくし、金属製メッシュでろ過して残骸を除去する。ばらばらになったケラチノサイトを遠心して回収し、ペレットをｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、同培地で培養することにより得ることができる。
斯かるヒト培養ケラチノサイトは、市販品、例えば正常ヒト表皮角化細胞（倉敷紡績株式会社）を購入し培養、継代して用いることもできる。
【００１７】
上記のようにして得られたヒト培養繊維芽細胞とヒト培養ケラチノサイトは、混合して細胞懸濁液とし、遠心分離を行い、培地を除去して細胞だけにすることにより、チャンバー頂上部４に設けられた小孔５を通してピペットマン等によりチャンバー内へ注入される（工程（ｂ））。細胞の量は４００−６００μＬ／ｃｍ^２とするのが望ましい。
【００１８】
細胞移植開始後、表面状態がヒト皮膚に類似した組織が再構築するまでには通常８〜１２週間を要する。本発明の方法では、チャンバーを脱離させるまでの間、すなわち細胞移植後７〜２０日までに、該チャンバーの上底部を少なくとも２回に分けて切断することにより円筒部を全面開口せしめることが必要である（工程（ｃ）、図４参照）。このように、チャンバーの円筒部を徐々に開口することにより急速な乾燥を妨げることとなり再構成皮膚の収縮を抑制することができる。
【００１９】
切断の回数は作業性及び急速な乾燥を考慮すると２回が好ましく、移植後７〜１０日間、好ましくは７日後に、チャンバー円筒部の断面積の６〜８割、好ましくは７割程度が開口するように円筒部を切断し、更に７〜１０日間放置した後に全面開口するように切断するのが好ましい（図４ａ参照）。チャンバーとして、上記の上側チャンバー（内径１２ｍｍ，外径２４ｍｍ）と下側チャンバー（内径１１ｍｍ，外径２４ｍｍ）の組合せを用いた場合は、初回の切断では頂上部から約５ｍｍ程度のところで切断し、一定期間経過後に、円筒部を全面開口させるように（頂上部から約８ｍｍのところで）切断すればよい（図４ｂ参照）。
【００２０】
また、チャンバー上底部の一部を切断して円筒部を開口した場合は、当該開口部位には、網を装着して当該開口部を覆うことが、床敷混合防止、急速な乾燥防止の点から好ましい。当該網は、金属製、樹脂製、綿製の何れでもよく、その孔径は０．１〜０．５ｍｍ、特に０．２〜０．３ｍｍのものが好ましい。
【００２１】
チャンバー円筒部を全面開口させた後、約２８〜５６日間、好ましくは２８〜３５日間で、チャンバーの取り外しを行なうが（工程（ｄ））、全面開口させた後は、再構成されている皮膚の急激な乾燥を避けるために、適当な水分補給を行うことが好ましい。この場合の水分補給は、例えば生理食塩水を２〜４日に一度、４００μＬ／ｃｍ^２の量でシリンジ等を用いて、再構成皮膚上に滴下する程度が好ましい。
【００２２】
チャンバーの取り外しは、チャンバーを固定するために動物の皮膚を縫合していた縫合糸を切断し、チャンバーが皮膚から自発的に脱離するようにして行う。
このように、チャンバーを皮膚から自発的に脱離させることが再構成皮膚とマウス皮膚との融合、再構成皮膚の収縮抑制の点から好ましい。通常、縫合糸を切断後、約２週間でチャンバーは外れる。
【００２３】
斯くして、ヒト培養線維芽細胞及びヒト培養ケラチノサイトからヒト皮膚組織を構築することができるが、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程において、皮膚組織の再生を促進するための因子、例えばＷｎｔ、ソニックヘッジホッグ等を適宜添加することができ、また、毛包、メラノサイト等の皮膚組織構成細胞を添加することもできる。
【００２４】
本発明の方法により再構成された皮膚組織は、図５に示すように、瘡蓋がなく均一な表面を有し、ヒト皮膚に極めて類似したツヤを呈する。また、縮小することなく一定以上の大きさを維持している。そして、図６〜７に示すように、ヒト皮膚に極めて類似した基底膜構造を有する。
【００２５】
従って、本発明方法によって得られた再構成皮膚は、重度の火傷、皮膚創傷、潰瘍のように、重度の皮膚損傷を受けた患者に適用するための皮膚組織となり得る。また、当該ヒト皮膚組織を保持する動物は、ヒト皮膚の遺伝子発現等を研究するための研究用動物として、或いは皮膚に対して作用する薬剤等を評価するためのモデル動物として有用である。
【００２６】
【実施例】
実施例１ヒト再構成皮膚の構築
（１）細胞の培養
ヒト培養線維芽細胞（大日本製薬株式会社）を１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃、ＣＯ_２５％のインキュベーター内で培養した。Ｔ１７５フラスコ（ＦＡＬＣＯＮＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でコンフルエントの状態になるまで培養した。
【００２７】
ヒト培養ケラチノサイトは、クラボウ社より購入したヒト新生児包皮由来表皮角化細胞を使用した。凍結細胞を３７℃で解凍した後、Ｔ２５フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ）にｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を用いて播種し、３７℃、ＣＯ_２５％のインキュベーター内で培養した。サブコンフルエントの状態で継代を行い、Ｔ１７５フラスコに移して同条件でサブコンフルエントの状態まで培養を行った。
【００２８】
（２）マウスへのチャンバーの挿入
マウスの背部の皮膚を円状に切除し、上部に直径２〜４ｍｍの穴を開けたチャンバー（ｕｐｐｅｒｐａｒｔ−内径１２ｍｍ，外径２４ｍｍとｌｏｗｅｒｐａｒｔ−内径１１ｍｍ，外径２４ｍｍを組み合わせたもの）（ＲｅｎｎｅｒＧＭＢＨ）を挿入した。チャンバーの周辺部のマウス皮膚を巾着の口のように縫合して、チャンバーを固定した。
【００２９】
（３）細胞の注入
トリプシンではがした（６−８）×１０^６個のヒト培養線維芽細胞と６×１０^６個のヒト培養ケラチノサイトを同一チューブ内で遠心して回収し、上清を捨てた。これをチャンバー内に上部の穴から注入した。
【００３０】
（４）チャンバーの取り外し
移植（ｇｒａｆｔ）してから１週間後、チャンバーの上部を上から５ｍｍ程度のところで切り取り、その上に金網を取り付けた。さらに１〜２週間後に金網を外し、チャンバーの上部を完全にカットした。この時点から生理食塩水を２〜４日に一度、再構成皮膚上に滴下し、急激な乾燥を避けるようにした。移植して約４〜５週間後にチャンバーをマウス皮膚に縫合した糸にはさみを入れ、自発的にチャンバーが外れるのを待った。一般的には移植してから６〜７週間後にチャンバーは外れる。
【００３１】
（５）再構成皮膚の所見
図５は、再構成皮膚の外観写真であり、再構成皮膚表面には瘡蓋がなく、均一であり、ヒト皮膚に極めて類似したツヤを呈していることが分かる。また、一定以上の大きさを維持していた。図６は、ヒト皮膚（左）、再構成皮膚（右）の組織切片の顕微鏡観察像であり、ｌａｍｉｎｉｎ−５抗体、ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧ抗体（陰性所見）を用いて免疫染色を行っている。矢印部がｌａｍｉｎｉｎ−５タンパク質の陽性所見であり、同タンパク質が発現していることを示している。表皮層と真皮層の結合部位である基底膜の構成因子であるｌａｍｉｎｉｎ−５タンパク質が再構成皮膚においてもヒト皮膚と同様に存在していることから、再構成皮膚がヒト皮膚と同程度に基底膜が発達していると考えられる。一方、非特異的な抗体であるｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧ抗体では陽性所見が認められないことから、ｌａｍｉｎｉｎ−５抗体による染色は特異的なものであるということが示されている。さらに、図７の再構成皮膚の透過型電子顕微鏡写真においても、基底層近傍に中間径線維が豊富に認められることから、強固な基底膜が形成されていることが示唆されている。写真中の白いバーは表皮層、黒いバーは真皮層を示している。
以上のように、図５〜７より、再構成皮膚は表面、内部性状共にヒト皮膚に極めて類似したものになっていることが示されている。従って、再構成皮膚は皮膚モデルとして有用である。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒト皮膚の遺伝子発現を研究するため、或いはヒト皮膚に対して作用する薬剤等を評価するための数量的及び利便性に優れたヒト再構成皮膚を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明チャンバーの外観図（正面図）である。
【図２】図１は本発明チャンバーの外観図（断面図）である。
【図３】図３は上側チャンバーａと下側チャンバーｂを用いる場合の概念図である。
【図４】図４はチャンバー上底部の切断を示す概念図（４ａ：正面図、４ｂ：断面図）である。
【図５】図５は再構成皮膚（移植後１６週）の外観写真である。
【図６】図６は再構成皮膚の組織顕微鏡写真である。
【図７】図７は再構成皮膚（移植後１６週）の組織電子顕微鏡写真である。
【符号の説明】
１：ツバ部
２：円筒部
３：上底部
４：頂上部
５：小孔（細胞注入口）
ａ：上側チャンバー
ｂ：下側チャンバー

Claims

ヒト皮膚組織を非ヒト動物の体表面で再構成する方法であって、（ａ）下部にツバ部を有し、頂上部に細胞注入用の小孔を有する帽子型のチャンバーを免疫不全非ヒト動物の背部皮膚に縫合埋植し、（ｂ）チャンバー内にヒト培養線維芽細胞及びヒト培養ケラチノサイトを含有する細胞懸濁液を注入し、（ｃ）細胞移植後７〜２０日までに、当該チャンバーの上底部を少なくとも２回に分けて切断することにより円筒部を全面開口せしめ、次いで、（ｄ）１４〜２１日経過後にチャンバーを固定する縫合糸を切断し、当該チャンバーを自発的に脱離させることを特徴とするヒト皮膚組織の構築方法。
細胞移植後７〜１０日目に、チャンバー円筒部の断面積の６〜８割が開口するように上底部を切断し、それから７〜１０日間放置した後、更に切断して、円筒部を全面開口せしめるものである請求項１記載の方法。
上底部の一部を切断した後、当該切断部位に網を取り付けるものである請求項２記載の方法。
チャンバー円筒部を全面開口せしめた後、水分補給を行うものである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られるヒト皮膚組織。
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られるヒト皮膚組織を保持する実験動物。