JPH09172909A - 培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物への移植法 - Google Patents
培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物への移植法Info
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- JPH09172909A JPH09172909A JP7351267A JP35126795A JPH09172909A JP H09172909 A JPH09172909 A JP H09172909A JP 7351267 A JP7351267 A JP 7351267A JP 35126795 A JP35126795 A JP 35126795A JP H09172909 A JPH09172909 A JP H09172909A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散させ
て支持体をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重層し
て得られる複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下に移
植し、その後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除して移
植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面において再
構成せしめることを特徴とする、移植法及び実験動物の
生産法、並びに該生産法により得ることができる実験動
物。 【効果】 ヒト皮膚組織を体表に保持するヒト皮膚モデ
ル動物を計画的に安定して生産することが可能となる。
て支持体をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重層し
て得られる複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下に移
植し、その後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除して移
植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面において再
構成せしめることを特徴とする、移植法及び実験動物の
生産法、並びに該生産法により得ることができる実験動
物。 【効果】 ヒト皮膚組織を体表に保持するヒト皮膚モデ
ル動物を計画的に安定して生産することが可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト皮膚組織を有
する実験動物を生産するための技術に関する。
する実験動物を生産するための技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト皮膚に関する基礎的研究及び皮膚疾
患の原因解明・治療法の開発において、ヒト皮膚の生体
内（in vivo ）実験系の確立が望まれており、均質なモ
デル動物を計画的かつ大量に供給できるシステムが不可
欠である。ヒト皮膚の動物モデル作成の手段としては、
ヒト皮膚そのものをscidマウス又はnu,scid マウス等の
免疫不全マウスに移植する方法が行われてきた。しか
し、この方法の実施はヒト皮膚の入手に依存するため、
移植動物を計画的に大量に生産することが難しく、また
ドナーの個体差をそのまま反映するために、生産された
移植動物が均質であるとはいえない。一方、ヒト表皮細
胞及び線維芽細胞を分離して増殖培養し、懸濁液の状態
にして免疫不全マウスの皮下に注入すると、細胞はそこ
で増殖・分化しヒト皮膚に類似した構造を形成する。し
かし、その皮膚様構造物は皮下に結節状の嚢胞となるた
め観察しにくく、その後の実験方法も限定されるという
問題点があった。
患の原因解明・治療法の開発において、ヒト皮膚の生体
内（in vivo ）実験系の確立が望まれており、均質なモ
デル動物を計画的かつ大量に供給できるシステムが不可
欠である。ヒト皮膚の動物モデル作成の手段としては、
ヒト皮膚そのものをscidマウス又はnu,scid マウス等の
免疫不全マウスに移植する方法が行われてきた。しか
し、この方法の実施はヒト皮膚の入手に依存するため、
移植動物を計画的に大量に生産することが難しく、また
ドナーの個体差をそのまま反映するために、生産された
移植動物が均質であるとはいえない。一方、ヒト表皮細
胞及び線維芽細胞を分離して増殖培養し、懸濁液の状態
にして免疫不全マウスの皮下に注入すると、細胞はそこ
で増殖・分化しヒト皮膚に類似した構造を形成する。し
かし、その皮膚様構造物は皮下に結節状の嚢胞となるた
め観察しにくく、その後の実験方法も限定されるという
問題点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト皮膚培
養細胞を用いて作成した複合皮膚片を非ヒト動物に移植
することによって、ヒト皮膚組織を非ヒト動物体表面に
再構築させ、ヒト皮膚の生体内（in vivo ）実験系に有
用なモデル動物を生産する方法の確立を目的とする。
養細胞を用いて作成した複合皮膚片を非ヒト動物に移植
することによって、ヒト皮膚組織を非ヒト動物体表面に
再構築させ、ヒト皮膚の生体内（in vivo ）実験系に有
用なモデル動物を生産する方法の確立を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、培養ヒト線維芽
細胞をゲル中に分散させて支持体をつくり、その上に培
養ヒト表皮細胞を重層して得られる複合皮膚片を免疫不
全非ヒト動物の皮下に移植することによって、ヒト皮膚
組織を体表に保持するヒト皮膚モデル動物を計画的に安
定して生産することができることを見出し、本発明を完
成するに至った。
を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、培養ヒト線維芽
細胞をゲル中に分散させて支持体をつくり、その上に培
養ヒト表皮細胞を重層して得られる複合皮膚片を免疫不
全非ヒト動物の皮下に移植することによって、ヒト皮膚
組織を体表に保持するヒト皮膚モデル動物を計画的に安
定して生産することができることを見出し、本発明を完
成するに至った。
【０００５】即ち、本発明は、以下の発明を包含する。 （１）培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散させて支持体
をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重層して得られ
る複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下に移植し、そ
の後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除して移植皮膚片
を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面において再構成せし
めることを特徴とする培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物へ
の移植法。 （２）ゲルがコラーゲンゲルである前記（１）に記載の
移植法。 （３）免疫不全非ヒト動物が免疫不全マウスである前記
（１）に記載の移植法。 （４）複合皮膚片を皮膚被覆材とともに免疫不全非ヒト
動物の皮下に移植することを特徴とする前記（１）に記
載の移植法。
をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重層して得られ
る複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下に移植し、そ
の後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除して移植皮膚片
を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面において再構成せし
めることを特徴とする培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物へ
の移植法。 （２）ゲルがコラーゲンゲルである前記（１）に記載の
移植法。 （３）免疫不全非ヒト動物が免疫不全マウスである前記
（１）に記載の移植法。 （４）複合皮膚片を皮膚被覆材とともに免疫不全非ヒト
動物の皮下に移植することを特徴とする前記（１）に記
載の移植法。
【０００６】（５）培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散
させて支持体をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重
層して得られる複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下
に移植し、その後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除し
て移植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面におい
て再構成せしめることを特徴とするヒト皮膚組織を有す
る実験動物の生産法。 （６）複合皮膚片を皮膚被覆材とともに免疫不全非ヒト
動物の皮下に移植することを特徴とする前記（５）に記
載の生産法。 （７）前記（５）又は（６）に記載の生産法により得る
ことができるヒト皮膚組織を有する実験動物。
させて支持体をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重
層して得られる複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下
に移植し、その後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除し
て移植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面におい
て再構成せしめることを特徴とするヒト皮膚組織を有す
る実験動物の生産法。 （６）複合皮膚片を皮膚被覆材とともに免疫不全非ヒト
動物の皮下に移植することを特徴とする前記（５）に記
載の生産法。 （７）前記（５）又は（６）に記載の生産法により得る
ことができるヒト皮膚組織を有する実験動物。
【０００７】本発明において、レシピエントとする動物
は、免疫能の不全な非ヒト動物であれば特に制限はな
く、例えば、ヌードマウス、SCIDマウス、SCID/hu マウ
ス、nu/SCID マウス等の免疫不全マウス、ヌードラット
等の免疫不全ラットが挙げられるが、C,B-17-scid 、BA
LB/cA-scid、BALB/cA-nu,scid 、BALB/cA-RAG2KO等の免
疫能の不全なマウス・ミュータント系を用いることが好
ましい。これらの動物は、特定の病原体感染を防止した
条件、即ちＳＰＦ(specific pathogen free)環境下で飼
育することが好ましい。なお、C,B-17-scid マウスは日
本クレア株式会社から販売されており、BALB/cA-scidマ
ウス、BALB/cA-nu,scid マウス、BALB/cA-RAG2KOは現在
本出願人が所持しており、必要に応じて分譲することが
できる。
は、免疫能の不全な非ヒト動物であれば特に制限はな
く、例えば、ヌードマウス、SCIDマウス、SCID/hu マウ
ス、nu/SCID マウス等の免疫不全マウス、ヌードラット
等の免疫不全ラットが挙げられるが、C,B-17-scid 、BA
LB/cA-scid、BALB/cA-nu,scid 、BALB/cA-RAG2KO等の免
疫能の不全なマウス・ミュータント系を用いることが好
ましい。これらの動物は、特定の病原体感染を防止した
条件、即ちＳＰＦ(specific pathogen free)環境下で飼
育することが好ましい。なお、C,B-17-scid マウスは日
本クレア株式会社から販売されており、BALB/cA-scidマ
ウス、BALB/cA-nu,scid マウス、BALB/cA-RAG2KOは現在
本出願人が所持しており、必要に応じて分譲することが
できる。
【０００８】本発明の対象となるヒト皮膚細胞として
は、正常体幹皮膚由来の細胞が好ましい。本発明では、
先ず、培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散させて真皮類
似の支持体をつくるが、ここで用いるゲルとしては、そ
の内部で線維芽細胞が自由な立体構造を形成し正常に機
能することが可能であり、かつ材質そのものが生体親和
性に優れているもの、例えばＩ型コラーゲン、IV型コラ
ーゲン、マトリゲルTMが好ましく、Ｉ型コラーゲン、マ
トリゲルTMが更に好ましい。マトリゲルTMはＥＨＳマウ
ス腫瘍の可溶化抽出物で、ゲルやコーティングに利用す
ると基底膜として機能する細胞外マトリクスであり、Be
cton Dickinson Labware Collaborative Biomedical Pr
oductsから市販されている。
は、正常体幹皮膚由来の細胞が好ましい。本発明では、
先ず、培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散させて真皮類
似の支持体をつくるが、ここで用いるゲルとしては、そ
の内部で線維芽細胞が自由な立体構造を形成し正常に機
能することが可能であり、かつ材質そのものが生体親和
性に優れているもの、例えばＩ型コラーゲン、IV型コラ
ーゲン、マトリゲルTMが好ましく、Ｉ型コラーゲン、マ
トリゲルTMが更に好ましい。マトリゲルTMはＥＨＳマウ
ス腫瘍の可溶化抽出物で、ゲルやコーティングに利用す
ると基底膜として機能する細胞外マトリクスであり、Be
cton Dickinson Labware Collaborative Biomedical Pr
oductsから市販されている。
【０００９】次いで、前記支持体上に増殖培養したヒト
表皮細胞を重層して、３次元構造をヒト皮膚に模した複
合皮膚片を作成し、これを免疫不全非ヒト動物の皮下に
移植する。複合皮膚片の表面積及び厚さは、動物の種類
等により異なるが、マウスの場合、好ましくは表面積７
〜１２ｃｍ2 、厚さ０．２〜０．６ｃｍである。また、
この際、複合皮膚片を皮膚被覆材とともに移植すること
が好ましく、これにより、移植片と動物表皮との癒着を
防止し、体表での再構築の効率化を図ることができる。
ここで用いる皮膚被覆材とは、皮下に埋没した際、マウ
ス表皮側からの細胞浸潤を阻止でき、肉芽形成反応を誘
起せず、生体にも移植片にも障害を及ぼさないものをい
い、例えばシリコーンやポリエチレン等のプラスチック
のシート、アセテート膜やニトロセルロース膜などが挙
げられる。皮膚被覆材として、例えばテガダームトラン
スペアレントドレッシング(TegadermTM Transparent Dr
essing)（３Ｍ社、商品名）、ベスキチン（ルセル・メ
ディカ社、商品名）、ゼメックスエピキュール（ゼオン
メディカル社、商品名）、デュオアクティブ（ブリスト
ルマイヤーズ社、商品名）が市販されている。
表皮細胞を重層して、３次元構造をヒト皮膚に模した複
合皮膚片を作成し、これを免疫不全非ヒト動物の皮下に
移植する。複合皮膚片の表面積及び厚さは、動物の種類
等により異なるが、マウスの場合、好ましくは表面積７
〜１２ｃｍ2 、厚さ０．２〜０．６ｃｍである。また、
この際、複合皮膚片を皮膚被覆材とともに移植すること
が好ましく、これにより、移植片と動物表皮との癒着を
防止し、体表での再構築の効率化を図ることができる。
ここで用いる皮膚被覆材とは、皮下に埋没した際、マウ
ス表皮側からの細胞浸潤を阻止でき、肉芽形成反応を誘
起せず、生体にも移植片にも障害を及ぼさないものをい
い、例えばシリコーンやポリエチレン等のプラスチック
のシート、アセテート膜やニトロセルロース膜などが挙
げられる。皮膚被覆材として、例えばテガダームトラン
スペアレントドレッシング(TegadermTM Transparent Dr
essing)（３Ｍ社、商品名）、ベスキチン（ルセル・メ
ディカ社、商品名）、ゼメックスエピキュール（ゼオン
メディカル社、商品名）、デュオアクティブ（ブリスト
ルマイヤーズ社、商品名）が市販されている。
【００１０】移植後、通常数週間後、移植皮膚片上の動
物表皮を切除して移植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織
を体表面において再構成せしめることにとり、ヒト皮膚
組織を有する実験動物を生産することができる。
物表皮を切除して移植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織
を体表面において再構成せしめることにとり、ヒト皮膚
組織を有する実験動物を生産することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施形態の好ま
しい一例を示す。 （１）採取されたヒト皮膚より表皮細胞及び線維芽細胞
を分離し、十分な細胞数が得られるまでそれぞれ増殖培
養し、３〜５代継代する。 （２）培養ヒト線維芽細胞を１移植片当たり２×１０6
個になるようゲル中に分散させ、培養プレートに撒いて
１〜３日間培養する。 （３）培養ヒト表皮細胞を１移植片当たり２×１０6 個
になるよう（２）のゲル上に重層して更に８〜２４時間
培養し、複合皮膚片を作成する。 （４）移植数時間前にゲルをプレートから浮遊させてお
く。 （５）免疫不全マウスをペントバルビタール、ネンブタ
ール等で麻酔する。
しい一例を示す。 （１）採取されたヒト皮膚より表皮細胞及び線維芽細胞
を分離し、十分な細胞数が得られるまでそれぞれ増殖培
養し、３〜５代継代する。 （２）培養ヒト線維芽細胞を１移植片当たり２×１０6
個になるようゲル中に分散させ、培養プレートに撒いて
１〜３日間培養する。 （３）培養ヒト表皮細胞を１移植片当たり２×１０6 個
になるよう（２）のゲル上に重層して更に８〜２４時間
培養し、複合皮膚片を作成する。 （４）移植数時間前にゲルをプレートから浮遊させてお
く。 （５）免疫不全マウスをペントバルビタール、ネンブタ
ール等で麻酔する。
【００１２】（６）背部を剃毛・消毒し、皮膚を２ｃｍ
程度切開する。皮下織を鈍性に剥離して皮下に空隙を作
り、皮膚被覆材を挿入する。 （７）皮膚被覆材の下側に複合皮膚片を挿入（表皮細胞
の重層されている方を上側にする）し、絹糸及び生体用
接着剤で縫合・固定する。 （８）移植約２〜３週間後、移植皮膚片上のマウス皮膚
を切除し、皮膚被覆材を除去して移植皮膚片を体表面に
露出させる。マウス皮膚断面を移植皮膚片に縫合し固定
する。 前記の移植手順の概略を図１及び２に示す。
程度切開する。皮下織を鈍性に剥離して皮下に空隙を作
り、皮膚被覆材を挿入する。 （７）皮膚被覆材の下側に複合皮膚片を挿入（表皮細胞
の重層されている方を上側にする）し、絹糸及び生体用
接着剤で縫合・固定する。 （８）移植約２〜３週間後、移植皮膚片上のマウス皮膚
を切除し、皮膚被覆材を除去して移植皮膚片を体表面に
露出させる。マウス皮膚断面を移植皮膚片に縫合し固定
する。 前記の移植手順の概略を図１及び２に示す。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例） Ａ．移植皮膚細胞 乳癌摘出手術又は剖検例の１２名よりインフォームド・
コンセントを得て提供された前胸部及び下腹部皮膚を用
いて、ヒト正常表皮細胞及び線維芽細胞を分離し、それ
ぞれ増殖培養した。
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例） Ａ．移植皮膚細胞 乳癌摘出手術又は剖検例の１２名よりインフォームド・
コンセントを得て提供された前胸部及び下腹部皮膚を用
いて、ヒト正常表皮細胞及び線維芽細胞を分離し、それ
ぞれ増殖培養した。
【００１４】Ｂ．移植方法 以下の手順に従って移植を行った。以下の操作は全て無
菌的に行った。使用する器具・器材は滅菌処理し、作業
は原則的にクリーンベンチ内にて行い、動物はビニルア
イソレーター等のＳＰＦ環境にて飼育した。 （１）採取されたヒト皮膚より表皮細胞及び線維芽細胞
を分離し、十分な細胞数が得られるまでそれぞれ増殖培
養し、３〜５代継代する。 （２）培養ヒト線維芽細胞を１移植片当たり２×１０6
個になるようコラーゲンゲル中に分散させ、培養プレー
トに撒いて１日間培養する。 （３）培養ヒト表皮細胞を１移植片当たり２×１０6 個
になるよう（２）のゲル上に重層して更に８時間培養
し、複合皮膚片を作成する。
菌的に行った。使用する器具・器材は滅菌処理し、作業
は原則的にクリーンベンチ内にて行い、動物はビニルア
イソレーター等のＳＰＦ環境にて飼育した。 （１）採取されたヒト皮膚より表皮細胞及び線維芽細胞
を分離し、十分な細胞数が得られるまでそれぞれ増殖培
養し、３〜５代継代する。 （２）培養ヒト線維芽細胞を１移植片当たり２×１０6
個になるようコラーゲンゲル中に分散させ、培養プレー
トに撒いて１日間培養する。 （３）培養ヒト表皮細胞を１移植片当たり２×１０6 個
になるよう（２）のゲル上に重層して更に８時間培養
し、複合皮膚片を作成する。
【００１５】（４）移植数時間前にゲルをプレートから
浮遊させておく。 （５）免疫不全マウスをペントバルビタールで麻酔す
る。 （６）背部を剃毛・消毒し、皮膚を２ｃｍ程度切開す
る。皮下織を鈍性に剥離して皮下に空隙を作り、皮膚被
覆材（３Ｍ社製テガダームトランスペアレントドレッシ
ング(TegadermTM Transparent Dressing)を使用）を挿
入する。
浮遊させておく。 （５）免疫不全マウスをペントバルビタールで麻酔す
る。 （６）背部を剃毛・消毒し、皮膚を２ｃｍ程度切開す
る。皮下織を鈍性に剥離して皮下に空隙を作り、皮膚被
覆材（３Ｍ社製テガダームトランスペアレントドレッシ
ング(TegadermTM Transparent Dressing)を使用）を挿
入する。
【００１６】（７）皮膚被覆材の下側に複合皮膚片を挿
入（表皮細胞の重層されている方を上側にする）し、絹
糸及び生体用接着剤（３Ｍ社製ベットボンド(Vetbon
dTM) 外科用接着剤を使用）で縫合・固定する。 （８）移植約３週間後、移植皮膚片上のマウス皮膚を切
除し、皮膚被覆材を除去して移植皮膚片を体表面に露出
させる。マウス皮膚断面を移植皮膚片に縫合し固定す
る。
入（表皮細胞の重層されている方を上側にする）し、絹
糸及び生体用接着剤（３Ｍ社製ベットボンド(Vetbon
dTM) 外科用接着剤を使用）で縫合・固定する。 （８）移植約３週間後、移植皮膚片上のマウス皮膚を切
除し、皮膚被覆材を除去して移植皮膚片を体表面に露出
させる。マウス皮膚断面を移植皮膚片に縫合し固定す
る。
【００１７】Ｃ．皮膚被覆材の有無による生着成績の比
較 C,B-17-scid ８匹、BALB/cA-scid１３匹、BALB/cA-nu,s
cid １匹、BALB/cA-RAG2KO３匹、計２５匹を用いて前述
の手順に従って移植を行った。また、皮膚被覆材を使用
しないことを除き前記と同様にして、C,B-17-scid ２
匹、BALB/cA-scid５匹、BALB/cA-RAG2KO４匹、計１１匹
について移植を行い、皮膚被覆材の使用の生着成績への
影響を調べた。なお、ゲル作成プレートの形状は６ウェ
ル・プレート（９．１ｃｍ2 （底面積）×０．３ｃｍ
（高さ））、ゲルの体積は２．５ｍｌとした。結果を表
１に示す。
較 C,B-17-scid ８匹、BALB/cA-scid１３匹、BALB/cA-nu,s
cid １匹、BALB/cA-RAG2KO３匹、計２５匹を用いて前述
の手順に従って移植を行った。また、皮膚被覆材を使用
しないことを除き前記と同様にして、C,B-17-scid ２
匹、BALB/cA-scid５匹、BALB/cA-RAG2KO４匹、計１１匹
について移植を行い、皮膚被覆材の使用の生着成績への
影響を調べた。なお、ゲル作成プレートの形状は６ウェ
ル・プレート（９．１ｃｍ2 （底面積）×０．３ｃｍ
（高さ））、ゲルの体積は２．５ｍｌとした。結果を表
１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】複合皮膚片の移植時に皮膚被覆材を一緒に
挿入することにより、ゲルの変形や癒着が防止され、よ
り効率的にヒト皮膚が再構成された。６週齢のBALB/cA-
scidに複合皮膚片（線維芽細胞２×１０6 個及び表皮細
胞２×１０6 個を含む）を移植し、３週間後にマウス表
皮を切除した時の移植４週間後の肉眼所見を図４に示
す。
挿入することにより、ゲルの変形や癒着が防止され、よ
り効率的にヒト皮膚が再構成された。６週齢のBALB/cA-
scidに複合皮膚片（線維芽細胞２×１０6 個及び表皮細
胞２×１０6 個を含む）を移植し、３週間後にマウス表
皮を切除した時の移植４週間後の肉眼所見を図４に示
す。
【００２０】９週齢のBALB/cA-nu,scid に複合皮膚片
（線維芽細胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を
含む）を移植し、３週間後にマウス表皮を切除した時の
移植４週間後及び８週間後の肉眼所見を図５（上：移植
４週間後、下：移植８週間後）に示す。図５から、移植
４週間後及び８週間後で移植皮膚片の面積はほとんど変
わらず、移植８週間後では移植４週間後に比し、メラニ
ン沈着域が拡大していることがわかる。
（線維芽細胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を
含む）を移植し、３週間後にマウス表皮を切除した時の
移植４週間後及び８週間後の肉眼所見を図５（上：移植
４週間後、下：移植８週間後）に示す。図５から、移植
４週間後及び８週間後で移植皮膚片の面積はほとんど変
わらず、移植８週間後では移植４週間後に比し、メラニ
ン沈着域が拡大していることがわかる。
【００２１】Ｄ．複合皮膚片の形状による生着成績の比
較 C,B-17-scid ４匹、BALB/cA-scid９匹、BALB/cA-nu,sci
d １匹、BALB/cA-RAG2KO１匹、計１５匹について、１２
ウェル・プレート（３．５ｃｍ2 （底面積）×０．７ｃ
ｍ（高さ））のゲル作成プレートを用いて前述の手順に
従って移植を行った。また、ゲル作成プレートとして６
ウェル・プレート（９．１ｃｍ2 （底面積）×０．３ｃ
ｍ（高さ））を用いることを除き前記と同様にして、C,
B-17-scid ３匹、BALB/cA-scid５匹、BALB/cA-nu,scid
２匹、BALB/cA-RAG2KO３匹、計１３匹について移植を行
い、複合皮膚片の形状の生着成績への影響を調べた。な
お、いずれもゲルの体積は２．５ｍｌで、含まれる細胞
数は同一にした。結果を表２に示す。
較 C,B-17-scid ４匹、BALB/cA-scid９匹、BALB/cA-nu,sci
d １匹、BALB/cA-RAG2KO１匹、計１５匹について、１２
ウェル・プレート（３．５ｃｍ2 （底面積）×０．７ｃ
ｍ（高さ））のゲル作成プレートを用いて前述の手順に
従って移植を行った。また、ゲル作成プレートとして６
ウェル・プレート（９．１ｃｍ2 （底面積）×０．３ｃ
ｍ（高さ））を用いることを除き前記と同様にして、C,
B-17-scid ３匹、BALB/cA-scid５匹、BALB/cA-nu,scid
２匹、BALB/cA-RAG2KO３匹、計１３匹について移植を行
い、複合皮膚片の形状の生着成績への影響を調べた。な
お、いずれもゲルの体積は２．５ｍｌで、含まれる細胞
数は同一にした。結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】ゲルは移植後、皮下でかなり収縮するた
め、もとの面積が小さいと消失してしまう。ある程度表
面積の広い形状の方が再構成されるヒト皮膚の面積が維
持された。
め、もとの面積が小さいと消失してしまう。ある程度表
面積の広い形状の方が再構成されるヒト皮膚の面積が維
持された。
【００２４】Ｅ．組織学的観察 マウス表皮切除後１〜２週間して再構成皮膚が周囲のマ
ウス表皮とスムーズに癒合したとき、皮紋や弾力性等表
皮の状態がマウス表皮とは確実に区別できたものを生着
とし、これらについて組織学的観察を行った。組織学的
には、表皮肥厚が見られたが、基底部には方形の細胞が
並び、角質層に至る分化過程が認められ、基底部が乳頭
状を呈する等、ヒト皮膚と類似した所見が観察された。
表皮と真皮との間には毛細血管が疎通し、線維芽細胞が
間質結合組織を伴って存在していた。抗ヒトinvolucrin
抗体による免疫組織染色では肥厚した表皮部分に陽性反
応が認められ、ヒト細胞であることが確認された。
ウス表皮とスムーズに癒合したとき、皮紋や弾力性等表
皮の状態がマウス表皮とは確実に区別できたものを生着
とし、これらについて組織学的観察を行った。組織学的
には、表皮肥厚が見られたが、基底部には方形の細胞が
並び、角質層に至る分化過程が認められ、基底部が乳頭
状を呈する等、ヒト皮膚と類似した所見が観察された。
表皮と真皮との間には毛細血管が疎通し、線維芽細胞が
間質結合組織を伴って存在していた。抗ヒトinvolucrin
抗体による免疫組織染色では肥厚した表皮部分に陽性反
応が認められ、ヒト細胞であることが確認された。
【００２５】７週齢のC,B-17-scid に複合皮膚片（線維
芽細胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）
を移植し、３週間後にマウス表皮を切除した時点におけ
る組織像を図６（ヘマトキシリン−エオシン染色、×４
０）及び図７（ヘマトキシリン−エオシン染色、×１４
０）に示し、同一移植片を抗ヒトＭＨＣ−クラスＩ抗体
により免疫組織染色したもの（×１４０）を図８に示
す。図６から、表皮層は十分に厚さを増し、ヒト線維芽
細胞を含んだコラーゲンゲルはマウス皮下組織とスムー
ズに癒合していることが、図７から、コラーゲンゲル中
に毛細血管が新生していることがわかる。図８におい
て、基底側数層の表皮細胞及び線維芽細胞に陽性反応が
認められる。
芽細胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）
を移植し、３週間後にマウス表皮を切除した時点におけ
る組織像を図６（ヘマトキシリン−エオシン染色、×４
０）及び図７（ヘマトキシリン−エオシン染色、×１４
０）に示し、同一移植片を抗ヒトＭＨＣ−クラスＩ抗体
により免疫組織染色したもの（×１４０）を図８に示
す。図６から、表皮層は十分に厚さを増し、ヒト線維芽
細胞を含んだコラーゲンゲルはマウス皮下組織とスムー
ズに癒合していることが、図７から、コラーゲンゲル中
に毛細血管が新生していることがわかる。図８におい
て、基底側数層の表皮細胞及び線維芽細胞に陽性反応が
認められる。
【００２６】また、移植１７週間後の組織像を図９（ヘ
マトキシリン−エオシン染色、×１４０）に示し、同一
移植片を抗ヒトＭＨＣ−クラスＩ抗体により免疫組織染
色したもの（×１４０）を図１０に示す。
マトキシリン−エオシン染色、×１４０）に示し、同一
移植片を抗ヒトＭＨＣ−クラスＩ抗体により免疫組織染
色したもの（×１４０）を図１０に示す。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、ヒト皮膚組織を体表に保
持するヒト皮膚モデル動物を計画的に安定して生産する
ことが可能となる。更に、本発明は、疾患皮膚の細胞又
は遺伝子導入した細胞を用いる等応用でき、ヒト皮膚に
関する生体内実験系に大きく寄与する。
持するヒト皮膚モデル動物を計画的に安定して生産する
ことが可能となる。更に、本発明は、疾患皮膚の細胞又
は遺伝子導入した細胞を用いる等応用でき、ヒト皮膚に
関する生体内実験系に大きく寄与する。
【図１】本発明による移植手順（前半）の概略を示す図
である。
である。
【図２】本発明による移植手順（後半）の概略を示す図
である。
である。
【図３】SCIDマウスに複合皮膚片を移植する時の生物の
形態を示す写真である。
形態を示す写真である。
【図４】６週齢のBALB/cA-scidに複合皮膚片（線維芽細
胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）を移
植し、３週間後にマウス表皮を切除した時の移植４週間
後の肉眼による生物の形態を示す写真である。
胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）を移
植し、３週間後にマウス表皮を切除した時の移植４週間
後の肉眼による生物の形態を示す写真である。
【図５】９週齢のBALB/cA-nu,scid に複合皮膚片（線維
芽細胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）
を移植し、３週間後にマウス表皮を切除した時の移植４
週間後（上）及び８週間後（下）の肉眼による生物の形
態を示す写真である。
芽細胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）
を移植し、３週間後にマウス表皮を切除した時の移植４
週間後（上）及び８週間後（下）の肉眼による生物の形
態を示す写真である。
【図６】７週齢のC,B-17-scid に複合皮膚片（線維芽細
胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）を移
植し、３週間後にマウス表皮を切除した時点における組
織像を表す生物の形態を示す写真である（ヘマトキシリ
ン−エオシン染色、×４０）。
胞２×１０6 個及び表皮細胞２×１０6 個を含む）を移
植し、３週間後にマウス表皮を切除した時点における組
織像を表す生物の形態を示す写真である（ヘマトキシリ
ン−エオシン染色、×４０）。
【図７】図６を強拡大した生物の形態を示す写真である
（ヘマトキシリン−エオシン染色、×１４０）。
（ヘマトキシリン−エオシン染色、×１４０）。
【図８】図６及び図７と同一移植片を抗ヒトＭＨＣ−ク
ラスＩ抗体により免疫組織染色したときの生物の形態を
示す写真である。
ラスＩ抗体により免疫組織染色したときの生物の形態を
示す写真である。
【図９】移植１７週間後の組織像を表す生物の形態を示
す写真である。
す写真である。
【図１０】図９と同一移植片を抗ヒトＭＨＣ−クラスＩ
抗体により免疫組織染色したときの生物の形態を示す写
真である。
抗体により免疫組織染色したときの生物の形態を示す写
真である。
フロントページの続き (72)発明者 片貝 祐子 神奈川県川崎市高津区梶ヶ谷２丁目６番地 16 よしみず荘210 (72)発明者 猪口 貞樹 東京都世田谷区瀬田２丁目32番20−201号
Claims (7)
- 【請求項１】 培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散させ
て支持体をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重層し
て得られる複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下に移
植し、その後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除して移
植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面において再
構成せしめることを特徴とする培養ヒト皮膚細胞の非ヒ
ト動物への移植法。 - 【請求項２】 ゲルがコラーゲンゲルである請求項１記
載の移植法。 - 【請求項３】 免疫不全非ヒト動物が免疫不全マウスで
ある請求項１記載の移植法。 - 【請求項４】 複合皮膚片を皮膚被覆材とともに免疫不
全非ヒト動物の皮下に移植することを特徴とする請求項
１記載の移植法。 - 【請求項５】 培養ヒト線維芽細胞をゲル中に分散させ
て支持体をつくり、その上に培養ヒト表皮細胞を重層し
て得られる複合皮膚片を免疫不全非ヒト動物の皮下に移
植し、その後、移植皮膚片上の該動物表皮を切除して移
植皮膚片を露出させ、ヒト皮膚組織を体表面において再
構成せしめることを特徴とするヒト皮膚組織を有する実
験動物の生産法。 - 【請求項６】 複合皮膚片を皮膚被覆材とともに免疫不
全非ヒト動物の皮下に移植することを特徴とする請求項
５記載の生産法。 - 【請求項７】 請求項５又は６記載の生産法により得る
ことができるヒト皮膚組織を有する実験動物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7351267A JPH09172909A (ja) | 1995-12-27 | 1995-12-27 | 培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物への移植法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7351267A JPH09172909A (ja) | 1995-12-27 | 1995-12-27 | 培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物への移植法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09172909A true JPH09172909A (ja) | 1997-07-08 |
Family
ID=18416165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7351267A Pending JPH09172909A (ja) | 1995-12-27 | 1995-12-27 | 培養ヒト皮膚細胞の非ヒト動物への移植法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09172909A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004344506A (ja) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | Kao Corp | 再構成皮膚の構築方法 |
| JP2008263980A (ja) * | 2007-04-18 | 2008-11-06 | Kao Corp | シミモデル動物 |
| JP2009532020A (ja) * | 2006-03-03 | 2009-09-10 | セ・イ・エ・エメ・ア・テ | 紫外線に過敏な移植されたヒト皮膚を含むマウスモデル |
-
1995
- 1995-12-27 JP JP7351267A patent/JPH09172909A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004344506A (ja) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | Kao Corp | 再構成皮膚の構築方法 |
| JP2009532020A (ja) * | 2006-03-03 | 2009-09-10 | セ・イ・エ・エメ・ア・テ | 紫外線に過敏な移植されたヒト皮膚を含むマウスモデル |
| JP2008263980A (ja) * | 2007-04-18 | 2008-11-06 | Kao Corp | シミモデル動物 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060314 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060711 |