JP2004331525A - 神経栄養因子様作用物質 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、神経疾患に有用な神経栄養因子様作用物質を、天然物から簡便に取得する手法の開発を課題とする。
【解決手段】マイタケの水乃至熱水抽出物に樹状突起伸長作用のあることを見出し、更にマイタケの水乃至熱水抽出物を添加したヒト神経芽細胞腫由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をＲＴ−ＰＣＲ法にて検討した結果、軸索遺伝子及び樹状突起遺伝子が発現されていることを見出し本発明を完成した。
【選択図】 なし
【解決手段】マイタケの水乃至熱水抽出物に樹状突起伸長作用のあることを見出し、更にマイタケの水乃至熱水抽出物を添加したヒト神経芽細胞腫由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をＲＴ−ＰＣＲ法にて検討した結果、軸索遺伝子及び樹状突起遺伝子が発現されていることを見出し本発明を完成した。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は神経栄養因子様作用物質に関する。更に詳しくは、マイタケ由来の神経栄養因子様作用物質及び該物質を含有する食品若しくは医薬品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年人口の高齢化と共に、痴呆患者も急増している。２０２０年には老人人口が２５％を越え、痴呆患者が３００万人以上になることも予想されている。老年期痴呆はアルツハイマー型痴呆と脳血管性痴呆に大別され、特に前者の増加が注目されている。又一方神経栄養因子、或いは神経栄養因子様作用物質が、アルツハイマー型痴呆、パーキンソン病等、脳神経変性疾患の治療薬へと発展する高い可能性を備えていると判断され（厚生科学研究費補助金（脳科学研究事業）平成１２年度総括研究報告書、「神経栄養因子の産生調節による神経細胞の保護・機能修復に関する研究」（非特許文献１））、この分野の開発が進められている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平９−２３８６９７号公報
【特許文献２】
特開２００１−１１９６５０号公報
【特許文献３】
特開２００１−１７２１９４号公報
【非特許文献１】
厚生科学研究費補助金（脳科学研究事業）平成１２年度総括研究報告書、「神経栄養因子の産生調節による神経細胞の保護・機能修復に関する研究」
【非特許文献２】
臨床精神医学 第２６巻、第１０号、１３５８〜１３６０ｐ（１９９７）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
神経疾患に有用な神経栄養因子様作用物質を、天然物から簡便に取得する手法の開発を課題とする。
【０００５】
【発明を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために、各種天然物抽出物について、種々濃度の存在下、ヒト神経芽細胞腫由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を２４〜９６時間培養して、樹状突起発現の状況を観察した。
その結果マイタケの水抽出物に樹状突起伸長作用のあることを見出した。
更にマイタケの水抽出物を添加したヒト神経芽細胞腫由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をＲＴ−ＰＣＲ法にて検討した結果、軸索遺伝子及び樹状突起遺伝子が発現されていることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
即ち本発明は、
（１）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出してなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（２）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、アルコールを加え生成する沈殿を採取することからなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（３）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで該溶液を噴霧乾燥することを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（４）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで更にアルコールを加え、生成する沈殿を採取することからなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項記載の神経栄養因子様作用物質を含有してなる食品、
（６）上記（１）〜（４）のいずれか１項記載の神経栄養因子様作用物質を含有してなる医薬品に関する。
【０００７】
神経栄養因子とは、一般に神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の作用に代表されるような、神経細胞の発達・分化・機能維持に重要な役割を果たす内因性生理活性物質と言われており（臨床精神医学 第２６巻、第１０号、１３５８〜１３６０ｐ（１９９７）（非特許文献２））、本発明で言う神経栄養因子様作用物質とは、上述の神経栄養因子様作用、若しくは神経栄養因子産生促進活性を有する物質を意味し、具体的には神経樹状突起や神経軸索の伸長作用を有する物質或いは神経樹状突起や神経軸索の遺伝子発現を誘発する物質を意味する。
そして、この神経栄養因子様作用物質が、前述のようにアルツハイマー型痴呆やパーキンソン病等特定の神経細胞が死滅することにより引き起こされる脳神経性変性疾患への応用に有効であると言われている。
【０００８】
マイタケの水乃至熱水抽出物については、本出願人の開発努力により多彩な作用が知られており、例えば抗腫瘍作用については、特開平９−２３８６９７号公報（特許文献１）に、活性酸素消去活性については特開２００１−１１９６５０号公報（特許文献２）に、ＮＯ産生誘導作用については特開２００１−１７２１９４号公報（特許文献３）等で報告されている。
本発明者等は、このマイタケの水乃至熱水抽出物に神経栄養因子様作用物質の有無を研究してみたところ、該物質を見出すことに成功した。
本物質は、食用のマイタケから抽出されたもので、毒性はなく新しい形の食品として利用できる。医薬品としても応用できることは勿論である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下本発明について詳述する。
本発明において、マイタケは（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、白マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、チョレイマイタケ（Ｄｅｎｄｒｏｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ）、トンビマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉａ）等いづれも用いることが出来る。又これらマイタケ類の子実体、菌糸体いずれも用いることが出来るが、最近ではマイタケの子実体の人工栽培が可能となり、安定した原料確保の面から該マイタケの子実体を使用するのが好ましい。
【００１０】
生マイタケは収穫後、出来るだけ新鮮なものを使用するのが好ましいが、食に供する状態であれば用いることができる。使用部位は特に特定される事なく茎部以上すべて使用しうる。乾燥マイタケとしては天日、熱風乾燥或いは凍結乾燥したもの等いずれも用いることが出来る。マイタケ粉末は粒子の粗いものから微細なものまで使用することが出来る。
【００１１】
抽出の方法は水乃至熱水で行う。「水乃至熱水」とは水から熱水に至るまでを意味し、温水も当然包含される。従って抽出は、常温、加温若しくは加熱下、常圧若しくは加圧下、常法に準じて適宜行いうる。
例えば常温〜１２０℃で５分〜数時間行う。短時間で、圧力下、１００℃以上、例えば圧力釜を用いて加圧下１２０℃前後で５分〜１時間前後抽出を行うのが好ましい。
【００１２】
水としては蒸留水、イオン交換水、水道水、天然水いずれも使用しうる。乾燥マイタケ若しくはマイタケ粉末１重量に対して水乃至熱水を４〜２０倍重量程度使用する。生マイタケを使用する場合は１重量に対して２〜１０倍重量程度の水乃至熱水を使用する。
以上の様に水乃至熱水抽出液はそのまま、更に濃縮して濃縮エキス若しくは濃縮エキスを乾燥して乾燥抽出エキス末として使用することが出来る。
【００１３】
水乃至熱水抽出液はアルコール沈殿法により精製することが可能である。例えばアルコールを抽出液もしくは必要に応じてその濃縮した液に加え沈殿する物質を採取する。沈殿物はマイタケ中に含まれる高分子多糖体β−グルカンを主体にした画分であり、このまま利用できる。また必要に応じて更に精製することも可能である。例えばアルコールを水乃至熱水抽出液もしくは必要に応じてその濃縮した液に沈殿が生じない程度に加え、望ましくは１〜２５℃で、放置し生ずる液面、液中に浮遊する物質或いは容器の壁に付着する物資を除去して精製することができる。除去は濾過、ピペッティング或いは網状のもので掬うなど適宜行いうる。
【００１４】
沈殿が生じない程度のアルコールの添加量は、抽出液の濃度や温度により異なり、一概には決めがたいが、アルコールの最終容量濃度が比較低濃度、即ち約３０〜６０容量％を目安にする。
尚、アルコールとしては低級アルコールが使用しうるが、特にエタノールが好ましい。
【００１５】
この様にして得られた溶液はそのまま濃縮・乾燥若しくは噴霧・乾燥しても良いし、必要に応じて、アルコールを比較的高濃度、即ち最終容量濃度が６０容量％以上になるよう加え、沈殿する物質を採取する様な手段をとることにより精製することもできる。
【００１６】
以上のように得られた沈殿物は水に可溶で水溶液とし上述の様にアルコール沈殿法を繰り返すことにより更に精製することも出来る。又高分子多糖体画分は、更にクロマトグラフィーにより、精製することも可能である。例えば ゲル濾過法、イオンクロマト法、アフィニティクロマト法等使用することが出来る。
【００１７】
本発明により得られたマイタケの抽出物についての神経栄養因子様作用についての評価は、以下の様にして行った。
（１）樹状突起発現算定
ヒト神経芽細胞腫由来ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いて、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、ニッスイ）に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を添加した培地に、検体であるマイタケ抽出物、ポジティブコントロールとして、ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）を、１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭに溶解後、種々濃度に希釈して、添加し２４〜９６時間培養後、位相差顕微鏡により、数視野を観察し、樹状突起（５０μｍ以上）の発現の割合を算定した。
マイタケ抽出物、ＮＧＦ共に樹状突起発現を促進し、７２時間をピークに以後９６時間に向け減少するパターンを示した。
【００１８】
（２）関連遺伝子発現の検出
ヒト神経芽細胞腫由来ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にマイタケ抽出物又はＮＧＦを添加して培養した細胞をＰＴ−ＰＣＲ法により常法に従い検討した。対象とした遺伝子は軸索遺伝子（Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）と樹状突起遺伝子（ＭＡＰ２、Ａｒｃ）の計４種である。
検討の結果マイタケ抽出物では、Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、ＭＡＰ２、Ａｒｃいずれもが２４時間〜４８時間で検出された。
【００１９】
一般に神経栄養因子様作用物質が、前述のようにアルツハイマー型痴呆やパーキンソン病等特定の神経細胞が死滅することにより引き起こされる脳神経性変性疾患への応用が可能であるところより、本発明によって得られた神経栄養因子様作用物質も、脳神経性変性疾患の治療薬やその罹患危険の軽減のための食品としての応用も可能である。その経口摂取量は成人１日当たり（濃縮乾燥粉末で）５０〜５００ｍｇを目安とするが、必要に応じ増減することができる。
【００２０】
例えば食品として応用する場合は、健康食品、サプリメント、機能性食品として用いることができるが、一般的な食品、例えば菓子・パン類、麺類、調味料、香辛類、食用粉類、乳製品、肉製品、加工水産物、加工果実・野菜、各種飲料・ジュース類、お茶、インスタント食品等に配合することができる。
健康食品、サプリメント、機能性食品又は医薬品として用いる場合は適宜、賦形剤、増量剤を加え錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、懸濁液剤等各種製剤に加工することができる。
以下に実施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【００２１】
〔実施例１〕
神経栄養因子様作用物質の製造
乾燥マイタケ子実体の粉末１０ｋｇにイオン交換水１２０Ｌを加圧釜に入れ、加圧下１１５〜１２０℃で約０．５時間処理し、その後濾過して褐色液（Ａ）約８０Ｌを得た。
（１）該褐色液（Ａ）３０Ｌを取り、減圧下濃縮してＢｒｉｘ濃度２０％の濃縮液を得、該濃縮液をスプレードライ装置用いて噴霧乾燥して褐色乾燥粉末（試料１）約９００ｇを得た。
（２）該褐色液（Ａ）５Ｌを取り、減圧下、約１Ｌまで濃縮し室温で９９％エタノールを約４Ｌ加え、約１０時間放置して褐色沈殿を回収し、それを減圧乾燥して褐色物質１０５ｇを得た。
（３）該褐色液（Ａ）を４０Ｌとり減圧下約５Ｌまで濃縮し、室温で９９％エタノールを同容量加え、１０℃以下で約１０時間放置すると液面、液中に浮遊及び容器の壁面に付着する茶褐色の物質が生成した。これら物質を除去し、褐色の溶液を得る。
（４）上記（３）で得た褐色の液約９．８Ｌを減圧下エタノールを除去し、更に濃縮してＢｒｉｘ濃度３５％の濃縮液を得た。該濃縮液をスプレードライ装置を用いて噴霧乾燥して褐色乾燥粉末（試料２）約１．１ｋｇを得た。
該試料２についてラットを用いた急性経口毒性試験において、ＬＤ５０値は２ｇ／ｋｇ以上を示し、毒性を示さなかった。
【００２２】
〔実施例２〕
神経芽細胞腫由来細胞の形態変化の観察
（１）細胞
ヒト神経芽細胞腫由来の細胞として、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を選び、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＭＥＭ、ニッスイ）に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を加えた培地で３７℃で、５％炭酸ガス存在下で培養した。
（２）試料の調製
上記実施例１で得た試料１及び２は、ミリポアフィルターにより滅菌後血清添加培地で希釈して調製した。比較対照として用いたＮＧＦ（ヒト神経成長因子、ＳＩＧＭＡ）は本発明の試料と同様に血清添加ＭＥＭ培地で希釈して用いた。
（３）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の形態変化の観察
試料１及び試料２について、各々２４穴プレートを用いて細胞数１×１０５ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを接種し、種々の濃度の試料又はＮＧＦ存在下で２４〜９６時間培養後，位相差顕微鏡で数視野を観察した。突起伸長が５０μｍ以上のものを突起発現有りとし、樹状突起発現の割合を算定した。又対照細胞は被験試料非存在で培養した。
【００２３】
結果は図１（試料１）及び図２（試料２）に示す。
図１から１００μｇ／ｍｌで培養後７２時間で、対照に比較して有意に樹状突起発現の割合が増加したことがわかる。
図２から試料２は５０μｇ／ｍｌにおいて４８時間後、７２時間後に対照に比較して有意に樹状突起発現の割合が増加したことがわかる。
【００２４】
〔実施例３〕
ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現
試料１及び試料２についてそれぞれ、ＮＧＦを添加した細胞と被験試料非存在細胞からＲＮＡを抽出し、その２μｇを逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ ）とＯｌｉｇｏ （ ｄＴ ）プライマーによりＤＮＡへ逆転写した。その後、Ｔａｕ （３７５ｂｐ ）、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ （ ４４６ｂｐ ） 、ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （ ＭＡＰ２） （ ６０７ｂｐ ）、Ａｒｃ （６２５ｂｐ ）の４種のプライマーを用いて標的遺伝子の増幅を行った。Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ は軸索遺伝子、ＭＡＰ２、Ａｒｃは樹状突起遺伝子である。増幅する際のプログラムは、９４℃ ６０ｓ、６１℃ ６０ｓ 、７２℃ ６０ｓ で３０ｃｙｃｌｅとし、最終的な ＰＣＲ産物は２．０％アガロースゲルにて３０分間電気泳動を行った。また、バンドの強度は、ＥＤＡＳ ２９０ （ Ｋｏｄａｃ ）を用いて解析した。この際、内部標準として ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ−ａｓｅ （ＧＡＰＤＨ ） （３０７ｐｂ ）を用いた。
得られたデータの解析にはｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）， ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎを用いた。
【００２５】
以上関連遺伝子発現について、図３に示されたように、試料１は上記４種のうち１種（ＭＡＰ２）のみに発現が検出され、試料２については４種（Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、ＭＡＰ２、Ａｒｃ）に発現が検出されたことが図４から図７に示されている。
【００２６】
すなわち、図３のＭＡＰ ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過をみると、試料１の５０μｇ／ｍｌで２４時間及び４８時間で対照を上回る発現が検出された。
また、図４のＴａｕ（軸索遺伝子）発現の時間的経過では、試料２では２４時間、４８時間で検出され発現の程度は低いものの、２４時間、４８時間何れにおいても神経細胞因子（ＮＧＦ）を上回る発現が検出された。
【００２７】
図５のＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（軸索遺伝子）発現の時間的経過では、試料２において２４時間後に神経成長因子（ＮＧＦ）の倍近くの発現が検出されたが、４８時間後には半減し神経成長因子（ＮＧＦ）や対照と同程度になった。
図６のＭＡＰ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過をみると、２４時間では発現が僅かに検出される程度であったが、４８時間後には神経成長因子（ＮＧＦ）及び対照に比べ著しく発現が検出された。
【００２８】
図７のＡｒｃ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過では、２４時間、４８時間後に発現が検出されたが、対照と比較して発現率に有意な差は認められなかった。４８時間後に神経成長因子（ＮＧＦ）の値は低下しＮＧＦとは有意な差が認められた。
以上の実施例２から、本発明のマイタケ抽出物には神経栄養因子様作用物質が含まれていることが明らかとなった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、マイタケのような容易に入手可能な天然物から、アルツハイマー型痴呆やパーキンソ病の様な脳神経変性疾患に有用な神経栄養因子様作用物質を取り出すことができ、食品、医薬品として用いることができる。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】試料１において樹状突起伸長に及ぼす影響を示す図。
【図２】試料２において樹状突起伸長に及ぼす影響を示す図。
【図３】試料１においてＭＡＰ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図４】試料２においてＴａｕ（軸索遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図５】試料２においてＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（軸索遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図６】試料２においてＭＡＰ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図７】試料２においてＡｒｃ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は神経栄養因子様作用物質に関する。更に詳しくは、マイタケ由来の神経栄養因子様作用物質及び該物質を含有する食品若しくは医薬品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年人口の高齢化と共に、痴呆患者も急増している。２０２０年には老人人口が２５％を越え、痴呆患者が３００万人以上になることも予想されている。老年期痴呆はアルツハイマー型痴呆と脳血管性痴呆に大別され、特に前者の増加が注目されている。又一方神経栄養因子、或いは神経栄養因子様作用物質が、アルツハイマー型痴呆、パーキンソン病等、脳神経変性疾患の治療薬へと発展する高い可能性を備えていると判断され（厚生科学研究費補助金（脳科学研究事業）平成１２年度総括研究報告書、「神経栄養因子の産生調節による神経細胞の保護・機能修復に関する研究」（非特許文献１））、この分野の開発が進められている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平９−２３８６９７号公報
【特許文献２】
特開２００１−１１９６５０号公報
【特許文献３】
特開２００１−１７２１９４号公報
【非特許文献１】
厚生科学研究費補助金（脳科学研究事業）平成１２年度総括研究報告書、「神経栄養因子の産生調節による神経細胞の保護・機能修復に関する研究」
【非特許文献２】
臨床精神医学 第２６巻、第１０号、１３５８〜１３６０ｐ（１９９７）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
神経疾患に有用な神経栄養因子様作用物質を、天然物から簡便に取得する手法の開発を課題とする。
【０００５】
【発明を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために、各種天然物抽出物について、種々濃度の存在下、ヒト神経芽細胞腫由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を２４〜９６時間培養して、樹状突起発現の状況を観察した。
その結果マイタケの水抽出物に樹状突起伸長作用のあることを見出した。
更にマイタケの水抽出物を添加したヒト神経芽細胞腫由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をＲＴ−ＰＣＲ法にて検討した結果、軸索遺伝子及び樹状突起遺伝子が発現されていることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
即ち本発明は、
（１）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出してなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（２）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、アルコールを加え生成する沈殿を採取することからなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（３）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで該溶液を噴霧乾燥することを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（４）生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで更にアルコールを加え、生成する沈殿を採取することからなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質、
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項記載の神経栄養因子様作用物質を含有してなる食品、
（６）上記（１）〜（４）のいずれか１項記載の神経栄養因子様作用物質を含有してなる医薬品に関する。
【０００７】
神経栄養因子とは、一般に神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の作用に代表されるような、神経細胞の発達・分化・機能維持に重要な役割を果たす内因性生理活性物質と言われており（臨床精神医学 第２６巻、第１０号、１３５８〜１３６０ｐ（１９９７）（非特許文献２））、本発明で言う神経栄養因子様作用物質とは、上述の神経栄養因子様作用、若しくは神経栄養因子産生促進活性を有する物質を意味し、具体的には神経樹状突起や神経軸索の伸長作用を有する物質或いは神経樹状突起や神経軸索の遺伝子発現を誘発する物質を意味する。
そして、この神経栄養因子様作用物質が、前述のようにアルツハイマー型痴呆やパーキンソン病等特定の神経細胞が死滅することにより引き起こされる脳神経性変性疾患への応用に有効であると言われている。
【０００８】
マイタケの水乃至熱水抽出物については、本出願人の開発努力により多彩な作用が知られており、例えば抗腫瘍作用については、特開平９−２３８６９７号公報（特許文献１）に、活性酸素消去活性については特開２００１−１１９６５０号公報（特許文献２）に、ＮＯ産生誘導作用については特開２００１−１７２１９４号公報（特許文献３）等で報告されている。
本発明者等は、このマイタケの水乃至熱水抽出物に神経栄養因子様作用物質の有無を研究してみたところ、該物質を見出すことに成功した。
本物質は、食用のマイタケから抽出されたもので、毒性はなく新しい形の食品として利用できる。医薬品としても応用できることは勿論である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下本発明について詳述する。
本発明において、マイタケは（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、白マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、チョレイマイタケ（Ｄｅｎｄｒｏｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ）、トンビマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉａ）等いづれも用いることが出来る。又これらマイタケ類の子実体、菌糸体いずれも用いることが出来るが、最近ではマイタケの子実体の人工栽培が可能となり、安定した原料確保の面から該マイタケの子実体を使用するのが好ましい。
【００１０】
生マイタケは収穫後、出来るだけ新鮮なものを使用するのが好ましいが、食に供する状態であれば用いることができる。使用部位は特に特定される事なく茎部以上すべて使用しうる。乾燥マイタケとしては天日、熱風乾燥或いは凍結乾燥したもの等いずれも用いることが出来る。マイタケ粉末は粒子の粗いものから微細なものまで使用することが出来る。
【００１１】
抽出の方法は水乃至熱水で行う。「水乃至熱水」とは水から熱水に至るまでを意味し、温水も当然包含される。従って抽出は、常温、加温若しくは加熱下、常圧若しくは加圧下、常法に準じて適宜行いうる。
例えば常温〜１２０℃で５分〜数時間行う。短時間で、圧力下、１００℃以上、例えば圧力釜を用いて加圧下１２０℃前後で５分〜１時間前後抽出を行うのが好ましい。
【００１２】
水としては蒸留水、イオン交換水、水道水、天然水いずれも使用しうる。乾燥マイタケ若しくはマイタケ粉末１重量に対して水乃至熱水を４〜２０倍重量程度使用する。生マイタケを使用する場合は１重量に対して２〜１０倍重量程度の水乃至熱水を使用する。
以上の様に水乃至熱水抽出液はそのまま、更に濃縮して濃縮エキス若しくは濃縮エキスを乾燥して乾燥抽出エキス末として使用することが出来る。
【００１３】
水乃至熱水抽出液はアルコール沈殿法により精製することが可能である。例えばアルコールを抽出液もしくは必要に応じてその濃縮した液に加え沈殿する物質を採取する。沈殿物はマイタケ中に含まれる高分子多糖体β−グルカンを主体にした画分であり、このまま利用できる。また必要に応じて更に精製することも可能である。例えばアルコールを水乃至熱水抽出液もしくは必要に応じてその濃縮した液に沈殿が生じない程度に加え、望ましくは１〜２５℃で、放置し生ずる液面、液中に浮遊する物質或いは容器の壁に付着する物資を除去して精製することができる。除去は濾過、ピペッティング或いは網状のもので掬うなど適宜行いうる。
【００１４】
沈殿が生じない程度のアルコールの添加量は、抽出液の濃度や温度により異なり、一概には決めがたいが、アルコールの最終容量濃度が比較低濃度、即ち約３０〜６０容量％を目安にする。
尚、アルコールとしては低級アルコールが使用しうるが、特にエタノールが好ましい。
【００１５】
この様にして得られた溶液はそのまま濃縮・乾燥若しくは噴霧・乾燥しても良いし、必要に応じて、アルコールを比較的高濃度、即ち最終容量濃度が６０容量％以上になるよう加え、沈殿する物質を採取する様な手段をとることにより精製することもできる。
【００１６】
以上のように得られた沈殿物は水に可溶で水溶液とし上述の様にアルコール沈殿法を繰り返すことにより更に精製することも出来る。又高分子多糖体画分は、更にクロマトグラフィーにより、精製することも可能である。例えば ゲル濾過法、イオンクロマト法、アフィニティクロマト法等使用することが出来る。
【００１７】
本発明により得られたマイタケの抽出物についての神経栄養因子様作用についての評価は、以下の様にして行った。
（１）樹状突起発現算定
ヒト神経芽細胞腫由来ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いて、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、ニッスイ）に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を添加した培地に、検体であるマイタケ抽出物、ポジティブコントロールとして、ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）を、１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭに溶解後、種々濃度に希釈して、添加し２４〜９６時間培養後、位相差顕微鏡により、数視野を観察し、樹状突起（５０μｍ以上）の発現の割合を算定した。
マイタケ抽出物、ＮＧＦ共に樹状突起発現を促進し、７２時間をピークに以後９６時間に向け減少するパターンを示した。
【００１８】
（２）関連遺伝子発現の検出
ヒト神経芽細胞腫由来ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にマイタケ抽出物又はＮＧＦを添加して培養した細胞をＰＴ−ＰＣＲ法により常法に従い検討した。対象とした遺伝子は軸索遺伝子（Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）と樹状突起遺伝子（ＭＡＰ２、Ａｒｃ）の計４種である。
検討の結果マイタケ抽出物では、Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、ＭＡＰ２、Ａｒｃいずれもが２４時間〜４８時間で検出された。
【００１９】
一般に神経栄養因子様作用物質が、前述のようにアルツハイマー型痴呆やパーキンソン病等特定の神経細胞が死滅することにより引き起こされる脳神経性変性疾患への応用が可能であるところより、本発明によって得られた神経栄養因子様作用物質も、脳神経性変性疾患の治療薬やその罹患危険の軽減のための食品としての応用も可能である。その経口摂取量は成人１日当たり（濃縮乾燥粉末で）５０〜５００ｍｇを目安とするが、必要に応じ増減することができる。
【００２０】
例えば食品として応用する場合は、健康食品、サプリメント、機能性食品として用いることができるが、一般的な食品、例えば菓子・パン類、麺類、調味料、香辛類、食用粉類、乳製品、肉製品、加工水産物、加工果実・野菜、各種飲料・ジュース類、お茶、インスタント食品等に配合することができる。
健康食品、サプリメント、機能性食品又は医薬品として用いる場合は適宜、賦形剤、増量剤を加え錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、懸濁液剤等各種製剤に加工することができる。
以下に実施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【００２１】
〔実施例１〕
神経栄養因子様作用物質の製造
乾燥マイタケ子実体の粉末１０ｋｇにイオン交換水１２０Ｌを加圧釜に入れ、加圧下１１５〜１２０℃で約０．５時間処理し、その後濾過して褐色液（Ａ）約８０Ｌを得た。
（１）該褐色液（Ａ）３０Ｌを取り、減圧下濃縮してＢｒｉｘ濃度２０％の濃縮液を得、該濃縮液をスプレードライ装置用いて噴霧乾燥して褐色乾燥粉末（試料１）約９００ｇを得た。
（２）該褐色液（Ａ）５Ｌを取り、減圧下、約１Ｌまで濃縮し室温で９９％エタノールを約４Ｌ加え、約１０時間放置して褐色沈殿を回収し、それを減圧乾燥して褐色物質１０５ｇを得た。
（３）該褐色液（Ａ）を４０Ｌとり減圧下約５Ｌまで濃縮し、室温で９９％エタノールを同容量加え、１０℃以下で約１０時間放置すると液面、液中に浮遊及び容器の壁面に付着する茶褐色の物質が生成した。これら物質を除去し、褐色の溶液を得る。
（４）上記（３）で得た褐色の液約９．８Ｌを減圧下エタノールを除去し、更に濃縮してＢｒｉｘ濃度３５％の濃縮液を得た。該濃縮液をスプレードライ装置を用いて噴霧乾燥して褐色乾燥粉末（試料２）約１．１ｋｇを得た。
該試料２についてラットを用いた急性経口毒性試験において、ＬＤ５０値は２ｇ／ｋｇ以上を示し、毒性を示さなかった。
【００２２】
〔実施例２〕
神経芽細胞腫由来細胞の形態変化の観察
（１）細胞
ヒト神経芽細胞腫由来の細胞として、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を選び、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＭＥＭ、ニッスイ）に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を加えた培地で３７℃で、５％炭酸ガス存在下で培養した。
（２）試料の調製
上記実施例１で得た試料１及び２は、ミリポアフィルターにより滅菌後血清添加培地で希釈して調製した。比較対照として用いたＮＧＦ（ヒト神経成長因子、ＳＩＧＭＡ）は本発明の試料と同様に血清添加ＭＥＭ培地で希釈して用いた。
（３）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の形態変化の観察
試料１及び試料２について、各々２４穴プレートを用いて細胞数１×１０５ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを接種し、種々の濃度の試料又はＮＧＦ存在下で２４〜９６時間培養後，位相差顕微鏡で数視野を観察した。突起伸長が５０μｍ以上のものを突起発現有りとし、樹状突起発現の割合を算定した。又対照細胞は被験試料非存在で培養した。
【００２３】
結果は図１（試料１）及び図２（試料２）に示す。
図１から１００μｇ／ｍｌで培養後７２時間で、対照に比較して有意に樹状突起発現の割合が増加したことがわかる。
図２から試料２は５０μｇ／ｍｌにおいて４８時間後、７２時間後に対照に比較して有意に樹状突起発現の割合が増加したことがわかる。
【００２４】
〔実施例３〕
ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現
試料１及び試料２についてそれぞれ、ＮＧＦを添加した細胞と被験試料非存在細胞からＲＮＡを抽出し、その２μｇを逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ ）とＯｌｉｇｏ （ ｄＴ ）プライマーによりＤＮＡへ逆転写した。その後、Ｔａｕ （３７５ｂｐ ）、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ （ ４４６ｂｐ ） 、ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （ ＭＡＰ２） （ ６０７ｂｐ ）、Ａｒｃ （６２５ｂｐ ）の４種のプライマーを用いて標的遺伝子の増幅を行った。Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ は軸索遺伝子、ＭＡＰ２、Ａｒｃは樹状突起遺伝子である。増幅する際のプログラムは、９４℃ ６０ｓ、６１℃ ６０ｓ 、７２℃ ６０ｓ で３０ｃｙｃｌｅとし、最終的な ＰＣＲ産物は２．０％アガロースゲルにて３０分間電気泳動を行った。また、バンドの強度は、ＥＤＡＳ ２９０ （ Ｋｏｄａｃ ）を用いて解析した。この際、内部標準として ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ−ａｓｅ （ＧＡＰＤＨ ） （３０７ｐｂ ）を用いた。
得られたデータの解析にはｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）， ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎを用いた。
【００２５】
以上関連遺伝子発現について、図３に示されたように、試料１は上記４種のうち１種（ＭＡＰ２）のみに発現が検出され、試料２については４種（Ｔａｕ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、ＭＡＰ２、Ａｒｃ）に発現が検出されたことが図４から図７に示されている。
【００２６】
すなわち、図３のＭＡＰ ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過をみると、試料１の５０μｇ／ｍｌで２４時間及び４８時間で対照を上回る発現が検出された。
また、図４のＴａｕ（軸索遺伝子）発現の時間的経過では、試料２では２４時間、４８時間で検出され発現の程度は低いものの、２４時間、４８時間何れにおいても神経細胞因子（ＮＧＦ）を上回る発現が検出された。
【００２７】
図５のＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（軸索遺伝子）発現の時間的経過では、試料２において２４時間後に神経成長因子（ＮＧＦ）の倍近くの発現が検出されたが、４８時間後には半減し神経成長因子（ＮＧＦ）や対照と同程度になった。
図６のＭＡＰ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過をみると、２４時間では発現が僅かに検出される程度であったが、４８時間後には神経成長因子（ＮＧＦ）及び対照に比べ著しく発現が検出された。
【００２８】
図７のＡｒｃ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過では、２４時間、４８時間後に発現が検出されたが、対照と比較して発現率に有意な差は認められなかった。４８時間後に神経成長因子（ＮＧＦ）の値は低下しＮＧＦとは有意な差が認められた。
以上の実施例２から、本発明のマイタケ抽出物には神経栄養因子様作用物質が含まれていることが明らかとなった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、マイタケのような容易に入手可能な天然物から、アルツハイマー型痴呆やパーキンソ病の様な脳神経変性疾患に有用な神経栄養因子様作用物質を取り出すことができ、食品、医薬品として用いることができる。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】試料１において樹状突起伸長に及ぼす影響を示す図。
【図２】試料２において樹状突起伸長に及ぼす影響を示す図。
【図３】試料１においてＭＡＰ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図４】試料２においてＴａｕ（軸索遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図５】試料２においてＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（軸索遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図６】試料２においてＭＡＰ２ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
【図７】試料２においてＡｒｃ （樹状突起遺伝子）発現の時間的経過を示す図。
Claims (6)
- 生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出してなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質。
- 生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、アルコールを加え生成する沈殿を採取することからなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質。
- 生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで該溶液を噴霧乾燥することを特徴とする神経栄養因子様作用物質。
- 生マイタケ、乾燥マイタケ及びマイタケ粉末のいずれか１以上から水乃至熱水で抽出して得られる抽出液に、沈殿が生じない程度にアルコールを加え、放置後液面若しくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質を取り除き、次いで更にアルコールを加え、生成する沈殿を採取することからなることを特徴とする神経栄養因子様作用物質。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載の神経栄養因子様作用物質を含有してなる食品。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載の神経栄養因子様作用物質を含有してなる医薬品。
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