JP2004301630A - 生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗原抗体反応の反応温度および／または洗浄液のｐＨを調節することによってＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させること。
【解決手段】（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；
を含む、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（２）の反応温度が３４℃〜４０℃であることを特徴とする上記の検出方法。
【選択図】 なし
【解決手段】（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；
を含む、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（２）の反応温度が３４℃〜４０℃であることを特徴とする上記の検出方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レセプターまたはリガンドを検出するアッセイ法に関する。より詳細には、本発明は、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットなどの支持体を利用して、レセプターまたはリガンドを検出するアッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプターをスポッター装置を用いて滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプターまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプターと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【０００３】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプターのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプターまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
上記の方法の一例としては、例えば、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法が挙げられる。例えば、抗原に対する抗体として酵素標識抗体を使用した場合には、抗原抗体反応後に、発色又は発光基質を添加することにより、抗原に結合した抗体の存在を検出することができる。ここで行う抗原抗体反応の反応温度に関して、従来は、一般に室温（２５℃）で行なっていた。しかし、これでは、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）が低いという問題があった。さらに、上記抗原抗体反応後は、洗浄液を用いて未反応の抗体を洗浄・除去しているが、従来はｐＨ７．５の洗浄液を用いて洗浄を行なっていた。しかし、これでは、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）が低いという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２８３７２７６号公報
【非特許文献１】
「ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２１， ｐ．２５−ｐ．３２（１９９９）
【非特許文献２】
「バイオインダストリー」Ｖｏｌ．１８， ｐ．１３−ｐ．１９（２００１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術における問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、抗原抗体反応の反応温度および／または洗浄液のｐＨを調節することによってＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗原抗体反応（本明細書の実施例では、ＤＩＧとＤＩＧ抗体との間の抗原抗体反応を使用した）を３４℃〜４０℃で行うことにより検出のＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができること、並びに抗体の洗浄液のｐＨを５．０から７．３にすることにより検出のＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；
を含む、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（２）の反応温度が３４℃〜４０℃であることを特徴とする上記の検出方法が提供される。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；及び
（３）洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程；
を含む検体中の抗原標識されたリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５．０〜７．３であることを特徴とする上記の検出方法が提供される。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；及び
（３）洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程；
を含む検体中の抗原標識されたリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程２の反応温度が３４℃〜４０℃であり、かつ上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５．０から７．３であることを特徴とする上記の検出方法が提供される。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、支持体は多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法に関するものであり、より具体的には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程によって行う。本発明の第一の態様では、上記工程（２）の反応温度を３４℃〜４０℃とする。さらに本発明では、上記工程（２）の後に、洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程（３）を行うことができる。本発明の第二の態様では、上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５から７．３である。本発明においては、上記の特徴により検出のＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができる。
【００１３】
本発明で用いる支持体の種類は特に限定されないが、好ましい一例としては、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを使用することができる。以下、図面を参照して、生化学解析用ユニットを使用する場合の本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプター５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００１４】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１５】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００１６】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２ 未満であり、好ましくは１ｍｍ２ 未満であり、０．３ｍｍ２ 未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２ 未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２ 以上であることが好ましい。
【００１７】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２ 以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２ 以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２ 以上、さらには１０００個／ｃｍ２ 以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２ 以下、さらには１００００個／ｃｍ２ 以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００１８】
本発明において、吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００１９】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２０】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２１】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２２】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２３】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプターがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００２４】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの一の実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器８と溶液循環パイプ１４とポンプ１５とからなり、反応容器８は、生化学解析用ユニット１を保持するとともに液漏れを防止するシール機能を有する生化学解析用ユニット保持部７を有しており、反応容器本体９は、反応容器上半部１０と反応容器下半部１１とからなり、反応容器上半部１０は反応容器本体９に取り外し可能に設けられており、生化学解析用ユニット１は反応容器上半部１０を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。
【００２５】
また、図２に示されるように、反応容器下半部１１の底壁には溶液が流通可能な溶液流入口１２が形成され、反応容器上半部１０の頂壁には同様に溶液が流通可能な溶液流出口１３が形成されている。さらに流入口１２および流出口１３には、溶液循環パイプ１４がそれぞれ取り外し可能に取り付けられている。リアクタは、ポンプ１５によって溶液が流入口１２から反応容器本体９に入り、生化学解析用ユニット１を通過した後、流出口１３から出て、溶液循環パイプ１４を通って循環するように構成されている。
【００２６】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。このリアクタは、図２に示すポンプの代わりにシリンジ１６とピストン１７が設けられているもので、反応溶液が反応容器内で往復流動するように構成したものである。このように、反応溶液の強制的流動は、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を往復流動するものであってもよい。
【００２７】
なお、図２および図３はともに、反応溶液が生化学解析用ユニットを循環するタイプのリアクタを示しているが、反応溶液が生化学解析用ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過するのみで、反応溶液が循環しないタイプのリアクタを用いることも可能である。
【００２８】
本発明のアッセイ法では、先ず、リガンドまたはレセプターが結合された支持体（例えば、上記したような多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域）に、抗原標識されたレセプターまたはリガンドを含む検体を接触させる。
【００２９】
支持体に結合されるリガンドまたはレセプターは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。
【００３０】
抗原標識されたリガンド又はレセプターは、支持体に結合されるレセプター又はリガンドと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、抗原によって標識されたものである。
【００３１】
抗原の種類は特に限定されず、抗体と特異的に結合することができ、該抗体を入手できるものであれば、任意の抗原を使用することができる。例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン又はアビジンなどの抗原を挙げることができる。
【００３２】
本発明では、次いで、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる。
上記抗原としてジゴキシゲニン、ビオチン又はアビジンを使用した場合には、それぞれ抗ジゴキシゲニン抗体、アビジン又はビオチンを抗体として使用することができる。
【００３３】
上記抗体には、検出のための標識物質が結合していることが好ましい。標識物質としては、標記物質そのものが発光、発色あるいは光を照射することによって蛍光を放出するものであっても、標識物質に何らかの化学物質を接触させて、標識物質によって化学物質が分解あるいは反応する等して発光、発色あるいは蛍光を放出するものであってもよい。前者の標識物質としては、発光物質にアクリジニウムエステル等、発色物質に金コロイド粒子等、蛍光物質にフルオレセイン等を用いることができる。また、後者の標識物質としては、酵素を用いることができ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質あるいは色素基質あるいは蛍光基質を接触させることによってそれぞれ、化学発光、発色、蛍光を放出する。
【００３４】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。また、色素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。蛍光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。
【００３５】
次に、本発明のアッセイ法の一例として、生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプターを固定し、抗原で標識された抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドをハイブリダイゼーションなどによって、吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプターと特異的に結合させ、続いて、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを、上記抗原に対する抗体を、化学発光を生じさせる酵素で標識し（以下、酵素標識抗体という）、この酵素標識抗体を抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する化学発光法によるアッセイ法を例に、順を追って説明する。
【００３６】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプターを結合させる。
【００３７】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプターは前述した通りであり、リガンドまたはレセプターは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプターがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００３８】
次に、吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプターに抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを特異的に結合させる。
【００３９】
抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターと特異的に結合させた後、生化学解析用ユニットを上記図２または図３等に示す、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に取り付ける。なお、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドが吸着性領域を閉塞させるようなものではない、例えば抗原結合ＤＮＡのような場合には、吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプターに抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを特異的に結合させる段階から生化学解析用ユニットを反応容器に取り付けてもよい。この場合には、吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターに、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを効率的かつ均一に接触させることができるので、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドの検出限界をさらに向上させることができるとともに、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドが微量であっても、よりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００４０】
また、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターと抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを特異的に結合する段階から、後述する抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドに酵素標識抗体を特異的に結合する段階まで、吸着性領域にそれぞれの反応溶液を強制的に流動させる方法により行うことができるので、工程を単純化することができるとともに、より精度の高い検出が可能となる。
【００４１】
反応容器に取り付けた生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターに特異的に結合しなかった抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを除去するために、吸着性領域にいわゆる洗浄液を強制的に流動させて洗浄することが好ましい。吸着性領域を洗浄液が強制的に流動するので、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターに特異的に結合していない抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４２】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。特に本発明では、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去するために使用する洗浄液のｐＨを５．０〜７．３に設定することによりＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができる。
【００４３】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプターに特異的に結合した抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて吸着性領域をブロッキングする。
【００４４】
なお、ブロッキングに用いられるブロッキングバッファは特に限定するものではないが、例えば、ブロックエース（大日本製薬社製）、ブロッカーカゼイン（ピアス社製）、リキッドブロック（アマシャムファルマシア社製）等の市販のブロッキングバッファを用いることができる。
【００４５】
次に、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させる。この際、酵素標識抗体は酵素標識抗体に対するブロッキングバッファに添加し、これを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させることが好ましい。特に本発明では、ここで行う抗原抗体反応を３４℃〜４０℃の反応温度で行うことにより、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができる。
【００４６】
続いて、生化学解析用ユニットを反応容器から取り出して、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。化学発光基質と酵素との接触によって各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４７】
【実施例】
実施例１
ＴＥバッファーに溶解した０．５ｐｇのＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を煮沸５分後１分間氷冷し、ナイロンメンブレン（ミリポア社製）に、１μｌスポット後紫外線照射（２５４ｎｍ， ３３ｍＪ／ｃｍ２）にて、ナイロンメンブレンに熱変性したＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を固定する。以下ケミルミ反応温度を３７℃、２５℃，３１℃，４３℃，４９℃て実施する。ナイロンメンブレンをケミルミ洗浄液に浸し５分間振とうし、予めブロッキングバッファーをＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したものに浸し６０分間振とうする。アルカリフォスファターゼ標識ＤＩＧ抗体を予め孔径０．２２μｍのウルトラフリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にて濾過し、予めＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したブロッキングバッファーに１／１００００ｖｏｌｕｍｅ添加して、６０分間振とうする。次にケミルミ洗浄液に浸し１５分間振とうする。これを３回繰り返す。ディテクションバッファーでｐＨ調整した後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ）を１時間反応させ、透明ＰＥＴベースに挟み込み、ＬＡＳ−１０００（富士写真フイルム社製）にて発光量を検出する。実施例１のＳ／Ｎの測定結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
実施例２
ＴＥバッファーに溶解した０．５ｐｇのＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を煮沸５分後１分間氷冷し、ナイロンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に、１μｌスポット後紫外線照射（２５４ｎｍ， ３３ｍＪ／ｃｍ２）にて、ナイロンメンブレンに熱変性したＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を固定する。以下すべて室温にて実施する。ナイロンメンブレンをケミルミ洗浄液に浸し５分間振とうし、予めブロッキングバッファーをＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したものを浸し６０分間振とうする。アルカリフォスファターゼ標識ＤＩＧ抗体を予め孔径０．２２μｍのウルトラフリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にて濾過し、予めＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したブロッキングバッファーに１／１０００ｖｏｌｕｍｅ添加して、６０分間振とうする。次にｐＨ７．３、ｐＨ６．３，ｐＨ７．５，ｐＨ８．３，ｐＨ８．７，ｐＨ９．２ケミルミ洗浄液に浸し１５分間振とうする。これを３回繰り返す。ディテクションバッファーでｐＨ調整した後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ）を１時間反応させ、透明ＰＥＴベースに挟み込み、ＬＡＳ−１０００（富士写真フイルム社製）にて発光量を検出する。実施例２のＳ／Ｎの測定結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、抗原抗体反応を利用した検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１ 生化学解析用ユニット
２ 基板
３ 孔
４ 吸着性領域
５ リガンドまたはレセプター
７ 生化学解析用ユニット保持部
８ 反応容器
９ 反応容器本体
１０ 反応容器上半部
１１ 反応容器下半部
１２ 溶液流入口
１３ 溶液流出口
１４ 溶液循環パイプ
１５ ポンプ
１６ シリンジ
１７ ピストン
【発明の属する技術分野】
本発明は、レセプターまたはリガンドを検出するアッセイ法に関する。より詳細には、本発明は、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットなどの支持体を利用して、レセプターまたはリガンドを検出するアッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプターをスポッター装置を用いて滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプターまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプターと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【０００３】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプターのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプターまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
上記の方法の一例としては、例えば、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法が挙げられる。例えば、抗原に対する抗体として酵素標識抗体を使用した場合には、抗原抗体反応後に、発色又は発光基質を添加することにより、抗原に結合した抗体の存在を検出することができる。ここで行う抗原抗体反応の反応温度に関して、従来は、一般に室温（２５℃）で行なっていた。しかし、これでは、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）が低いという問題があった。さらに、上記抗原抗体反応後は、洗浄液を用いて未反応の抗体を洗浄・除去しているが、従来はｐＨ７．５の洗浄液を用いて洗浄を行なっていた。しかし、これでは、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）が低いという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２８３７２７６号公報
【非特許文献１】
「ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２１， ｐ．２５−ｐ．３２（１９９９）
【非特許文献２】
「バイオインダストリー」Ｖｏｌ．１８， ｐ．１３−ｐ．１９（２００１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術における問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、抗原抗体反応の反応温度および／または洗浄液のｐＨを調節することによってＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗原抗体反応（本明細書の実施例では、ＤＩＧとＤＩＧ抗体との間の抗原抗体反応を使用した）を３４℃〜４０℃で行うことにより検出のＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができること、並びに抗体の洗浄液のｐＨを５．０から７．３にすることにより検出のＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；
を含む、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（２）の反応温度が３４℃〜４０℃であることを特徴とする上記の検出方法が提供される。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；及び
（３）洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程；
を含む検体中の抗原標識されたリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５．０〜７．３であることを特徴とする上記の検出方法が提供される。
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、（１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；及び
（３）洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程；
を含む検体中の抗原標識されたリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程２の反応温度が３４℃〜４０℃であり、かつ上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５．０から７．３であることを特徴とする上記の検出方法が提供される。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、支持体は多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法に関するものであり、より具体的には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程によって行う。本発明の第一の態様では、上記工程（２）の反応温度を３４℃〜４０℃とする。さらに本発明では、上記工程（２）の後に、洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程（３）を行うことができる。本発明の第二の態様では、上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５から７．３である。本発明においては、上記の特徴により検出のＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができる。
【００１３】
本発明で用いる支持体の種類は特に限定されないが、好ましい一例としては、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを使用することができる。以下、図面を参照して、生化学解析用ユニットを使用する場合の本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプター５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００１４】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１５】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００１６】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２ 未満であり、好ましくは１ｍｍ２ 未満であり、０．３ｍｍ２ 未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２ 未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２ 以上であることが好ましい。
【００１７】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２ 以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２ 以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２ 以上、さらには１０００個／ｃｍ２ 以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２ 以下、さらには１００００個／ｃｍ２ 以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００１８】
本発明において、吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００１９】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２０】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２１】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２２】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２３】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプターがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００２４】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの一の実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器８と溶液循環パイプ１４とポンプ１５とからなり、反応容器８は、生化学解析用ユニット１を保持するとともに液漏れを防止するシール機能を有する生化学解析用ユニット保持部７を有しており、反応容器本体９は、反応容器上半部１０と反応容器下半部１１とからなり、反応容器上半部１０は反応容器本体９に取り外し可能に設けられており、生化学解析用ユニット１は反応容器上半部１０を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。
【００２５】
また、図２に示されるように、反応容器下半部１１の底壁には溶液が流通可能な溶液流入口１２が形成され、反応容器上半部１０の頂壁には同様に溶液が流通可能な溶液流出口１３が形成されている。さらに流入口１２および流出口１３には、溶液循環パイプ１４がそれぞれ取り外し可能に取り付けられている。リアクタは、ポンプ１５によって溶液が流入口１２から反応容器本体９に入り、生化学解析用ユニット１を通過した後、流出口１３から出て、溶液循環パイプ１４を通って循環するように構成されている。
【００２６】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。このリアクタは、図２に示すポンプの代わりにシリンジ１６とピストン１７が設けられているもので、反応溶液が反応容器内で往復流動するように構成したものである。このように、反応溶液の強制的流動は、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を往復流動するものであってもよい。
【００２７】
なお、図２および図３はともに、反応溶液が生化学解析用ユニットを循環するタイプのリアクタを示しているが、反応溶液が生化学解析用ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過するのみで、反応溶液が循環しないタイプのリアクタを用いることも可能である。
【００２８】
本発明のアッセイ法では、先ず、リガンドまたはレセプターが結合された支持体（例えば、上記したような多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域）に、抗原標識されたレセプターまたはリガンドを含む検体を接触させる。
【００２９】
支持体に結合されるリガンドまたはレセプターは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。
【００３０】
抗原標識されたリガンド又はレセプターは、支持体に結合されるレセプター又はリガンドと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、抗原によって標識されたものである。
【００３１】
抗原の種類は特に限定されず、抗体と特異的に結合することができ、該抗体を入手できるものであれば、任意の抗原を使用することができる。例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン又はアビジンなどの抗原を挙げることができる。
【００３２】
本発明では、次いで、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる。
上記抗原としてジゴキシゲニン、ビオチン又はアビジンを使用した場合には、それぞれ抗ジゴキシゲニン抗体、アビジン又はビオチンを抗体として使用することができる。
【００３３】
上記抗体には、検出のための標識物質が結合していることが好ましい。標識物質としては、標記物質そのものが発光、発色あるいは光を照射することによって蛍光を放出するものであっても、標識物質に何らかの化学物質を接触させて、標識物質によって化学物質が分解あるいは反応する等して発光、発色あるいは蛍光を放出するものであってもよい。前者の標識物質としては、発光物質にアクリジニウムエステル等、発色物質に金コロイド粒子等、蛍光物質にフルオレセイン等を用いることができる。また、後者の標識物質としては、酵素を用いることができ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質あるいは色素基質あるいは蛍光基質を接触させることによってそれぞれ、化学発光、発色、蛍光を放出する。
【００３４】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。また、色素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。蛍光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。
【００３５】
次に、本発明のアッセイ法の一例として、生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプターを固定し、抗原で標識された抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドをハイブリダイゼーションなどによって、吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプターと特異的に結合させ、続いて、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを、上記抗原に対する抗体を、化学発光を生じさせる酵素で標識し（以下、酵素標識抗体という）、この酵素標識抗体を抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する化学発光法によるアッセイ法を例に、順を追って説明する。
【００３６】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプターを結合させる。
【００３７】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプターは前述した通りであり、リガンドまたはレセプターは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプターがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００３８】
次に、吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプターに抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを特異的に結合させる。
【００３９】
抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターと特異的に結合させた後、生化学解析用ユニットを上記図２または図３等に示す、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に取り付ける。なお、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドが吸着性領域を閉塞させるようなものではない、例えば抗原結合ＤＮＡのような場合には、吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプターに抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを特異的に結合させる段階から生化学解析用ユニットを反応容器に取り付けてもよい。この場合には、吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターに、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを効率的かつ均一に接触させることができるので、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドの検出限界をさらに向上させることができるとともに、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドが微量であっても、よりＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことができる。
【００４０】
また、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターと抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを特異的に結合する段階から、後述する抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドに酵素標識抗体を特異的に結合する段階まで、吸着性領域にそれぞれの反応溶液を強制的に流動させる方法により行うことができるので、工程を単純化することができるとともに、より精度の高い検出が可能となる。
【００４１】
反応容器に取り付けた生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターに特異的に結合しなかった抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを除去するために、吸着性領域にいわゆる洗浄液を強制的に流動させて洗浄することが好ましい。吸着性領域を洗浄液が強制的に流動するので、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプターに特異的に結合していない抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４２】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。特に本発明では、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去するために使用する洗浄液のｐＨを５．０〜７．３に設定することによりＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができる。
【００４３】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプターに特異的に結合した抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて吸着性領域をブロッキングする。
【００４４】
なお、ブロッキングに用いられるブロッキングバッファは特に限定するものではないが、例えば、ブロックエース（大日本製薬社製）、ブロッカーカゼイン（ピアス社製）、リキッドブロック（アマシャムファルマシア社製）等の市販のブロッキングバッファを用いることができる。
【００４５】
次に、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させる。この際、酵素標識抗体は酵素標識抗体に対するブロッキングバッファに添加し、これを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させることが好ましい。特に本発明では、ここで行う抗原抗体反応を３４℃〜４０℃の反応温度で行うことにより、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることができる。
【００４６】
続いて、生化学解析用ユニットを反応容器から取り出して、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。化学発光基質と酵素との接触によって各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、抗原結合レセプターまたは抗原結合リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４７】
【実施例】
実施例１
ＴＥバッファーに溶解した０．５ｐｇのＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を煮沸５分後１分間氷冷し、ナイロンメンブレン（ミリポア社製）に、１μｌスポット後紫外線照射（２５４ｎｍ， ３３ｍＪ／ｃｍ２）にて、ナイロンメンブレンに熱変性したＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を固定する。以下ケミルミ反応温度を３７℃、２５℃，３１℃，４３℃，４９℃て実施する。ナイロンメンブレンをケミルミ洗浄液に浸し５分間振とうし、予めブロッキングバッファーをＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したものに浸し６０分間振とうする。アルカリフォスファターゼ標識ＤＩＧ抗体を予め孔径０．２２μｍのウルトラフリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にて濾過し、予めＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したブロッキングバッファーに１／１００００ｖｏｌｕｍｅ添加して、６０分間振とうする。次にケミルミ洗浄液に浸し１５分間振とうする。これを３回繰り返す。ディテクションバッファーでｐＨ調整した後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ）を１時間反応させ、透明ＰＥＴベースに挟み込み、ＬＡＳ−１０００（富士写真フイルム社製）にて発光量を検出する。実施例１のＳ／Ｎの測定結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
実施例２
ＴＥバッファーに溶解した０．５ｐｇのＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を煮沸５分後１分間氷冷し、ナイロンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に、１μｌスポット後紫外線照射（２５４ｎｍ， ３３ｍＪ／ｃｍ２）にて、ナイロンメンブレンに熱変性したＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８（Ｒｏｃｈｅ社製）を固定する。以下すべて室温にて実施する。ナイロンメンブレンをケミルミ洗浄液に浸し５分間振とうし、予めブロッキングバッファーをＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したものを浸し６０分間振とうする。アルカリフォスファターゼ標識ＤＩＧ抗体を予め孔径０．２２μｍのウルトラフリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にて濾過し、予めＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したブロッキングバッファーに１／１０００ｖｏｌｕｍｅ添加して、６０分間振とうする。次にｐＨ７．３、ｐＨ６．３，ｐＨ７．５，ｐＨ８．３，ｐＨ８．７，ｐＨ９．２ケミルミ洗浄液に浸し１５分間振とうする。これを３回繰り返す。ディテクションバッファーでｐＨ調整した後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ）を１時間反応させ、透明ＰＥＴベースに挟み込み、ＬＡＳ−１０００（富士写真フイルム社製）にて発光量を検出する。実施例２のＳ／Ｎの測定結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【発明の効果】
本発明により、抗原抗体反応を利用した検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を向上させることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１ 生化学解析用ユニット
２ 基板
３ 孔
４ 吸着性領域
５ リガンドまたはレセプター
７ 生化学解析用ユニット保持部
８ 反応容器
９ 反応容器本体
１０ 反応容器上半部
１１ 反応容器下半部
１２ 溶液流入口
１３ 溶液流出口
１４ 溶液循環パイプ
１５ ポンプ
１６ シリンジ
１７ ピストン
Claims (4)
- （１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；及び
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；
を含む、検体中のリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（２）の反応温度が３４℃〜４０℃であることを特徴とする上記の検出方法。 - （１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；及び
（３）洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程；
を含む検体中の抗原標識されたリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５．０〜７．３であることを特徴とする上記の検出方法。 - （１）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと、抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させる工程；
（２）支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体とを接触させる工程；及び
（３）洗浄液を用いて工程（２）における未結合の抗体を除去する工程；
を含む検体中の抗原標識されたリガンドまたはレセプターを検出する方法において、上記工程２の反応温度が３４℃〜４０℃であり、かつ上記工程（３）で用いる洗浄液のｐＨが５．０から７．３であることを特徴とする上記の検出方法。 - 支持体が多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットである、請求項１から３の何れかに記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003094270A JP2004301630A (ja) | 2003-03-31 | 2003-03-31 | 生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2004301630A true JP2004301630A (ja) | 2004-10-28 |
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| JP2003094270A Pending JP2004301630A (ja) | 2003-03-31 | 2003-03-31 | 生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法 |
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| JP (1) | JP2004301630A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008256376A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-23 | Fujifilm Corp | 検体の検出方法及びバイオチップ |
-
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- 2003-03-31 JP JP2003094270A patent/JP2004301630A/ja active Pending
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