JP2004254549A - ２級アルコール脱水素酵素及びその製法 - Google Patents
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Abstract
【課題】光学活性アルコール、特に光学活性２級アルコールの合成に利用できる安定性に優れた酵素を提供する。
【解決手段】バークホルデリア属に属する微生物に由来し、ＮＡＤを補酵素として２−ブタノールの（Ｒ）体を選択的に酸化する安定性に優れた新規な２級アルコール脱水素酵素。及び、バークホルデリア属に属する微生物培養し、培養物から上記酵素を採取する２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【解決手段】バークホルデリア属に属する微生物に由来し、ＮＡＤを補酵素として２−ブタノールの（Ｒ）体を選択的に酸化する安定性に優れた新規な２級アルコール脱水素酵素。及び、バークホルデリア属に属する微生物培養し、培養物から上記酵素を採取する２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な２級アルコール脱水素酵素およびその製造方法に関するものである。より詳細には、２−ブタノールを基質とする酸化反応における立体選択性が（Ｒ）体選択的である２級アルコール脱水素酵素およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物が産生する２級アルコール脱水素酵素のうち、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略す）を要求する２級アルコール脱水素酵素については数多くの報告がある。このうち、２級アルコール脱水素酵素の基質として最もよく研究されている２−ブタノールに対して、（Ｒ）−２−ブタノールを立体選択的に酸化して、２−ブタノンを生成する活性を有するものとしては、シュードモナス・エスピー ＡＴＣＣ２１４３９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＴＣＣ２１４３９：非特許文献１参照）、シュードモナス・エスピー ＳＰＤ６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＳＰＤ６：非特許文献２参照）、コマモナス・テリゲーナ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ：非特許文献３参照）、キャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ ＳＡＨＭ：非特許文献４参照）、及び、ピキア・エスピー ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８（Ｐｉｃｉａ ｓｐ．ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８：非特許文献５参照）由来の酵素が知られている。
【０００３】
上記の酵素のうち、シュードモナス・エスピー ＡＴＣＣ２１４３９およびピキア・エスピー ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８由来の酵素は分子量約４８，０００の同一サブユニットからなる二量体であり、のこりの微生物由来の酵素は、いずれも四量体であることが報告されている。
【０００４】
シュードモナス・エスピー ＳＢＤ６、コマモナス・テリゲーナおよびキャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭ由来の酵素は分子量約３３，５００から４１，０００の同一サブユニットからなる四量体と推定されている。シュードモナス・エスピー ＳＢＤ６の酵素は、分子量１６２，０００、サブユニット分子量４１，０００の四量体で、等電点は４．７である。コマモナス・テリゲーナの酵素は、分子量１２５，０００から１５０，０００、サブユニット分子量３３，５００の四量体である。キャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭの酵素は、分子量１５０，０００、サブユニット分子量３８，０００の四量体で、等電点は４．９である。
【０００５】
２級アルコール脱水素酵素のなかでも、上記の四量体タンパク質酵素はいずれも短鎖の脂肪族アルコールによく作用し、１級アルコールよりも２級アルコールにより作用する性質を有し、ケトン化合物の立体選択的還元反応による光学活性２級アルコール化合物の合成や、ラセミ体の２級アルコール化合物を立体選択的に酸化させ光学活性２級アルコール化合物を合成する上で有用な酵素である。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９巻，３５９−３６４頁，１９８１年
【０００７】
【非特許文献２】
Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９巻，３９８−４１７頁，１９９１年
【０００８】
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，６６１巻，７４−８６頁，１９８１年
【０００９】
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７１６巻，２９８−３０７頁，１９８２年
【００１０】
【非特許文献５】
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１巻，４０１−４０６頁，１９７９年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の酵素はいずれも工業的に使用するためには、その安定性は必ずしも十分ではない。例えば、シュードモナス・エスピー ＳＢＤ６の酵素は、エチレンジアミン四酢酸によっては阻害されないが、５５℃、１３分間または６５℃、３分間の熱処理により、活性は５０％となる。コマモナス・テリゲーナの酵素は、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸と３０分間存在させることにより活性の１６％が失われる。キャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭの酵素は、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸により阻害されないが、５０℃、６０分間熱処理後の残存活性７５％となる。従って、より安定な２級アルコール脱水素酵素が求められていた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意に研究を行なった結果、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物が、安定性のよい新規な２級アルコール脱水素酵素を生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有する２級アルコール脱水素酵素である：
（ａ）作用：ＮＡＤを補酵素として、２−ブタノールの（Ｒ）体を優先的に酸化して２−ブタノンを生成する、
（ｂ）分子量：ゲル濾過法により１５０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３７，０００、
（ｃ）等電点：５．３５、
（ｄ）薬剤耐性：１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸の存在下で、反応が阻害されない、
（ｅ）熱安定性：ｐＨ７．０、６０℃で６０分加熱後の残存活性が８５％以上。
【００１４】
また本発明は、バークホルデリア属に属する微生物を培養して、培養物から上記２級アルコール脱水素酵素を取得することを特徴とする、２級アルコール脱水素酵素の製造方法である。
【００１５】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は安定性に優れ、各種の光学活性アルコール、特に光学活性２級アルコールの製造に有用である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の２級アルコール脱水素酵素について説明する。本発明の２級アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤを補酵素として、脂肪族アルコールを酸化し、対応するケトンまたはアルデヒドを生成する。
反応は立体選択的であり、ラセミ体の２−ブタノールを基質とした場合には、（Ｒ）体を選択的に酸化して２−ブタノンを生成する。１級アルコールよりも２級アルコールに対する活性が高い。
【００１７】
また、本発明の２級アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤＨを補酵素として、脂肪族ケトンまたは脂肪族アルデヒドを還元してアルコールを生成することもできる。
【００１８】
分子量は、ゲル濾過法による測定で約１５０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により約３７，０００であり、同一サブユニットからなる四量体と考えられる。また、等電点は約５．３５である。
【００１９】
反応の至適ｐＨは、２−プロパノールの酸化反応においてｐＨは８．５以上、２−ブタノンの還元反応において約ｐＨは６．０である。また、酵素のＮ末端のアミノ酸配列は、ＭＫＡＬＶＦＮＧＰＧＱＫＡＬＥＤＫＰＥＰＱである。
【００２０】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、安定性に優れる。ｐＨ６．５から９．０の範囲で本酵素は極めて安定であり、当該ｐＨ範囲ではｐＨ７．０、６０℃で６０分加熱後においても８５％の活性が残存する。
【００２１】
また、各種の酵素阻害剤の影響については、α，α′−ジピリジル、８−ハイドロキシキノリン、ｏ−フェナンスロリン、４−（クロロ水銀）ベンゼンスルホン酸、硫酸マンガン、塩化亜鉛により阻害される一方、１ｍＭのセミカルバジド、エチレンジアミン四酢酸、アジ化ナトリウムの存在下においても、反応は阻害剤されない。
【００２２】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、例えば、バークホルデリア属に属する微生物、好ましくはバークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２株から得ることができる。
【００２３】
上記バークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２株は、本発明者が土壌から分離、採取し、平成１５年１月３１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託したものであり、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１９１９８である。上記菌株の菌学的性質を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
以上の菌学的性質から、Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、Ｉｎｔ．，Ｊ．，Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４５巻，２７４頁，１９９５年、およびＩｎｔ．，Ｊ．，Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４８巻，５４９頁，１９９８年に基づき、検索を行なった結果、ＡＩＵ６５２株は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）に属することが判明した。
【００２６】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、例えば、上記の微生物を栄養培地にて培養し、該培養物から採取することにより製造することができる。
【００２７】
培養に使用する培地としては、使用菌株が資化できる炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源を適量含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれもが使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、ラクトース、マルトース、メタノール等を用いることができる。なお、培地にコレステロール、または２−プロパノールを添加すると本発明の２級アルコール脱水素酵素活性の高い培養物を得ることができる。上記コレステロール、２−プロパノールは唯一炭素源として用いてもよいし、前記の炭素源と併用してもよい。
窒素源としてはポリペプトン、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物やアンモニウム塩類、尿素等の無機窒素化合物が使用できる。また、無機物としてはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、銅、りん酸等が使用される。
【００２８】
生産菌の培養は、振とう培養または通気攪拌培養により行なわれる。この時の培養温度は２０〜４５℃の範囲で、好ましくは２５〜４０℃であり、培地のｐＨは３〜９の範囲で，好ましくは４〜８に制御するのがよい。しかし、これら以外の条件下であっても使用する菌株が生育しさえすれば実施は可能である。菌株の培養期間は通常１０〜９６時間であり、好ましくは２４〜７２時間である。菌株は、増殖の過程で２級アルコール脱水素酵素を産生し、菌体内に蓄積する。
【００２９】
本発明の２級アルコール脱水素酵素の精製には、一般に使用されている蛋白質の精製法を用いることができる。菌体からの酵素の抽出法としては、超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス等を用いる物理的な破砕法のほか、界面活性剤を用いる化学的な方法、リゾチウムを用いる生化学的な方法等があげられる。
【００３０】
上記の方法によって得られた抽出液は、一般に使用される酵素精製法を組合せて、処理することにより、目的の酵素を高純度に精製することができる。例えば、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過による分子量分画、アフィニティークロマトグラフィー等の方法があげられる。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお。％は特に断らないかぎり重量％を表す。
【００３２】
（実施例１）酵素の生産
バークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＩＵ６５２）を、リン酸ニ水素カリウム０．１％、リン酸水素ニカリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硝酸アンモニウム０．３％、酵母エキス０．１％、グルコース０．２％（ｐＨ４．０）からなるＧｌｕｃｏｓｅ培地、リン酸ニ水素カリウム０．１％、リン酸水素ニカリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硝酸アンモニウム０．３％、酵母エキス０．１％、２−プロパノール０．２％（ｐＨ４．０）からなる２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ培地、リン酸ニ水素カリウム０．１％、リン酸水素ニカリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硝酸アンモニウム０．３％、酵母エキス０．１％、コレステロール０．２％（ｐＨ４．０）からなるＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ培地の３つの培地を入れて殺菌した１００ｍｌフラスコに接種し、表２に示す時間、３０℃で振とう培養した。培養後、菌体を遠心分離により集めマルチビーズショッカーを用いてガラスビーズにより破砕し、破砕物を遠心分離して上清を得た。この無細胞抽出液中の２級アルコール脱水素酵素の活性とタンパク濃度を測定した結果を表２にまとめた。なお、酵素活性の測定は、１１ｍＭの２−プロパノール、０．６ｍＭのＮＡＤ＋および酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行なった。１分間に１μモルのＮＡＤをＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
（実施例２）酵素の精製
以下の手順により２級アルコール脱水素酵素をバークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＩＵ６５２）から精製した。すべての操作は４〜１０℃で実施した。本菌を、実施例１に記したＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ培地で培養した培養液約６ｌを遠心分離により菌体を集め、石油エーテルで洗浄した。これを５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、マルチビーズショッカーを用いてガラスビーズにより３分間破砕した。遠心分離により不溶物を除いた上清の無細胞抽出液とした。１００ｍｌの無細胞抽出液に３０％となるように硫酸アンモニウムを加えて、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したフェニルトヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。活性は、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により溶出された。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化したブルーセファロースカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄ののち、活性は２０ｍＭＮＡＤを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化したハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄ののち、活性は、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）の１０ｍＭから１００ｍＭまでのリニアグラジエントにより溶出した。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄ののち、活性は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中の塩化ナトリウム濃度が０ｍＭから３００ｍＭまでになるようにしたリニアグラジエントにより溶出した。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、トヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィーによるゲル濾過にかけ、溶出活性画分を精製酵素とした。本カラムにより、分子量標準タンパク質を用いて精製酵素の分子量を測定したところ、約１５０，０００であった。また、精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一のバンドが認められた。また、分子量標準タンパク質との移動度の差から、その分子量は約３７，０００と算出された。したがって、本菌の生産する２級アルコール脱水素酵素は同一サブユニットからなる四量体であると考えられた。精製の各ステップでの収率等を表３にまとめた。以後本酵素をＳ−ＡＬＤＨと呼ぶ。
【００３５】
【表３】
【００３６】
（実施例３）酸化反応の際の基質特異性
１％の各種化合物、０．７５ｍＭのＮＡＤおよび酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定して酵素活性を求めた。表４に示した化合物について、２−プロパノールでの活性を１００としたときの相対活性およびＫｍ値を調べた。結果を表４に示した。
【００３７】
【表４】
【００３８】
（実施例４）還元反応の際の基質特異性
０．０５％の各種化合物、０．３ｍＭのＮＡＤＨおよび酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の減少を測定して酵素活性を求めた。表５に示した化合物について、アセトンでの活性を１００としたときの相対活性およびＫｍ値を調べた。結果を表５に示した。なお、ジヒドロキシアセトン、アセト酢酸、ピルビン酸については、表の脚注に示した基質濃度で反応させた。
【００３９】
【表５】
【００４０】
（実施例５）光学活性化合物に対する基質特異性
１％の各種化合物、０．７５ｍＭのＮＡＤおよび酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）３ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定して酵素活性を求めた。表６に示した化合物について、２−プロパノールでの活性を１００としたときの相対活性およびＫｍ値を調べた。結果を表６に示した。
【００４１】
【表６】
【００４２】
（実施例６）要求する補酵素
実施例１記載の酵素活性測定条件で、ＮＡＤをＮＡＤＰに変えて酸化活性を測定し、ＮＡＤを用いた場合を１００とした相対値を求めた。また、実施例４記載の酵素活性測定条件で、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変えて酸化活性を測定し、ＮＡＤＨを用いた場合を１００とした相対値を求めた。これらの結果と、ＮＡＤおよびＮＡＤＨの対するＫｍ値を表７にまとめた。
【００４３】
【表７】
【００４４】
（実施例７）各種化合物の影響
表８に示した各種の化合物を１ｍＭとなるように反応液に加え、実施例１記載の方法により酵素活性を測定し、なにも加えない場合の活性を１００とした相対値を求めた。結果を表７にまとめた。８−ハイドロキシキノリンやｏ−フェナンスロリンにより強く阻害されたが、カルボニル試薬により阻害されなかった。
【００４５】
【表８】
【００４６】
（実施例８）金属の影響
実施例７の各種化合物の代わりに、表９に記した化合物を用いて同様の実験を行なった、結果を表９にまとめた。１ｍＭの塩化銅を添加した場合、３０％程度活性が向上した。１ｍＭの塩化亜鉛や硫酸マンガンを添加した場合、６０〜７０％程度活性が低下したが、同一濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加しても活性は完全には回復しなかった。
【００４７】
【表９】
【００４８】
（実施例９）ｐＨの影響
実施例１に記載の酵素活性測定条件において、緩衝液のｐＨを変化させることにより酸化反応の至適ｐＨを求めた。また、実施例４記載の酵素反応活性測定条件において、基質を２−ブタノンとし緩衝液のｐＨを変化させることにより、還元反応の至適ｐＨを求めた。さらに、酵素液を各種ｐＨで５０℃で６０分間加熱したのち、残存する酵素活性を測定した。これらの結果を図１にまとめた。５０℃で６０分間加熱してもｐＨ６〜９では、７５％の活性が残存しており、特にｐＨ７〜８では９５％以上の活性が残存していた。
【００４９】
（実施例１０）温度の影響
実施例１記載の酵素活性測定条件において、反応温度を変化させることにより、酸化反応の至適温度を求めた。また、酵素液をｐＨ７．０とし各温度で６０分間加熱したのち、残存する酵素活性を測定した。これらの結果を図２に示した。反応の最適温度は７０℃以上であり、ｐＨ７．０で６０℃、６０分間加熱した場合には、約８５％の活性が残存していた。
【００５０】
（実施例１１）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
実施例２で得た精製酵素標品のＮ末端アミノ酸配列を、フェニルチオヒダントインを用いるアミノ酸分析装置を装着したプロテインシークエンサーを用いて決定したところ、ＭＫＡＬＶＦＮＧＰＧＱＫＡＬＥＤＫＰＥＰＱであった。
【００５１】
【発明の効果】
安定性に優れ、（Ｒ）−２−ブタノールに特異的に作用する新規な２級アルコール脱水素酵素が提供された。本酵素を用いることにより、ケトン化合物の還元反応またはアルコール化合物の酸化反応により、光学活性アルコール化合物の合成が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓ−ＡＬＤＨ酵素活性及び安定性に対するｐＨの影響
【図２】Ｓ−ＡＬＤＨ酵素活性及び安定性に対する温度の影響
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な２級アルコール脱水素酵素およびその製造方法に関するものである。より詳細には、２−ブタノールを基質とする酸化反応における立体選択性が（Ｒ）体選択的である２級アルコール脱水素酵素およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物が産生する２級アルコール脱水素酵素のうち、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略す）を要求する２級アルコール脱水素酵素については数多くの報告がある。このうち、２級アルコール脱水素酵素の基質として最もよく研究されている２−ブタノールに対して、（Ｒ）−２−ブタノールを立体選択的に酸化して、２−ブタノンを生成する活性を有するものとしては、シュードモナス・エスピー ＡＴＣＣ２１４３９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＴＣＣ２１４３９：非特許文献１参照）、シュードモナス・エスピー ＳＰＤ６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＳＰＤ６：非特許文献２参照）、コマモナス・テリゲーナ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ：非特許文献３参照）、キャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ ＳＡＨＭ：非特許文献４参照）、及び、ピキア・エスピー ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８（Ｐｉｃｉａ ｓｐ．ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８：非特許文献５参照）由来の酵素が知られている。
【０００３】
上記の酵素のうち、シュードモナス・エスピー ＡＴＣＣ２１４３９およびピキア・エスピー ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８由来の酵素は分子量約４８，０００の同一サブユニットからなる二量体であり、のこりの微生物由来の酵素は、いずれも四量体であることが報告されている。
【０００４】
シュードモナス・エスピー ＳＢＤ６、コマモナス・テリゲーナおよびキャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭ由来の酵素は分子量約３３，５００から４１，０００の同一サブユニットからなる四量体と推定されている。シュードモナス・エスピー ＳＢＤ６の酵素は、分子量１６２，０００、サブユニット分子量４１，０００の四量体で、等電点は４．７である。コマモナス・テリゲーナの酵素は、分子量１２５，０００から１５０，０００、サブユニット分子量３３，５００の四量体である。キャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭの酵素は、分子量１５０，０００、サブユニット分子量３８，０００の四量体で、等電点は４．９である。
【０００５】
２級アルコール脱水素酵素のなかでも、上記の四量体タンパク質酵素はいずれも短鎖の脂肪族アルコールによく作用し、１級アルコールよりも２級アルコールにより作用する性質を有し、ケトン化合物の立体選択的還元反応による光学活性２級アルコール化合物の合成や、ラセミ体の２級アルコール化合物を立体選択的に酸化させ光学活性２級アルコール化合物を合成する上で有用な酵素である。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９巻，３５９−３６４頁，１９８１年
【０００７】
【非特許文献２】
Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９巻，３９８−４１７頁，１９９１年
【０００８】
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，６６１巻，７４−８６頁，１９８１年
【０００９】
【非特許文献４】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７１６巻，２９８−３０７頁，１９８２年
【００１０】
【非特許文献５】
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１巻，４０１−４０６頁，１９７９年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の酵素はいずれも工業的に使用するためには、その安定性は必ずしも十分ではない。例えば、シュードモナス・エスピー ＳＢＤ６の酵素は、エチレンジアミン四酢酸によっては阻害されないが、５５℃、１３分間または６５℃、３分間の熱処理により、活性は５０％となる。コマモナス・テリゲーナの酵素は、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸と３０分間存在させることにより活性の１６％が失われる。キャンディダ・ボイディニィ ＳＡＨＭの酵素は、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸により阻害されないが、５０℃、６０分間熱処理後の残存活性７５％となる。従って、より安定な２級アルコール脱水素酵素が求められていた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意に研究を行なった結果、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物が、安定性のよい新規な２級アルコール脱水素酵素を生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有する２級アルコール脱水素酵素である：
（ａ）作用：ＮＡＤを補酵素として、２−ブタノールの（Ｒ）体を優先的に酸化して２−ブタノンを生成する、
（ｂ）分子量：ゲル濾過法により１５０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３７，０００、
（ｃ）等電点：５．３５、
（ｄ）薬剤耐性：１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸の存在下で、反応が阻害されない、
（ｅ）熱安定性：ｐＨ７．０、６０℃で６０分加熱後の残存活性が８５％以上。
【００１４】
また本発明は、バークホルデリア属に属する微生物を培養して、培養物から上記２級アルコール脱水素酵素を取得することを特徴とする、２級アルコール脱水素酵素の製造方法である。
【００１５】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は安定性に優れ、各種の光学活性アルコール、特に光学活性２級アルコールの製造に有用である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の２級アルコール脱水素酵素について説明する。本発明の２級アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤを補酵素として、脂肪族アルコールを酸化し、対応するケトンまたはアルデヒドを生成する。
反応は立体選択的であり、ラセミ体の２−ブタノールを基質とした場合には、（Ｒ）体を選択的に酸化して２−ブタノンを生成する。１級アルコールよりも２級アルコールに対する活性が高い。
【００１７】
また、本発明の２級アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤＨを補酵素として、脂肪族ケトンまたは脂肪族アルデヒドを還元してアルコールを生成することもできる。
【００１８】
分子量は、ゲル濾過法による測定で約１５０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により約３７，０００であり、同一サブユニットからなる四量体と考えられる。また、等電点は約５．３５である。
【００１９】
反応の至適ｐＨは、２−プロパノールの酸化反応においてｐＨは８．５以上、２−ブタノンの還元反応において約ｐＨは６．０である。また、酵素のＮ末端のアミノ酸配列は、ＭＫＡＬＶＦＮＧＰＧＱＫＡＬＥＤＫＰＥＰＱである。
【００２０】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、安定性に優れる。ｐＨ６．５から９．０の範囲で本酵素は極めて安定であり、当該ｐＨ範囲ではｐＨ７．０、６０℃で６０分加熱後においても８５％の活性が残存する。
【００２１】
また、各種の酵素阻害剤の影響については、α，α′−ジピリジル、８−ハイドロキシキノリン、ｏ−フェナンスロリン、４−（クロロ水銀）ベンゼンスルホン酸、硫酸マンガン、塩化亜鉛により阻害される一方、１ｍＭのセミカルバジド、エチレンジアミン四酢酸、アジ化ナトリウムの存在下においても、反応は阻害剤されない。
【００２２】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、例えば、バークホルデリア属に属する微生物、好ましくはバークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２株から得ることができる。
【００２３】
上記バークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２株は、本発明者が土壌から分離、採取し、平成１５年１月３１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託したものであり、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１９１９８である。上記菌株の菌学的性質を表１に示す。
【００２４】
【表１】
以上の菌学的性質から、Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、Ｉｎｔ．，Ｊ．，Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４５巻，２７４頁，１９９５年、およびＩｎｔ．，Ｊ．，Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４８巻，５４９頁，１９９８年に基づき、検索を行なった結果、ＡＩＵ６５２株は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）に属することが判明した。
【００２６】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、例えば、上記の微生物を栄養培地にて培養し、該培養物から採取することにより製造することができる。
【００２７】
培養に使用する培地としては、使用菌株が資化できる炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源を適量含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれもが使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、ラクトース、マルトース、メタノール等を用いることができる。なお、培地にコレステロール、または２−プロパノールを添加すると本発明の２級アルコール脱水素酵素活性の高い培養物を得ることができる。上記コレステロール、２−プロパノールは唯一炭素源として用いてもよいし、前記の炭素源と併用してもよい。
窒素源としてはポリペプトン、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物やアンモニウム塩類、尿素等の無機窒素化合物が使用できる。また、無機物としてはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、銅、りん酸等が使用される。
【００２８】
生産菌の培養は、振とう培養または通気攪拌培養により行なわれる。この時の培養温度は２０〜４５℃の範囲で、好ましくは２５〜４０℃であり、培地のｐＨは３〜９の範囲で，好ましくは４〜８に制御するのがよい。しかし、これら以外の条件下であっても使用する菌株が生育しさえすれば実施は可能である。菌株の培養期間は通常１０〜９６時間であり、好ましくは２４〜７２時間である。菌株は、増殖の過程で２級アルコール脱水素酵素を産生し、菌体内に蓄積する。
【００２９】
本発明の２級アルコール脱水素酵素の精製には、一般に使用されている蛋白質の精製法を用いることができる。菌体からの酵素の抽出法としては、超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス等を用いる物理的な破砕法のほか、界面活性剤を用いる化学的な方法、リゾチウムを用いる生化学的な方法等があげられる。
【００３０】
上記の方法によって得られた抽出液は、一般に使用される酵素精製法を組合せて、処理することにより、目的の酵素を高純度に精製することができる。例えば、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過による分子量分画、アフィニティークロマトグラフィー等の方法があげられる。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお。％は特に断らないかぎり重量％を表す。
【００３２】
（実施例１）酵素の生産
バークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＩＵ６５２）を、リン酸ニ水素カリウム０．１％、リン酸水素ニカリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硝酸アンモニウム０．３％、酵母エキス０．１％、グルコース０．２％（ｐＨ４．０）からなるＧｌｕｃｏｓｅ培地、リン酸ニ水素カリウム０．１％、リン酸水素ニカリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硝酸アンモニウム０．３％、酵母エキス０．１％、２−プロパノール０．２％（ｐＨ４．０）からなる２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ培地、リン酸ニ水素カリウム０．１％、リン酸水素ニカリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硝酸アンモニウム０．３％、酵母エキス０．１％、コレステロール０．２％（ｐＨ４．０）からなるＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ培地の３つの培地を入れて殺菌した１００ｍｌフラスコに接種し、表２に示す時間、３０℃で振とう培養した。培養後、菌体を遠心分離により集めマルチビーズショッカーを用いてガラスビーズにより破砕し、破砕物を遠心分離して上清を得た。この無細胞抽出液中の２級アルコール脱水素酵素の活性とタンパク濃度を測定した結果を表２にまとめた。なお、酵素活性の測定は、１１ｍＭの２−プロパノール、０．６ｍＭのＮＡＤ＋および酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行なった。１分間に１μモルのＮＡＤをＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【００３３】
【表２】
（実施例２）酵素の精製
以下の手順により２級アルコール脱水素酵素をバークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＩＵ６５２）から精製した。すべての操作は４〜１０℃で実施した。本菌を、実施例１に記したＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ培地で培養した培養液約６ｌを遠心分離により菌体を集め、石油エーテルで洗浄した。これを５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、マルチビーズショッカーを用いてガラスビーズにより３分間破砕した。遠心分離により不溶物を除いた上清の無細胞抽出液とした。１００ｍｌの無細胞抽出液に３０％となるように硫酸アンモニウムを加えて、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したフェニルトヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。活性は、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により溶出された。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化したブルーセファロースカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄ののち、活性は２０ｍＭＮＡＤを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化したハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄ののち、活性は、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）の１０ｍＭから１００ｍＭまでのリニアグラジエントにより溶出した。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄ののち、活性は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中の塩化ナトリウム濃度が０ｍＭから３００ｍＭまでになるようにしたリニアグラジエントにより溶出した。活性画分を限外濾過膜により脱塩、濃縮し、トヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィーによるゲル濾過にかけ、溶出活性画分を精製酵素とした。本カラムにより、分子量標準タンパク質を用いて精製酵素の分子量を測定したところ、約１５０，０００であった。また、精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一のバンドが認められた。また、分子量標準タンパク質との移動度の差から、その分子量は約３７，０００と算出された。したがって、本菌の生産する２級アルコール脱水素酵素は同一サブユニットからなる四量体であると考えられた。精製の各ステップでの収率等を表３にまとめた。以後本酵素をＳ−ＡＬＤＨと呼ぶ。
【００３５】
【表３】
（実施例３）酸化反応の際の基質特異性
１％の各種化合物、０．７５ｍＭのＮＡＤおよび酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定して酵素活性を求めた。表４に示した化合物について、２−プロパノールでの活性を１００としたときの相対活性およびＫｍ値を調べた。結果を表４に示した。
【００３７】
【表４】
（実施例４）還元反応の際の基質特異性
０．０５％の各種化合物、０．３ｍＭのＮＡＤＨおよび酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の減少を測定して酵素活性を求めた。表５に示した化合物について、アセトンでの活性を１００としたときの相対活性およびＫｍ値を調べた。結果を表５に示した。なお、ジヒドロキシアセトン、アセト酢酸、ピルビン酸については、表の脚注に示した基質濃度で反応させた。
【００３９】
【表５】
（実施例５）光学活性化合物に対する基質特異性
１％の各種化合物、０．７５ｍＭのＮＡＤおよび酵素液を含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）３ｍｌの反応液を３０℃で３分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定して酵素活性を求めた。表６に示した化合物について、２−プロパノールでの活性を１００としたときの相対活性およびＫｍ値を調べた。結果を表６に示した。
【００４１】
【表６】
（実施例６）要求する補酵素
実施例１記載の酵素活性測定条件で、ＮＡＤをＮＡＤＰに変えて酸化活性を測定し、ＮＡＤを用いた場合を１００とした相対値を求めた。また、実施例４記載の酵素活性測定条件で、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変えて酸化活性を測定し、ＮＡＤＨを用いた場合を１００とした相対値を求めた。これらの結果と、ＮＡＤおよびＮＡＤＨの対するＫｍ値を表７にまとめた。
【００４３】
【表７】
（実施例７）各種化合物の影響
表８に示した各種の化合物を１ｍＭとなるように反応液に加え、実施例１記載の方法により酵素活性を測定し、なにも加えない場合の活性を１００とした相対値を求めた。結果を表７にまとめた。８−ハイドロキシキノリンやｏ−フェナンスロリンにより強く阻害されたが、カルボニル試薬により阻害されなかった。
【００４５】
【表８】
（実施例８）金属の影響
実施例７の各種化合物の代わりに、表９に記した化合物を用いて同様の実験を行なった、結果を表９にまとめた。１ｍＭの塩化銅を添加した場合、３０％程度活性が向上した。１ｍＭの塩化亜鉛や硫酸マンガンを添加した場合、６０〜７０％程度活性が低下したが、同一濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加しても活性は完全には回復しなかった。
【００４７】
【表９】
（実施例９）ｐＨの影響
実施例１に記載の酵素活性測定条件において、緩衝液のｐＨを変化させることにより酸化反応の至適ｐＨを求めた。また、実施例４記載の酵素反応活性測定条件において、基質を２−ブタノンとし緩衝液のｐＨを変化させることにより、還元反応の至適ｐＨを求めた。さらに、酵素液を各種ｐＨで５０℃で６０分間加熱したのち、残存する酵素活性を測定した。これらの結果を図１にまとめた。５０℃で６０分間加熱してもｐＨ６〜９では、７５％の活性が残存しており、特にｐＨ７〜８では９５％以上の活性が残存していた。
【００４９】
（実施例１０）温度の影響
実施例１記載の酵素活性測定条件において、反応温度を変化させることにより、酸化反応の至適温度を求めた。また、酵素液をｐＨ７．０とし各温度で６０分間加熱したのち、残存する酵素活性を測定した。これらの結果を図２に示した。反応の最適温度は７０℃以上であり、ｐＨ７．０で６０℃、６０分間加熱した場合には、約８５％の活性が残存していた。
【００５０】
（実施例１１）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
実施例２で得た精製酵素標品のＮ末端アミノ酸配列を、フェニルチオヒダントインを用いるアミノ酸分析装置を装着したプロテインシークエンサーを用いて決定したところ、ＭＫＡＬＶＦＮＧＰＧＱＫＡＬＥＤＫＰＥＰＱであった。
【００５１】
【発明の効果】
安定性に優れ、（Ｒ）−２−ブタノールに特異的に作用する新規な２級アルコール脱水素酵素が提供された。本酵素を用いることにより、ケトン化合物の還元反応またはアルコール化合物の酸化反応により、光学活性アルコール化合物の合成が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓ−ＡＬＤＨ酵素活性及び安定性に対するｐＨの影響
【図２】Ｓ−ＡＬＤＨ酵素活性及び安定性に対する温度の影響
Claims (7)
- 次の理化学的性質を有する２級アルコール脱水素酵素：
（ａ）作用：ＮＡＤを補酵素として、２−ブタノールの（Ｒ）体を優先的に酸化して２−ブタノンを生成する、
（ｂ）分子量：ゲル濾過法により１５０，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３７，０００、
（ｃ）等電点：５．３５、
（ｄ）薬剤耐性：１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸の存在下で、反応が阻害されない、
（ｅ）熱安定性：ｐＨ７．０、６０℃で６０分加熱後の残存活性が８５％以上、 - さらに以下の理化学的性質を有する請求項１記載の２級アルコール脱水素酵素：
（ｆ）至適ｐＨ：２−ブタノールの酸化反応時ｐＨ８．５以上、２−ブタノンの還元反応時ｐＨ６．０、
（ｇ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜ｐＨ９．０、
（ｈ）基質特異性：１−ブタノールに対する活性よりも２−ブタノールに対する活性が高い。
（ｉ）Ｎ末端アミノ酸配列：ＭＫＡＬＶＦＮＧＰＧＱＫＡＬＥＤＫＰＥＰＱ。 - バークホルデリア属に属する微生物由来である請求項１又は２記載の２級アルコール脱水素酵素。
- バークホルデリア属に属し、請求項１記載の酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素を取得することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
- バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア・エスピー ＡＩＵ６５２（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＩＵ６５２）（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１９８）である請求項４記載の製造方法。
- 微生物を培養する際に、２−プロパノールを含有する培地を用いることを特徴とする請求項４又は５記載の製造方法。
- 微生物を培養する際に、コレステロールを含有する培地を用いることを特徴とする請求項４又は５記載の製造方法。
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