JP2004201566A - アポトーシス抑制ペプチド - Google Patents
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Abstract
【課題】従来、知られているアポトーシス阻害剤に認められる短所を克服した新しいアポトーシスまたは炎症を阻害する物質を提供することを課題とする。
【解決手段】次のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩であって、アポトーシスまたは炎症の誘導を阻害する活性を有するもの：（ａ）特定なアミノ酸配列（ｂ）上記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において６個を越えない任意のアミノ酸残基が欠失、付加および／または置換しているアミノ酸配列を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】次のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩であって、アポトーシスまたは炎症の誘導を阻害する活性を有するもの：（ａ）特定なアミノ酸配列（ｂ）上記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において６個を越えない任意のアミノ酸残基が欠失、付加および／または置換しているアミノ酸配列を提供する。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシスや炎症を阻害する活性を有する、新規なペプチドおよびその塩に関する。特に、本発明は、TNF、TRAIL、FasLなどによって誘導されるアポトーシスや炎症を阻害し、これが原因となる自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リューマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病など)、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎(例えば、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎など)、AIDS、臓器移植後の拒絶反応、敗血症ショック、うっ血性心不全、脊髄異形成症候群、神経変性疾患(例えば、脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマーなど)および癌などの処置に有用なペプチドならびにその薬学的に許容される塩を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは生体の恒常性を保つために必要な自然死であり、その破綻は癌や自己免疫疾患などの重篤な疾患を招く(Annu. Rev. Immunol., 17, 221-253, 1999)。アポトーシスは放射線や薬剤などの外因によっても引き起されるが、内因性の誘導因子としてTNF、TRAIL、FasLなどが報告されている(Pharm Acta Helv, 74, 281-286, 2000; Exp Cell Res, 256, 58-66, 2000)。これらは、標的細胞上のそれぞれに特異的な受容体と結合し、アポトーシスを誘導する(TIBS, 24 February, 47-53, 1999)。
【０００３】
一方、TNF、TRAIL、FasLなどの過剰産生は、リウマチ性関節炎(Rheumatoid arthritis)、多発性硬化症(Multiple sclerosis)、AIDS(Acquired immune deficiency syndrome)、癌、敗血症ショック(Septic shock)、うっ血性心不全(Congestive heart failure)、再性不良性貧血(Aplastic anemia)、脊髄異形成症候群(Myelodysplastic syndrome)、クローン病(Crohn's disease)等の疾患の原因となる(Microsc Res Tech, 50, 229-235, 2000)。
【０００４】
FasLに特異的に反応するヒト型化免疫グロブリンが知られており、アポトーシスに代表されるFasLとFasとの生理的反応を抑制することが示されている(ＷＯ９８／１００７０)。
【０００５】
Fas/FasL系の異常に起因する疾患の治療剤として有用な、抗Fas抗体を有効成分として含有する新規医薬組成物が知られている(特開２０００−１６９３９３)。
【０００６】
Caspase-8と結合しDeath effector domainを持たないタンパク質が、アポトーシス制御能を有することが知られている(特開２０００−２２６４００)。
【０００７】
Fasの細胞内ドメインに結合するMORT-1、あるいはTRADDに結合して、FasLまたはTNFの効果をモジュレートするタンパク質、さらにはその活性を阻害するペプチドが知られている(特表平１１−５０９４２２)。
【０００８】
上皮細胞増殖因子(EGF)を有効成分とする、細胞障害性Ｔ細胞上のFasLと臓器細胞膜上のFasとの相互作用によって惹起されるアポトーシスの抑制剤または予防剤が知られている(特開平１０−１９４９８８)。
【０００９】
天然のTNF結合蛋白のTNF結合機能部分を探索して得られた合成ペプチドが知られており、マウスL-M細胞に対するTNFの細胞毒性を阻害することが示されている(特開平５−１９４５９４)。
【００１０】
トリアゼピンまたはジアゼピンからなる７員環と２乃至４個の窒素原子を含む５員環との縮合環化合物であることを特徴とするアポトーシス抑制剤が知られている(特開平１１−２２８５７６)。
【００１１】
また、近年カスペースの阻害作用などによりアポトーシスを阻害する薬剤が脳虚血による神経障害（Proc Natl Acad Sci USA, 95, 15769-15774, 1998）、ハンチントン病（Nature Medicine, 6, 797-801, 2000）、パーキンソン病（J Neurosci, 22, 1763-1771, 2002）、筋萎縮性側索硬化症（Nature, 417, 74-78, 2002）、アルツハイマー等の神経変性疾患の動物モデルにおいて有効な治療効果を示すことが報告されている。
【００１２】
抗体に代表されるアポトーシス阻害剤は、特異性は高いが分子量が大きいタンパク質であるので、抗原性、投与方法、安定性などに問題がある。天然のTNF結合蛋白のTNF結合機能部分を探索して得られた合成ペプチドであるアポトーシス阻害剤は、天然のTNF結合蛋白との競合による有効性の低下、血液中の滞留時間が短い等の問題がある。また、低分子有機化合物のアポトーシス阻害剤は、アポトーシスの基本経路を阻害するので、選択性が低いことによる副作用が問題である。
【００１３】
【特許文献１】
特開２００２−１３８０９９号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した抗体、合成ペプチドおよび低分子有機化合物のような従来知られているアポトーシス阻害剤に認められる短所を克服した、新しいアポトーシスまたは炎症を阻害する物質を提供することを課題とする。すなわち、選択性が高く、有効性が良好で、しかも分子量がそれほど大きくないアポトーシスまたは炎症の阻害物質を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、本発明により、「次ぎのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、そのＮ末端のアミノ基はアシル化されていてもよく、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化またはエステル化されていてもよい。）またはその塩であって、アポトーシスまたは炎症の誘導を阻害する活性を有するもの：
（ａ）下記のいずれかのアミノ酸配列：
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)；
Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)；
Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His （配列番号：３）；
（ｂ）上記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において６個を越えない任意のアミノ酸残基が欠失、付加および／または置換しているアミノ酸配列」を提供することにより、解決される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
【００１７】
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。
【００１８】
本発明のペプチドの製造は、通常のペプチド合成方法により行われる。例えば固相合成法または液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日 株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。
【００１９】
本発明のペプチドの固相合成法による調製は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体のような反応溶媒に不溶性である重合体に、目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−ＣＯＯＨ基を介して結合させ、次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−アミノ基のような官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ基のようなペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作とを順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより目的とするペプチドを得、次いでこれを精製することによって実施される。ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィ−やゲルパーミエイションクロマトグラフィーで行うのが効果的である。
【００２０】
また、本発明のペプチドの塩は、通常の塩生成反応を利用することにより調製される。
【００２１】
本発明のペプチドに含まれるべきアミノ酸配列としては、前記したとおり、
(１)： Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)
(２) Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)、
(３) Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His（配列番号：３）、
から選択されたものが挙げられる。
また、上記（ｂ）に含まれるアミノ酸配列の具体例としては、(４) Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys（配列番号：４）、(５) Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr（配列番号：５）、(６) Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys（配列番号：６）、(７) Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His（配列番号：７）などが挙げられる。
【００２２】
すなわち、本発明のペプチドには、前記配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列を、配列の全部または一部として有するペプチドが含まれる。場合によっては、当該アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基はアシル化されてもよく、例えば当該アミノ基に低級アルカノイル基(例えば、アセチル基など)または低級アルコキシカルボニル基(例えば、メトキシカルボニル基またはブトキシカルボニル基など)が導入されていてもよい。また、当該アミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基はアミド化またはエステル化されていてもよく、例えば当該カルボキシル基はアミド基または低級アルキルエステル基(例えば、メチルエステル基またはブチルエステル基など)に変換されていてもよい。また、本発明のペプチドに含まれている前記配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列は、各アミノ酸残基が側鎖官能基の性質に基づき相同性置換されたものでもよい。例えば、CysはSerに、LeuはIle、Valに、SerはThrに、GluはAspに、GlnはAsnに、LysはArgに、PheはTyr、His、Trpにそれぞれ置換可能であり、その逆も置換可能である。さらに、本発明のペプチドに含まれている前記配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列中の任意の位置において、１〜６個の任意のアミノ酸残基が、好ましくは１もしくは２個の任意のアミノ酸残基が、さらに好ましくは１個の任意のアミノ酸残基が、それぞれ独立して付加されてもよく(例えば、配列番号２に対応する配列番号４または５)、また、１〜６個の任意のアミノ酸残基が、好ましくは１〜３個の任意のアミノ酸残基が、より好ましくは１もしくは２個の任意のアミノ酸残基が、さらに好ましくは１個の任意のアミノ酸残基が、それぞれ独立して欠失してもよい。本明細書における「本発明のペプチド」の記載には、これらのペプチドすべてが含まれる。
【００２３】
本発明のペプチドは、塩、特に薬学的に許容される塩を形成していてもよく、酸塩、金属塩またはアミン塩を形成する。その塩としては、例えば、以下に限らないが、塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩など；アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム、カリウムなど)もしくはアルカリ土類金属塩(例えば、カルシウムなど)、またはアルミニウム塩など(これらの塩は、水酸化物イオンまたは炭酸イオンとの間で形成する塩である)；トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩、ジエタノールアミン塩、ｔ−ブチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、アルギニン塩などが挙げられる。
【００２４】
本発明のペプチドのTNF、TRAIL、FasLなどに対する阻害効果は、通常のこれらの活性を測定する方法を利用して行われる。例えば、TNFの活性は、(１)マウスＬ細胞を標的とする細胞障害活性、(２)リポプロテインリパーゼの抑制活性、(３)線維芽細胞に対する増殖促進活性を測定して行われる〔例えば、中嶋暉躬他編 新基礎生化学実験法 ６ 「生物活性を用いる測定法」(昭和６３年４月３０日 丸善株式会社発行)、第２６７−２７２頁参照〕。また、TNFの活性はマウスＬ９２９細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる。TRAILの活性はマウスＬ９２９細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる。FasLの活性はFas遺伝子を導入したマウスＬ９２９細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる(例えば、EMBO J, 13 , 4587-4596, 1994.参照)。アポトーシス誘導の検出は、ヨウ化プロピディウム(ＰＩ)やヘキスト３３２５８等の核酸染色試薬や、蛍光標識アネキシンＶなどの膜構造の変化を検出する方法が好ましく用いられる。中でもヨウ化プロピディウム(ＰＩ)、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶが特に好ましい。
【００２５】
本発明のペプチドを用いる処置法は、例えば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、経口投与などの全身的投与や、関節内投与などのように疾患部位にカテーテルや注射針を用いて本発明のペプチドを注入する方法などが挙げられる。
【００２６】
本発明のペプチドの有効な活性発現のための投与量は、一日量が通常０．０１μｇ／ｋｇ〜２ｇ／ｋｇ(体重)であり、好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ(体重)である。
【００２７】
投与形態としてはペプチドを５％ブドウ糖液や生理食塩水などの薬学的に許容し得る溶液に溶解させて得られる溶液が好ましく、また該溶液は薬理学的に許容される種々の添加剤を含んでいてもよい。さらにペプチド類をカプセル化またはリポソ−ム化することも可能である。
【００２８】
抗体の作成
種々の宿主動物に、１種類以上の本発明のペプチドを含む組成物を注射することよって免疫することが出来る。宿主動物には、ウサギ、マウス、モルモット、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。種々のアジュバントを宿主種に応じて免疫応答を増強させるために使用することが出来、その例として、フロイント（完全又は不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール及びＢＣＧ（無菌化ウシ型結核菌）やコリネバクテリウム・パルブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')２断片、Fab発現ライブラリーを使用して生産された分子などが含まれる。
【００３０】
特定の抗原に対する抗体の均一な集合であるモノクローナル抗体は、上記したペプチドを使用し、標準のハイブリドーマ技術（コーラーら: Nature, 256:495,1975; コーラーら: Eur. J. Immunol., 6:511, 1976; コーラーら:Eur. J. Immunol., 6:292, 1976; ハマーリングら: In: Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas, Elsevier, NY, 1981; アメリカ特許4,376,110; コスボアら：Immunology Today, 4:72, 1983; コールら: Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:2026,1983; コールら: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983）を採用することによって、調製することが出来る。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及びそれらのサブクラスを含む、任意のイムノグロブリンのクラスから選択することが出来る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれで培養されてもよい。
【００３１】
抗体は、例えば診断的検定の部分として生物学的試料中の抗原の存在を検出するために使用することが出来、また、他の治療的方法による医療的処置効果の評価のために使用することも出来る。
【００３２】
免疫検定法
更なる本発明の実施態様は、１種類以上の本発明のペプチドを抗原として特異的に認識する抗体を用いる免疫検定法の分野に関連する。
【００３３】
１種類以上の本発明のペプチドは当該抗原として特異的に認識される。
【００３４】
１つの実施態様において、免疫検定法は、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)である。この型では、サンプルおよび所定の試薬は、マイクロタイターウェルプレートのウェル内に含まれ、検定は、酵素標識の検出に適当な検出試薬をウェルに加えることにより開始される。当該検定は、当業者に既知であり、当該免疫検定法の技術に関連する背景情報は、'The Immunoassay Handbook', (Wild, D. G. Ed, Stockton Press, New York, [1994])に見ることができる。
【００３５】
適当な典型的な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限らない。ワサビのペルオキシダーゼが、本発明の酵素免疫検定法の使用に特に好ましい酵素標識である。
【００３６】
更に異なる実施態様では、免疫検定法は、放射性免疫検定法であり、本発明のアッセイ法の使用に適当な放射性同位元素には、トリチウムのようなβ-放射する同位元素およびオージェ電子を放射するヨウ素-１２５が含まれる。
【００３７】
また、更に異なる実施態様では、免疫検定法は、蛍光免疫検定法であり、適当な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミンおよびシアニン色素から選択される。
【００３８】
更には、本発明の別態様として、本発明のペプチド以外に、本発明のペプチドをコードしている核酸を提供する。
【００３９】
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
(実施例１)
式(１)： Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)で示されるアミノ酸配列を含むペプチドTyr Arg His Ala Trp Ser GluAsn Leu Ala Gln Cys Phe Asn-NH2をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(２’，４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル)−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−エチル基を０．６２ミリモル／ｇ(樹脂)の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、Ｆｍｏｃアミドレジン〕０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Ｆｍｏｃグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−γ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸〔Ｆｍｏｃグルタミン酸〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎβ−トリチル−Ｌ−アスパラギン〔Ｆｍｏｃアスパラギン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＧ−(２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル)−Ｌ−アルギニン〔Ｆｍｏｃアルギニン〕、Ｎα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン〔Ｆｍｏｃシステイン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン〔Ｆｍｏｃセリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Ｆｍｏｃロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン〔Ｆｍｏｃヒスチジン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−フェニルアラニン〔Ｆｍｏｃフェニルアラニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Ｆｍｏｃアラニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン〔Ｆｍｏｃチロシン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｎｄ−ブトキシ−Ｌ−トリプトファン〔Ｆｍｏｃトリプトファン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。
【００４０】
得られたペプチド樹脂を、７．５％のフェノール、２．５％のエタンジチオール、５％の水と５％のチオアニソールを含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をＰＤ１０カラム(アマシャムファルマシアジャパン)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをファルマシアバイオテク株式会社製ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ＸＴ〔カラム：ミリポアウオーターズ株式会社製ノバパックＣ１８ ３．９ｍｍφ×１５０ｍｍ、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に直線的に変化させた)、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕に付したところ、１７．３minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は１７３８であった(理論値：１７３７．９２)。
【００４１】
(実施例２)
式(２)：Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)、式(３)： Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His（配列番号：３）、式(４)：Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys（配列番号：４）、式(５)： Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr（配列番号：５）、式(６)： Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro GluThr Cys Arg Lys（配列番号：６）、式(７)： Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His（配列番号：７）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを実施例１と同様の方法で合成した。ただし、結合反応において、実施例１に示したアミノ酸以外に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Ｆｍｏｃグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−プロリン〔Ｆｍｏｃプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−トレオニン〔Ｆｍｏｃトレオニン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン〔Ｆｍｏｃリジン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−バリン〔Ｆｍｏｃバリン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−β−ブチル−Ｌ−アスパラギン酸〔Ｆｍｏｃアスパラギン酸〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。
【００４２】
Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2で示される精製ペプチドでは、１０．０minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１４９６であった(理論値：１４９５．６４)。Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His-NH2で示される精製ペプチドでは、１０．２minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１０３９であった(理論値：１０３８．１７)。Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2で示される精製ペプチドでは、１０．９minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は２１４４であった(理論値：２１４３．３０)。Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr-NH2で示される精製ペプチドでは、９．８minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１８５６であった(理論値：１８５６．０７)。Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2で示される精製ペプチドでは、９．０minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１４４３であった(理論値：１４４２．５９)。Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His-NH2で示される精製ペプチドでは、８．３minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１００６であった(理論値：１００６．０４)。
【００４３】
（試験例１）
２４穴プレート（ＮＵＮＣ社）の各ウエルに、１０％のウシ胎児血清を含むイーグル培地（１０％ＦＣＳ／Ｅ−ＭＥＭ）に分散した５万個のＬ９２９細胞または１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ）に分散した５万個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、各１ｍｌずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２下２４時間培養して細胞を接着させた後、本発明のペプチドの、リン酸塩緩衝（ＰＢＳ：１０ｍＭ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４）溶液を１００μｌ、ならびにｒｈＴＮＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはｒｈＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはｒｈＦａｓＬ（Ｒ＆Ｄシステムズ）のＰＢＳ溶液１０μｌを各ウエルに加えた。ｒｈＦａｓＬ（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはｒｈＴＲＡＩＬを用いる場合には、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）を最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように、さらに加えた。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合には、さらにシクロヘキシイミドを最終濃度が５μｇ／ｍｌになるように加えた。３７℃、５％ＣＯ２下１２時間培養した後、ヨウ化プロピディウム（ＰＩ）を培地中に最終濃度が１μｇ／ｍｌになるように加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２下１５分間静置した。共焦点レーザー顕微鏡でＰＩの蛍光を観察し、アポトーシスに誘導された細胞を判別した。任意に選んだ５視野におけるアポトーシスに誘導された細胞と全細胞の割合を計算し、アポトーシス誘導率とした。
【００４４】
Ｌ９２９細胞に対してｒｈＴＮＦαを５０ｎｇ／ｍｌ用い、かつペプチド溶液の代わりにＰＢＳを加えた時のアポトーシス誘導率が６１％であった。Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn-NH2のペプチドを最終濃度１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合には、アポトーシス誘導率は４３％であり、アポトーシス阻害率は２９％であった。
【００４５】
同じく、Ｌ９２９細胞に対してｒｈＴＲＡＩＬを５０ｎｇ／ｍｌ用い、かつペプチド溶液の代わりにＰＢＳを加えた時のアポトーシス誘導率が４６％であった。Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は５９％、Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は４７％、Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は４４％、Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は６１％であった。
【００４６】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してｒｈＦａｓＬを５０ｎｇ／ｍｌ用い、かつペプチド溶液の代わりにＰＢＳを加えた時のアポトーシス誘導率が６１％であった。Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His -NH2のペプチドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は２１％、Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His-NH2のペプチドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は１９％であった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、抗体、合成ペプチドおよび低分子有機化合物のような従来知られているアポトーシス阻害剤に認められる短所を克服した、新しいアポトーシスまたは炎症を阻害する新規なペプチドまたはその塩が提供される。すなわち、選択性が高く、有効性が良好で、しかも分子量がそれほど大きくない、アポトーシスまたは炎症を阻害する新規なペプチドが提供される。
また、上記の実施例および試験例から明らかなように、本発明により提供される新規なペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、TNF、TRAIL、FasLなどによるアポトーシス誘導を効果的に阻害できるので、これらが原因となる自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リューマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセド―病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病など)、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎(例えば、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎など)、AIDS、臓器移植後の拒絶反応、敗血症ショック、うっ血性心不全、脊髄異形成症候群、神経変性疾患(例えば、脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマーなど)および癌などの処置剤として有用である。
【００４８】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシスや炎症を阻害する活性を有する、新規なペプチドおよびその塩に関する。特に、本発明は、TNF、TRAIL、FasLなどによって誘導されるアポトーシスや炎症を阻害し、これが原因となる自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リューマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病など)、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎(例えば、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎など)、AIDS、臓器移植後の拒絶反応、敗血症ショック、うっ血性心不全、脊髄異形成症候群、神経変性疾患(例えば、脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマーなど)および癌などの処置に有用なペプチドならびにその薬学的に許容される塩を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは生体の恒常性を保つために必要な自然死であり、その破綻は癌や自己免疫疾患などの重篤な疾患を招く(Annu. Rev. Immunol., 17, 221-253, 1999)。アポトーシスは放射線や薬剤などの外因によっても引き起されるが、内因性の誘導因子としてTNF、TRAIL、FasLなどが報告されている(Pharm Acta Helv, 74, 281-286, 2000; Exp Cell Res, 256, 58-66, 2000)。これらは、標的細胞上のそれぞれに特異的な受容体と結合し、アポトーシスを誘導する(TIBS, 24 February, 47-53, 1999)。
【０００３】
一方、TNF、TRAIL、FasLなどの過剰産生は、リウマチ性関節炎(Rheumatoid arthritis)、多発性硬化症(Multiple sclerosis)、AIDS(Acquired immune deficiency syndrome)、癌、敗血症ショック(Septic shock)、うっ血性心不全(Congestive heart failure)、再性不良性貧血(Aplastic anemia)、脊髄異形成症候群(Myelodysplastic syndrome)、クローン病(Crohn's disease)等の疾患の原因となる(Microsc Res Tech, 50, 229-235, 2000)。
【０００４】
FasLに特異的に反応するヒト型化免疫グロブリンが知られており、アポトーシスに代表されるFasLとFasとの生理的反応を抑制することが示されている(ＷＯ９８／１００７０)。
【０００５】
Fas/FasL系の異常に起因する疾患の治療剤として有用な、抗Fas抗体を有効成分として含有する新規医薬組成物が知られている(特開２０００−１６９３９３)。
【０００６】
Caspase-8と結合しDeath effector domainを持たないタンパク質が、アポトーシス制御能を有することが知られている(特開２０００−２２６４００)。
【０００７】
Fasの細胞内ドメインに結合するMORT-1、あるいはTRADDに結合して、FasLまたはTNFの効果をモジュレートするタンパク質、さらにはその活性を阻害するペプチドが知られている(特表平１１−５０９４２２)。
【０００８】
上皮細胞増殖因子(EGF)を有効成分とする、細胞障害性Ｔ細胞上のFasLと臓器細胞膜上のFasとの相互作用によって惹起されるアポトーシスの抑制剤または予防剤が知られている(特開平１０−１９４９８８)。
【０００９】
天然のTNF結合蛋白のTNF結合機能部分を探索して得られた合成ペプチドが知られており、マウスL-M細胞に対するTNFの細胞毒性を阻害することが示されている(特開平５−１９４５９４)。
【００１０】
トリアゼピンまたはジアゼピンからなる７員環と２乃至４個の窒素原子を含む５員環との縮合環化合物であることを特徴とするアポトーシス抑制剤が知られている(特開平１１−２２８５７６)。
【００１１】
また、近年カスペースの阻害作用などによりアポトーシスを阻害する薬剤が脳虚血による神経障害（Proc Natl Acad Sci USA, 95, 15769-15774, 1998）、ハンチントン病（Nature Medicine, 6, 797-801, 2000）、パーキンソン病（J Neurosci, 22, 1763-1771, 2002）、筋萎縮性側索硬化症（Nature, 417, 74-78, 2002）、アルツハイマー等の神経変性疾患の動物モデルにおいて有効な治療効果を示すことが報告されている。
【００１２】
抗体に代表されるアポトーシス阻害剤は、特異性は高いが分子量が大きいタンパク質であるので、抗原性、投与方法、安定性などに問題がある。天然のTNF結合蛋白のTNF結合機能部分を探索して得られた合成ペプチドであるアポトーシス阻害剤は、天然のTNF結合蛋白との競合による有効性の低下、血液中の滞留時間が短い等の問題がある。また、低分子有機化合物のアポトーシス阻害剤は、アポトーシスの基本経路を阻害するので、選択性が低いことによる副作用が問題である。
【００１３】
【特許文献１】
特開２００２−１３８０９９号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した抗体、合成ペプチドおよび低分子有機化合物のような従来知られているアポトーシス阻害剤に認められる短所を克服した、新しいアポトーシスまたは炎症を阻害する物質を提供することを課題とする。すなわち、選択性が高く、有効性が良好で、しかも分子量がそれほど大きくないアポトーシスまたは炎症の阻害物質を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、本発明により、「次ぎのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、そのＮ末端のアミノ基はアシル化されていてもよく、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化またはエステル化されていてもよい。）またはその塩であって、アポトーシスまたは炎症の誘導を阻害する活性を有するもの：
（ａ）下記のいずれかのアミノ酸配列：
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)；
Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)；
Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His （配列番号：３）；
（ｂ）上記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において６個を越えない任意のアミノ酸残基が欠失、付加および／または置換しているアミノ酸配列」を提供することにより、解決される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
【００１７】
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。
【００１８】
本発明のペプチドの製造は、通常のペプチド合成方法により行われる。例えば固相合成法または液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日 株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。
【００１９】
本発明のペプチドの固相合成法による調製は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体のような反応溶媒に不溶性である重合体に、目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−ＣＯＯＨ基を介して結合させ、次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−アミノ基のような官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ基のようなペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作とを順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより目的とするペプチドを得、次いでこれを精製することによって実施される。ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィ−やゲルパーミエイションクロマトグラフィーで行うのが効果的である。
【００２０】
また、本発明のペプチドの塩は、通常の塩生成反応を利用することにより調製される。
【００２１】
本発明のペプチドに含まれるべきアミノ酸配列としては、前記したとおり、
(１)： Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)
(２) Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)、
(３) Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His（配列番号：３）、
から選択されたものが挙げられる。
また、上記（ｂ）に含まれるアミノ酸配列の具体例としては、(４) Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys（配列番号：４）、(５) Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr（配列番号：５）、(６) Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys（配列番号：６）、(７) Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His（配列番号：７）などが挙げられる。
【００２２】
すなわち、本発明のペプチドには、前記配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列を、配列の全部または一部として有するペプチドが含まれる。場合によっては、当該アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基はアシル化されてもよく、例えば当該アミノ基に低級アルカノイル基(例えば、アセチル基など)または低級アルコキシカルボニル基(例えば、メトキシカルボニル基またはブトキシカルボニル基など)が導入されていてもよい。また、当該アミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基はアミド化またはエステル化されていてもよく、例えば当該カルボキシル基はアミド基または低級アルキルエステル基(例えば、メチルエステル基またはブチルエステル基など)に変換されていてもよい。また、本発明のペプチドに含まれている前記配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列は、各アミノ酸残基が側鎖官能基の性質に基づき相同性置換されたものでもよい。例えば、CysはSerに、LeuはIle、Valに、SerはThrに、GluはAspに、GlnはAsnに、LysはArgに、PheはTyr、His、Trpにそれぞれ置換可能であり、その逆も置換可能である。さらに、本発明のペプチドに含まれている前記配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列中の任意の位置において、１〜６個の任意のアミノ酸残基が、好ましくは１もしくは２個の任意のアミノ酸残基が、さらに好ましくは１個の任意のアミノ酸残基が、それぞれ独立して付加されてもよく(例えば、配列番号２に対応する配列番号４または５)、また、１〜６個の任意のアミノ酸残基が、好ましくは１〜３個の任意のアミノ酸残基が、より好ましくは１もしくは２個の任意のアミノ酸残基が、さらに好ましくは１個の任意のアミノ酸残基が、それぞれ独立して欠失してもよい。本明細書における「本発明のペプチド」の記載には、これらのペプチドすべてが含まれる。
【００２３】
本発明のペプチドは、塩、特に薬学的に許容される塩を形成していてもよく、酸塩、金属塩またはアミン塩を形成する。その塩としては、例えば、以下に限らないが、塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩など；アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム、カリウムなど)もしくはアルカリ土類金属塩(例えば、カルシウムなど)、またはアルミニウム塩など(これらの塩は、水酸化物イオンまたは炭酸イオンとの間で形成する塩である)；トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩、ジエタノールアミン塩、ｔ−ブチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、アルギニン塩などが挙げられる。
【００２４】
本発明のペプチドのTNF、TRAIL、FasLなどに対する阻害効果は、通常のこれらの活性を測定する方法を利用して行われる。例えば、TNFの活性は、(１)マウスＬ細胞を標的とする細胞障害活性、(２)リポプロテインリパーゼの抑制活性、(３)線維芽細胞に対する増殖促進活性を測定して行われる〔例えば、中嶋暉躬他編 新基礎生化学実験法 ６ 「生物活性を用いる測定法」(昭和６３年４月３０日 丸善株式会社発行)、第２６７−２７２頁参照〕。また、TNFの活性はマウスＬ９２９細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる。TRAILの活性はマウスＬ９２９細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる。FasLの活性はFas遺伝子を導入したマウスＬ９２９細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するアポトーシス誘導で測定できる(例えば、EMBO J, 13 , 4587-4596, 1994.参照)。アポトーシス誘導の検出は、ヨウ化プロピディウム(ＰＩ)やヘキスト３３２５８等の核酸染色試薬や、蛍光標識アネキシンＶなどの膜構造の変化を検出する方法が好ましく用いられる。中でもヨウ化プロピディウム(ＰＩ)、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶが特に好ましい。
【００２５】
本発明のペプチドを用いる処置法は、例えば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、経口投与などの全身的投与や、関節内投与などのように疾患部位にカテーテルや注射針を用いて本発明のペプチドを注入する方法などが挙げられる。
【００２６】
本発明のペプチドの有効な活性発現のための投与量は、一日量が通常０．０１μｇ／ｋｇ〜２ｇ／ｋｇ(体重)であり、好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ(体重)である。
【００２７】
投与形態としてはペプチドを５％ブドウ糖液や生理食塩水などの薬学的に許容し得る溶液に溶解させて得られる溶液が好ましく、また該溶液は薬理学的に許容される種々の添加剤を含んでいてもよい。さらにペプチド類をカプセル化またはリポソ−ム化することも可能である。
【００２８】
抗体の作成
種々の宿主動物に、１種類以上の本発明のペプチドを含む組成物を注射することよって免疫することが出来る。宿主動物には、ウサギ、マウス、モルモット、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。種々のアジュバントを宿主種に応じて免疫応答を増強させるために使用することが出来、その例として、フロイント（完全又は不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール及びＢＣＧ（無菌化ウシ型結核菌）やコリネバクテリウム・パルブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')２断片、Fab発現ライブラリーを使用して生産された分子などが含まれる。
【００３０】
特定の抗原に対する抗体の均一な集合であるモノクローナル抗体は、上記したペプチドを使用し、標準のハイブリドーマ技術（コーラーら: Nature, 256:495,1975; コーラーら: Eur. J. Immunol., 6:511, 1976; コーラーら:Eur. J. Immunol., 6:292, 1976; ハマーリングら: In: Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas, Elsevier, NY, 1981; アメリカ特許4,376,110; コスボアら：Immunology Today, 4:72, 1983; コールら: Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:2026,1983; コールら: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983）を採用することによって、調製することが出来る。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及びそれらのサブクラスを含む、任意のイムノグロブリンのクラスから選択することが出来る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれで培養されてもよい。
【００３１】
抗体は、例えば診断的検定の部分として生物学的試料中の抗原の存在を検出するために使用することが出来、また、他の治療的方法による医療的処置効果の評価のために使用することも出来る。
【００３２】
免疫検定法
更なる本発明の実施態様は、１種類以上の本発明のペプチドを抗原として特異的に認識する抗体を用いる免疫検定法の分野に関連する。
【００３３】
１種類以上の本発明のペプチドは当該抗原として特異的に認識される。
【００３４】
１つの実施態様において、免疫検定法は、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)である。この型では、サンプルおよび所定の試薬は、マイクロタイターウェルプレートのウェル内に含まれ、検定は、酵素標識の検出に適当な検出試薬をウェルに加えることにより開始される。当該検定は、当業者に既知であり、当該免疫検定法の技術に関連する背景情報は、'The Immunoassay Handbook', (Wild, D. G. Ed, Stockton Press, New York, [1994])に見ることができる。
【００３５】
適当な典型的な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限らない。ワサビのペルオキシダーゼが、本発明の酵素免疫検定法の使用に特に好ましい酵素標識である。
【００３６】
更に異なる実施態様では、免疫検定法は、放射性免疫検定法であり、本発明のアッセイ法の使用に適当な放射性同位元素には、トリチウムのようなβ-放射する同位元素およびオージェ電子を放射するヨウ素-１２５が含まれる。
【００３７】
また、更に異なる実施態様では、免疫検定法は、蛍光免疫検定法であり、適当な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミンおよびシアニン色素から選択される。
【００３８】
更には、本発明の別態様として、本発明のペプチド以外に、本発明のペプチドをコードしている核酸を提供する。
【００３９】
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
(実施例１)
式(１)： Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)で示されるアミノ酸配列を含むペプチドTyr Arg His Ala Trp Ser GluAsn Leu Ala Gln Cys Phe Asn-NH2をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(２’，４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル)−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−エチル基を０．６２ミリモル／ｇ(樹脂)の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、Ｆｍｏｃアミドレジン〕０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Ｆｍｏｃグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−γ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸〔Ｆｍｏｃグルタミン酸〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎβ−トリチル−Ｌ−アスパラギン〔Ｆｍｏｃアスパラギン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＧ−(２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル)−Ｌ−アルギニン〔Ｆｍｏｃアルギニン〕、Ｎα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン〔Ｆｍｏｃシステイン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン〔Ｆｍｏｃセリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Ｆｍｏｃロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン〔Ｆｍｏｃヒスチジン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−フェニルアラニン〔Ｆｍｏｃフェニルアラニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Ｆｍｏｃアラニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン〔Ｆｍｏｃチロシン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｎｄ−ブトキシ−Ｌ−トリプトファン〔Ｆｍｏｃトリプトファン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。
【００４０】
得られたペプチド樹脂を、７．５％のフェノール、２．５％のエタンジチオール、５％の水と５％のチオアニソールを含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をＰＤ１０カラム(アマシャムファルマシアジャパン)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをファルマシアバイオテク株式会社製ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ＸＴ〔カラム：ミリポアウオーターズ株式会社製ノバパックＣ１８ ３．９ｍｍφ×１５０ｍｍ、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に直線的に変化させた)、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕に付したところ、１７．３minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は１７３８であった(理論値：１７３７．９２)。
【００４１】
(実施例２)
式(２)：Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)、式(３)： Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His（配列番号：３）、式(４)：Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys（配列番号：４）、式(５)： Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr（配列番号：５）、式(６)： Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro GluThr Cys Arg Lys（配列番号：６）、式(７)： Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His（配列番号：７）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを実施例１と同様の方法で合成した。ただし、結合反応において、実施例１に示したアミノ酸以外に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Ｆｍｏｃグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−プロリン〔Ｆｍｏｃプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−トレオニン〔Ｆｍｏｃトレオニン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン〔Ｆｍｏｃリジン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−バリン〔Ｆｍｏｃバリン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−β−ブチル−Ｌ−アスパラギン酸〔Ｆｍｏｃアスパラギン酸〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。
【００４２】
Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2で示される精製ペプチドでは、１０．０minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１４９６であった(理論値：１４９５．６４)。Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His-NH2で示される精製ペプチドでは、１０．２minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１０３９であった(理論値：１０３８．１７)。Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2で示される精製ペプチドでは、１０．９minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は２１４４であった(理論値：２１４３．３０)。Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr-NH2で示される精製ペプチドでは、９．８minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１８５６であった(理論値：１８５６．０７)。Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2で示される精製ペプチドでは、９．０minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１４４３であった(理論値：１４４２．５９)。Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His-NH2で示される精製ペプチドでは、８．３minに単一のピ−クが示され、精製ペプチドの分子量は１００６であった(理論値：１００６．０４)。
【００４３】
（試験例１）
２４穴プレート（ＮＵＮＣ社）の各ウエルに、１０％のウシ胎児血清を含むイーグル培地（１０％ＦＣＳ／Ｅ−ＭＥＭ）に分散した５万個のＬ９２９細胞または１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ）に分散した５万個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、各１ｍｌずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２下２４時間培養して細胞を接着させた後、本発明のペプチドの、リン酸塩緩衝（ＰＢＳ：１０ｍＭ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４）溶液を１００μｌ、ならびにｒｈＴＮＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはｒｈＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはｒｈＦａｓＬ（Ｒ＆Ｄシステムズ）のＰＢＳ溶液１０μｌを各ウエルに加えた。ｒｈＦａｓＬ（Ｒ＆Ｄシステムズ）またはｒｈＴＲＡＩＬを用いる場合には、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）を最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように、さらに加えた。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いる場合には、さらにシクロヘキシイミドを最終濃度が５μｇ／ｍｌになるように加えた。３７℃、５％ＣＯ２下１２時間培養した後、ヨウ化プロピディウム（ＰＩ）を培地中に最終濃度が１μｇ／ｍｌになるように加え、さらに３７℃、５％ＣＯ２下１５分間静置した。共焦点レーザー顕微鏡でＰＩの蛍光を観察し、アポトーシスに誘導された細胞を判別した。任意に選んだ５視野におけるアポトーシスに誘導された細胞と全細胞の割合を計算し、アポトーシス誘導率とした。
【００４４】
Ｌ９２９細胞に対してｒｈＴＮＦαを５０ｎｇ／ｍｌ用い、かつペプチド溶液の代わりにＰＢＳを加えた時のアポトーシス誘導率が６１％であった。Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn-NH2のペプチドを最終濃度１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合には、アポトーシス誘導率は４３％であり、アポトーシス阻害率は２９％であった。
【００４５】
同じく、Ｌ９２９細胞に対してｒｈＴＲＡＩＬを５０ｎｇ／ｍｌ用い、かつペプチド溶液の代わりにＰＢＳを加えた時のアポトーシス誘導率が４６％であった。Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は５９％、Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は４７％、Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys Cys Arg Thr-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は４４％、Phe Cys Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys-NH2のペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は６１％であった。
【００４６】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してｒｈＦａｓＬを５０ｎｇ／ｍｌ用い、かつペプチド溶液の代わりにＰＢＳを加えた時のアポトーシス誘導率が６１％であった。Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His -NH2のペプチドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は２１％、Phe Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu His-NH2のペプチドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えた場合のアポトーシス阻害率は１９％であった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、抗体、合成ペプチドおよび低分子有機化合物のような従来知られているアポトーシス阻害剤に認められる短所を克服した、新しいアポトーシスまたは炎症を阻害する新規なペプチドまたはその塩が提供される。すなわち、選択性が高く、有効性が良好で、しかも分子量がそれほど大きくない、アポトーシスまたは炎症を阻害する新規なペプチドが提供される。
また、上記の実施例および試験例から明らかなように、本発明により提供される新規なペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、TNF、TRAIL、FasLなどによるアポトーシス誘導を効果的に阻害できるので、これらが原因となる自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リューマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、自然不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセド―病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病など)、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎(例えば、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎など)、AIDS、臓器移植後の拒絶反応、敗血症ショック、うっ血性心不全、脊髄異形成症候群、神経変性疾患(例えば、脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマーなど)および癌などの処置剤として有用である。
【００４８】
【配列表】
Claims (18)
- 次ぎのいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、そのＮ末端のアミノ基はアシル化されていてもよく、Ｃ末端のカルボキシル基はアミド化またはエステル化されていてもよい。）またはその塩であって、アポトーシスまたは炎症の誘導を阻害する活性を有するもの：
（ａ）下記のいずれかのアミノ酸配列：
Tyr Arg His Ala Trp Ser Glu Asn Leu Ala Gln Cys Phe Asn (配列番号：１)；
Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Thr Cys Arg Lys (配列番号：２)；
Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His （配列番号：３）；
（ｂ）上記（ａ）のいずれかのアミノ酸配列において６個を越えない任意のアミノ酸残基が欠失、付加および／または置換しているアミノ酸配列。 - （ｂ）のアミノ酸配列において、欠失、付加および／または置換しているアミノ酸残基の数が３個を越えないものである、請求項１記載のペプチドまたはその塩。
- （ｂ）のアミノ酸配列において、置換が側鎖官能基の性質に基づいて相同性のあるアミノ酸間で行なわれている、請求項１または２記載のペプチドまたはその塩。
- Ｎ末端のアミノ基のアシル化により、低級アルカノイル基または低級アルコキシカルボニル基が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたはその塩。
- Ｃ末端のカルボキシ基のアミド化またはエステル化により、アミド基または低級アルキルエステル基が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたはその塩。
- 塩が酸塩、金属塩またはアミン塩である、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドの塩。
- 酸塩が塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、オレイン酸塩またはパルミチン酸塩である、請求項６に記載のペプチドの塩。
- 金属塩がアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアルミニウム塩である、請求項６に記載のペプチドの塩。
- アミン塩がトリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩、ジエタノールアミン塩、ｔ−ブチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩またはアルギニン塩である、請求項６に記載のペプチドの塩。
- アポトーシスまたは炎症の誘導がTNFによるものである、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその塩。
- アポトーシスまたは炎症の誘導がTRAILによるものである、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその塩。
- アポトーシスまたは炎症の誘導がFasLによるものである、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドまたはその塩。
- 自己免疫疾患、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、肝炎、AIDS、臓器移植後の拒絶反応、敗血症ショック、うっ血性心不全、脊髄異形成症候群、神経変性疾患または癌の処置に有用な請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチドまたはその塩。
- 請求項１から９のいずれかに記載のペプチドまたはその塩を抗原として特異的に認識する抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
- 用いられる抗体が請求項１４または１５に記載の抗体である、免疫検定方法。
- 検定方法が酵素免疫検定法、放射性免疫検定法または蛍光免疫検定法である、請求項１６に記載の免疫検定方法。
- 請求項１に記載のペプチドをコードしている核酸。
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