JP2004151607A - 落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡及びその顕微鏡の使用方法 - Google Patents
落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡及びその顕微鏡の使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】落射蛍光照明装置のユニットを兼用して簡単な構成変更だけでリフレクションコントラスト照明観察を可能とする顕微鏡を提供する。
【解決手段】標本を照明する光源と対物レンズの間に中間光学系を配置し、前記中間光学系はリレー光学系と、開口絞り部材と、前記光源の照明光の励起成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起成分を前記標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光を制限し、それ以外の蛍光光を観察光学系に導く反射光学素子と、前記反射光学素子からの蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤーフィルター素子とで構成する。
【選択図】 図１
【解決手段】標本を照明する光源と対物レンズの間に中間光学系を配置し、前記中間光学系はリレー光学系と、開口絞り部材と、前記光源の照明光の励起成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起成分を前記標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光を制限し、それ以外の蛍光光を観察光学系に導く反射光学素子と、前記反射光学素子からの蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤーフィルター素子とで構成する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡の落射照明・観察に関するものであり、特に落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察ができる顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、図９に示すリフレクションコントラスト照明装置は、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）８９：１４１−１５０内、Ｐ．１４３のＦｉｇ．１に示すような構成であった。
【０００３】
つまり、開口絞り９０は、中央部を遮光したリング形状の絞りとし、偏光素子であるポラライザ９１、アナライザ９２（ポラライザ９１の偏光方向と直交している偏光方向をもつ）、対物レンズ９３先端の１／４λ板９４（ポラライザ９１の偏光方向に対して４５度の結晶軸方向をもつ）を必要としていた。
【０００４】
対物レンズ９３のレンズ表面からの反射光は、ポラライザ９１と、アナライザ９２と、１／４λ板９４とによりカットすることができる。そして、標本の置かれたスライドグラス９５の表面或いは裏面からの反射光は、リング状の開口絞り９０により中央が遮光されることでを防ぐことができる。その結果、観察される標本の反射像のコントラスト、或いは干渉縞のコントラストが、ノイズとなる背景光に対して相対的に向上するようになっている。
【０００５】
以上のように、従来は、リフレクションコントラストによる干渉縞を観察するためには、リング状の開口絞り、各種偏光素子を必要とした。
【０００６】
【非特許文献】
Ｉ．Ｃｏｒｎｅｌｅｓｅ−ｔｅｎ Ｖｅｌｄｅ， Ｊ．Ｂｏｎｎｅｔ， Ｈ．Ｊ． Ｔａｎｋｅ， ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｐｌｏｅｍ
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）８９：１４１−１５０
１９８７年１１月２３日論文受領、１９８８年度版
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来のリフレクションコントラスト照明装置は、特殊な構成を取っていたため、他の落射照明装置、例えば落射蛍光照明装置や全反射照明装置などと共通のユニット構成が取れるとは考えられていなかった。
【０００８】
本件発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、落射照明装置のユニットを兼用して簡単な構成変更だけでリフレクションコントラスト照明観察を可能とする顕微鏡を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決する為の手段】
請求項１に係る発明は、標本を照明する光源と、対物レンズを介して、前記標本に前記光源の照明光を導き且つ前記標本からの反射光を観察光学系に導く、前記光源と前記対物レンズとの間に配置された中間光学系とを有し、
前記中間光学系は、前記照明光を前記対物レンズまでリレーするリレー光学系と、前記照明光の光束を制限する開口絞り部材と、前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を前記標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導く反射光学素子と、前記反射光学素子からの蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とから構成され、
前記中間光学系を共通に使用して、前記中間光学系の一部構成要素の状態を変更することで同一の前記標本を観察する落射蛍光観察モードとリフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記両観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１０】
請求項２に係る発明は、前記落射蛍光観察モード時には、前記開口絞り部材を第１の開口径に設定した前記中間光学系を前記対物レンズの光路中に設定し、
前記リフレクションコントラスト観察モード時には、前記開口絞り部材を第１の開口径より小さな開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記中間光学系を前記対物レンズの光路中に設定することを特徴とする請求項１記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１１】
請求項３に係る発明は、（ａ） 標本を照明する照明光源と、開口径を変更できる可変開口絞りを含み、前記可変開口絞りを通った前記照明光源の照明光を対物レンズ側へ導くリレー光学系とを含む落射照明光学ユニットと、
（ｂ） 前記落射照明光学ユニットを通った前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光成分を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導くダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光のうち蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とを含むフィルターブロックとを備え、
前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックとを共通して使用し、落射蛍光観察モードとリフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記落射蛍光観察モードから前記リフレクションコントラスト観察モードへ切換える際には、前記落射照明光学ユニットの前記可変開口絞りを所定の絞り開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記フィルターブロックを前記対物レンズの光路中に設定し、
前記両観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１２】
請求項４に係る発明は、前記フィルターブロックを複数装填できるフィルターカセットを備え、
前記フィルターカセットには、前記落射蛍光観察モードとして使用する場合の落射蛍光照明用フィルターブロックと、前記リフレクションコントラスト観察モードとして使用する場合のリフレクションコントラスト照明用フィルターブロックとが装填され、
前記両観察モードの切換えに応じて自動的に前記フィルターカセットが切り換わることを特徴とする請求項３記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１３】
請求項５に係る発明は、前記標本を全反射照明する全反射照明光源と、前記落射照明光学ユニットの前記リレー光学系の光路に挿脱可能に設けられ、前記全反射照明光源からの照明光を前記対物レンズ側へ導く反射ミラーと、前記対物レンズを介して前記標本に前記反射ミラーからの照明光を全照射させる全反射照明用フィルターブロックとを更に備え、
全反射照明観察モードと前記落射蛍光観察モードと前記リフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記全反射照明観察モードへの切換え時には、前記反射ミラーが前記リレー光学系の光路内に設定され且つ前記全反射照明用フィルターブロックが前記対物レンズの光路内に設定され、
前記全観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする請求項３記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１４】
請求項６に係る発明は、複数の前記フィルターブロックを装填できるフィルターカセットを備え、
前記フィルターカセットには、前記全反射照明観察モードとして使用する場合の前記全反射照明用フィルターブロックと、前記落射蛍光観察モードとして使用する場合の落射蛍光照明用フィルターブロックと、前記リフレクションコントラスト観察モードとして使用する場合のリ
フレクションコントラスト照明用フィルターブロックとが装填され、
前記観察モードの切換えに応じて自動的に前記フィルターカセットが切り換わることを特徴とする請求項５記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１５】
請求項７に係る発明は、（ａ） 標本を照明する照明光源と、開口径を変更できる可変開口絞りを含み、前記可変開口絞りを通った前記照明光源の照明光を対物レンズ側へ導くリレー光学系とを含む落射照明光学ユニットと、（ｂ） 前記落射照明光学ユニットを通った前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光成分を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導くダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光のうち蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とを含むフィルターブロックとを備えた顕微鏡の使用方法において、
落射蛍光観察に使用する場合には、前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックを設定し、
リフレクションコントラスト観察に使用する場合には、前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックとを共通して使用して、前記落射照明光学ユニットの前記可変開口絞りを所定の絞り開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記フィルターブロックを前記対物レンズの光路中に設定し、
前記両観察において共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡の使用方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
図１乃至図５は、本件発明に係る第１の実施の形態を示す。図１は、落射蛍光及びリフレクションコントラスト照明・観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。図２は、図１の照明・観察装置が装着できる倒立顕微鏡の全体図である。図３は、図１の照明・観察装置のフィルターブロックの断面図である。図４は、図３のフィルターブロックの各光学素子の透過特性線図である。図５は図１を自動化した装置を示す図である。
【００１７】
図１及び図２において、倒立顕微鏡１には、透過照明装置５０及びコンデンサレンズ５１が備えると共に、落射蛍光照明装置２及びフィルターブロック３を複数装填したフィルターカセット５２が備えられている。落射蛍光照明・観察装置は、落射蛍光照明装置２及びフィルターブロック３を複数装填したフィルターカセット５２から構成されている。
【００１８】
なお、倒立顕微鏡１には、周知のステージ５３、複数の対物レンズ１３が装着されたレボルバー５４、結像レンズ１５及び接眼部５５がある。ステージ５３上の標本１４の光学像は、観察光学系を構成する対物レンズ１３、フィルターブロック３、結像レンズ１５を通して接眼部５５へ導かれる。
【００１９】
本実施の形態では、後述するように、フィルターカセット５２に装填されたフィルターブロックは、観察モード（以後、詳細に説明する落射蛍光観察モード、リフレクションコントラスト観察モード、全反射照明観察モード）に適合したものが設定される。そして、本実施形態の顕微鏡は、観察モードの変更を行なっても、落射蛍光照明装置２及びフィルターカセット５２に装填されたフィルターブロックを共通に使用するため、照明及び観察光路を共用できる。
【００２０】
まず、顕微鏡の各構成部材の構成について説明する。
落射蛍光照明装置２は、照明光源の水銀ランプ４、コレクタレンズ５、第１のリレーレンズ６、可変開口絞りである開口絞り７、第２のリレーレンズ８、視野絞り９、第３のリレーレンズ１０を持っている。水銀ランプ４からの照明光は、コレクタレンズ５により平行光束に変換され、第１のリレーレンズ６により開口絞り７に集光される。そして、その照明光は、開口絞り７によって対物レンズ１３の開口数に適合した照明光束に絞られ、フィルターブロック３、対物レンズ１３に導かれ、標本１４を照明する。
【００２１】
フィルターカセット５２に装填されたフィルターブロック３は、良く知られているように直方体形状であり、図３に示される励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２及びバリヤフィルター２８を交換可能に備えている。励起フィルター１１及びバリヤフィルター２８は、フィルターブロック３に対してネジ結合している。ダイクロイックミラー１２は、バネにより基準となる面に押圧され、保持されている。したがって、フィルターブロック３は、任意のフィルターを取り外すことが可能である。
【００２２】
このフィルターブロック３の各光学素子である励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２及びバリヤフィルター２８は、図４に示す透過特性を示す。
励起フィルター１１は、水銀ランプ４からの光から所定の励起波長例えば（ｆ１＝４７０ｎｍ〜４９０ｎｍ）を透過するフィルターである。
【００２３】
ダイクロイックミラー１２は、励起フィルターからの波長の光を対物レンズの方向に反射するミラーであり、境界波長例えば（ｆ２＝５０５ｎｍ）以下を反射するものある。標本１４内にある蛍光物質を観察する場合、その物質の吸収波長が上記励起波長ｆ１となり、そこから発せられる蛍光波長は、励起波長ｆ１より、長い波長となる。ダイクロイックミラー１２は、この蛍光波長を透過する特性を持っている。
【００２４】
但し、ダイクロイックミラー１２を透過した光には、標本１４の蛍光物資からの蛍光波長だけでなく、励起波長も含まれている。この励起光が混じると、蛍光画像の画質を低下させてしまう。そのため、次に記すバリアフィルター２８を設けている。
【００２５】
バリヤフィルター２８は、蛍光波長のみを透過するフィルターであり、例えばｆ３＝５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの吸収波長を有し、その吸収波長ｆ３以外の波長をカットする特性を有する。
【００２６】
図４に、蛍光観察用のフィルターカセットに使用するフィルターの波長特性を示す。
横軸が波長を表し、左から右に波長が長くなる。縦軸が透過強度を表し、最大を１００としている。また、縦軸の０は、透過強度がゼロで、反射強度が１００と考える。各曲線は、励起フィルター特性ａ、ダイクロイックミラー特性ｂ、バリヤフィルター特性ｃを示す。
【００２７】
ここでは、模式的に各フィルターの特性を表している。励起フィルター特性ａにおいて、強度０近辺は、直線的に強度が増減せず、曲線を描きながら、徐々に透過光の強度が変化する。 また、直線状に強度が増減する部分において、ある波長で、急激に増減せず、ある角度を持って、増減する。これは、バリヤフィルター特性ｃも同様の特性を持っている。
【００２８】
ダイクロイックミラー特性ｃは、ある範囲より短い波長（図の左方向）は反射し、長い波長（図の右方向）は、透過するようになっている。ここでも、強度０近辺と、直線部分の性質は、４０１ 励起フィルター特性ａと同じである。
【００２９】
蛍光物質の吸収波長と、そこから発せられる蛍光波長は、あまり離れていない。両者の波長を分離するため、一般に、図４のような組み合わせとしている。励起フィルター特性ａと、バリヤフィルター特性ｂの領域を完全に離す。これにより、蛍光波長のみを、結像側に透過することができる。落射蛍光照明するためのダイクロイックミラー１２において、励起部分（ｆ１）とバリヤ部分（ｆ２）を完全に分離する特性を持たせることが、フィルター製作上、困難である。その理由は、両者の間隔が近いことにある。そこで、ダイクロイックミラー特性ｂの端が、励起フィルター特性ａの端に少し重なるようにした。この重複部分（ｆ４〜ｆ５）において、標本で反射された励起光が透過する。しかし、バリヤフィルター２８により、励起光は、カットされ、蛍光だけが、結像側に透過する。
【００３０】
不図示の切換機構により、フィルターの種類の異なる複数のフィルターブロック３は、フィルターカセット５２に保持され、対物レンズ１３の光軸への挿脱が行える。
【００３１】
このフィルターブロック３は、落射蛍光観察（落射蛍光観察モード）では図３に示されるように励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２及びバリヤフィルター２８が装着されている。また、リフラクションコントラスト観察（リフラクションコントラスト観察モード）では、図１に示されるように、フィルターブロック３は励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２のみが装着され、バリヤフィルター２８が取り外されている。
【００３２】
落射蛍光照明装置２の開口絞り７は、落射蛍光観察の為に対物レンズ１３の開口数に合わせて開閉することが可能である。更に、リフレクションコントラスト観察の為に、開口絞り７は最小の開口径に設定される。例えば、直径１ｍｍ以下に絞ることが可能となっている。
【００３３】
視野絞り９は、落射蛍光照明による照明範囲を変えることができる。必要以上の範囲に励起光を照射することにより、観察視野以外の部分からの蛍光が観察に必要とする部分の画像に重なり、画像を劣化することを防止する。さらに、標本１４中の観察に必要以外の位置の蛍光物質が退色することを防止する。
【００３４】
次に、リフレクションコントラスト観察モード、落射蛍光観察モードに設定された時の顕微鏡の状態について説明する。
リフレクションコントラスト観察（リフレクションコントラスト観察モード）の場合、フィルターブロック３は、励起フィルター１１とダイクロイックミラー１２とを備えている。一般の落射蛍光照明では、この中にバリヤフィルター２８も備えているが、ここでは、リフレクションコントラスト観察の画像を得るためには、照明光による観察が必要となるため、バリヤフィルターは設けない。
【００３５】
落射蛍光照明装置２からの照明光は、励起フィルター１１で必要な励起波長を選択し、ダイクロイックミラー１２で、対物レンズ１３に向かい、標本１４を照明する。標本１４からの光は、励起波長成分の照明光と、蛍光光とが混ざった状態となっている。ここで、蛍光光の光強度は、照明光の１／１０００以下となる。
【００３６】
標本１４からの光（励起波長成分の照明光と蛍光光とが混ざった光）は、図４から分かるように、励起フィルター１１の透過特性ａとダイクロイックミラー１２の透過特性ｂが一部オーバーラップしているために、その波長域（波長ｆ４〜ｆ５）において数％の励起光が漏れて観察光学系側に透過する。すなわち、標本１４からの光は、ダイクロイックミラー１２の透過特性ｂにより、蛍光光の９０％以上が透過し、励起光の数％のみが透過する。その透過光は、結像レンズ１５で、結像面１６に像を形成する。
【００３７】
ここで、ダイクロイックミラー１２における蛍光成分（波長ｆ３付近）の透過率は高いが、蛍光自体の強度は、非常に小さい。一方、波長域ｆ４〜ｆ５の照明光（励起光）の透過率は数％であるが、照明光強度が強い。そのため、両者が混合されていても、照明光による標本画像が捉えられ、蛍光成分の蛍光画像は、ほとんど観察することができない。
【００３８】
もう少し詳細に説明する。
リフレクションコントラスト観察（特にリフレクション・インターフェアランス・コントラス観察）の場合、バリヤフィルター２８を除いた励起フィルター１１と、ダイクロイックミラー１２だけの組み合わせとしている。それにより、重複部分（ｆ４〜ｆ５）の励起光が、結像側に透過することができる。そのため、ｆ４〜ｆ５の照明光が減光されるだけでなく、干渉の基準波長が重複領域に限定される。単波長に近い範囲の光の干渉となるため、干渉縞の明暗コントラストを向上させる効果がある。
【００３９】
一般に干渉縞は、単波長では、その色の明暗となり、高いコントラストの模様となる。波長域が広くなると、単波長の干渉縞の重なりが起きる。例えば、全波長域を使用すると、虹のような色の繰り返し模様となる。そのコントラストは、単波長より低く、干渉縞の繰り返しピッチが長くなり、見づらいものとなってしまう。
【００４０】
従って、リフレクションコントラスト観察の場合には、フィルターブロック３からバリヤフィルター２８を取り払っているため、波長域ｆ４〜ｆ５の照明光の低い透過率であっても、蛍光光の蛍光画像に対して相対的に標本画像が明るくなり、標本画像の干渉縞のコントラストが上がる効果を生じている。
【００４１】
一方、落射蛍光観察（落射蛍光観察モード）の場合には、フィルターブロック３にバリヤフィルター２８が取り付いている為にバリヤフィルター２８の透過特性ｃによって波長域ｆ４〜ｆ５の照明光がカットされ、蛍光画像のみを観察光学系側に導くことができる。
【００４２】
落射蛍光観察の場合には、低い強度の蛍光画像を捉えるため、結像面１６には、不図示の高感度テレビカメラが設けられている。
このように、落射蛍光照明装置２とフィルターブロックとを共用できるため、両観察モードにおいて照明・観察光路を共通に使用できることから、構造的に簡単な顕微鏡を提供でき、使用者も使用勝手のよいものとなる。さらに、専用のリフレクションコントラスト用に照明装置を用意する必要がなく、低コストな顕微鏡を提供できる。
【００４３】
次に、図５においてリフレクションコントラスト観察モードと落射蛍光観察モードとの切換えを自動化した場合について説明する。
リフレクションコントラスト観察モードと落射蛍光観察モードとの切換えにおいては、フィルターカセット５２にフィルターブロック３として２つの種類のフィルターブロックを用意しておけば簡単に行なえる。すなわち、リフレクションコントラスト観察モード用には、上述したバリヤフィルター２８のないリフレクションコントラスト用のフィルターブロック３を用意し、また、落射蛍光観察モード用には、上述したバリヤフィルターのある落射蛍光用のフィルターブロック３Ａを用意し、夫々をフィルターカセット５２にセットしておく。
【００４４】
観察モード切換えスイッチ５９によって、リフラクションコントラス観察モードが選択されると、制御回路（マイクロコンピュータ）５８により絞り駆動用モータ５６とカセット駆動用モータ５７に駆動信号を送る。モータ５６は、開口絞り７を最小絞り口径に設定し、また、モータ５７は、フィルターカセット５２を駆動してリフレクションコントラスト用のフィルターブロック３を設定する。
【００４５】
同様に、観察モード切換えスイッチ５９によって落射蛍光観察モードが選択されると、制御回路（マイクロコンピュータ）５８は絞り駆動用モータ５６とカセット駆動用モータ５７に駆動信号を送り、開口絞り７とフィルターカセット５２を駆動する。
【００４６】
具体的には、観察モード切換動作は下記のように行なわれる。
落射蛍光観察モードの場合：開口絞り７は、対物レンズ１３の開口数に合わせた大きさに設定する。電動フィルターカセット切換装置（５６〜５９）により、バリヤフィルター付きフィルターカセット３Ａを、光路に入れる。
【００４７】
リフレクションコントラスト観察モードの場合：開口絞り７は、対物レンズ１３の開口数よりも小さい大きさに設定する。例えば、直径１ｍｍにする。電動フィルターカセット切換装置（５６〜５９）により、バリヤフィルターなしフィルターカセット３を、光路に入れる。
【００４８】
なお、上記のモータ５６，５７の駆動に代えて、マニュアル操作で行なってもよい。
また、落射蛍光照明装置２の開口絞り７は、絞り羽根を利用した大きさ可変の絞りとするだけでなく、固定サイズの絞りの挿脱、または、切換としてもよい。固定サイズの絞りとは、例えば、０．１ｍｍ厚さ程度の薄い金属板に所定サイズの穴を明けたものである。大きさの異なる固定サイズの絞りを複数用意して、交換、もしくは、切換することで、異なる大きさの絞りを光路に置くことができる。
（第２の実施の形態）
図６は、本件発明に係る第２の実施の形態を示す。図２は、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【００４９】
第２の実施の形態は、第１の実施の形態を全反射照明観察できるように改良したのものであり、ここでは第１の実施の形態と同じ構成部品の説明を省略し、異なるところを説明する。
【００５０】
図６は、落射蛍光照明装置２の中に全反射照明装置を組み込んだ状態を示している。
全反射照明装置は、不図示のレーザ光源と、レーザ光源に接続された光ファイバー２１と、光ファーバー２１からのレーザ照明光をコリメートするコリメートレンズ２２と、コリメートされたレーザ照明光を制限する視野絞り２３と、視野絞りからの照明光を反射してフィルターブロック３側に導くフルミラー２４と、第４のリレーレンズ２５とから構成されている。
【００５１】
第４のリレーレンズ２５は、水銀ランプ４からの照明光、光ファイバー２１からの照明光の両方を対物レンズ１３にリレーすることができる。
フィルターカセット５２には、不図示の落射蛍光照明用フィルターブロックとリフレクションコントラスト用フィルターブロック３と全反射照明用フィルターブロック２６とがセットされており、観察モードに応じて切換装置（５６−６０）によって自動的に切り換えることができる。
【００５２】
全反射照明用フィルターブロック２６には、ダイクロイックミラー２７と、バリヤフィルター２８が設けられている。光ファイバー２１からのレーザ光は、波長が決まっているので、励起フィルター１１は不要となる。
【００５３】
全反射照明装置は、落射照明の一種である全反射照明を行うことが可能となる。全反射照明は、ＴＩＲＦ（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）とも呼ばれ、標本１４のカバーグラスに接した１００〜１５０ｎｍ程度の範囲のみの照明を行うことができる。それにより、その範囲の落射蛍光観察を通常の蛍光照明に比べ、コントラスト良く行うことができるようになる。
【００５４】
次に、リフレクションコントラスト観察モード及び落射蛍光観察モードから全反射照明観察モードに切換動作（自動化した場合）について説明する。
リフレクションコントラスト観察モード及び落射蛍光観察モードから全反射照明観察モードに切換えにおいては、フィルターカセット５２に装填されて得いる全反射照明観察用のフィルターブロック２６を対物レンズ光軸に設定し、さらにフルミラー２４を水銀ランプ４の光路上（開口絞り９と第４のリレーレンズ２５との間）に設定する。
【００５５】
観察モード切換えスイッチ５９によって全反射照明観察モードが選択されると、制御回路（マイクロコンピュータ）５８はカセット駆動用モータ５７とフルミラー駆動用モータ６０とに駆動信号を送る。モータ５８は、フルミラー２４を紙面垂直方向に移動して照明光路中に設定し、また、モータ５７は、フィルターカセット５２を駆動して全反射照明用のフィルターブロック２６を設定する。
【００５６】
観察モードが全反射照明観察モード以外のモードが選択されているときは、全反射照明用のレーザ光源は、不図示の開閉シャッタによって光路中に入り込まないようにカットされる。
（第３の実施の形態）
図７は、本件発明に係る第３の実施の形態を示す。図７は、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【００５７】
第３の実施の形態は、第２の実施の形態を一部変更したのものであり、ここでは第１及び第２の実施の形態と同じ構成部品の説明を省略し、異なるところを説明する。
【００５８】
図７は、対物レンズ１３の光軸に対して、リフレクションコントラスト観察を行なう落射照明と全反射照明観察を別々に設けた例を示す。
落射蛍光照明装置２は、第一のリレーレンズ６と、開口絞り７の間に、フルミラー３１を設けてある。図では、上方に光軸を折り曲げているが、これは説明用にこのように描いただけである。実際の装置では、左右どちらかの方向に光軸を折り曲げることになる。これにより、顕微鏡背面方向へ、照明装置が延びることがなくなる。
【００５９】
全反射照明装置７０は、不図示のレーザ光源と、レーザ光源に接続された光ファイバー２１と、光ファーバー２１からのレーザ照明光をコリメートするコリメートレンズ２２と、コリメートされたレーザ照明光を制限する視野絞り２３と、第４のリレーレンズ２５とから構成されている。全反射照明装置７０には、不図示の開閉シャッタが配置され、全反射照明観察モードが選択されている以外はレーザ光が光路中に入り込まないようにカットされる。
【００６０】
この全反射照明装置７０と落射蛍光照明装置２との配置関係は、顕微鏡１の内部では対物レンズ１３に対して近い側に落射蛍光照明装置２を配置し、その次に全反射照明装置７０を配置している。
【００６１】
観察モードを切り換えた時の光路の切換手順は、次のようになる。
リフレクションコントラスト観察（あるいは落射蛍光観察）の場合は、リフレクションコントラスト用フィルターブロック３（あるいは不図示の落射蛍光用フィルターブロック）を光路に入れ、その下に位置している全反射照明用フィルターブロック２６を光路から外す。また、全反射照明による蛍光観察の場合、前とは逆に、リフレクションコントラスト用フィルターブロック３を光路から外し、その下に位置している全反射照明用フィルターブロック２６を光路に入れる。
【００６２】
これらの観察モードの切換は、既に第１及び第２の実施形態で説明したのと同様に自動化できる。
（第４の実施の形態）
図８は、本件発明に係る第４の実施の形態を示す。図８は、落射蛍光観察及びリフレクションコントラスト観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【００６３】
第４の実施の形態は、第１の実施の形態のバリヤフィルターの配置を改良したのものであり、ここでは第１の実施の形態と同じ構成部品の説明を省略し、異なるところを説明する。
【００６４】
図８は、図１の配置に加え、結像位置近くに、光路からの挿脱を可能にしたバリヤフィルター４１が設けてある。従って、落射蛍光観察用のフィルターブロック３Ａにはバリヤフィルターが不要である。
【００６５】
この挿脱可能なバリヤフィルター４１の動作は、つぎのとおりである。
リフレクションコントラスト観察の時は、バリヤフィルター４１を対物レンズ１３の光路から外し、開口絞り７を所定の大きさまで絞り込む。また、落射蛍光観察の時は、バリヤフィルター４１を対物レンズ１３の光路に入れ、開口絞り７を対物レンズ１３の開口数に合わせた大きさに設定する。
【００６６】
観察モード切換を電動化するには、上述した実施形態と同様に、開口絞り７の絞り駆動用モータ５６とバリヤフィルター４１の駆動用モータ６１を設ければよい。
【００６７】
また、結像位置近くの挿脱可能なバリヤフィルター４１を上述した実施形態に適用してもよい。
第１乃至第４の実施態様によれば、レーザ光照明による全反射照明と組み合わせることで、標本がカバーグラスに接近している形態情報を含む画像と、密着している部分の蛍光画像を容易に切り換えて観察することができる。
【００６８】
リフレクションコントラストにより、カバーグラスとの間隔の定量測定が可能になる。 さらに、全反射照明と組み合わせることにより、全反射による蛍光画像の光軸方向の位置を特定または、推定することが可能になる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、リフレクションコントラストにより干渉縞の観察が、専用の光学素子を追加せずに、落射照明装置を応用することで、実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本件発明に係る第１の実施の形態を示し、落射蛍光及びリフレクションコントラスト照明・観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図２】図２は、図１の照明・観察装置が装着できる倒立顕微鏡の全体図である。
【図３】図３は、図１の照明・観察装置のフィルターブロックの断面図である。
【図４】図４は、図３のフィルターブロックの各光学素子の透過特性線図である。
【図５】図５は図１を自動化した装置の光学要素の配置図である。
【図６】図６は、本件発明に係る第２の実施の形態を示し、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図７】図７は、本件発明に係る第３の実施の形態を示し、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図８】図８は、本件発明に係る第４の実施の形態を示し、落射蛍光観察及びリフレクションコントラスト観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図９】図９は、従来のリフレクションコントラスト照明装置の原理図である。
【主要部分の符号の説明】
１：倒立顕微鏡
２：落射蛍光照明装置
３：リフレクションコントラスト用フィルターブロック
３Ａ：落射蛍光用フィルターブロック
４：水銀ランプ
７：開口絞り
９：視野絞り
１１：励起フィルター
１２：ダイクロイックミラー
１３：対物レンズ
１４：標本
２１：光ファイバー
２４：フルミラー
２６：全反射照明用フィルターブロック
２８：バリヤフィルター
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡の落射照明・観察に関するものであり、特に落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察ができる顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、図９に示すリフレクションコントラスト照明装置は、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）８９：１４１−１５０内、Ｐ．１４３のＦｉｇ．１に示すような構成であった。
【０００３】
つまり、開口絞り９０は、中央部を遮光したリング形状の絞りとし、偏光素子であるポラライザ９１、アナライザ９２（ポラライザ９１の偏光方向と直交している偏光方向をもつ）、対物レンズ９３先端の１／４λ板９４（ポラライザ９１の偏光方向に対して４５度の結晶軸方向をもつ）を必要としていた。
【０００４】
対物レンズ９３のレンズ表面からの反射光は、ポラライザ９１と、アナライザ９２と、１／４λ板９４とによりカットすることができる。そして、標本の置かれたスライドグラス９５の表面或いは裏面からの反射光は、リング状の開口絞り９０により中央が遮光されることでを防ぐことができる。その結果、観察される標本の反射像のコントラスト、或いは干渉縞のコントラストが、ノイズとなる背景光に対して相対的に向上するようになっている。
【０００５】
以上のように、従来は、リフレクションコントラストによる干渉縞を観察するためには、リング状の開口絞り、各種偏光素子を必要とした。
【０００６】
【非特許文献】
Ｉ．Ｃｏｒｎｅｌｅｓｅ−ｔｅｎ Ｖｅｌｄｅ， Ｊ．Ｂｏｎｎｅｔ， Ｈ．Ｊ． Ｔａｎｋｅ， ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｐｌｏｅｍ
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）８９：１４１−１５０
１９８７年１１月２３日論文受領、１９８８年度版
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来のリフレクションコントラスト照明装置は、特殊な構成を取っていたため、他の落射照明装置、例えば落射蛍光照明装置や全反射照明装置などと共通のユニット構成が取れるとは考えられていなかった。
【０００８】
本件発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、落射照明装置のユニットを兼用して簡単な構成変更だけでリフレクションコントラスト照明観察を可能とする顕微鏡を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決する為の手段】
請求項１に係る発明は、標本を照明する光源と、対物レンズを介して、前記標本に前記光源の照明光を導き且つ前記標本からの反射光を観察光学系に導く、前記光源と前記対物レンズとの間に配置された中間光学系とを有し、
前記中間光学系は、前記照明光を前記対物レンズまでリレーするリレー光学系と、前記照明光の光束を制限する開口絞り部材と、前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を前記標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導く反射光学素子と、前記反射光学素子からの蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とから構成され、
前記中間光学系を共通に使用して、前記中間光学系の一部構成要素の状態を変更することで同一の前記標本を観察する落射蛍光観察モードとリフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記両観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１０】
請求項２に係る発明は、前記落射蛍光観察モード時には、前記開口絞り部材を第１の開口径に設定した前記中間光学系を前記対物レンズの光路中に設定し、
前記リフレクションコントラスト観察モード時には、前記開口絞り部材を第１の開口径より小さな開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記中間光学系を前記対物レンズの光路中に設定することを特徴とする請求項１記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１１】
請求項３に係る発明は、（ａ） 標本を照明する照明光源と、開口径を変更できる可変開口絞りを含み、前記可変開口絞りを通った前記照明光源の照明光を対物レンズ側へ導くリレー光学系とを含む落射照明光学ユニットと、
（ｂ） 前記落射照明光学ユニットを通った前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光成分を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導くダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光のうち蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とを含むフィルターブロックとを備え、
前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックとを共通して使用し、落射蛍光観察モードとリフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記落射蛍光観察モードから前記リフレクションコントラスト観察モードへ切換える際には、前記落射照明光学ユニットの前記可変開口絞りを所定の絞り開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記フィルターブロックを前記対物レンズの光路中に設定し、
前記両観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１２】
請求項４に係る発明は、前記フィルターブロックを複数装填できるフィルターカセットを備え、
前記フィルターカセットには、前記落射蛍光観察モードとして使用する場合の落射蛍光照明用フィルターブロックと、前記リフレクションコントラスト観察モードとして使用する場合のリフレクションコントラスト照明用フィルターブロックとが装填され、
前記両観察モードの切換えに応じて自動的に前記フィルターカセットが切り換わることを特徴とする請求項３記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１３】
請求項５に係る発明は、前記標本を全反射照明する全反射照明光源と、前記落射照明光学ユニットの前記リレー光学系の光路に挿脱可能に設けられ、前記全反射照明光源からの照明光を前記対物レンズ側へ導く反射ミラーと、前記対物レンズを介して前記標本に前記反射ミラーからの照明光を全照射させる全反射照明用フィルターブロックとを更に備え、
全反射照明観察モードと前記落射蛍光観察モードと前記リフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記全反射照明観察モードへの切換え時には、前記反射ミラーが前記リレー光学系の光路内に設定され且つ前記全反射照明用フィルターブロックが前記対物レンズの光路内に設定され、
前記全観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする請求項３記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１４】
請求項６に係る発明は、複数の前記フィルターブロックを装填できるフィルターカセットを備え、
前記フィルターカセットには、前記全反射照明観察モードとして使用する場合の前記全反射照明用フィルターブロックと、前記落射蛍光観察モードとして使用する場合の落射蛍光照明用フィルターブロックと、前記リフレクションコントラスト観察モードとして使用する場合のリ
フレクションコントラスト照明用フィルターブロックとが装填され、
前記観察モードの切換えに応じて自動的に前記フィルターカセットが切り換わることを特徴とする請求項５記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡である。
【００１５】
請求項７に係る発明は、（ａ） 標本を照明する照明光源と、開口径を変更できる可変開口絞りを含み、前記可変開口絞りを通った前記照明光源の照明光を対物レンズ側へ導くリレー光学系とを含む落射照明光学ユニットと、（ｂ） 前記落射照明光学ユニットを通った前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光成分を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導くダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光のうち蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とを含むフィルターブロックとを備えた顕微鏡の使用方法において、
落射蛍光観察に使用する場合には、前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックを設定し、
リフレクションコントラスト観察に使用する場合には、前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックとを共通して使用して、前記落射照明光学ユニットの前記可変開口絞りを所定の絞り開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記フィルターブロックを前記対物レンズの光路中に設定し、
前記両観察において共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡の使用方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
図１乃至図５は、本件発明に係る第１の実施の形態を示す。図１は、落射蛍光及びリフレクションコントラスト照明・観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。図２は、図１の照明・観察装置が装着できる倒立顕微鏡の全体図である。図３は、図１の照明・観察装置のフィルターブロックの断面図である。図４は、図３のフィルターブロックの各光学素子の透過特性線図である。図５は図１を自動化した装置を示す図である。
【００１７】
図１及び図２において、倒立顕微鏡１には、透過照明装置５０及びコンデンサレンズ５１が備えると共に、落射蛍光照明装置２及びフィルターブロック３を複数装填したフィルターカセット５２が備えられている。落射蛍光照明・観察装置は、落射蛍光照明装置２及びフィルターブロック３を複数装填したフィルターカセット５２から構成されている。
【００１８】
なお、倒立顕微鏡１には、周知のステージ５３、複数の対物レンズ１３が装着されたレボルバー５４、結像レンズ１５及び接眼部５５がある。ステージ５３上の標本１４の光学像は、観察光学系を構成する対物レンズ１３、フィルターブロック３、結像レンズ１５を通して接眼部５５へ導かれる。
【００１９】
本実施の形態では、後述するように、フィルターカセット５２に装填されたフィルターブロックは、観察モード（以後、詳細に説明する落射蛍光観察モード、リフレクションコントラスト観察モード、全反射照明観察モード）に適合したものが設定される。そして、本実施形態の顕微鏡は、観察モードの変更を行なっても、落射蛍光照明装置２及びフィルターカセット５２に装填されたフィルターブロックを共通に使用するため、照明及び観察光路を共用できる。
【００２０】
まず、顕微鏡の各構成部材の構成について説明する。
落射蛍光照明装置２は、照明光源の水銀ランプ４、コレクタレンズ５、第１のリレーレンズ６、可変開口絞りである開口絞り７、第２のリレーレンズ８、視野絞り９、第３のリレーレンズ１０を持っている。水銀ランプ４からの照明光は、コレクタレンズ５により平行光束に変換され、第１のリレーレンズ６により開口絞り７に集光される。そして、その照明光は、開口絞り７によって対物レンズ１３の開口数に適合した照明光束に絞られ、フィルターブロック３、対物レンズ１３に導かれ、標本１４を照明する。
【００２１】
フィルターカセット５２に装填されたフィルターブロック３は、良く知られているように直方体形状であり、図３に示される励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２及びバリヤフィルター２８を交換可能に備えている。励起フィルター１１及びバリヤフィルター２８は、フィルターブロック３に対してネジ結合している。ダイクロイックミラー１２は、バネにより基準となる面に押圧され、保持されている。したがって、フィルターブロック３は、任意のフィルターを取り外すことが可能である。
【００２２】
このフィルターブロック３の各光学素子である励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２及びバリヤフィルター２８は、図４に示す透過特性を示す。
励起フィルター１１は、水銀ランプ４からの光から所定の励起波長例えば（ｆ１＝４７０ｎｍ〜４９０ｎｍ）を透過するフィルターである。
【００２３】
ダイクロイックミラー１２は、励起フィルターからの波長の光を対物レンズの方向に反射するミラーであり、境界波長例えば（ｆ２＝５０５ｎｍ）以下を反射するものある。標本１４内にある蛍光物質を観察する場合、その物質の吸収波長が上記励起波長ｆ１となり、そこから発せられる蛍光波長は、励起波長ｆ１より、長い波長となる。ダイクロイックミラー１２は、この蛍光波長を透過する特性を持っている。
【００２４】
但し、ダイクロイックミラー１２を透過した光には、標本１４の蛍光物資からの蛍光波長だけでなく、励起波長も含まれている。この励起光が混じると、蛍光画像の画質を低下させてしまう。そのため、次に記すバリアフィルター２８を設けている。
【００２５】
バリヤフィルター２８は、蛍光波長のみを透過するフィルターであり、例えばｆ３＝５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの吸収波長を有し、その吸収波長ｆ３以外の波長をカットする特性を有する。
【００２６】
図４に、蛍光観察用のフィルターカセットに使用するフィルターの波長特性を示す。
横軸が波長を表し、左から右に波長が長くなる。縦軸が透過強度を表し、最大を１００としている。また、縦軸の０は、透過強度がゼロで、反射強度が１００と考える。各曲線は、励起フィルター特性ａ、ダイクロイックミラー特性ｂ、バリヤフィルター特性ｃを示す。
【００２７】
ここでは、模式的に各フィルターの特性を表している。励起フィルター特性ａにおいて、強度０近辺は、直線的に強度が増減せず、曲線を描きながら、徐々に透過光の強度が変化する。 また、直線状に強度が増減する部分において、ある波長で、急激に増減せず、ある角度を持って、増減する。これは、バリヤフィルター特性ｃも同様の特性を持っている。
【００２８】
ダイクロイックミラー特性ｃは、ある範囲より短い波長（図の左方向）は反射し、長い波長（図の右方向）は、透過するようになっている。ここでも、強度０近辺と、直線部分の性質は、４０１ 励起フィルター特性ａと同じである。
【００２９】
蛍光物質の吸収波長と、そこから発せられる蛍光波長は、あまり離れていない。両者の波長を分離するため、一般に、図４のような組み合わせとしている。励起フィルター特性ａと、バリヤフィルター特性ｂの領域を完全に離す。これにより、蛍光波長のみを、結像側に透過することができる。落射蛍光照明するためのダイクロイックミラー１２において、励起部分（ｆ１）とバリヤ部分（ｆ２）を完全に分離する特性を持たせることが、フィルター製作上、困難である。その理由は、両者の間隔が近いことにある。そこで、ダイクロイックミラー特性ｂの端が、励起フィルター特性ａの端に少し重なるようにした。この重複部分（ｆ４〜ｆ５）において、標本で反射された励起光が透過する。しかし、バリヤフィルター２８により、励起光は、カットされ、蛍光だけが、結像側に透過する。
【００３０】
不図示の切換機構により、フィルターの種類の異なる複数のフィルターブロック３は、フィルターカセット５２に保持され、対物レンズ１３の光軸への挿脱が行える。
【００３１】
このフィルターブロック３は、落射蛍光観察（落射蛍光観察モード）では図３に示されるように励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２及びバリヤフィルター２８が装着されている。また、リフラクションコントラスト観察（リフラクションコントラスト観察モード）では、図１に示されるように、フィルターブロック３は励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２のみが装着され、バリヤフィルター２８が取り外されている。
【００３２】
落射蛍光照明装置２の開口絞り７は、落射蛍光観察の為に対物レンズ１３の開口数に合わせて開閉することが可能である。更に、リフレクションコントラスト観察の為に、開口絞り７は最小の開口径に設定される。例えば、直径１ｍｍ以下に絞ることが可能となっている。
【００３３】
視野絞り９は、落射蛍光照明による照明範囲を変えることができる。必要以上の範囲に励起光を照射することにより、観察視野以外の部分からの蛍光が観察に必要とする部分の画像に重なり、画像を劣化することを防止する。さらに、標本１４中の観察に必要以外の位置の蛍光物質が退色することを防止する。
【００３４】
次に、リフレクションコントラスト観察モード、落射蛍光観察モードに設定された時の顕微鏡の状態について説明する。
リフレクションコントラスト観察（リフレクションコントラスト観察モード）の場合、フィルターブロック３は、励起フィルター１１とダイクロイックミラー１２とを備えている。一般の落射蛍光照明では、この中にバリヤフィルター２８も備えているが、ここでは、リフレクションコントラスト観察の画像を得るためには、照明光による観察が必要となるため、バリヤフィルターは設けない。
【００３５】
落射蛍光照明装置２からの照明光は、励起フィルター１１で必要な励起波長を選択し、ダイクロイックミラー１２で、対物レンズ１３に向かい、標本１４を照明する。標本１４からの光は、励起波長成分の照明光と、蛍光光とが混ざった状態となっている。ここで、蛍光光の光強度は、照明光の１／１０００以下となる。
【００３６】
標本１４からの光（励起波長成分の照明光と蛍光光とが混ざった光）は、図４から分かるように、励起フィルター１１の透過特性ａとダイクロイックミラー１２の透過特性ｂが一部オーバーラップしているために、その波長域（波長ｆ４〜ｆ５）において数％の励起光が漏れて観察光学系側に透過する。すなわち、標本１４からの光は、ダイクロイックミラー１２の透過特性ｂにより、蛍光光の９０％以上が透過し、励起光の数％のみが透過する。その透過光は、結像レンズ１５で、結像面１６に像を形成する。
【００３７】
ここで、ダイクロイックミラー１２における蛍光成分（波長ｆ３付近）の透過率は高いが、蛍光自体の強度は、非常に小さい。一方、波長域ｆ４〜ｆ５の照明光（励起光）の透過率は数％であるが、照明光強度が強い。そのため、両者が混合されていても、照明光による標本画像が捉えられ、蛍光成分の蛍光画像は、ほとんど観察することができない。
【００３８】
もう少し詳細に説明する。
リフレクションコントラスト観察（特にリフレクション・インターフェアランス・コントラス観察）の場合、バリヤフィルター２８を除いた励起フィルター１１と、ダイクロイックミラー１２だけの組み合わせとしている。それにより、重複部分（ｆ４〜ｆ５）の励起光が、結像側に透過することができる。そのため、ｆ４〜ｆ５の照明光が減光されるだけでなく、干渉の基準波長が重複領域に限定される。単波長に近い範囲の光の干渉となるため、干渉縞の明暗コントラストを向上させる効果がある。
【００３９】
一般に干渉縞は、単波長では、その色の明暗となり、高いコントラストの模様となる。波長域が広くなると、単波長の干渉縞の重なりが起きる。例えば、全波長域を使用すると、虹のような色の繰り返し模様となる。そのコントラストは、単波長より低く、干渉縞の繰り返しピッチが長くなり、見づらいものとなってしまう。
【００４０】
従って、リフレクションコントラスト観察の場合には、フィルターブロック３からバリヤフィルター２８を取り払っているため、波長域ｆ４〜ｆ５の照明光の低い透過率であっても、蛍光光の蛍光画像に対して相対的に標本画像が明るくなり、標本画像の干渉縞のコントラストが上がる効果を生じている。
【００４１】
一方、落射蛍光観察（落射蛍光観察モード）の場合には、フィルターブロック３にバリヤフィルター２８が取り付いている為にバリヤフィルター２８の透過特性ｃによって波長域ｆ４〜ｆ５の照明光がカットされ、蛍光画像のみを観察光学系側に導くことができる。
【００４２】
落射蛍光観察の場合には、低い強度の蛍光画像を捉えるため、結像面１６には、不図示の高感度テレビカメラが設けられている。
このように、落射蛍光照明装置２とフィルターブロックとを共用できるため、両観察モードにおいて照明・観察光路を共通に使用できることから、構造的に簡単な顕微鏡を提供でき、使用者も使用勝手のよいものとなる。さらに、専用のリフレクションコントラスト用に照明装置を用意する必要がなく、低コストな顕微鏡を提供できる。
【００４３】
次に、図５においてリフレクションコントラスト観察モードと落射蛍光観察モードとの切換えを自動化した場合について説明する。
リフレクションコントラスト観察モードと落射蛍光観察モードとの切換えにおいては、フィルターカセット５２にフィルターブロック３として２つの種類のフィルターブロックを用意しておけば簡単に行なえる。すなわち、リフレクションコントラスト観察モード用には、上述したバリヤフィルター２８のないリフレクションコントラスト用のフィルターブロック３を用意し、また、落射蛍光観察モード用には、上述したバリヤフィルターのある落射蛍光用のフィルターブロック３Ａを用意し、夫々をフィルターカセット５２にセットしておく。
【００４４】
観察モード切換えスイッチ５９によって、リフラクションコントラス観察モードが選択されると、制御回路（マイクロコンピュータ）５８により絞り駆動用モータ５６とカセット駆動用モータ５７に駆動信号を送る。モータ５６は、開口絞り７を最小絞り口径に設定し、また、モータ５７は、フィルターカセット５２を駆動してリフレクションコントラスト用のフィルターブロック３を設定する。
【００４５】
同様に、観察モード切換えスイッチ５９によって落射蛍光観察モードが選択されると、制御回路（マイクロコンピュータ）５８は絞り駆動用モータ５６とカセット駆動用モータ５７に駆動信号を送り、開口絞り７とフィルターカセット５２を駆動する。
【００４６】
具体的には、観察モード切換動作は下記のように行なわれる。
落射蛍光観察モードの場合：開口絞り７は、対物レンズ１３の開口数に合わせた大きさに設定する。電動フィルターカセット切換装置（５６〜５９）により、バリヤフィルター付きフィルターカセット３Ａを、光路に入れる。
【００４７】
リフレクションコントラスト観察モードの場合：開口絞り７は、対物レンズ１３の開口数よりも小さい大きさに設定する。例えば、直径１ｍｍにする。電動フィルターカセット切換装置（５６〜５９）により、バリヤフィルターなしフィルターカセット３を、光路に入れる。
【００４８】
なお、上記のモータ５６，５７の駆動に代えて、マニュアル操作で行なってもよい。
また、落射蛍光照明装置２の開口絞り７は、絞り羽根を利用した大きさ可変の絞りとするだけでなく、固定サイズの絞りの挿脱、または、切換としてもよい。固定サイズの絞りとは、例えば、０．１ｍｍ厚さ程度の薄い金属板に所定サイズの穴を明けたものである。大きさの異なる固定サイズの絞りを複数用意して、交換、もしくは、切換することで、異なる大きさの絞りを光路に置くことができる。
（第２の実施の形態）
図６は、本件発明に係る第２の実施の形態を示す。図２は、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【００４９】
第２の実施の形態は、第１の実施の形態を全反射照明観察できるように改良したのものであり、ここでは第１の実施の形態と同じ構成部品の説明を省略し、異なるところを説明する。
【００５０】
図６は、落射蛍光照明装置２の中に全反射照明装置を組み込んだ状態を示している。
全反射照明装置は、不図示のレーザ光源と、レーザ光源に接続された光ファイバー２１と、光ファーバー２１からのレーザ照明光をコリメートするコリメートレンズ２２と、コリメートされたレーザ照明光を制限する視野絞り２３と、視野絞りからの照明光を反射してフィルターブロック３側に導くフルミラー２４と、第４のリレーレンズ２５とから構成されている。
【００５１】
第４のリレーレンズ２５は、水銀ランプ４からの照明光、光ファイバー２１からの照明光の両方を対物レンズ１３にリレーすることができる。
フィルターカセット５２には、不図示の落射蛍光照明用フィルターブロックとリフレクションコントラスト用フィルターブロック３と全反射照明用フィルターブロック２６とがセットされており、観察モードに応じて切換装置（５６−６０）によって自動的に切り換えることができる。
【００５２】
全反射照明用フィルターブロック２６には、ダイクロイックミラー２７と、バリヤフィルター２８が設けられている。光ファイバー２１からのレーザ光は、波長が決まっているので、励起フィルター１１は不要となる。
【００５３】
全反射照明装置は、落射照明の一種である全反射照明を行うことが可能となる。全反射照明は、ＴＩＲＦ（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）とも呼ばれ、標本１４のカバーグラスに接した１００〜１５０ｎｍ程度の範囲のみの照明を行うことができる。それにより、その範囲の落射蛍光観察を通常の蛍光照明に比べ、コントラスト良く行うことができるようになる。
【００５４】
次に、リフレクションコントラスト観察モード及び落射蛍光観察モードから全反射照明観察モードに切換動作（自動化した場合）について説明する。
リフレクションコントラスト観察モード及び落射蛍光観察モードから全反射照明観察モードに切換えにおいては、フィルターカセット５２に装填されて得いる全反射照明観察用のフィルターブロック２６を対物レンズ光軸に設定し、さらにフルミラー２４を水銀ランプ４の光路上（開口絞り９と第４のリレーレンズ２５との間）に設定する。
【００５５】
観察モード切換えスイッチ５９によって全反射照明観察モードが選択されると、制御回路（マイクロコンピュータ）５８はカセット駆動用モータ５７とフルミラー駆動用モータ６０とに駆動信号を送る。モータ５８は、フルミラー２４を紙面垂直方向に移動して照明光路中に設定し、また、モータ５７は、フィルターカセット５２を駆動して全反射照明用のフィルターブロック２６を設定する。
【００５６】
観察モードが全反射照明観察モード以外のモードが選択されているときは、全反射照明用のレーザ光源は、不図示の開閉シャッタによって光路中に入り込まないようにカットされる。
（第３の実施の形態）
図７は、本件発明に係る第３の実施の形態を示す。図７は、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【００５７】
第３の実施の形態は、第２の実施の形態を一部変更したのものであり、ここでは第１及び第２の実施の形態と同じ構成部品の説明を省略し、異なるところを説明する。
【００５８】
図７は、対物レンズ１３の光軸に対して、リフレクションコントラスト観察を行なう落射照明と全反射照明観察を別々に設けた例を示す。
落射蛍光照明装置２は、第一のリレーレンズ６と、開口絞り７の間に、フルミラー３１を設けてある。図では、上方に光軸を折り曲げているが、これは説明用にこのように描いただけである。実際の装置では、左右どちらかの方向に光軸を折り曲げることになる。これにより、顕微鏡背面方向へ、照明装置が延びることがなくなる。
【００５９】
全反射照明装置７０は、不図示のレーザ光源と、レーザ光源に接続された光ファイバー２１と、光ファーバー２１からのレーザ照明光をコリメートするコリメートレンズ２２と、コリメートされたレーザ照明光を制限する視野絞り２３と、第４のリレーレンズ２５とから構成されている。全反射照明装置７０には、不図示の開閉シャッタが配置され、全反射照明観察モードが選択されている以外はレーザ光が光路中に入り込まないようにカットされる。
【００６０】
この全反射照明装置７０と落射蛍光照明装置２との配置関係は、顕微鏡１の内部では対物レンズ１３に対して近い側に落射蛍光照明装置２を配置し、その次に全反射照明装置７０を配置している。
【００６１】
観察モードを切り換えた時の光路の切換手順は、次のようになる。
リフレクションコントラスト観察（あるいは落射蛍光観察）の場合は、リフレクションコントラスト用フィルターブロック３（あるいは不図示の落射蛍光用フィルターブロック）を光路に入れ、その下に位置している全反射照明用フィルターブロック２６を光路から外す。また、全反射照明による蛍光観察の場合、前とは逆に、リフレクションコントラスト用フィルターブロック３を光路から外し、その下に位置している全反射照明用フィルターブロック２６を光路に入れる。
【００６２】
これらの観察モードの切換は、既に第１及び第２の実施形態で説明したのと同様に自動化できる。
（第４の実施の形態）
図８は、本件発明に係る第４の実施の形態を示す。図８は、落射蛍光観察及びリフレクションコントラスト観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【００６３】
第４の実施の形態は、第１の実施の形態のバリヤフィルターの配置を改良したのものであり、ここでは第１の実施の形態と同じ構成部品の説明を省略し、異なるところを説明する。
【００６４】
図８は、図１の配置に加え、結像位置近くに、光路からの挿脱を可能にしたバリヤフィルター４１が設けてある。従って、落射蛍光観察用のフィルターブロック３Ａにはバリヤフィルターが不要である。
【００６５】
この挿脱可能なバリヤフィルター４１の動作は、つぎのとおりである。
リフレクションコントラスト観察の時は、バリヤフィルター４１を対物レンズ１３の光路から外し、開口絞り７を所定の大きさまで絞り込む。また、落射蛍光観察の時は、バリヤフィルター４１を対物レンズ１３の光路に入れ、開口絞り７を対物レンズ１３の開口数に合わせた大きさに設定する。
【００６６】
観察モード切換を電動化するには、上述した実施形態と同様に、開口絞り７の絞り駆動用モータ５６とバリヤフィルター４１の駆動用モータ６１を設ければよい。
【００６７】
また、結像位置近くの挿脱可能なバリヤフィルター４１を上述した実施形態に適用してもよい。
第１乃至第４の実施態様によれば、レーザ光照明による全反射照明と組み合わせることで、標本がカバーグラスに接近している形態情報を含む画像と、密着している部分の蛍光画像を容易に切り換えて観察することができる。
【００６８】
リフレクションコントラストにより、カバーグラスとの間隔の定量測定が可能になる。 さらに、全反射照明と組み合わせることにより、全反射による蛍光画像の光軸方向の位置を特定または、推定することが可能になる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、リフレクションコントラストにより干渉縞の観察が、専用の光学素子を追加せずに、落射照明装置を応用することで、実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本件発明に係る第１の実施の形態を示し、落射蛍光及びリフレクションコントラスト照明・観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図２】図２は、図１の照明・観察装置が装着できる倒立顕微鏡の全体図である。
【図３】図３は、図１の照明・観察装置のフィルターブロックの断面図である。
【図４】図４は、図３のフィルターブロックの各光学素子の透過特性線図である。
【図５】図５は図１を自動化した装置の光学要素の配置図である。
【図６】図６は、本件発明に係る第２の実施の形態を示し、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図７】図７は、本件発明に係る第３の実施の形態を示し、落射蛍光観察、リフレクションコントラスト観察及び全反射照明観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図８】図８は、本件発明に係る第４の実施の形態を示し、落射蛍光観察及びリフレクションコントラスト観察可能な照明・観察装置の光学要素の配置図である。
【図９】図９は、従来のリフレクションコントラスト照明装置の原理図である。
【主要部分の符号の説明】
１：倒立顕微鏡
２：落射蛍光照明装置
３：リフレクションコントラスト用フィルターブロック
３Ａ：落射蛍光用フィルターブロック
４：水銀ランプ
７：開口絞り
９：視野絞り
１１：励起フィルター
１２：ダイクロイックミラー
１３：対物レンズ
１４：標本
２１：光ファイバー
２４：フルミラー
２６：全反射照明用フィルターブロック
２８：バリヤフィルター
Claims (7)
- 標本を照明する光源と、対物レンズを介して、前記標本に前記光源の照明光を導き且つ前記標本からの反射光を観察光学系に導く、前記光源と前記対物レンズとの間に配置された中間光学系とを有し、
前記中間光学系は、前記照明光を前記対物レンズまでリレーするリレー光学系と、前記照明光の光束を制限する開口絞り部材と、前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を前記標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導く反射光学素子と、前記反射光学素子からの蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とから構成され、
前記中間光学系を共通に使用して、前記中間光学系の一部構成要素の状態を変更することで同一の前記標本を観察する落射蛍光観察モードとリフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記両観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡。 - 前記落射蛍光観察モード時には、前記開口絞り部材を第１の開口径に設定した前記中間光学系を前記対物レンズの光路中に設定し、
前記リフレクションコントラスト観察モード時には、前記開口絞り部材を第１の開口径より小さな開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記中間光学系を前記対物レンズの光路中に設定することを特徴とする請求項１記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡。 - （ａ） 標本を照明する照明光源と、開口径を変更できる可変開口絞りを含み、前記可変開口絞りを通った前記照明光源の照明光を対物レンズ側へ導くリレー光学系とを含む落射照明光学ユニットと、
（ｂ） 前記落射照明光学ユニットを通った前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光成分を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導くダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光のうち蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とを含むフィルターブロックとを備え、
前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックとを共通して使用し、落射蛍光観察モードとリフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記落射蛍光観察モードから前記リフレクションコントラスト観察モードへ切換える際には、前記落射照明光学ユニットの前記可変開口絞りを所定の絞り開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記フィルターブロックを前記対物レンズの光路中に設定し、
前記両観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡。 - 前記フィルターブロックを複数装填できるフィルターカセットを備え、
前記フィルターカセットには、前記落射蛍光観察モードとして使用する場合の落射蛍光照明用フィルターブロックと、前記リフレクションコントラスト観察モードとして使用する場合のリフレクションコントラスト照明用フィルターブロックとが装填され、
前記両観察モードの切換えに応じて自動的に前記フィルターカセットが切り換わることを特徴とする請求項３記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡。 - 前記標本を全反射照明する全反射照明光源と、前記落射照明光学ユニットの前記リレー光学系の光路に挿脱可能に設けられ、前記全反射照明光源からの照明光を前記対物レンズ側へ導く反射ミラーと、前記対物レンズを介して前記標本に前記反射ミラーからの照明光を全照射させる全反射照明用フィルターブロックとを更に備え、
全反射照明観察モードと前記落射蛍光観察モードと前記リフレクションコントラスト観察モードとを切換え設定でき、
前記全反射照明観察モードへの切換え時には、前記反射ミラーが前記リレー光学系の光路内に設定され且つ前記全反射照明用フィルターブロックが前記対物レンズの光路内に設定され、
前記全観察モードにおいて共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする請求項３記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡。 - 複数の前記フィルターブロックを装填できるフィルターカセットを備え、
前記フィルターカセットには、前記全反射照明観察モードとして使用する場合の前記全反射照明用フィルターブロックと、前記落射蛍光観察モードとして使用する場合の落射蛍光照明用フィルターブロックと、前記リフレクションコントラスト観察モードとして使用する場合のリフレクションコントラスト照明用フィルターブロックとが装填され、
前記観察モードの切換えに応じて自動的に前記フィルターカセットが切り換わることを特徴とする請求項５記載の落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡。 - （ａ） 標本を照明する照明光源と、開口径を変更できる可変開口絞りを含み、前記可変開口絞りを通った前記照明光源の照明光を対物レンズ側へ導くリレー光学系とを含む落射照明光学ユニットと、
（ｂ） 前記落射照明光学ユニットを通った前記照明光の励起光成分を透過する励起フィルター素子と、前記励起光成分を標本に導き、前記標本から反射された反射光のうちの励起光成分を制限し、それ以外の蛍光光を前記観察光学系側に導くダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光のうち蛍光光以外の光波長成分をカットし、前記蛍光光を透過するバリヤフィルター素子とを含むフィルターブロックとを備えた顕微鏡の使用方法において、
落射蛍光観察に使用する場合には、前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックを設定し、
リフレクションコントラスト観察に使用する場合には、前記落射照明光学ユニットと前記フィルターブロックとを共通して使用して、前記落射照明光学ユニットの前記可変開口絞りを所定の絞り開口径に設定し且つ少なくとも前記バリヤフィルター素子が取り外された前記フィルターブロックを前記対物レンズの光路中に設定し、
前記両観察において共通の照明・観察光路を使用することを特徴とする落射蛍光及びリフレクションコントラスト観察可能な顕微鏡の使用方法。
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