JP2004123692A - 化合物、抗体、試薬キット、抗体の製造方法、ならびに検体の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造に有用なハプテン、中間体、および免疫原などの化合物に関する。メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体、メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体が入っている試薬キット、メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造方法、およびメチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体のメンバーを含有している検体の検出方法にも関する。
【解決手段】構造
【化１】
［ここで各記号は明細書で定義されている］を有する化合物。
【選択図】 なし
メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造に有用なハプテン、中間体、および免疫原などの化合物に関する。メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体、メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体が入っている試薬キット、メチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造方法、およびメチレンジオキシクラスのアンフェタミン誘導体のメンバーを含有している検体の検出方法にも関する。
【解決手段】構造
【化１】
［ここで各記号は明細書で定義されている］を有する化合物。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫学的アッセイに関し、さらに詳しくは、アンフェタミンの誘導体、特に「エクスタシー薬物」のための免疫学的アッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
「エクスタシー薬物」と一般に知られている不法合成麻薬類の使用および乱用は近年大きく増加した。メチレンジオキシ−フェニル縮合環系を持つことで特徴づけられるアンフェタミンの誘導体であるこれらの化合物としては：ＭＤＡ（３，４−メチレンジオキシアンフェタミン）；「エクスタシー（Ｅｃｓｔａｓｙ）」としても知られるＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−メチルアンフェタミン）；「イブ（Ｅｖｅ）」としても知られるＭＤＥＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−エチルアンフェタミン）；ＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−２−ブタンアミン）；ＭＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−Ｎ−メチルブタンアミン）；およびＭＤＰＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−プロピルアンフェタミン）が挙げられる。
【０００３】
これまで、エクスタシー薬物の検出方法は、元々アンフェタミンおよび／またはメトアンフェタミンの検出用に開発された免疫学的アッセイが主に関係してきた。かかるアッセイによるエクスタシー薬物の検出は、エクスタシー薬物とアンフェタミンおよび／またはメトアンフェタミン抗体との間に偶然の一致で存在するかも知れない限られた交差反応性に依存する。そのようなアッセイにより得られた肯定的な結果はなお、どの特定の物質あるいはメチレンジオキシクラスの誘導体のメンバーがサンプル中に存在するかを示さない場合がある。
【０００４】
一般に、アンフェタミンおよびメトアンフェタミン免疫学的アッセイはエクスタシー薬物に対し比較的鈍感で非特異的である。かかるアッセイはＭＤＥＡ（「イブ」）誘導体に対して特に限られた認識を示す。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メチレンジオキシ（ＭＤ）クラスのエクスタシー薬物のメンバーを検出するために従来のアンフェタミンおよび／またはメトアンフェタミンの免疫学的アッセイを用いることに関する、これらおよび他の問題を改善することに向けられている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題は本明細書の特許請求の範囲に記載の本発明により解決される。
【０００７】
本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ明確にされるのであって、この「課題を解決するための手段」にある記述によっていささかも影響されるものでない。
【０００８】
簡潔に述べると、本発明の特徴を具現する化合物は構造
【化４】
［ここで Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；Ｒ３ は置換されていてもよいアルキル基であり；そして Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ である。Ｒ１ がエチル、プロピル、またはブチルであるのが好ましく、さらに好ましいのは Ｒ１ がエチルである。Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含む。Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択される（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）。Ｑ は、水素、ヒドロキシル、脱離基、マクロ分子キャリヤー、および標識から構成される群から選択される。］
を有する。
【０００９】
本発明の特徴を具現する第１の抗体は ＭＤＥＡ に特異的である。
【００１０】
本発明の特徴を具現する第２の抗体は、構造
【化５】
［ここで Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；Ｒ３ は置換されていてもよいアルキル基であり；そして Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ である。Ｒ１ がエチル、プロピル、またはブチルであるのが好ましく、さらに好ましいのは Ｒ１ がエチルである。Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含む。Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択される（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）。Ｑ は、水素、ヒドロキシル、脱離基、マクロ分子キャリヤー、および標識から構成される群から選択される。］
を有する検体に特異的である。
【００１１】
本発明の特徴を具現する試薬キットは上記したタイプの抗体を含む。
【００１２】
本発明の特徴を具現する抗体の製造方法は、宿主に、構造
【化６】
［ここで Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；Ｒ３ は置換されていてもよいアルキル基であり；そして Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ である。Ｒ１ がエチル、プロピル、またはブチルであるのが好ましく、さらに好ましいのは Ｒ１ がエチルである。Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含む。Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択される（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）。Ｑ はマクロ分子キャリヤーである。］
を含む免疫原を接種する段階を有する。
【００１３】
本発明の特徴を具現する、サンプル中の検体を検出する方法は、サンプルを上記したタイプの抗体と接触させる段階、抗体を検体と結合させる段階、および抗体および検体により生成された付加生成物を検出する段階、を有する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造に有用な化合物（例えば、ハプテン、中間体）および免疫原、ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体、ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体を含む試薬キット、ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造方法、およびＭＤクラスのアンフェタミン誘導体のメンバー（即ち、エクスタシー薬物）を含む検体の検出方法が発見された。以下に記載する。
【００１５】
本発明の特許請求の範囲および発明の詳細な説明を通して、用語の定義は以下の通りとする：「免疫原」とは、生体に免疫反応を誘起させることができる物質を意味する。
【００１６】
「コンジュゲート」とは、２つの部分が１つに結合することにより生成される物質を意味する。本発明の代表的なコンジュゲートとしては、小分子と大分子（例えばタンパク質）が１つに結合することにより生成されるコンジュゲートが挙げられる。「コンジュゲート」は「免疫原」を包含するものとする。
【００１７】
「ハプテン」とは、典型的には分子量が低い免疫原の一部分を意味し、それ自身は抗体の産生を刺激しない。
【００１８】
「活性ハプテン」とは、ハプテンをキャリヤー、免疫原、標識、トレーサー、あるいはその他の部分構造と結合するのに用いることができる、利用可能な反応部位（例えば、反応性部分構造を持つ結合基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）の付加により）が備わっているハプテンを意味する。
【００１９】
「結合基」（または「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」）とは、ハプテンをマクロ分子キャリヤー、免疫原、標識、トレーサーまたはその他の部分構造と結合させるのに用いられる化学部分構造を意味する。結合基の使用は、その特定のハプテンおよびキャリヤーならびに所望の抗体の特異性に応じて、有利であるかまたは必要とされることもあるし、そうでないこともある。好適なリンカーとしては、直鎖、分枝鎖、飽和、または不飽和の炭素鎖が挙げられるが、これらにはその鎖内に１以上のヘテロ原子（即ち、炭素以外の原子、例えば、酸素、窒素、硫黄など）が組み込まれていてもよいし、あるいはその末端上でおよび／または末端で置換されていてもよい。
【００２０】
「キャリヤー」および「マクロ分子キャリヤー」とは、ハプテンと結合して免疫原を生成することができる高分子量の物質を意味する。好適なマクロ分子キャリヤーとしては、異質として認識されそれによって宿主から免疫応答を誘起させるタンパク質、糖タンパク質、ポリマー、多糖類、ポリペプチド、および核酸、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
「ポリペプチド」とは、アミド結合を介する２つ以上のアミノ酸の結合により生成される化合物を意味する。代表的なポリペプチドとしては、α−アミノ酸のポリマーが挙げられるが、この場合各非末端アミノ酸残基のα−アミノ基が線状鎖中で隣接する残基のα−カルボキシル基に結合している。高分子量のポリペプチドは「タンパク質」とよばれる。
【００２２】
「標識」とは、検体を検出するためにキャリヤー物質または分子に付けることができる識別用の目印を意味する。標識は、結合性または架橋性部分構造によりそのキャリヤー物質に直接または間接的につけることができる。好適な標識としては、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）、蛍光化合物（例えば、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネートまたはＦＩＴＣ、他）、発光性化合物（例えば、ジオキセタン、ルシフェリンなど）、放射性同位元素（例えば、 １２５Ｉ）、タンパク質結合性パートナー（例えば、ビオチン）、ならびに同様なものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
「抗体」（略して「Ａｂ」）とは、免疫原またはそれの一部分に結合することができる特定のタンパク質を意味する。抗体は、注射により宿主（例えば、動物またはヒト）に導入しておくこともできる免疫原に応答して産生される。一般名称「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体断片を包含する。
【００２４】
「検体」とは、その存在または量が測定されるべき物質または物質の集団を意味する。本明細書で用いる場合、「検体」は、抗体に結合することができる化合物を意味する「抗原」を包含する。さらに、本明細書で用いる場合、「検体」とは、限定するものではないが、コンジュゲート、免疫原、薬物、薬物誘導体、ホルモン、タンパク質、ならびにこれらに類似のものを含めたあらゆる種類の化学物質を意味する。代表的なエクスタシー薬物検体としては、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらに類似のものが挙げられる。
【００２５】
「誘導体」とは、親化合物から１以上の化学反応により生成された化学化合物を意味する。
【００２６】
「リガンド」とは、例えば競合免疫学的アッセイに用いることができるもののような、抗体に対する結合能に関し検体と同様にふるまう物質または物質の集団を意味する。代表的なリガンドとしては、薬物、薬物誘導体、これらの異性体、ホルモン、ポリピプチド、ヌクレオチド、およびこれらに類似のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
「検体を検出する」とは、通常は検体、そして特にはエクスタシー薬物を測定するための定量的、半定量的、または定性的な方法を意味する。例えば、単にサンプル中のエクスタシー薬物の存在の有無を検出する方法も、そのサンプル中の薬物の量または濃度に関するデータを提供する方法と同様に、本発明の範囲に入る。「検出する」、「測定する」、「識別する」、ならびにこれらに類似のものは、本明細書中では同意語として用いられ、すべて本発明の範囲に入る。
【００２８】
「試薬キット」とは、アッセイを行うのに用いられる材料のアセンブリーを意味する。試薬は、その交差反応性および安定性に応じて同一の容器または別々の容器に、また液体または凍結乾燥形態で、パックされた組み合わせとして提供され得る。キットに提供されている試薬の量および割合は、特定の用途に対し至適な結果を与えるように選択できる。本発明の特徴を具現する試薬キットはエクスタシー薬物に特異的な抗体を含んでいる。キットはさらに検体のリガンド、ならびに検量および対照材料を含みうる。本試薬は液体形態のままでもよいしあるいは凍結乾燥してもよい。
【００２９】
「検量および対照材料」とは、測定すべき検体の既知量を含有する標準または参照材料を意味する。検体を含んでいると疑われるサンプルおよびそれに対応する検量材料は同じような条件下でアッセイが行なわれる。検体の濃度は、未知の試料に対して得られた結果を標準の試料に対して得られた結果と比較することにより算出される。これは一般には、図８に示されているような検量線を作成することにより行なわれる。
【００３０】
「アルキル基」とは、直鎖、分枝、環式、非環式、飽和または不飽和の炭素鎖を意味する。代表的なアルキル基としては、アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、シクロアルケン、シクロアルキン、アリール、およびこれらに類似のもの、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
「置換されていてもよい」とは、アルキル基への１以上の置換基の任意的な付加を意味する。
【００３２】
「脱離基」とは、基質の化学部分構造であって、それと反応させる試薬で置換できるものを意味する。好適な脱離基としては、ハロゲン化物、メシラート、トシラート、アルコキシ、第四級アンモニウム塩、およびこれらに類似のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。現状で好ましい実施形態で用いるのに好ましい脱離基は活性エステル（例えば、トリフルオロエトキシエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル）により提供され、この場合カルボニル炭素に付いている、エステルの酸素含有部分が反応で置換される。
【００３３】
「保護基」とは、反応性原子または中心につけられてその通常の反応性を変える部分構造を意味する。好適な保護基としては、専門書 Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９）（この文献の全内容は参照により本明細書に組み入れるものとする）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、またもし本出願と一致しない開示または定義がある場合は、本明細書にある開示または定義が優先するものとする。アミンの窒素に対する種々の保護基が当技術分野で知られているが（例えば、上記を参照されたし）、その中でもトリフルオロアセチルが、現時点で好ましいとされる窒素保護基である。
【００３４】
本発明の特徴を具現する化合物は、エクスタシー薬物に特異的な抗体の製造において中間体、ハプテン、または免疫原として有用である。本発明の特徴を具現する化合物の第１のシリーズは構造 Ｉ：
【化７】
［ここで Ｒ１ は−Ｊ−Ｍ−Ｔであり；Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；そしてＲ３ は置換されていてもよいアルキル基である。Ｊ は１〜１５個の炭素原子および０〜６個のヘテロ原子を含む。Ｍ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ−）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択される（式中 Ｒ４ は水素およびアルキル基から構成される群から選択される）。Ｔ は、水素、ヒドロキシル、脱離基、マクロ分子キャリヤー、および標識から構成される群から選択される。Ｒ２ が水素であり且つＲ３ がメチルである場合は Ｒ１ は、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２Ｃ＝ＣＨ２、−ＣＨＯ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＣＨではない。］
を有する。
【００３５】
マクロ分子キャリヤーは、タンパク質、ポリペプチド、および多糖類から構成される群から選択するのが好ましい。好ましいタンパク質としては、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および ＢＴＧ（ウシサイログロブリン）が挙げられる。アルキル基は、直鎖または分枝鎖であって、１〜１５個の炭素原子、さらには１〜１１個の炭素原子、なおさらには１〜９個の炭素原子を有しているのが好ましい。
【００３６】
この第１のシリーズの好ましい実施形態では、Ｊ が−（ＣＨ２）ｋ−を含み、ｋ が１、２、３、４、５、または６、さらには ｋ が ３ であるのが好ましい。さらに Ｍ が−ＣＯ−であるのが好ましい。Ｒ２ が水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルであるのが好ましく、さらにはＲ２ が水素であるのが好ましい。Ｒ３ が水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルであるのが好ましく、さらにはＲ３ がメチルであるのが好ましい。Ｔ は、Ｎ−オキシスクシンイミド、ヘモシアニン、グロブリン、およびアルブミンから構成される群から選択するのが好ましく、さらにはＴ は、ＫＬＨ、ＢＳＡ、およびＢＴＧから構成されるタンパク質の群から選択するのが好ましい。
【００３７】
図１は、この第１のシリーズの好ましい実施形態の化合物および免疫原を合成するための代表的なスキームを示す。この代表的な合成スキームにおいて、出発原料、試薬、個々の合成変換反応、および反応条件は全く説明のためのものであって、限定のためのものではないことを理解すべきである。図示されているものとは全く別の出発原料に基づく合成を含めて、別の合成製法を、本特許請求の範囲の思想と範囲から逸脱することなく開発することができる。
【００３８】
図１に示されているように、合成はエクスタシー薬物メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＡ）２から始める。２の第一級アミノ基と４−ブロモ−酪酸エチルエステルを反応させてアルキル化生成物４を得る。得られた４の第二級アミノ基を適当なアミノ保護基を用いて保護する。図１に示されているように、４のアミノ基はトリフルオロ無水酢酸（ＴＦＡＡ）でトリフルオロアセチル化して保護されたトリフルオロアセチル化誘導体６を得る。６のエチルエステル部分構造の加水分解によりカルボン酸誘導体８を得、これをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応でエステル化して活性エステル誘導体１０を得る。活性エステル誘導体１０をマクロ分子キャリヤー部分構造［ Ｔ ］（例えば、ＫＬＨ、ＢＴＧ、ＢＳＡ）と反応させて、脱保護して、そして透析して免疫原１２を得る。
【００３９】
図１の化合物６、８、１０、および１２では、上記の好ましい部分構造 −（ＣＨ２）３− および −ＣＯ− はそれぞれ Ｊ および Ｍ に対応するが、この合成に示されている特定の化合物は純粋に説明のためであって、図１に描かれている合成方法を改変して実質的に異なる化学構造を有する化合物を製造できることを強調しておきたい。例えば、図１に示されているアルキル化剤 ４−ブロモ−酪酸エチルエステルは、脱離基（例えば、臭素）を末端官能基（例えば、そのエチルエステル）から分け隔てるもっと多くのあるいは少ない連続メチレン単位をもつ試薬と置き換えできる。同様にこれらの末端間を分け隔てる炭素鎖は、ヘテロ原子、置換、不飽和、またはこれらと同様なものを含むことができる。さらに、このアルキル化工程をとおして導入された官能基（即ち、４−ブロモ−酪酸エチルエステルのエチルエステル部分構造）は、例えばアルコール類、保護アルコール類、カルボン酸類、保護カルボン酸類、アミン類（例えば、第一級、第二級、または第三級）、保護アミン類、チオール類、保護チオール類、チオエーテル類、アミド類、チオアミド類、イミド類、チオイミド類、ニトリル類、イミン類、ヒドラゾン類、マレイミドチオエーテル類、およびこれらに類似のものを含めて、またこれらに限定されるものではないが、様々な代替の部分構造によって、あるいは、当技術分野で十分確立されているように、１以上の合成変換反応によりその部分構造に変換することができるこれら部分構造の官能基前駆体で置き換えることができる。
【００４０】
図１に描かれている合成方法は、ＭＤＡ２に含まれるアミノ基のアルキル化をとおして −Ｊ−Ｍ−Ｔ 部分構造を導入するが、既に窒素を含んでいるメチレンジオキシ−フェニル環系を反応させていくこの方法は純粋に説明のためであり、そして数多くの別の方法をこれに代えて用いることができることを強調しておきたい。例えば、ＭＤＡ２のアミノ基の代わりに脱離基を含むメチレンジオキシ−フェニル環系をアミノ含有求核試薬と、あるいはアミノ基の前駆体（例えば、アジド、シアニドなど）を含んでいる求核試薬と反応させることができる。事実、アミノ基の代わりに脱離基を含んでいるＭＤＡ２の類似体を、４−ブロモ−酪酸エチルエステルのアミノ類似体と、即ち ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ２Ｅｔ−と、反応させると、これもまた、異なるルートで化合物６を生成すると考えられる。例えば、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ． Ｌａｒｏｃｋ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９）および Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ． Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ２００１）、およびこれらの中で引用されている文献、のような論文に記載されているものを含めて、当技術分野で知られている全ての化学変換反応の方法は、本好ましい実施形態で用いることができると考えられる。
【００４１】
図１に示されている代表的な合成反応を変更するのに有用となると思われる変換反応としては、決して限定するものではないが、Ｆｉｓｃｈｅｒ エステル化反応、その他の活性エステルの調製（例えば、カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、２−クロロピリジニウム、３−クロロイソオキサゾリウム、２，２’−ジピリジルジスルフィド、２−ピリジルチオクロロホルマート、およびこれらに類似のものを用いて）、酸化反応（例えば、アルコール類、アミン類、チオール類、チオエーテル類の、あるいはバイヤー−ビリガー酸化（Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）など）、還元反応（例えば、ニトロ基の還元、カルボニル基の環元、水素化など）、アミノ基の保護（例えば、カルバメートアミド類、Ｎ−アルキルアミン類、Ｎ−アリールアミン類、イミン類、エナミン類、Ｎ−ヘテロ原子誘導体、およびこれらに類似のもの）および対応する脱保護、縮合反応（例えば、アルドール、クライゼン（Ｃｌａｉｓｅｎ）、クネベナーゲル（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ）など）、１，４−付加反応（例えば、マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）反応、コーリイ−ホワイトサイド−ハウス有機銅酸化物結合（Ｃｏｒｅｙ−Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ−Ｈｏｕｓｅ ｏｒｇａｎｏｃｕｐｒａｔｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）など）、１，２−付加反応（例えば、グリニャール（Ｇｒｉｇｎａｒｄ）反応、カルボニル還元など）、二トリルの還元、アルコールの脱保護、カルボン酸の脱保護、ケトンの脱保護、アルデヒドの脱保護、アジドの還元、イミンの還元、ならびにこれらに類似のもの、が挙げられる。
【００４２】
本発明の特徴を具現する化合物の第２のシリーズは構造 ＩＩ：
【化８】
［ここで：Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；Ｒ３ は、置換されていてもよいアルキル基であり；そして Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ である。Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含む。Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択される（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）。Ｑ は、水素、ヒドロキシル、脱離基、マクロ分子キャリヤー、および標識から構成される群から選択される。］
を有する。
【００４３】
マクロ分子キャリヤーは、タンパク質、ポリペプチド、および多糖類から構成される群から選択するのが好ましい。好適なタンパク質としては、 ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および ＢＴＧ（ウシサイログロブリン）が挙げられる。前記アルキル基は、直鎖または分枝鎖であり、１〜１５ 個の炭素原子、より好ましくは １〜１１ 個の炭素原子、さらに好ましくは １〜９ 個の炭素原子を有するのが好ましい。
【００４４】
この第２のシリーズの好ましい実施形態では、Ｌ を構成する炭素原子および任意のヘテロ原子は制限されるものではなく、直鎖、分枝、環式、および非環式系を含み得る。Ｌ は、−（ＣＨ２）ｊ−（式中 ｊ は、１、２、３、４、５、または ６ であるのが、さらに好ましくは ｊ は ３ であるのが好ましい）を含んでなるのが好ましい。さらに、Ｘ は −ＣＯ− であるのが好ましい。Ｒ１ は、エチル、ｎ−プロピル、または ｎ−ブチルであるのが好ましく、また Ｒ１ がエチルであるのがもっと好ましい。Ｒ２ は、水素または保護基であるのが好ましく、そして Ｒ２ が、トリフルオロアセチル基のような保護基であるのがもっと好ましい。Ｒ３ は、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、または ｎ−ブチルであるのが好ましく、そして Ｒ３ はメチルであるのがもっと好ましい。Ｑ は、ヒドロキシ、Ｎ−オキシスクシンイミド、ヘモシアニン、グロブリン、およびアルブミンから構成される群から選択するのが好ましく、そして Ｑ は ＫＬＨ、ＢＳＡ、および ＢＴＧ から構成されるタンパク質の群から選択するのがもっと好ましい。
【００４５】
図２は、この第２のシリーズの好ましい実施形態の化合物および免疫原を合成するための代表的なスキームを示す。この代表的な合成スキームにおいて、出発原料、試薬、個々の合成変換反応、および反応条件は全く説明のためのものであって、限定のためのものではないことを理解すべきである。図示されているものとは全く別の出発原料に基づく合成を含めて、別の合成製法を、本特許請求の範囲の思想と範囲から逸脱することなく開発することができる。
【００４６】
図２に示されているように、合成は １−メチル−２−フェニル−エチルアミン１４で始まる。１４のアミノ基を臭化エチルでアルキル化して Ｎ−エチルアミン誘導体１６を得る。１６のアミノ基を適当なアミノ保護基を用いて保護する。図２に示されているように、１６のアミノ基をトリフルオロ無水酢酸（ＴＦＡＡ）でトリフルオロアセチル化する。トリフルオロアセチル化誘導体１８をフリーデル−クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ）型反応で無水コハク酸と反応させてカルボン酸誘導体２０を得る。カルボン酸誘導体２０のベンジルカルボニル基の還元により還元生成物２２を得、これを Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によりエステル化して活性エステル誘導体２４を得る。活性エステル誘導体２４をマクロ分子キャリヤー部分構造［ Ｑ ］（例えば、ＫＬＨ、ＢＳＡ、ＢＴＧ）と反応させ、窒素を塩基性条件下で脱保護し、そして透析して免疫原２６を得る。あるいは、図３に示すように、活性エステル誘導体２４を、例えば ４−アミノメチル安息香酸との反応によりさらに反応させて安息香酸誘導体３２を得る。安息香酸誘導体３２、および３２から Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により得られる活性エステル誘導体３４は、本発明の各種コンジュゲート、標識、およびこれらに類似のものの合成に有用な中間体である。図３に示されている合成方法（即ち、アミノ安息香酸の導入）は、図１に示されているタイプのメチレンジオキシ化合物にも容易に用いることができる（例えば、活性エステル誘導体１０を ４−アミノメチル−安息香酸と反応させることにより）。
【００４７】
図２の化合物２２、２４、および２６では、上記の好ましい部分構造 −（ＣＨ２）３− および −ＣＯ− はそれぞれＬ およびＸ に対応するが、この合成に示されている特定の化合物は純粋に説明のためであって、図２に描かれている合成方法を改変して実質的に異なる化学構造を有する化合物を製造できることを強調しておきたい。例えば、図２に示されている無水コハク酸は、もっと多くのあるいはもっと少ない環炭素原子および／または環へテロ原子（これら自身、置換されていてもよいし、不飽和を含むことができる）を有する環式無水物、あるいはそれに類似のもので置き換えできる。さらに、フリーデル−クラフツアシル化剤としては環式無水物を用いる必要もない。非環式試薬（例えば、ハロゲン化アシル、カルボン酸、ケテンなど）を用いることもできる。さらに、図２に示されているフェニル環の構造を反応させていくのに、フリーデル−クラフツアシル化反応を用いる必要もない。限定するものではないが、フリーデル−クラフツアルキル化、ハロゲン化、ニトロ化、スルホン化、イプソ置換、およびこれらに類似のものを含めて、多数の代替の求電子的芳香族置換を用いることもできる。同様に、フリーデル−クラフツアシル化工程を通して導入された官能基（即ち、化合物２０および２２に示されている末端カルボン酸部分構造）は、例えば、限定するものではないが、アルコール類、保護アルコール類、保護カルボン酸類、アミン類（例えば、第一級、第二級、または第三級）、保護アミン類、チオール類、保護チオール類、チオエーテル類、アミド類、チオアミド類、イミド類、チオイミド類、ニトリル類、イミン類、ヒドラゾン類、マレイミドチオエーテル類、およびこれらに類似のものを含めて様々な代替の部分構造で置き換えることができる、またはそれらに変換することができる、あるいは、当技術分野で十分確立されているように、１以上の合成変換反応によりその部分構造に変換することができるこれら部分構造の官能基前駆体で置き換えることができる。
【００４８】
図２に描かれている合成方法は、トリフルオロアセチル化誘導体１８のフェニル環のアシル化を通して −Ｌ−Ｘ−Ｑ 部分構造を導入するものであるが、求電子的置換により既に存在しているフェニル環をさらに反応させていくこの方法は純粋に説明のためであって、これに代えていろいろな代替の方法を用いることができると考えられることを強調しておきたい。例えば、アミノ含有側鎖に対しパラの位置でハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されたフェニル環は、当技術分野で周知の方法を用いて、有機金属試薬（例えば、グリニャール、有機リチウム、有機スタナン、有機ボラン、有機銅酸化物（ｏｒｇａｎｏｃｕｐｒａｔｅ）、またはこれらに類似のもの）に変換し、そのあと求電子的試薬と反応させて炭素−炭素結合を形成さすことができる。あるいは、アミノ含有側鎖に対しパラの位置で適当な脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルコキシなど）で置換されたフェニル環は、当技術分野で周知の方法を用いて、求核芳香族置換反応をさせることができる。さらには、フェニル環の置換パターンは、完全飽和のまたは部分不飽和のシクロヘキサン環系（またはその前駆体）上に生成させることも考えられ、そしてこれは、例えば、限定するものではないが水素化触媒（例えば、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉなど）、Ｓ および Ｓｅ、キニーネ、ならびにこれらに類似のものなどの、当技術分野で周知の試薬を用いて芳香族化される。
【００４９】
図１に示されている合成スキームに関連して上記したように、当技術分野で知られている全ての化学変換反応の方法は本好ましい実施形態で用いることができると考えられる。図２に示されている代表的な合成の変更に有用になると思われる変換反応としては、決して限定するものではないが、図１の合成スキームに関連して上記で明らかにされたもの、ならびにウォルフ−キシュナー（Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ）還元、クレメンゼン（Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ）還元、ヒドラゾンの還元（例えば、ＬｉＡｌＨ４、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、またはこれらに類似のもの）、およびこれらに類似のものが挙げられる。
【００５０】
本発明の特徴を具現する第１の抗体はエクスタシー薬物に対して特異的である。エクスタシー薬物は、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらの組み合わせから構成される群から選択するのが好ましい。
【００５１】
本発明の特徴を具現する第２の抗体は ＭＤＥＡ に対し特異的である。
【００５２】
本発明の特徴を具現する第３の抗体は、上記で示されまた説明された構造 Ｉ または ＩＩ を含んでなる検体（即ち、免疫原、コンジュゲート、またはその他の化学物質）に対し特異的である。
【００５３】
上述の好ましい実施形態の第１のシリーズからの免疫原、即ち、メチレンジオキシ−フェニル縮合環系（例えば、図１）を含んでなる化合物のシリーズは、例えば、限定するものではないが、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらを組み合わせたものなどのエクスタシー薬物に対して特異的な抗体を製造するのに有用である。図４に示されている表１は、エクスタシー薬物、特に融合番号３からの、そして特に Ａｂ ２．１．１（これは、図１の免疫原１２に応答して産生された抗体であり、この場合 Ｔ は ＫＬＨ である）に対して特異的ないくつかの抗体の交差反応データを示している。当技術分野で十分確立されているタイプの古典的免疫化プロトコルを用いてこのデータを得た。表１において、略記号 ｄＡＭは ｄ−アンフェタミンを表わし、略記号 ｄＭＡ は ｄ−メトアンフェタミンを表わし、略記号 ＩＡＭ は Ｉ−アンフェタミンを表わし、略記号 ＩＭＡ は Ｉ−メトアンフェタミンを表わし、略記号 Ｓｅｓ はセサミンを表わし、略記号 Ｐｈｅｎ はフェンテルミンを表わし、略記号 Ｔｙｒ はチラミンを表わし、略記号 Ｐｓｅｕ はプソイドエフェドリンを表わし、略記号 Ｅｐｈ はエフェドリンを表わし、略記号 ＰＰＡ はフェニルプロパノールアミンを表わし、略記号 ｎＥｐｎ はノルフェドリンを表わし、略記号Ａｄｒ はアドレナリンを表わし、略記号 Ｒａｎ はラニチジン（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ より商品名 ＺＡＮＴＡＣ で発売されており、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ， ＮＪ から販売されている）を表わす。
【００５４】
図５の競合阻害プロットに示されているように、免疫原１２（例えば、 Ｔ が ＫＬＨ であるもの）によって誘導された抗体はエクスタシー薬物に対し良好な応答と特異性を示している。さらに、図６の競合阻害プロットに示されているように、これらの抗体は関連薬物には殆どあるいは全く交差反応性を示さない。図６において、略記号 ｄＡＭＰ は ｄ−アンフェタミンを表わし、略記号 ＩＡＭＰ は Ｉ−アンフェタミンを表わし、略記号 Ｓｍｉｎ はセサミンを表わすが、略記号 ＩＭＡ、ｄＭＡ、および Ｐｈｅｎ は上記の表１で記載したのと同じ意味を有する。
【００５５】
表２は、Ｔ が ＫＬＨ である図１の免疫原１２に応答して産生された抗体 ＭＤＭＡ−２．１．１ に対する交差反応性データを示している。標準であるメトアンフェタミンの結合に５０％の低下をもたらす薬物の濃度（ＥＤ ５０）を決定し、その ＥＤ５０ でそれぞれのその他の薬物の ＥＤ５０ を割り、そしてその結果を １００ で乗ずることにより、表２に示されている交差反応性のパーセントを計算することができる。このデータを得るのに用いた抗体は、当技術分野で十分確立されているタイプの古典的免疫法プロトコルにより製造した。
【００５６】
表２：各種薬物に対する ＭＤＭＡ−２．１．１ の交差反応性
薬物 交差反応性 ％
ｄ−ＭＤＭＡ １００
ＭＤＥＡ ２０４
ＭＤＡ ６０．６
ＭＢＤＢ ２６．１
ＢＤＢ ２０．５
ＭＤＰＡ ３６５
ｄ−ＡＭＰ ０
ｄ−ＭＡＭＰ ０．６５
Ｉ−ＡＭＰ ０
Ｉ−ＭＡＭＰ ０
セサミン ０
フェンテルミン ０
チラミン ０
プソイドエフェドリン ０
エフェドリン ０
フェニルプロパノールアミン ０
ノルピネフリン ０
アドレナリン ０
ラニチジン（ＺＡＮＴＡＣ） ０
【００５７】
上記した好ましい実施形態の第２のシリーズからの免疫原、即ち、縮合メチレンジオキシ−フェニル環系のない化合物のシリーズは、限定するものではないが、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらを組み合わせたものなどのエクスタシー薬物に特異的な抗体を製造するのに有用である。この第２のシリーズの Ｎ−エチル置換免疫原（即ち、構造 ＩＩ の Ｒ１ がエチルである）に応答して産生される抗体は、従来のアンフェタミンおよびメトアンフェタミンの免疫学的アッセイでは通常十分に検出できなかったエクスタシー薬物 ＭＤＥＡ（「イブ」）に対し特に高い認識を示す。このようにして産生された抗体は、既存のアンフェタミンまたはメトアンフェタミンアッセイにおいて検出を向上させるための追加抗体として、あるいは ＭＤ クラスの薬物の免疫学的アッセイにおける ＭＤＥＡ に対する別の抗体として用いることができる。
【００５８】
表３は、Ｑ が ＫＬＨ である図２の免疫原２６に応答して産生させられた抗体 ＮＥＡＭＰ−１．３ に対する交差反応性データを示している。上述した手順により、表３に示されている交差反応パーセントは算出できる。このデータを得るのに用いた抗体は古典的免疫プロトコルを用いて製造することができる。
【００５９】
表３：各種薬物に対する ＮＥＡＭＰ−１．３ の交差反応性
薬物 交差反応パーセント
ｄ−メトアンフェタミン １００
Ｉ−メトアンフェタミン 検出せず
ｄ−アンフェタミン ３２．５
Ｉ−アンフェタミン ３３．５
ＭＤＭＡ １１４
ＭＤＥＡ ５０７
ＭＢＤＢ ２０
フェンジメトラジン ０．６
プソイドエフェドリン ２．０
Ｉ−エフェドリン ６．７
ラニチジン（ＺＡＮＴＡＣ） ０．２
【００６０】
Ｎ−エチル置換免疫原２６（例えば、Ｑ が ＫＬＨ である場合）により誘導された抗体は、図７の競合阻害プロットにより示されているように、一般にエクスタシー薬物に対して、そして特に ＭＤＥＡ に対して良好な応答および特異性を示す。図７では、略記号 ｄＭｅｔｈ は ｄ−メトアンフェタミンを表わし、そして略記号 Ｉｍｅｔｈ
は Ｉ−メトアンフェタミンを表わす。
【００６１】
本発明の特徴を具現する試薬キットは、本発明の特徴を具現する抗体を含んでなる。代表的な試薬キットは、エクスタシー薬物に特異的な抗体および、エクスタシー薬物のリガンドを含む複合体または標識部分構造に結合されたそれの誘導体を含んでなり得、また、エクスタシー薬物または関連標準の既知量を含む１以上の検量物質も任意に含んでなり得る。
【００６２】
本発明の特徴を具現する抗体は、その利用方法の説明書と一緒に、キット、容器、パック、またはディスペンサーの中に入れておくことができる。抗体をキットに入れて提供する場合、免疫学的アッセイの異なる成分は別々の容器にパックし、使用する前に混ぜるということでよい。このように各成分を別々にパックすると、活性成分の機能を実質的に減少させることなく長期の貯蔵を可能にし得る。さらに、試薬を不活性環境下（例えば、窒素ガス、アルゴンガス、またはこれらに類似のものの正圧下）にパックすることもでき、これは空気および／または水分に敏感な試薬に対しては特に好ましい。
【００６３】
本発明の特徴を具現するキットに含まれる試薬は、その異なる成分の各活性が実質的に維持され、同時に各成分がそれ自身容器の材質により実質的に吸収または変質されないならば、あらゆる種類の容器に入れて提供することができる。好適な容器としては、限定するものではないが、アンプル、ボトル、試験管、バイアル、フラスコ、シリンジ、封筒（例えば、ホイルで裏張りされた）、およびこれらに類似のものが挙げられる。容器は、限定するものではないが、ガラス、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンなど）、セラミックス、金属（例えば、アルミニウム）、金属合金（例えば、鋼）、コルク、およびこれらに類似のものなどの適切な材料から構成される。加えて、容器には、セプタムにより提供され得るもののような、１個以上の滅菌アクセスポート（例えば、ニードルを介してのアクセス用に）がついていてもよい。セプタム用の好ましい材料としては、ゴムおよび、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）により商品名ＴＥＦＬＯＮで販売されているタイプのポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。さらに、容器は、取り除くことで各成分の混合を起こさすことができるパーティションまたはメンブレーンにより仕切られている２以上のコンパートメントを有し得る。
【００６４】
本発明の特徴を具現する試薬キットには説明用資料をつけてもよい。説明書は印刷（例えば、紙面上に）されていてもよいし、また／あるいは電子的に読み取り可能な媒体（例えば、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープなど）に入れて提供されてもよい。あるいは、ユーザーをインターネットウェブサイトに、また／あるいは電子メールを通じて案内することで、説明書を提供してもよい。
【００６５】
先述したように、本発明の特徴を具現する試薬キットは、測定すべき検体の既知量を含んでいる検量用または対照用材料を含んでいてもよい。検体の濃度は、サンプルに対して得られた結果を、標準に対して得られた結果と比べることにより算出することができる。検量曲線を作成し、これを用いることで結果の一式を相関させることができ、そしてサンプル中の検体の濃度を決定することができる。図８は、改変ロッシュオンラインフォーマート（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｏｃｈｅ ＯＮＬＩＮＥ ｆｏｒｍａｔｓ）および試薬および Ａｂ ＭＤＭＡ ２．１．１（即ち、Ｔ が ＫＬＨ である免疫原１２から誘導された抗体）を用いた場合のヒタチアナライザー（ＨＩＴＡＣＨＩ Ａｎａｌｙｚｅｒ）における曲線を示す。
【００６６】
本発明の特徴を具現する検体検出方法は、サンプルを本発明の特徴を具現する抗体と接触させる段階、抗体を検体に結合させる段階、および抗体と検体とにより生成された付加生成物を検出する段階を有してなる。
【００６７】
検体を含有しているのではないかと疑われるサンプルを、本好ましい実施形態の方法により分析することができる。望ましいならサンプルを予備加熱することができるし、またアッセイに干渉しないいかなる都合のよい媒体中においても調製することができる。サンプルは、例えば宿主からの体液のような水性媒体からなるのが好ましい。代表的な体液としては、限定するものではないが、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、およびこれらに類似のもの、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。体液は、血漿、血清、または尿からなるのが好ましい。
【００６８】
抗体が固相に結合されているアッセイおよび抗体が液体媒体中にあるアッセイを含めて、抗体を用いるあらゆる種類の免疫学的アッセイを本好ましい実施形態において用いることが考えられることは理解すべきである。本発明の特徴を具現する抗体を用いて、検体を検出するのに用いることができる免疫学的アッセイの方法としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：サンプル中の標識検体と検体が抗体に対して競合する競合（試薬限定的）アッセイ；抗体が標識化されている単一部位免疫定量アッセイ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｔｅ ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）；捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（即ち、固相に付着している抗体）が抗原の最初のエピトープに結合し、そして検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（即ち、標識抗体）がこの抗原−捕捉抗体複合体に結合する二部位免疫定量（試薬過剰）アッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）；およびこれらに類似のもの。
【００６９】
各種の免疫学的アッセイを行う方法は当技術分野では十分確立されており、例えばＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， ２０００）（これの全内容を参照により本明細書に組み入れるものとする）などの多数の論文および刊行物に述べられている。但し、本出願と一致しない開示あるいは定義がある場合は、本明細書中の開示あるいは定義が優先するものとする。
【００７０】
本発明の特徴を具現する抗体の製造方法は、宿主に、本発明の特徴を具現する免疫原を接種する段階を有してなる。好適な宿主としては、限定するものではないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ロバ、ウマ、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ヒト、ならびに成熟免疫応答を見せることができる種が挙げられる。用いる免疫化方法は当技術分野で十分確立されており、例えば上記で引用した Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ などの多数の論文および刊行物、ならびにそれらの中で引用されている文献に述べられている。
【００７１】
本発明の特徴を具現する免疫原は、アジュバント（免疫強化剤）と組み合わせて宿主被験体（例えば、動物またはヒト）に投与される。好適なアジュバントとしては、限定するものではないが、フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ）、粉末水酸化アルミニウム（ミョウバン）、ボルデテラ属百日咳菌と一緒にした水酸化アルミニウム、およびモノホスホリルリピド Ａ 合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。
【００７２】
ポリクローナル抗体は、アジュバントと一緒に任意追加的に投与され得る免疫原の１以上の注射により、哺乳動物宿主中で生じさせることができる。典型的には、免疫原（または免疫原とアジュバントとの組み合わせ）が哺乳動物宿主に１回または複数回の皮下または腹腔内注射により注入される。この免疫プログラムは少なくとも１週間に亘って、そしてより好ましくは２週間以上に亘って行うのが好ましい。このようにして産生されたポリクローナル抗体は単離され、当技術分野で周知の方法を用いて精製される。
【００７３】
モノクローナル抗体は、十分確立されているケーラーとミルシュタイン（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のハイブリドーマ法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ， １９７５， ２５６， ｐｐ． ４９５−４９７）により製造することができる。ハイブリドーマ法は典型的には以下の段階を有する：（１）宿主または宿主からのリンパ球を免疫化する段階；（２）モノクローナル抗体を分泌する（または分泌する能力を有する）リンパ球を回収する段階；（３）このリンパ球を不朽化された（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）細胞に融合する段階；および（４）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する段階。
【００７４】
宿主を免疫化して免疫原に対し特異的な抗体を産生するまたは産生する能力を有するリンパ球を誘導することもできる。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。もしヒト細胞が求められているのであれば、他の哺乳動物源からの脾臓細胞またはリンパ球が好ましいけれども、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いることができる。
【００７５】
リンパ球を不朽化細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させることができるが、この工程は融合助剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いることにより促進することができる。具体例として、形質転換により不朽化された変異齧歯動物、ウシ、またはヒトの骨髄腫細胞を用いることができる。融合されていない不朽化細胞（ｕｎｆｕｓｅｄ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ）とは対照的に、ハイブリドーマ細胞の実質的に純粋な個体群が好ましい。従って、例えば、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ または ＨＰＲＴ）を欠く変異骨髄腫細胞を用いて、融合のあと、融合していない不朽化細胞の増殖または生存を阻害する適当な培地中で、これらの細胞を増殖することができる。このような例においては、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンをその培地に加えることで（ＨＡＴ 培地）、ＨＧＰＲＴ−欠陥細胞の増殖を妨げる一方で、ハイブリドーマを増殖させることができる。
【００７６】
不朽化細胞は、効率的に融合し、ＨＡＴのような培地中における淘汰により雑多の個体群から単離することができ、そして融合のあと安定且つ高レベルの抗体の発現を維持するものが好ましい。好ましい不朽化細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能な骨髄腫細胞株が挙げられる。
【００７７】
ハイブリドーマ細胞は典型的には細胞外に抗体を分泌するので、その培養培地を、ＭＤ クラスのアンフェタミン誘導体に特異的なモノクローナル抗体の存在に関してアッセイすることができる。免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ［例えば、ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）］を用いることでモノクローナル抗体の結合特異性を測定することができる。
【００７８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は限界希釈法で単一クローンとして単離し、そして継代培養することができる。好適な培養培地としては、限定するものではないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ 社の Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ−１６４０、およびポリペプチド不含有もしくはポリペプチド低減型または無血清培地［例えば、 Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手可能な Ｕｌｔｒａ ＤＯＭＡ ＰＦ または ＨＬ−１）が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を腹水としてインビボで増殖させることもできる。
【００７９】
モノクローナル抗体は在来の Ｉｇ 精製法、例えば、限定するものではないが、ポリペプチド Ａ−セファローズ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー；ゲル電気浸透；透析；硫酸アンモニウム沈降；およびアフィニティークロマトグラフィーなどにより、培養培地または腹水液から単離および／または精製することができる。
【００８０】
また、例えば米国特許第 ４，１６６，４５２ 号に記載されているもののような遺伝子組換え法によりモノクローナル抗体を製造することもできる。在来の方法を用いて（例えば、ネズミ重および軽鎖抗体遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、好ましくは、エクスタシー薬物に特異的な抗体を分泌するモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株から単離された ＤＮＡ を調べることで、モノクローナル抗体をコードする ＤＮＡ を単離し、配列決定することができる。この単離された ＤＮＡ 断片を、発現ベクターにサブクローニングしその後宿主細胞（例えば、さもなければ Ｉｇ ポリペプチドを産生しないサル ＣＯＳ−７ 細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）の中にトランスフェクトしてモノクローナル抗体を発現させることができる。米国特許第 ４，８１６，５６７号に記載されているように、この相同ネズミ配列に代えてヒト重および軽鎖定常領域のコード配列で置き換えることで、あるいは Ｉｇ をコードする配列を、非−Ｉｇ ポリペプチドのコード配列の全部または一部と融合させることにより、単離された ＤＮＡ 断片を改変することができる。このような非−Ｉｇ ポリペプチドは、抗体の定常領域に代えて置き換えることができ、あるいは１つの抗原結合性部位の可変領域に代えて置き換えることにより、キメラ２価抗体をつくることができる。
【００８１】
【実施例】
以下の、本発明の特徴を具現する免疫原の代表的な調製方法およびエクスタシー薬物に対するハイブリドーマの製造方法は、説明のためだけに提供するものであって、特許請求の範囲またはそれと均等なものの限定を意図するものではない。
【００８２】
実施例共通事項
特に断らない限り、試薬は Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ， ＵＳＡ）から入手した。また特に断らない限り、溶剤は、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ または Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ から入手し、ＡＣＳ または ＨＰＬＣ グレードまたはそれ以上であった。塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、水素化カルシウムを用いた蒸留により脱水させた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、ナトリウムおよびベンゾフェノンを用いた蒸留により脱水させた。脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、密封 ＳＵＲＥＳＥＡＬ ボトルの形で Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から入手した。カラムクロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ のフラッシュグレード（ｆｌａｓｈ−ｇｒａｄｅ）のシリカゲル（カタログ番号 ９３８５−９；Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０；２３０−４００ ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ）を用いて行った。薄層クロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ から入手したシリカゲルプレート（カタログ番号 ５７１５−７；厚み ０．０２５ ｃｍ）を用いて行った。「ＫＰｉ」は、リン酸カルシウム緩衝液を意味する。混合溶媒は、容量パーセントとして容量で表わされる（例えば、１０％ ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３ または ＣＨＣｌ３ 中 １０％ ＭｅＯＨとは、メタノールを １０容量％ 含有するクロロホルムである）。
【００８３】
代表的合成方法
ＭＤＡ 誘導体４の合成
ａ）塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）中メチレンジオキシアンフェタミン臭化水素酸塩の懸濁液／溶液 ７００ ｍｇ を、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）飽和水溶液（略してｓａｔ． ａｑ．）と一緒にして十分振盪した。得られた層を分離し、水性層を追加の ＣＨ２Ｃｌ２ で、抽出される有機物質が無視できる程度となるまで繰り返し抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥するまで蒸発させ（ロータリーエバポレータ−；略して ｒｏｔｏｖａｐ）、その後さらに高真空下でしばらく乾燥させて、メチレンジオキシアンフェタミンの遊離塩基 ４０８ ｍｇ を油状物として得た。
【００８４】
ｂ）脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５ ｍＬ 中遊離塩基２ ４００ ｍｇ の溶液に、４−ブロモブチル酸エチルエステル（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）３８７ μＬ（１．２ モル当量）を加え、反応をアルゴン下、室温（略して ＲＴ）で、一晩（略して Ｏ．Ｎ．）撹拌した。反応混合物を ＣＨ２Ｃｌ２ ２０ｍＬ で希釈し、ＮａＨＣＯ３ 飽和水溶液 ２５ ｍＬ と一緒に撹拌し、各層を分離し、水性層を ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ ｍＬ 、次いで酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）５０ ｍＬ で抽出し、有機抽出物を合わせ、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で脱水させ、減圧下（ｒｏｔｏｖａｐ）で蒸発させ、そして残渣を高真空（マニホールド）下で乾燥させて生成物４ ５２０ ｍｇ（ １Ｈ−ＮＭＲ により約 ９０％ の純度であることが示された）を得た。この物質をこれ以上精製することなく次の工程で用いた。
【００８５】
水性クェンチ後の同様な反応の抽出から得られる物質から、１Ｈ−ＮＭＲ により、生成物４が少量の二置換生成物と一緒に ＨＢｒ 塩として存在していることが示された。シリカゲルクロマトグラフィー精製［第１カラム：クロロホルム（ＣＨＣｌ３）中 ２０％ メタノール（ＭｅＯＨ）を溶離液として；第２カラム：ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−アセトン−水（６：１：１：１）を溶離液として］により純粋な生成物４を得た。マススペク：Ｍ−Ｈ、２９２。
【００８６】
６の合成
アルゴン下で且つ〜０℃（アイスバス）に冷却された、脱水 ＣＨ２Ｃｌ２ 中粗生成物４ ５００ ｍｇ およびトリエチルアミン ９５０ μＬ（４ モル当量）の溶液に、トリフルオロ無水酢酸（ＴＦＡＡ）２８９ μＬ（１．２モル当量）を加えた。反応を、一晩撹拌しながら ＲＴ まで昇温させた。反応を ＣＨ２Ｃｌ２ で容量 ５０ ｍＬ に希釈し、水（２×５０ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ． ＮａＨＣＯ３（２×５０ ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ．塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水させ、蒸発させ（ｒｏｔｏｖａｐ）、そして高真空下で乾燥させて粗生成物〜７３０ ｍｇ を得た。この物質を、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン中 ３０％ ＥｔＯＡｃ で溶出して生成物６ ４４９ ｍｇ を薄青色の液体として得た。マススペク（Ｍ＋Ｈ）：実測値、３８９．１４４９；計算値、３８９．１４５０。
【００８７】
８の合成
ＴＨＦ ２ ｍＬ および ３ 規定（３Ｎ）過塩素酸 ２ ｍＬ 中６ ４４５ ｍｇ の溶液を、アルゴン下 ５０ ℃（オイルバス）で、４．５ 時間撹拌した。反応物を水 ７５ ｍＬ 中に流し込み、この混合物を ＥｔＯＡｃ（２×５０ ｍＬ）で抽出を行い、この有機抽出物を水で洗浄し、脱水（Ｎａ２ＳＯ４）させ、そして蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）させて粗生成物 ４１６ ｍｇ を得た。この物質をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、ＣＨ２Ｃｌ２中 ５％ ＭｅＯＨで溶出させ、生成物を含有する分画を合わせ、蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）させ、そして高真空下で乾燥させて生成物８ ３２０ ｍｇ を崩壊性泡状物として得た。低分解能質量分析（Ｌｏｗ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃ）：（Ｍ＋Ｈ）：実測値、３６２．１。高分解能質量分析：（Ｍ＋Ｎａ）：実測値、３８４．１０２４；計算値、３８４．１０３５。
【００８８】
１０の合成
アルゴン下にある脱水 ＣＨ２Ｃｌ２ ２０ ｍＬ 中８ ３１０ ｍｇ の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ２９６ ｍｇ（３ モル当量）で、続いて １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ．ＨＣｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） ３２９ ｍｇ（２ モル当量）で処理し、そのあと ＲＴ で Ｏ．Ｎ． 撹拌した。反応物を水（１×２０ ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ． ＮａＨＣＯ３（２×２０ ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ． ＮａＣｌ（１×２０ ｍＬ）で洗浄し、脱水（Ｎａ２ＳＯ４）させ、そして蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）させた。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン中 ３０％ ＥｔＯＡｃ で溶出を行い、生成物分画を合わせ、そして蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）を行った。残渣を脱水 ＣＨ２Ｃｌ２ 中に再溶解させ且つ再蒸発（×６）させ、次いで高真空下で乾燥させて ＮＨＳ エステル誘導体１０２８０ ｍｇ を白色〜無色崩壊性泡状物として得た。Ｈｉｇｈ Ｒｅｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ：（Ｍ＋Ｈ）：実測値、４５９．１３８１；計算値、４５９．１３７９。
【００８９】
ＭＤＭＡ 免疫原１２（ Ｔ ＝ ＫＬＨ ；１２ａ）の合成
アイス−ウォーターバス中で冷却されている ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ １３ ｍＬ 中キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ） ２２０ ｍｇ の撹拌溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ４．３３ ｍＬ を滴下で加えて、２５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の ＫＬＨ 溶液を得た。１．５８ ｍＬ（タンパク質〜２０ ｍｇ に相当）を、対照として使用するために採取した。残りのものに、ＤＭＳＯ 合計 １．５ ｍＬ 中に溶解された１０ ２６ ｍｇ（ＫＬＨ 中のリシン当たり〜０．６当量）の溶液を加え、〜３１％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の１０と ＫＬＨ との反応を起こさせた。アイスバスを取り外し、反応物（ストッパー付きフラスコ）を一晩撹拌した。乳白灰色の反応物を透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ（３×１．１ Ｌ）、１５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ、そのあと ＫＰｉ（１×２．２ Ｌ／ＲＴ −＞ 〜４ ℃；５×２．２ Ｌ／〜４ ℃）に対して透析を順次行った（全ての ＫＰｉ は ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ であった）。対照用 ＫＬＨ もまた透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、別個に ３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ に対して透析を行い、そのあと １５％ ＤＭＳＯ − ＫＰｉ に下げる時に免疫原と共に同じ透析容器中に入れた。不透析液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）１ ｍＬ をリシン改変の程度を決定するために取り出した。残りのものを、５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３（４×２．２ Ｌ／ＲＴ／２ 日）に対して、そのあと ＫＰｉ（４×２．２ Ｌ／〜４ ℃）に対して透析を行った。アミンの脱保護を、ｐＨ １３ の緩衝液（ＫＯＨ で ｐＨ １３ に塩基性化された５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３ ）に対して ＲＴ で〜７ 日間再透析を行い、そのあと ｐＨ ７．５ の ＫＰｉ ５０ ｍＭ（３ 回交換）中に逆透析を行うことにより完了して ＭＤＭＡ 免疫原 １２（Ｔ ＝ ＫＬＨ；１２ａ）をほとんど無色の透明な溶液として得た。クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）タンパク質アッセイ（改変ブラッドフォードアッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ））（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ））によりタンパク質 １．９ ｍｇ／ｍＬ を得た。脱保護されていない免疫原（上記参照）に関するトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイ（クーマシーブルーアッセイによるタンパク質濃度測定のあと）により、ＫＬＨ 上の利用可能なリシンの ３８％ が改変されていたという結果を得た。
【００９０】
ＭＤＭＡ コンジュゲート１２（ Ｔ ＝ ＢＳＡ ；１２ｂ）の合成
アイスウォーターバス中で冷却されている ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ １１ ｍＬ 中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｐｅｎｔｅｘ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．， Ｋａｎｋａｋｅｅ， ＩＬ， ＵＳＡ）０．５５ ｇ の撹拌溶液に ＤＭＳＯ ４．０ ｍＬ を滴下で加えた。必要な場合対照として用いるために、得られた〜２７％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の ＢＳＡ 溶液から１．３６ ｍＬ（ＢＳＡ 〜０．０５ ｇ を含有している）を抜き出した。残った溶液に、合計 ０．６ ｍＬ の ＤＭＳＯ に溶解されている１０ ８．２ ｍｇ（〜２．４ モル当量）を加え、３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の１０と ＢＳＡ の混合物を得た。アイスウォーターバスを取り外し、反応物をストッパー付きのフラスコ中で一晩撹拌した。この透明な反応物を透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、そして ３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ（１．１ Ｌ）、１５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ（１．１ Ｌ）、ＫＰｉ／ＲＴ（１×１．１）、次いで ５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３（４×１．１ Ｌ／ＲＴ／２ 日）に対してそのあと ＫＰｉ（４×２．２ Ｌ／〜４ ℃）（全ての ＫＰｉ は ｐＨ ７．５ で ５０ ｍＭ であった）に対して順次透析を行った。対照用 ＫＬＨ もまた透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、そして別個に ３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ に対して透析を行い、そのあと １５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ に下げるときに免疫原と共に同じ透析容器に入れ、そして平行して進めた。ここにおける不透析液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の一部の分析を行ったところ、タンパク質濃度が １８．９ ｍｇ／ｍＬ（クーマシーブルータンパク質アッセイ）であり、ハプテンによる置換が〜１．６（対照 ＢＳＡ に対する、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ＵＶ）であった。アミンの脱保護を、ｐＨ １３ の緩衝液（ＫＯＨ で ｐＨ １３ に塩基性化された５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３）に対して ＲＴ で〜４日間再透析を行い、そのあと ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ（４ 回交換）中に逆透析を行うことで完了し、ＭＤＭＡコンジュゲート１２（Ｔ ＝ ＢＳＡ；１２ｂ）を無色透明な溶液として得た。タンパク質濃度を ＵＶ（コンジュゲートのＯＤ２８０ は、親 ＢＳＡ の ＯＤ２８０［＝ １ ｍｇ／ｍＬ で ０．６］と略同じとした）により測定したところ、約 １．９ ｍｇ／ｍＬ のタンパク質であった。
【００９１】
Ｎ− エチルアンフェタミン１６の合成
ｄ−アンフェタミンサルフェート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）５．０ ｇ を、ＣＨ２Ｃｌ２ １００ ｍＬ および １Ｎ ＮａＯＨ ３０ ｍＬ で処理し、そして１５分間激しく撹拌した。各層を分離し、水性部分を ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ ｍＬ で抽出を行った。有機部分を合わせ、無水 Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水させ、そして減圧下で濃縮してｄ−アンフェタミン不含有塩基１４ ３．６６ｇ を透明な油状物として得た。これを無水 ＤＭＦ ３０ ｍＬ 中に溶解し、臭化エチル ２．９ ｇ で処理し、そして室温で３日間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮して ６．６ ｇ を得、次の工程の原料とした。この生成物は、カラムクロマトグラフィーでは精製するのが困難であるいくらかの出発原料およびジエチル化された副生成物を含んでいる。
【００９２】
１８の合成
無水 ＣＨ２Ｃｌ２ ７５ ｍＬ 中粗 Ｎ−エチルアンフェタミン ６．６ ｇ の溶液をトリエチルアミン １０ ｍＬ で処理した。この混合物をアイスバスで冷却し、無水トリフルオロ酢酸 ４．３ ｍＬ で処理し、そしてアルゴン下室温で一晩撹拌を加えた。この混合物を減圧下で濃縮した。その残渣を ＥｔＯＡｃ ７５ ｍＬ に溶解し、そして飽和 ＮａＨＣＯ３ ３×２５ ｍＬ、Ｈ２Ｏ ２５ ｍＬ、飽和ブライン ２５ ｍＬ で洗浄を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水を行い、そして減圧下で濃縮を行った。この残渣を、溶離液として ３０％ ＥｔＯＡｃ−ヘキサンを用いてシリカゲル ３００ ｇ 上のクロマトグラフィーにかけ、透明な油状物 ４．０ ｇ を得た（これは、前の工程からのジエチル化された副生成物をなおいくらか含んでいた）。これを、溶離液として ５％ ＥｔＯＡｃ−ヘキサンを用いてシリカゲル ２５０ ｇ 上のクロマトグラフィーにかけ、１８ ２．６ ｇ を透明な油状物として得た。
【００９３】
２０の合成
アルゴン下の無水 ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ ｍＬ 中１８ ２．０ ｇ の溶液を、無水コハク酸 １．２ｇ で処理した。この混合物をアイスバスで冷やし、そのあと ＡｌＣｌ３ ４．０ ｇ を少しずつ加えることで処理した。反応物を ０ ℃で２ 時間撹拌し、そのあと室温にて一晩撹拌した。この混合物を、３Ｎ ＨＣｌ １８ ｍＬ を最初はゆっくり加え、そのあと ３０ 分間激しく撹拌することで処理した。各層を分け、有機層を Ｈ２Ｏ ２５ ｍＬ および飽和ブライン ２５ ｍＬ で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして減圧下で濃縮してアンバー色の油状物とした。これを、溶離液として ３％ ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２ を用いてシリカゲル １５０ ｇ 上のクロマトグラフィーにかけることにより２０ ２．６ ｇ をアンバー色の油状物として得た。
【００９４】
２２の合成
５００ ｍＬ のパー（Ｐａｒｒ）ボトルに １０％ Ｐｄ／Ｃ １１５ ｍｇを入れ、続いて酢酸 ３０ ｍＬ 中２０ ６００ ｍｇ の溶液を入れ、そして ５０ ＰＳＩ で １７ 時間水素化を行った。Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商品名 ＣＥＬＩＴＥ で販売されている濾過材（Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から入手可能）を通すことで触媒を濾過分離し、濾液を減圧下で濃縮した。残留酢酸は、トルエン ２５ ｍＬ を用いて ５ 回蒸発を行うことにより追い出した。このトルエンを ＣＨ２Ｃｌ２ を用いた ５ 回の蒸発により追い出して２２ ５７６ ｍｇ をアンバー色の油状物として得た。
【００９５】
２４の合成
アルゴン下の無水 ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ ｍＬ 中２２ ５７６ ｍｇ の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ２６０ ｍｇで処理し、続いて １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ＨＣｌ ４３５ ｍｇ で処理し、そして室温で一晩撹拌を加えた。この混合物を ０．１Ｎ ＨＣｌ ２５ ｍＬ、Ｈ２Ｏ ２５ ｍＬ、飽和 ＮａＨＣＯ３ ２×２５ ｍＬ、飽和ブライン２５ ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして減圧下で濃縮して２４ ７３５ ｍｇ をアンバー色の油状物として得た。
【００９６】
３２の合成
Ｈ２Ｏ ５ ｍＬ 中 ４−（アミノメチル）安息香酸 １０８ ｍｇ と蒸留 ＴＨＦ １０ ｍＬ との混合物を、蒸留 ＴＨＦ １０ ｍＬ 中２４ ３１５ ｍｇ の溶液で、続いて １Ｎ ＮａＯＨ １．２ ｍＬ で処理し、そして室温にて１時間撹拌を加えた。反応物の ｐＨ は９であった。ＴＨＦ を減圧下で除去し、水性残渣を Ｈ２Ｏ ５ ｍＬ で希釈し、そして ６Ｎ ＨＣｌ を用いて ｐＨ ６ に酸性化した。これを、ＥｔＯＡｃ ２×１５ ｍＬ で抽出を行った。この ＥｔＯＡｃ 抽出物を合わせて、無水 Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして真空下で濃縮して３２ ２９０ ｍｇ を白色無定形固体として得た。
【００９７】
３４の合成
アルゴン下の無水 ＣＨ２Ｃｌ２ １０ ｍＬ 中３２ ２７０ ｍｇ の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ８５ ｍｇ で、続いて １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ＨＣｌ １４０ ｍｇ で処理し、そして室温で一晩撹拌を加えた。この混合物を ＣＨ２Ｃｌ２ １０ ｍＬ で希釈し、０．１Ｎ ＨＣｌ １０ ｍＬ、飽和ブライン １０ ｍＬ、飽和 ＮａＨＣＯ３ ２×１０ ｍＬ、飽和ブライン １０ ｍＬ で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして減圧下で濃縮して白色無定形固体とした。これを、溶離液として ＥｔＯＡｃ を用いてシリカゲル ８０ ｇ 上のクロマトグラフィーを行い３４ １９０ ｍｇ を白色無定形固体として得た。
【００９８】
Ｎ− エチルアンフェタミン免疫原２６（ Ｑ ＝ ＫＬＨ ２６ａ）の合成
ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ １０ ｍＬ 中精製 ＫＬＨ ３４２ ｍｇ の溶液をアイスバスで冷やし、ＤＭＳＯ ４ ｍＬ を滴下で加えることで処理した。１．７ ｍＬ を採りだし、これを参照として用いた。これにより ＫＬＨ ３００ ｍｇ が溶液に残った。このあとこれを ＤＭＳＯ １．０ ｍＬ 中２４ ５０ ｍｇ の溶液を滴下で加えることで処理した。この反応物を室温で一晩撹拌した。この反応物と前記参照サンプルを別々の １０，０００ ＭＷ カットオフ透析チュービング（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）の中に入れ、室温にあるｐＨ ７．５ の ３３％ ＤＭＳＯ−５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中で、３ 回交換（３ ｃｈａｎｇｅｓ）、少なくともそれぞれ ３ 時間、最後の１つは一晩の透析を行った。このあとこれを、２０％ ＤＭＳＯ １ リットル、１０％ ＤＭＳＯ １ リットル、１００％ ＫＰｉ １ リットル中の降下勾配を用いて、室温 ｐＨ ７．５ でそれぞれ少なくとも ３ 時間透析を行った。バッグをこのあと ５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３（ｐＨ １１．４）１ リットル中に入れ、４０ ℃で ４ 日間（２ 日目に１度交換を行った）透析を行った。これをこのあと ５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中、４ ℃ ｐＨ ７．５ で、各回それぞれ少なくとも ６ 時間の ６ 回交換で透析した。クーマシーブルータンパク質アッセイにより、タンパク質濃度 ８．１６ ｍｇ／ｍＬ の結果を得る。保護サンプルに関するトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイにより、利用可能なリシンの ４１．４％ が改変されていたという結果を得る。
【００９９】
Ｎ− エチルアンフェタミンコンジュゲート２６（ Ｑ ＝ ＢＳＡ ；２６ｂ）の合成
ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ ８ ｍＬ 中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ 改質粉末（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｗｄｅｒ）；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｕｒｃｈａｓｅ， ＮＹ， ＵＳＡ） ５００ ｍＬ の溶液をアイスバスで冷やし、 ＤＭＳＯ １１ ｍＬ をゆっくり滴下で加えることで処理した。これをこのあと ＤＭＳＯ １ ｍＬ 中２４ ６．７ ｍｇ の溶液を滴下で加えることにより処理し、そして室温で一晩撹拌した。この混合物を １０，０００ ＭＷ カットオフ透析チュービング（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）の中に入れ、室温で ｐＨ ７．５ の ６０％ ＤＭＳＯ−５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中で、各回それぞれ少なくとも ３ 時間の ３ 回交換で且つ最後の１回は１晩、透析を行った。これをそのあと、室温で ｐＨ ７．５ にある ４０％ ＤＭＳＯ １ リットル、２０％ ＤＭＳＯ １ リットル、１０％ ＤＭＳＯ １ リットルおよび １００％ ５０ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中の降下勾配を用いて、それぞれ少なくとも ３ 時間透析した。これを次に ５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３ １ リットル（ＫＯＨ で ｐＨ １３ に調整されている）中で ４ 日間、緩衝液の交換 ４ 回で透析した。これをこのあと ４ ℃で ｐＨ７．５ にある ５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中で、各回それぞれ少なくとも ６ 時間の ６回交換で透析した。クーマシーブルータンパク質アッセイによりタンパク質濃度 １２．２ ｍｇ／ｍＬ の結果を得た。
【０１００】
ＭＤＭＡ 免疫原を用いた、エクスタシー薬物に対するハイブリドーマの開発
免疫化
１８〜２４週齡の ＢＡＬＢ／ｃ 雌のマウスを１２（Ｔ ＝ ＫＬＨ；１２ａ）で免疫化した。免疫原はフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）中に乳化し、腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。注射は２１日以上の間隔で行い、典型的には、生理食塩水が ５０％ 、アジュバント乳濁液が ５０％ で構成される １００ μＬ 中に当該コンジュゲート ５０ μｇを含む。完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を１次免疫に用い、不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）をそのあと用いた。融合の ４ 日前に、同じ乳濁液中のブースター免疫 ５０ μｇ を ＩＰ 投与した。
【０１０１】
融合：
融合を行うその日にマウスを頚椎脱臼により絶命させ、血液サンプルを採取した。脾臓および膝窩、鼠径、鎖骨下ならびに深鎖骨下リンパ節を回収、貯留した。これらを２枚の滅菌スライドグラスの間ですり潰しリンパ球をリリースさせた。得られたリンパ球の半分は Ｆ０ 骨髄腫細胞株と融合させるのに使い、残りの半分は Ｐ３ 骨髄腫細胞と融合させた（両骨髄腫細胞とも ＡＴＣＣ から入手）。
【０１０２】
融合は、骨髄腫細胞の添加（リンパ球の数の １／５）、遠心沈殿法による洗浄、無血清加温アイスコブ変法ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉａ）中への再懸濁、および再遠心分離により行った。得られたペレットが入っている遠心分離管を軽く叩いて細胞を解し、そのあと加温した ＰＥＧ／ＤＭＳＯ 溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１ ｍＬ を穏やかにかき混ぜながらゆっくりと加えた。これらの細胞を加温条件下に １．５ 分間保持し、そしてこのあと予備加温された無血清 ＩＭＤＭ を以下：１ ｍＬ／ｍｉｎ、２ ｍＬ／ｍｉｎ、４ ｍＬ／ｍｉｎ、１０ ｍＬ／ｍｉｎ、の速度で加え、そして遠心分離管を ５０ ｍＬ まで満たし、密封し、そして １５ 分間インキュベートした。この細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを静かに別の容器に移し、１０％ ウシ胎仔血清を含んでいる ＩＭＤＭ を加えた。これらの細胞をもう一度遠心分離にかけ、そして完全クローニング培地中に再懸濁させた。これは、ＩＭＤＭ、１０％ ＦＣＳ、１０％ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）、４ ｍＭ グルタミン、５０ μＭ ２−メルカプトエタノール、４０ μＭ エタノールアミン、および ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ 抗生物質から構成される。細胞を密度 ４ｘ１０５ リンパ球／ｍＬ で懸濁させ、１００ μＬ／ウェルを滅菌 ９６−ウェル無菌ミクロ培養プレート中に分注し、５％ 二酸化炭素中 ３７ ℃で ２４ 時間インキュベートした。次の日、ＨＭＴ 選択培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手のクローニング培地 ＋ １：２５ ＨＭＴ サプリメント）１００ μＬ を加えた。インキュベーションの ６ 日目の日、低真空源に連結さた滅菌 ８ 分岐マニホールドを用いてそれぞれのウェルから培地約 １５０ μＬ を採取した。ＨＴ 培地 １５０ μＬをそのあと加えた。これはクローニング培地（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ） ＋ １：５０ ＨＴ サプリメントからなる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。プレートをインキュベーターに戻し、増殖の兆候について毎日検査した。増殖が十分であると判断されたとき、ウェルを ＥＬＩＳＡ により抗体産生に関しスクリーニングした。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ スクリーニング：
ミクロプレートを濃度 １ ｍｇ／ｍＬ でメチレンジオキシメトアンフェタミン−ＢＳＡ コンジュゲート１２（Ｔ ＝ ＢＳＡ；１２ｂ）１００ μＬ でコーティングし、別のプレートを濃度 １ ｍｇ／ｍＬ でメトアンフェタミン−ＢＳＡ（ＭＡＭＰ−ＢＳＡ）２８
【化９】
１００ μＬ、または濃度 １ ｍｇ／ｍＬ でアンフェタミン−ＢＳＡ（ＡＭＰ−ＢＳＡ）３０
【化１０】
１００ μＬ でコーティングした。全ての希釈は ｐＨ ９．５ の ０．１ Ｍ 炭酸塩緩衝液中に行った。
【０１０４】
プレートをカバーしたまま ３７ ℃（加湿されている）で １ 時間インキュベートした。そのあとプレートを空にし、Ｔｒｉｓ 緩衝液、１％ ゼラチン水解物、２％ スクロース、および ０．１７％ Ｔｗｅｅｎ−２０（全ての試薬は Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から入手）からなるポストコーティング溶液（ｐｏｓｔ−ｃｏａｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で満たした。プレートをさらに １ 時間 ３７ ℃（加湿されている）でカバーしたままインキュベートし、そのあと ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。そのあとプレートを ｐＨ ７．２〜７．４ にある ０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ中 ２％ スクロース溶液で一時的に満たし、次いで空にし、そして室温で空気乾燥させた。乾いたあと、プレートをいくつかの乾燥剤ピロー（ｐｉｌｌｏｗｓ）が入っているジップロックバッグ（ｚｉｐ−ｌｏｃｋ ｂａｇ）の中にパックし、密封し、そして使用の時まで ４ ℃ で保存した。
【０１０５】
一次融合スクリーニング
融合プレートからの増殖中のクローンの一次スクリーニングには、ＭＤＭＡ−ＢＳＡ（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）でコーティングされたプレートのみを使用した。ＰＢＳ ５０ マイクロリットルを各ウェルに加えたあと、融合プレート上のウェルからの培地のサンプル ５０ μＬ を加え、ＰＢＳ 中に １：１０ に希釈した。プレートを ３７ ℃ で １ 時間カバーしたままインキュベートし、そのあと ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で洗浄した。次いでウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ 中に希釈されたヤギ抗マウス ＩｇＧ−ＨＲＰ コンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ）１００ μＬで満たし、プレートを １ 時間再度インキュベートした。プレートをこのあと再度洗浄し、Ｋ−Ｂｌｕｅ 基質（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）１００ μＬ を加えた。これを ５〜１５ 分間成長させ、反応を １ Ｎ ＨＣｌ １００ μＬ を加えることにより停止させた。色を ４５０ ｎｍ のミクロプレート読み取り機により読み取り、コンピューターによりデータ収集して分析した。ＭＤＭＡ−ＢＳＡ（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）に結合している抗体の存在を示したウェルを選択しその次の処理を行う。細胞に限界希釈サブクローニングを行い、増殖が出現した時点で、二次スクリーニングにより検定を行った。
【０１０６】
二次スクリーニング
ＭＤＭＡ−ＢＳＡ コンジュゲート（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）でコーティングされた４枚のプレートに、１枚のプレートのウェルに ５０ μＬ のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２枚目のプレートに遊離 ＭＤＭＡの溶液（８００ ｎｇ／ｍＬ） ５０ μＬ 、３枚目のプレートに ＭＤＥＡの溶液（８００ ｎｇ／ｍＬ） ５０ μＬ 、４枚目のプレートにプソイドエフェドリンの溶液（８ μｇ／ｍＬ） ５０ μＬ を加えて準備した。全ての薬物は ＰＢＳ 中に溶解した。ＭＡＭＰ−ＢＳＡ（２８）および ＡＭＰ−ＢＳＡ（３０）でコーティングされたプレートのウェルに ＰＢＳ ５０μＬ を加える。
【０１０７】
増殖段階にあるサブクローンが検定可能と判断された時点で、ウェルから上澄み ２５ μＬ を採取し、９６−ウェルフレキシブルプレートに移した。それぞれのウェルに培養液を加えて培養サンプルの １：１０ の希釈とした。この希釈サンプルの５０ μＬ を上記のコーティングされたプレートのそれぞれに移した。以降の処理は１次スクリーニングの場合と全く同じであった。選択の基準は、ＭＤＭＡ−ＢＳＡ（メチレンジオキシメトアンフェタミン−ＢＳＡ）コンジュゲート（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）との結合、および遊離の ＭＤＭＡ および／または ＭＤＥＡによる阻害の徴候、およびプソイドエフェドリンによる阻害がほとんどないしは全くないことであった。ＡＭＰ−ＢＳＡ（３０）および ＭＡＭＰ−ＢＳＡ コンジュゲート（２８）との結合は参考のためだけであった。
【０１０８】
選択されたクローンを直ちにサブクローニングし、そして可能となった時点で、二次スクリーニング手順により再検定した。安定サブクローンを増殖させ、凍結させ、費やした培地を使って交差反応性アッセイにより特異性を測定した。サブクローンは、親クローンの名称の後にサフィックス「．」を加えることにより識別されており、また数字は選択の順番を表わす。
【０１０９】
表４はこのスクリーニング結果の一部を示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
交差反応性アッセイ
上澄みを順次希釈していき、上記のＥＬＩＳＡスクリーニングで再検定した。最大 ＯＤ から約 ５０％ の低下を与える希釈を選択して交差反応性試験に進めた。これは、先のアッセイを、選択された希釈にある抗体を用いてまた各種濃度の薬物の存在下で繰り返すことで行った。図５および図６に示されているチャートはこのような測定の結果を表わしている。
【０１１２】
Ｎ− エチルアンフェタミン免疫原を用いた、エクスタシー薬物に対するハイブリドーマの開発
免疫化
週齡 １８〜２４ のＳＪＬ 雌マウスを改変 ＲＩＭＭＳ 法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＩＭＭＳ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １９９７， １６：４， ｐｐ． ３８１−３８９）により免疫化した。簡潔に述べると、免疫原２６（Ｑ ＝ ＫＬＨ， ２６ａ）
【化１１】
［ここで Ｑ は ＫＬＨ である］を不完全フロイントアジュバント中に乳化し、皮下注射により首の項部、および左右の脹脛（ｃａｌｆ）と鼠径（ｇｒｏｉｎ）に分布する ６ 部位に投与した。注射は ０、３、６ および １１ の日に行った。それぞれの投与した量は：全部で ５０ μｇ、２５ μｇ、１２ μｇ、および ６ μｇ であった。
【０１１３】
融合
１３ の日に全採血により２匹のマウスを絶命させた。膝窩、鼠径、鎖骨下および深鼠径のリンパ節を回収し、貯留した。これらのリンパ節を２枚のスライドグラスに挟んですり潰してリンパ球をリリースした。得られたリンパ球懸濁液の半分を使って Ｆ０ 骨髄腫細胞株と融合させた。残りの半分を Ｐ３ 骨髄腫細胞（両骨髄腫細胞は ＡＴＣＣ から入手した）と融合させた。
【０１１４】
融合は、骨髄腫細胞の添加（リンパ球数の１／５）、遠心分離による洗浄、無血清加温アイスコブ変法ダルベッコ培地中への再懸濁、および再遠心分離により行った。得られたペレットが入っている遠心分離管を軽く叩いて細胞を解し、そのあと加温した ＰＥＧ／ＤＭＳＯ 溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１ ｍＬ を穏やかにかき混ぜながらゆっくりと加えた。細胞を加温条件下に １．５ 分間保持し、そしてこのあと予備加温された無血清 ＩＭＤＭ を以下：１ ｍＬ／ｍｉｎ、２ ｍＬ／ｍｉｎ、４ ｍＬ／ｍｉｎ、および１０ ｍＬ／ｍｉｎ、の速度で加えた。そして遠心分離管を ５０ ｍＬ まで満たし、密封し、そして １５ 分間インキュベートした。この細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを静かに別の容器に移し、１０％ ウシ胎仔血清を含んでいる ＩＭＤＭ を加えた。細胞をもう一度遠心分離にかけ、そして完全クローニング培地中に再懸濁させた。これは、ＩＭＤＭ、１０％ ＦＣＳ、１０％ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）、４ ｍＭ グルタミン、５０ μＭ ２−メルカプトエタノール、４０ μＭ エタノールアミン、および ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ 抗生物質から構成される。細胞を密度 ４×１０５ リンパ球／ｍＬ で懸濁させ、１００ μＬ／ウェルを滅菌 ９６−ウェル無菌ミクロ培養プレート中に分注し、５％ ＣＯ２ 中 ３７ ℃で ２４ 時間インキュベートした。次の日、ＨＭＴ 選択培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ から入手のクローニング培地 ＋ １：２５ ＨＭＴ サプリメント）１００ μＬ を加えた。インキュベーションの ６ 日目の日、低真空源に連結さた滅菌 ８ 分岐マニホールドを用いてそれぞれのウェルから培地約 １５０ μＬ を採取した。ＨＴ 培地 １５０ μＬをそのあと加えた。これは クローニング培地（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ） ＋ １：５０ ＨＴ サプリメントからなる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。プレートをインキュベーターに戻し、増殖の兆候について毎日検査した。増殖が十分であると判断されたとき、ウェルを ＥＬＩＳＡ により抗体産生に関しスクリーニングした。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡ スクリーニング：
３７ ℃（加湿されている）で １ 時間かけて、ｐＨ ９．５ の ０．１ Ｍ 炭酸塩緩衝液中濃度 １ μｇ／ｍＬ にあるメトアンフェタミン−ＢＳＡ コンジュゲート２８ １００ μＬ でミクロプレートを、また同じく Ｎ−エチルアンフェタミン−ＢＳＡ２６（Ｑ ＝ ＢＳＡ、２６ｂ）１００ μＬ で別のプレートをコーティングした。その後プレートを空にし、そしてＴｒｉｓ 緩衝液、１％ ゼラチン水解物、２％ スクロース、および ０．１７％ Ｔｗｅｅｎ−２０（全ての試薬は Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から入手）からなるポストコーティング溶液（ｐｏｓｔ−ｃｏａｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で満たした。プレートをさらに １ 時間 ３７ ℃（加湿されている）でインキュベートし、そのあと ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。そのあとプレートを ｐＨ ７．２〜７．４ にある ０．１５ Ｍ Ｔｒｉｓ 中 ２％ スクロース溶液で一時的に満たし、次いで空にし、そして室温で空気乾燥させた。乾いたあと、プレートをいくつかの乾燥剤ピロー（ｐｉｌｌｏｗｓ）が入っているジップロックバッグの中にパックし、密封し、そして使用の時まで ４ ℃ で保存した。
【０１１６】
増殖段階にあるクローンが検定可能と判断された時点で、ウェルから上澄み ２５ μＬ を採取し、９６−ウェルフレキシブルプレートに移した。それぞれのウェルに培地を加えて培養サンプルの １：１０ の希釈とした。この希釈サンプルの １００ μＬ を上記のコーティングされたプレートのそれぞれに移した。プレートを ３７ ℃ で １ 時間カバーしたままインキュベートし、そのあと ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次いでウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ 中に希釈されたヤギ抗マウス ＩｇＧ−ＨＲＰ コンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ）１００ μＬで満たし、プレートを １ 時間再インキュベートした。プレートをこのあと再度洗浄し、Ｋ−Ｂｌｕｅ 基質（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）１００ μＬ を加えた。これを ５〜１５ 分間成長させ、反応を １ Ｎ ＨＣｌ １００ μＬ を加えることにより停止させた。色を ４５０ ｎｍ でミクロプレート読み取り機により読み取り、コンピューターによりデータ収集して分析した。選択の基準はメトアンフェタミン−ＢＳＡ コンジュゲート２８との結合であった。表５は、メト−ＢＳＡ ２８ および ＮＥＡＭＰ−ＢＳＡ ２６（Ｑ ＝ ＢＳＡ， ２６ｂ）でコーティングされたプレートのスクリーニングの一部に対する結合データを示している。
【０１１７】
【表２】
選択したクローンを直ちにサブクローニングし、そして可能となった時点で、再検定した。安定サブクローンを分裂させ、凍結させそして残った培地を使って交差反応性アッセイにより特異性を測定した。
【０１１８】
交差反応性アッセイ
上澄みを順次希釈していき、上記のＥＬＩＳＡスクリーニングで再検定した。最大 ＯＤ から約 ５０％ の低下を与える希釈を選択して次の交差反応性試験に進んだ。これは、先のアッセイを、選択された希釈にある抗体を用いてまた各種濃度の薬物の存在下で繰り返すことで行った。図７に示されているチャートはこのような測定の結果を表わし、表３（上記参照）は測定された交差反応性のパーセントを示す。
【０１１９】
ここまでの詳細な説明および実施例は説明と例示のために提供したものであり、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。当業者には、本明細書中で例示された本発明の好ましい実施形態の多くの変形が明らかであり、そしてそれらは本特許請求の範囲およびそれに相当するものの中に入る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の特徴を具現する化合物および免疫原を合成するための第１の代表的なスキームを示す図である。
【図２】
本発明の特徴を具現する化合物および免疫原を合成するための第２の代表的なスキームを示す図である。
【図３】
本発明の特徴を具現する化合物を合成するための第３の代表的なスキームを示す図である。
【図４】
本発明の特徴を具現する抗体の交差反応性データの表を示す図である。
【図５】ＭＤ クラスの薬物のメンバーによる、本発明の特徴を具現する抗体の競合阻害のＥＬＩＳＡプロットを示す図である。
【図６】
関連薬物誘導体による、本発明の特徴を具現する抗体の競合阻害のＥＬＩＳＡプロットを示す図である。
【図７】
各種薬物による、本発明の特徴を具現する抗体の競合阻害のＥＬＩＳＡプロットを示す図である。
【図８】
本発明の特徴を具現するコンジュゲートおよび抗体を用いて得られた曲線のデータを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫学的アッセイに関し、さらに詳しくは、アンフェタミンの誘導体、特に「エクスタシー薬物」のための免疫学的アッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
「エクスタシー薬物」と一般に知られている不法合成麻薬類の使用および乱用は近年大きく増加した。メチレンジオキシ−フェニル縮合環系を持つことで特徴づけられるアンフェタミンの誘導体であるこれらの化合物としては：ＭＤＡ（３，４−メチレンジオキシアンフェタミン）；「エクスタシー（Ｅｃｓｔａｓｙ）」としても知られるＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−メチルアンフェタミン）；「イブ（Ｅｖｅ）」としても知られるＭＤＥＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−エチルアンフェタミン）；ＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−２−ブタンアミン）；ＭＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−Ｎ−メチルブタンアミン）；およびＭＤＰＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−プロピルアンフェタミン）が挙げられる。
【０００３】
これまで、エクスタシー薬物の検出方法は、元々アンフェタミンおよび／またはメトアンフェタミンの検出用に開発された免疫学的アッセイが主に関係してきた。かかるアッセイによるエクスタシー薬物の検出は、エクスタシー薬物とアンフェタミンおよび／またはメトアンフェタミン抗体との間に偶然の一致で存在するかも知れない限られた交差反応性に依存する。そのようなアッセイにより得られた肯定的な結果はなお、どの特定の物質あるいはメチレンジオキシクラスの誘導体のメンバーがサンプル中に存在するかを示さない場合がある。
【０００４】
一般に、アンフェタミンおよびメトアンフェタミン免疫学的アッセイはエクスタシー薬物に対し比較的鈍感で非特異的である。かかるアッセイはＭＤＥＡ（「イブ」）誘導体に対して特に限られた認識を示す。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メチレンジオキシ（ＭＤ）クラスのエクスタシー薬物のメンバーを検出するために従来のアンフェタミンおよび／またはメトアンフェタミンの免疫学的アッセイを用いることに関する、これらおよび他の問題を改善することに向けられている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題は本明細書の特許請求の範囲に記載の本発明により解決される。
【０００７】
本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ明確にされるのであって、この「課題を解決するための手段」にある記述によっていささかも影響されるものでない。
【０００８】
簡潔に述べると、本発明の特徴を具現する化合物は構造
【化４】
を有する。
【０００９】
本発明の特徴を具現する第１の抗体は ＭＤＥＡ に特異的である。
【００１０】
本発明の特徴を具現する第２の抗体は、構造
【化５】
を有する検体に特異的である。
【００１１】
本発明の特徴を具現する試薬キットは上記したタイプの抗体を含む。
【００１２】
本発明の特徴を具現する抗体の製造方法は、宿主に、構造
【化６】
を含む免疫原を接種する段階を有する。
【００１３】
本発明の特徴を具現する、サンプル中の検体を検出する方法は、サンプルを上記したタイプの抗体と接触させる段階、抗体を検体と結合させる段階、および抗体および検体により生成された付加生成物を検出する段階、を有する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造に有用な化合物（例えば、ハプテン、中間体）および免疫原、ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体、ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体を含む試薬キット、ＭＤクラスのアンフェタミン誘導体に特異的な抗体の製造方法、およびＭＤクラスのアンフェタミン誘導体のメンバー（即ち、エクスタシー薬物）を含む検体の検出方法が発見された。以下に記載する。
【００１５】
本発明の特許請求の範囲および発明の詳細な説明を通して、用語の定義は以下の通りとする：「免疫原」とは、生体に免疫反応を誘起させることができる物質を意味する。
【００１６】
「コンジュゲート」とは、２つの部分が１つに結合することにより生成される物質を意味する。本発明の代表的なコンジュゲートとしては、小分子と大分子（例えばタンパク質）が１つに結合することにより生成されるコンジュゲートが挙げられる。「コンジュゲート」は「免疫原」を包含するものとする。
【００１７】
「ハプテン」とは、典型的には分子量が低い免疫原の一部分を意味し、それ自身は抗体の産生を刺激しない。
【００１８】
「活性ハプテン」とは、ハプテンをキャリヤー、免疫原、標識、トレーサー、あるいはその他の部分構造と結合するのに用いることができる、利用可能な反応部位（例えば、反応性部分構造を持つ結合基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）の付加により）が備わっているハプテンを意味する。
【００１９】
「結合基」（または「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」）とは、ハプテンをマクロ分子キャリヤー、免疫原、標識、トレーサーまたはその他の部分構造と結合させるのに用いられる化学部分構造を意味する。結合基の使用は、その特定のハプテンおよびキャリヤーならびに所望の抗体の特異性に応じて、有利であるかまたは必要とされることもあるし、そうでないこともある。好適なリンカーとしては、直鎖、分枝鎖、飽和、または不飽和の炭素鎖が挙げられるが、これらにはその鎖内に１以上のヘテロ原子（即ち、炭素以外の原子、例えば、酸素、窒素、硫黄など）が組み込まれていてもよいし、あるいはその末端上でおよび／または末端で置換されていてもよい。
【００２０】
「キャリヤー」および「マクロ分子キャリヤー」とは、ハプテンと結合して免疫原を生成することができる高分子量の物質を意味する。好適なマクロ分子キャリヤーとしては、異質として認識されそれによって宿主から免疫応答を誘起させるタンパク質、糖タンパク質、ポリマー、多糖類、ポリペプチド、および核酸、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
「ポリペプチド」とは、アミド結合を介する２つ以上のアミノ酸の結合により生成される化合物を意味する。代表的なポリペプチドとしては、α−アミノ酸のポリマーが挙げられるが、この場合各非末端アミノ酸残基のα−アミノ基が線状鎖中で隣接する残基のα−カルボキシル基に結合している。高分子量のポリペプチドは「タンパク質」とよばれる。
【００２２】
「標識」とは、検体を検出するためにキャリヤー物質または分子に付けることができる識別用の目印を意味する。標識は、結合性または架橋性部分構造によりそのキャリヤー物質に直接または間接的につけることができる。好適な標識としては、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）、蛍光化合物（例えば、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネートまたはＦＩＴＣ、他）、発光性化合物（例えば、ジオキセタン、ルシフェリンなど）、放射性同位元素（例えば、 １２５Ｉ）、タンパク質結合性パートナー（例えば、ビオチン）、ならびに同様なものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
「抗体」（略して「Ａｂ」）とは、免疫原またはそれの一部分に結合することができる特定のタンパク質を意味する。抗体は、注射により宿主（例えば、動物またはヒト）に導入しておくこともできる免疫原に応答して産生される。一般名称「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体断片を包含する。
【００２４】
「検体」とは、その存在または量が測定されるべき物質または物質の集団を意味する。本明細書で用いる場合、「検体」は、抗体に結合することができる化合物を意味する「抗原」を包含する。さらに、本明細書で用いる場合、「検体」とは、限定するものではないが、コンジュゲート、免疫原、薬物、薬物誘導体、ホルモン、タンパク質、ならびにこれらに類似のものを含めたあらゆる種類の化学物質を意味する。代表的なエクスタシー薬物検体としては、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらに類似のものが挙げられる。
【００２５】
「誘導体」とは、親化合物から１以上の化学反応により生成された化学化合物を意味する。
【００２６】
「リガンド」とは、例えば競合免疫学的アッセイに用いることができるもののような、抗体に対する結合能に関し検体と同様にふるまう物質または物質の集団を意味する。代表的なリガンドとしては、薬物、薬物誘導体、これらの異性体、ホルモン、ポリピプチド、ヌクレオチド、およびこれらに類似のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
「検体を検出する」とは、通常は検体、そして特にはエクスタシー薬物を測定するための定量的、半定量的、または定性的な方法を意味する。例えば、単にサンプル中のエクスタシー薬物の存在の有無を検出する方法も、そのサンプル中の薬物の量または濃度に関するデータを提供する方法と同様に、本発明の範囲に入る。「検出する」、「測定する」、「識別する」、ならびにこれらに類似のものは、本明細書中では同意語として用いられ、すべて本発明の範囲に入る。
【００２８】
「試薬キット」とは、アッセイを行うのに用いられる材料のアセンブリーを意味する。試薬は、その交差反応性および安定性に応じて同一の容器または別々の容器に、また液体または凍結乾燥形態で、パックされた組み合わせとして提供され得る。キットに提供されている試薬の量および割合は、特定の用途に対し至適な結果を与えるように選択できる。本発明の特徴を具現する試薬キットはエクスタシー薬物に特異的な抗体を含んでいる。キットはさらに検体のリガンド、ならびに検量および対照材料を含みうる。本試薬は液体形態のままでもよいしあるいは凍結乾燥してもよい。
【００２９】
「検量および対照材料」とは、測定すべき検体の既知量を含有する標準または参照材料を意味する。検体を含んでいると疑われるサンプルおよびそれに対応する検量材料は同じような条件下でアッセイが行なわれる。検体の濃度は、未知の試料に対して得られた結果を標準の試料に対して得られた結果と比較することにより算出される。これは一般には、図８に示されているような検量線を作成することにより行なわれる。
【００３０】
「アルキル基」とは、直鎖、分枝、環式、非環式、飽和または不飽和の炭素鎖を意味する。代表的なアルキル基としては、アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、シクロアルケン、シクロアルキン、アリール、およびこれらに類似のもの、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
「置換されていてもよい」とは、アルキル基への１以上の置換基の任意的な付加を意味する。
【００３２】
「脱離基」とは、基質の化学部分構造であって、それと反応させる試薬で置換できるものを意味する。好適な脱離基としては、ハロゲン化物、メシラート、トシラート、アルコキシ、第四級アンモニウム塩、およびこれらに類似のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。現状で好ましい実施形態で用いるのに好ましい脱離基は活性エステル（例えば、トリフルオロエトキシエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル）により提供され、この場合カルボニル炭素に付いている、エステルの酸素含有部分が反応で置換される。
【００３３】
「保護基」とは、反応性原子または中心につけられてその通常の反応性を変える部分構造を意味する。好適な保護基としては、専門書 Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９）（この文献の全内容は参照により本明細書に組み入れるものとする）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、またもし本出願と一致しない開示または定義がある場合は、本明細書にある開示または定義が優先するものとする。アミンの窒素に対する種々の保護基が当技術分野で知られているが（例えば、上記を参照されたし）、その中でもトリフルオロアセチルが、現時点で好ましいとされる窒素保護基である。
【００３４】
本発明の特徴を具現する化合物は、エクスタシー薬物に特異的な抗体の製造において中間体、ハプテン、または免疫原として有用である。本発明の特徴を具現する化合物の第１のシリーズは構造 Ｉ：
【化７】
を有する。
【００３５】
マクロ分子キャリヤーは、タンパク質、ポリペプチド、および多糖類から構成される群から選択するのが好ましい。好ましいタンパク質としては、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および ＢＴＧ（ウシサイログロブリン）が挙げられる。アルキル基は、直鎖または分枝鎖であって、１〜１５個の炭素原子、さらには１〜１１個の炭素原子、なおさらには１〜９個の炭素原子を有しているのが好ましい。
【００３６】
この第１のシリーズの好ましい実施形態では、Ｊ が−（ＣＨ２）ｋ−を含み、ｋ が１、２、３、４、５、または６、さらには ｋ が ３ であるのが好ましい。さらに Ｍ が−ＣＯ−であるのが好ましい。Ｒ２ が水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルであるのが好ましく、さらにはＲ２ が水素であるのが好ましい。Ｒ３ が水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルであるのが好ましく、さらにはＲ３ がメチルであるのが好ましい。Ｔ は、Ｎ−オキシスクシンイミド、ヘモシアニン、グロブリン、およびアルブミンから構成される群から選択するのが好ましく、さらにはＴ は、ＫＬＨ、ＢＳＡ、およびＢＴＧから構成されるタンパク質の群から選択するのが好ましい。
【００３７】
図１は、この第１のシリーズの好ましい実施形態の化合物および免疫原を合成するための代表的なスキームを示す。この代表的な合成スキームにおいて、出発原料、試薬、個々の合成変換反応、および反応条件は全く説明のためのものであって、限定のためのものではないことを理解すべきである。図示されているものとは全く別の出発原料に基づく合成を含めて、別の合成製法を、本特許請求の範囲の思想と範囲から逸脱することなく開発することができる。
【００３８】
図１に示されているように、合成はエクスタシー薬物メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＡ）２から始める。２の第一級アミノ基と４−ブロモ−酪酸エチルエステルを反応させてアルキル化生成物４を得る。得られた４の第二級アミノ基を適当なアミノ保護基を用いて保護する。図１に示されているように、４のアミノ基はトリフルオロ無水酢酸（ＴＦＡＡ）でトリフルオロアセチル化して保護されたトリフルオロアセチル化誘導体６を得る。６のエチルエステル部分構造の加水分解によりカルボン酸誘導体８を得、これをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応でエステル化して活性エステル誘導体１０を得る。活性エステル誘導体１０をマクロ分子キャリヤー部分構造［ Ｔ ］（例えば、ＫＬＨ、ＢＴＧ、ＢＳＡ）と反応させて、脱保護して、そして透析して免疫原１２を得る。
【００３９】
図１の化合物６、８、１０、および１２では、上記の好ましい部分構造 −（ＣＨ２）３− および −ＣＯ− はそれぞれ Ｊ および Ｍ に対応するが、この合成に示されている特定の化合物は純粋に説明のためであって、図１に描かれている合成方法を改変して実質的に異なる化学構造を有する化合物を製造できることを強調しておきたい。例えば、図１に示されているアルキル化剤 ４−ブロモ−酪酸エチルエステルは、脱離基（例えば、臭素）を末端官能基（例えば、そのエチルエステル）から分け隔てるもっと多くのあるいは少ない連続メチレン単位をもつ試薬と置き換えできる。同様にこれらの末端間を分け隔てる炭素鎖は、ヘテロ原子、置換、不飽和、またはこれらと同様なものを含むことができる。さらに、このアルキル化工程をとおして導入された官能基（即ち、４−ブロモ−酪酸エチルエステルのエチルエステル部分構造）は、例えばアルコール類、保護アルコール類、カルボン酸類、保護カルボン酸類、アミン類（例えば、第一級、第二級、または第三級）、保護アミン類、チオール類、保護チオール類、チオエーテル類、アミド類、チオアミド類、イミド類、チオイミド類、ニトリル類、イミン類、ヒドラゾン類、マレイミドチオエーテル類、およびこれらに類似のものを含めて、またこれらに限定されるものではないが、様々な代替の部分構造によって、あるいは、当技術分野で十分確立されているように、１以上の合成変換反応によりその部分構造に変換することができるこれら部分構造の官能基前駆体で置き換えることができる。
【００４０】
図１に描かれている合成方法は、ＭＤＡ２に含まれるアミノ基のアルキル化をとおして −Ｊ−Ｍ−Ｔ 部分構造を導入するが、既に窒素を含んでいるメチレンジオキシ−フェニル環系を反応させていくこの方法は純粋に説明のためであり、そして数多くの別の方法をこれに代えて用いることができることを強調しておきたい。例えば、ＭＤＡ２のアミノ基の代わりに脱離基を含むメチレンジオキシ−フェニル環系をアミノ含有求核試薬と、あるいはアミノ基の前駆体（例えば、アジド、シアニドなど）を含んでいる求核試薬と反応させることができる。事実、アミノ基の代わりに脱離基を含んでいるＭＤＡ２の類似体を、４−ブロモ−酪酸エチルエステルのアミノ類似体と、即ち ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ２Ｅｔ−と、反応させると、これもまた、異なるルートで化合物６を生成すると考えられる。例えば、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ． Ｌａｒｏｃｋ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９）および Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ． Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ２００１）、およびこれらの中で引用されている文献、のような論文に記載されているものを含めて、当技術分野で知られている全ての化学変換反応の方法は、本好ましい実施形態で用いることができると考えられる。
【００４１】
図１に示されている代表的な合成反応を変更するのに有用となると思われる変換反応としては、決して限定するものではないが、Ｆｉｓｃｈｅｒ エステル化反応、その他の活性エステルの調製（例えば、カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、２−クロロピリジニウム、３−クロロイソオキサゾリウム、２，２’−ジピリジルジスルフィド、２−ピリジルチオクロロホルマート、およびこれらに類似のものを用いて）、酸化反応（例えば、アルコール類、アミン類、チオール類、チオエーテル類の、あるいはバイヤー−ビリガー酸化（Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）など）、還元反応（例えば、ニトロ基の還元、カルボニル基の環元、水素化など）、アミノ基の保護（例えば、カルバメートアミド類、Ｎ−アルキルアミン類、Ｎ−アリールアミン類、イミン類、エナミン類、Ｎ−ヘテロ原子誘導体、およびこれらに類似のもの）および対応する脱保護、縮合反応（例えば、アルドール、クライゼン（Ｃｌａｉｓｅｎ）、クネベナーゲル（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ）など）、１，４−付加反応（例えば、マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）反応、コーリイ−ホワイトサイド−ハウス有機銅酸化物結合（Ｃｏｒｅｙ−Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ−Ｈｏｕｓｅ ｏｒｇａｎｏｃｕｐｒａｔｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）など）、１，２−付加反応（例えば、グリニャール（Ｇｒｉｇｎａｒｄ）反応、カルボニル還元など）、二トリルの還元、アルコールの脱保護、カルボン酸の脱保護、ケトンの脱保護、アルデヒドの脱保護、アジドの還元、イミンの還元、ならびにこれらに類似のもの、が挙げられる。
【００４２】
本発明の特徴を具現する化合物の第２のシリーズは構造 ＩＩ：
【化８】
を有する。
【００４３】
マクロ分子キャリヤーは、タンパク質、ポリペプチド、および多糖類から構成される群から選択するのが好ましい。好適なタンパク質としては、 ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および ＢＴＧ（ウシサイログロブリン）が挙げられる。前記アルキル基は、直鎖または分枝鎖であり、１〜１５ 個の炭素原子、より好ましくは １〜１１ 個の炭素原子、さらに好ましくは １〜９ 個の炭素原子を有するのが好ましい。
【００４４】
この第２のシリーズの好ましい実施形態では、Ｌ を構成する炭素原子および任意のヘテロ原子は制限されるものではなく、直鎖、分枝、環式、および非環式系を含み得る。Ｌ は、−（ＣＨ２）ｊ−（式中 ｊ は、１、２、３、４、５、または ６ であるのが、さらに好ましくは ｊ は ３ であるのが好ましい）を含んでなるのが好ましい。さらに、Ｘ は −ＣＯ− であるのが好ましい。Ｒ１ は、エチル、ｎ−プロピル、または ｎ−ブチルであるのが好ましく、また Ｒ１ がエチルであるのがもっと好ましい。Ｒ２ は、水素または保護基であるのが好ましく、そして Ｒ２ が、トリフルオロアセチル基のような保護基であるのがもっと好ましい。Ｒ３ は、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、または ｎ−ブチルであるのが好ましく、そして Ｒ３ はメチルであるのがもっと好ましい。Ｑ は、ヒドロキシ、Ｎ−オキシスクシンイミド、ヘモシアニン、グロブリン、およびアルブミンから構成される群から選択するのが好ましく、そして Ｑ は ＫＬＨ、ＢＳＡ、および ＢＴＧ から構成されるタンパク質の群から選択するのがもっと好ましい。
【００４５】
図２は、この第２のシリーズの好ましい実施形態の化合物および免疫原を合成するための代表的なスキームを示す。この代表的な合成スキームにおいて、出発原料、試薬、個々の合成変換反応、および反応条件は全く説明のためのものであって、限定のためのものではないことを理解すべきである。図示されているものとは全く別の出発原料に基づく合成を含めて、別の合成製法を、本特許請求の範囲の思想と範囲から逸脱することなく開発することができる。
【００４６】
図２に示されているように、合成は １−メチル−２−フェニル−エチルアミン１４で始まる。１４のアミノ基を臭化エチルでアルキル化して Ｎ−エチルアミン誘導体１６を得る。１６のアミノ基を適当なアミノ保護基を用いて保護する。図２に示されているように、１６のアミノ基をトリフルオロ無水酢酸（ＴＦＡＡ）でトリフルオロアセチル化する。トリフルオロアセチル化誘導体１８をフリーデル−クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ）型反応で無水コハク酸と反応させてカルボン酸誘導体２０を得る。カルボン酸誘導体２０のベンジルカルボニル基の還元により還元生成物２２を得、これを Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によりエステル化して活性エステル誘導体２４を得る。活性エステル誘導体２４をマクロ分子キャリヤー部分構造［ Ｑ ］（例えば、ＫＬＨ、ＢＳＡ、ＢＴＧ）と反応させ、窒素を塩基性条件下で脱保護し、そして透析して免疫原２６を得る。あるいは、図３に示すように、活性エステル誘導体２４を、例えば ４−アミノメチル安息香酸との反応によりさらに反応させて安息香酸誘導体３２を得る。安息香酸誘導体３２、および３２から Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により得られる活性エステル誘導体３４は、本発明の各種コンジュゲート、標識、およびこれらに類似のものの合成に有用な中間体である。図３に示されている合成方法（即ち、アミノ安息香酸の導入）は、図１に示されているタイプのメチレンジオキシ化合物にも容易に用いることができる（例えば、活性エステル誘導体１０を ４−アミノメチル−安息香酸と反応させることにより）。
【００４７】
図２の化合物２２、２４、および２６では、上記の好ましい部分構造 −（ＣＨ２）３− および −ＣＯ− はそれぞれＬ およびＸ に対応するが、この合成に示されている特定の化合物は純粋に説明のためであって、図２に描かれている合成方法を改変して実質的に異なる化学構造を有する化合物を製造できることを強調しておきたい。例えば、図２に示されている無水コハク酸は、もっと多くのあるいはもっと少ない環炭素原子および／または環へテロ原子（これら自身、置換されていてもよいし、不飽和を含むことができる）を有する環式無水物、あるいはそれに類似のもので置き換えできる。さらに、フリーデル−クラフツアシル化剤としては環式無水物を用いる必要もない。非環式試薬（例えば、ハロゲン化アシル、カルボン酸、ケテンなど）を用いることもできる。さらに、図２に示されているフェニル環の構造を反応させていくのに、フリーデル−クラフツアシル化反応を用いる必要もない。限定するものではないが、フリーデル−クラフツアルキル化、ハロゲン化、ニトロ化、スルホン化、イプソ置換、およびこれらに類似のものを含めて、多数の代替の求電子的芳香族置換を用いることもできる。同様に、フリーデル−クラフツアシル化工程を通して導入された官能基（即ち、化合物２０および２２に示されている末端カルボン酸部分構造）は、例えば、限定するものではないが、アルコール類、保護アルコール類、保護カルボン酸類、アミン類（例えば、第一級、第二級、または第三級）、保護アミン類、チオール類、保護チオール類、チオエーテル類、アミド類、チオアミド類、イミド類、チオイミド類、ニトリル類、イミン類、ヒドラゾン類、マレイミドチオエーテル類、およびこれらに類似のものを含めて様々な代替の部分構造で置き換えることができる、またはそれらに変換することができる、あるいは、当技術分野で十分確立されているように、１以上の合成変換反応によりその部分構造に変換することができるこれら部分構造の官能基前駆体で置き換えることができる。
【００４８】
図２に描かれている合成方法は、トリフルオロアセチル化誘導体１８のフェニル環のアシル化を通して −Ｌ−Ｘ−Ｑ 部分構造を導入するものであるが、求電子的置換により既に存在しているフェニル環をさらに反応させていくこの方法は純粋に説明のためであって、これに代えていろいろな代替の方法を用いることができると考えられることを強調しておきたい。例えば、アミノ含有側鎖に対しパラの位置でハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されたフェニル環は、当技術分野で周知の方法を用いて、有機金属試薬（例えば、グリニャール、有機リチウム、有機スタナン、有機ボラン、有機銅酸化物（ｏｒｇａｎｏｃｕｐｒａｔｅ）、またはこれらに類似のもの）に変換し、そのあと求電子的試薬と反応させて炭素−炭素結合を形成さすことができる。あるいは、アミノ含有側鎖に対しパラの位置で適当な脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルコキシなど）で置換されたフェニル環は、当技術分野で周知の方法を用いて、求核芳香族置換反応をさせることができる。さらには、フェニル環の置換パターンは、完全飽和のまたは部分不飽和のシクロヘキサン環系（またはその前駆体）上に生成させることも考えられ、そしてこれは、例えば、限定するものではないが水素化触媒（例えば、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉなど）、Ｓ および Ｓｅ、キニーネ、ならびにこれらに類似のものなどの、当技術分野で周知の試薬を用いて芳香族化される。
【００４９】
図１に示されている合成スキームに関連して上記したように、当技術分野で知られている全ての化学変換反応の方法は本好ましい実施形態で用いることができると考えられる。図２に示されている代表的な合成の変更に有用になると思われる変換反応としては、決して限定するものではないが、図１の合成スキームに関連して上記で明らかにされたもの、ならびにウォルフ−キシュナー（Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ）還元、クレメンゼン（Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ）還元、ヒドラゾンの還元（例えば、ＬｉＡｌＨ４、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、またはこれらに類似のもの）、およびこれらに類似のものが挙げられる。
【００５０】
本発明の特徴を具現する第１の抗体はエクスタシー薬物に対して特異的である。エクスタシー薬物は、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらの組み合わせから構成される群から選択するのが好ましい。
【００５１】
本発明の特徴を具現する第２の抗体は ＭＤＥＡ に対し特異的である。
【００５２】
本発明の特徴を具現する第３の抗体は、上記で示されまた説明された構造 Ｉ または ＩＩ を含んでなる検体（即ち、免疫原、コンジュゲート、またはその他の化学物質）に対し特異的である。
【００５３】
上述の好ましい実施形態の第１のシリーズからの免疫原、即ち、メチレンジオキシ−フェニル縮合環系（例えば、図１）を含んでなる化合物のシリーズは、例えば、限定するものではないが、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらを組み合わせたものなどのエクスタシー薬物に対して特異的な抗体を製造するのに有用である。図４に示されている表１は、エクスタシー薬物、特に融合番号３からの、そして特に Ａｂ ２．１．１（これは、図１の免疫原１２に応答して産生された抗体であり、この場合 Ｔ は ＫＬＨ である）に対して特異的ないくつかの抗体の交差反応データを示している。当技術分野で十分確立されているタイプの古典的免疫化プロトコルを用いてこのデータを得た。表１において、略記号 ｄＡＭは ｄ−アンフェタミンを表わし、略記号 ｄＭＡ は ｄ−メトアンフェタミンを表わし、略記号 ＩＡＭ は Ｉ−アンフェタミンを表わし、略記号 ＩＭＡ は Ｉ−メトアンフェタミンを表わし、略記号 Ｓｅｓ はセサミンを表わし、略記号 Ｐｈｅｎ はフェンテルミンを表わし、略記号 Ｔｙｒ はチラミンを表わし、略記号 Ｐｓｅｕ はプソイドエフェドリンを表わし、略記号 Ｅｐｈ はエフェドリンを表わし、略記号 ＰＰＡ はフェニルプロパノールアミンを表わし、略記号 ｎＥｐｎ はノルフェドリンを表わし、略記号Ａｄｒ はアドレナリンを表わし、略記号 Ｒａｎ はラニチジン（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ より商品名 ＺＡＮＴＡＣ で発売されており、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ， ＮＪ から販売されている）を表わす。
【００５４】
図５の競合阻害プロットに示されているように、免疫原１２（例えば、 Ｔ が ＫＬＨ であるもの）によって誘導された抗体はエクスタシー薬物に対し良好な応答と特異性を示している。さらに、図６の競合阻害プロットに示されているように、これらの抗体は関連薬物には殆どあるいは全く交差反応性を示さない。図６において、略記号 ｄＡＭＰ は ｄ−アンフェタミンを表わし、略記号 ＩＡＭＰ は Ｉ−アンフェタミンを表わし、略記号 Ｓｍｉｎ はセサミンを表わすが、略記号 ＩＭＡ、ｄＭＡ、および Ｐｈｅｎ は上記の表１で記載したのと同じ意味を有する。
【００５５】
表２は、Ｔ が ＫＬＨ である図１の免疫原１２に応答して産生された抗体 ＭＤＭＡ−２．１．１ に対する交差反応性データを示している。標準であるメトアンフェタミンの結合に５０％の低下をもたらす薬物の濃度（ＥＤ ５０）を決定し、その ＥＤ５０ でそれぞれのその他の薬物の ＥＤ５０ を割り、そしてその結果を １００ で乗ずることにより、表２に示されている交差反応性のパーセントを計算することができる。このデータを得るのに用いた抗体は、当技術分野で十分確立されているタイプの古典的免疫法プロトコルにより製造した。
【００５６】
表２：各種薬物に対する ＭＤＭＡ−２．１．１ の交差反応性
薬物 交差反応性 ％
ｄ−ＭＤＭＡ １００
ＭＤＥＡ ２０４
ＭＤＡ ６０．６
ＭＢＤＢ ２６．１
ＢＤＢ ２０．５
ＭＤＰＡ ３６５
ｄ−ＡＭＰ ０
ｄ−ＭＡＭＰ ０．６５
Ｉ−ＡＭＰ ０
Ｉ−ＭＡＭＰ ０
セサミン ０
フェンテルミン ０
チラミン ０
プソイドエフェドリン ０
エフェドリン ０
フェニルプロパノールアミン ０
ノルピネフリン ０
アドレナリン ０
ラニチジン（ＺＡＮＴＡＣ） ０
【００５７】
上記した好ましい実施形態の第２のシリーズからの免疫原、即ち、縮合メチレンジオキシ−フェニル環系のない化合物のシリーズは、限定するものではないが、ＭＤＡ、ＭＤＭＡ、ＭＤＥＡ、ＭＤＰＡ、ＢＤＢ、ＭＢＤＢ、ならびにこれらを組み合わせたものなどのエクスタシー薬物に特異的な抗体を製造するのに有用である。この第２のシリーズの Ｎ−エチル置換免疫原（即ち、構造 ＩＩ の Ｒ１ がエチルである）に応答して産生される抗体は、従来のアンフェタミンおよびメトアンフェタミンの免疫学的アッセイでは通常十分に検出できなかったエクスタシー薬物 ＭＤＥＡ（「イブ」）に対し特に高い認識を示す。このようにして産生された抗体は、既存のアンフェタミンまたはメトアンフェタミンアッセイにおいて検出を向上させるための追加抗体として、あるいは ＭＤ クラスの薬物の免疫学的アッセイにおける ＭＤＥＡ に対する別の抗体として用いることができる。
【００５８】
表３は、Ｑ が ＫＬＨ である図２の免疫原２６に応答して産生させられた抗体 ＮＥＡＭＰ−１．３ に対する交差反応性データを示している。上述した手順により、表３に示されている交差反応パーセントは算出できる。このデータを得るのに用いた抗体は古典的免疫プロトコルを用いて製造することができる。
【００５９】
表３：各種薬物に対する ＮＥＡＭＰ−１．３ の交差反応性
薬物 交差反応パーセント
ｄ−メトアンフェタミン １００
Ｉ−メトアンフェタミン 検出せず
ｄ−アンフェタミン ３２．５
Ｉ−アンフェタミン ３３．５
ＭＤＭＡ １１４
ＭＤＥＡ ５０７
ＭＢＤＢ ２０
フェンジメトラジン ０．６
プソイドエフェドリン ２．０
Ｉ−エフェドリン ６．７
ラニチジン（ＺＡＮＴＡＣ） ０．２
【００６０】
Ｎ−エチル置換免疫原２６（例えば、Ｑ が ＫＬＨ である場合）により誘導された抗体は、図７の競合阻害プロットにより示されているように、一般にエクスタシー薬物に対して、そして特に ＭＤＥＡ に対して良好な応答および特異性を示す。図７では、略記号 ｄＭｅｔｈ は ｄ−メトアンフェタミンを表わし、そして略記号 Ｉｍｅｔｈ
は Ｉ−メトアンフェタミンを表わす。
【００６１】
本発明の特徴を具現する試薬キットは、本発明の特徴を具現する抗体を含んでなる。代表的な試薬キットは、エクスタシー薬物に特異的な抗体および、エクスタシー薬物のリガンドを含む複合体または標識部分構造に結合されたそれの誘導体を含んでなり得、また、エクスタシー薬物または関連標準の既知量を含む１以上の検量物質も任意に含んでなり得る。
【００６２】
本発明の特徴を具現する抗体は、その利用方法の説明書と一緒に、キット、容器、パック、またはディスペンサーの中に入れておくことができる。抗体をキットに入れて提供する場合、免疫学的アッセイの異なる成分は別々の容器にパックし、使用する前に混ぜるということでよい。このように各成分を別々にパックすると、活性成分の機能を実質的に減少させることなく長期の貯蔵を可能にし得る。さらに、試薬を不活性環境下（例えば、窒素ガス、アルゴンガス、またはこれらに類似のものの正圧下）にパックすることもでき、これは空気および／または水分に敏感な試薬に対しては特に好ましい。
【００６３】
本発明の特徴を具現するキットに含まれる試薬は、その異なる成分の各活性が実質的に維持され、同時に各成分がそれ自身容器の材質により実質的に吸収または変質されないならば、あらゆる種類の容器に入れて提供することができる。好適な容器としては、限定するものではないが、アンプル、ボトル、試験管、バイアル、フラスコ、シリンジ、封筒（例えば、ホイルで裏張りされた）、およびこれらに類似のものが挙げられる。容器は、限定するものではないが、ガラス、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンなど）、セラミックス、金属（例えば、アルミニウム）、金属合金（例えば、鋼）、コルク、およびこれらに類似のものなどの適切な材料から構成される。加えて、容器には、セプタムにより提供され得るもののような、１個以上の滅菌アクセスポート（例えば、ニードルを介してのアクセス用に）がついていてもよい。セプタム用の好ましい材料としては、ゴムおよび、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）により商品名ＴＥＦＬＯＮで販売されているタイプのポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。さらに、容器は、取り除くことで各成分の混合を起こさすことができるパーティションまたはメンブレーンにより仕切られている２以上のコンパートメントを有し得る。
【００６４】
本発明の特徴を具現する試薬キットには説明用資料をつけてもよい。説明書は印刷（例えば、紙面上に）されていてもよいし、また／あるいは電子的に読み取り可能な媒体（例えば、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープなど）に入れて提供されてもよい。あるいは、ユーザーをインターネットウェブサイトに、また／あるいは電子メールを通じて案内することで、説明書を提供してもよい。
【００６５】
先述したように、本発明の特徴を具現する試薬キットは、測定すべき検体の既知量を含んでいる検量用または対照用材料を含んでいてもよい。検体の濃度は、サンプルに対して得られた結果を、標準に対して得られた結果と比べることにより算出することができる。検量曲線を作成し、これを用いることで結果の一式を相関させることができ、そしてサンプル中の検体の濃度を決定することができる。図８は、改変ロッシュオンラインフォーマート（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｏｃｈｅ ＯＮＬＩＮＥ ｆｏｒｍａｔｓ）および試薬および Ａｂ ＭＤＭＡ ２．１．１（即ち、Ｔ が ＫＬＨ である免疫原１２から誘導された抗体）を用いた場合のヒタチアナライザー（ＨＩＴＡＣＨＩ Ａｎａｌｙｚｅｒ）における曲線を示す。
【００６６】
本発明の特徴を具現する検体検出方法は、サンプルを本発明の特徴を具現する抗体と接触させる段階、抗体を検体に結合させる段階、および抗体と検体とにより生成された付加生成物を検出する段階を有してなる。
【００６７】
検体を含有しているのではないかと疑われるサンプルを、本好ましい実施形態の方法により分析することができる。望ましいならサンプルを予備加熱することができるし、またアッセイに干渉しないいかなる都合のよい媒体中においても調製することができる。サンプルは、例えば宿主からの体液のような水性媒体からなるのが好ましい。代表的な体液としては、限定するものではないが、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、およびこれらに類似のもの、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。体液は、血漿、血清、または尿からなるのが好ましい。
【００６８】
抗体が固相に結合されているアッセイおよび抗体が液体媒体中にあるアッセイを含めて、抗体を用いるあらゆる種類の免疫学的アッセイを本好ましい実施形態において用いることが考えられることは理解すべきである。本発明の特徴を具現する抗体を用いて、検体を検出するのに用いることができる免疫学的アッセイの方法としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：サンプル中の標識検体と検体が抗体に対して競合する競合（試薬限定的）アッセイ；抗体が標識化されている単一部位免疫定量アッセイ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｔｅ ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）；捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（即ち、固相に付着している抗体）が抗原の最初のエピトープに結合し、そして検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（即ち、標識抗体）がこの抗原−捕捉抗体複合体に結合する二部位免疫定量（試薬過剰）アッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）；およびこれらに類似のもの。
【００６９】
各種の免疫学的アッセイを行う方法は当技術分野では十分確立されており、例えばＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， ２０００）（これの全内容を参照により本明細書に組み入れるものとする）などの多数の論文および刊行物に述べられている。但し、本出願と一致しない開示あるいは定義がある場合は、本明細書中の開示あるいは定義が優先するものとする。
【００７０】
本発明の特徴を具現する抗体の製造方法は、宿主に、本発明の特徴を具現する免疫原を接種する段階を有してなる。好適な宿主としては、限定するものではないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ロバ、ウマ、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ヒト、ならびに成熟免疫応答を見せることができる種が挙げられる。用いる免疫化方法は当技術分野で十分確立されており、例えば上記で引用した Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ などの多数の論文および刊行物、ならびにそれらの中で引用されている文献に述べられている。
【００７１】
本発明の特徴を具現する免疫原は、アジュバント（免疫強化剤）と組み合わせて宿主被験体（例えば、動物またはヒト）に投与される。好適なアジュバントとしては、限定するものではないが、フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ）、粉末水酸化アルミニウム（ミョウバン）、ボルデテラ属百日咳菌と一緒にした水酸化アルミニウム、およびモノホスホリルリピド Ａ 合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。
【００７２】
ポリクローナル抗体は、アジュバントと一緒に任意追加的に投与され得る免疫原の１以上の注射により、哺乳動物宿主中で生じさせることができる。典型的には、免疫原（または免疫原とアジュバントとの組み合わせ）が哺乳動物宿主に１回または複数回の皮下または腹腔内注射により注入される。この免疫プログラムは少なくとも１週間に亘って、そしてより好ましくは２週間以上に亘って行うのが好ましい。このようにして産生されたポリクローナル抗体は単離され、当技術分野で周知の方法を用いて精製される。
【００７３】
モノクローナル抗体は、十分確立されているケーラーとミルシュタイン（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のハイブリドーマ法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ， １９７５， ２５６， ｐｐ． ４９５−４９７）により製造することができる。ハイブリドーマ法は典型的には以下の段階を有する：（１）宿主または宿主からのリンパ球を免疫化する段階；（２）モノクローナル抗体を分泌する（または分泌する能力を有する）リンパ球を回収する段階；（３）このリンパ球を不朽化された（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）細胞に融合する段階；および（４）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する段階。
【００７４】
宿主を免疫化して免疫原に対し特異的な抗体を産生するまたは産生する能力を有するリンパ球を誘導することもできる。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。もしヒト細胞が求められているのであれば、他の哺乳動物源からの脾臓細胞またはリンパ球が好ましいけれども、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いることができる。
【００７５】
リンパ球を不朽化細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させることができるが、この工程は融合助剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いることにより促進することができる。具体例として、形質転換により不朽化された変異齧歯動物、ウシ、またはヒトの骨髄腫細胞を用いることができる。融合されていない不朽化細胞（ｕｎｆｕｓｅｄ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ）とは対照的に、ハイブリドーマ細胞の実質的に純粋な個体群が好ましい。従って、例えば、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ または ＨＰＲＴ）を欠く変異骨髄腫細胞を用いて、融合のあと、融合していない不朽化細胞の増殖または生存を阻害する適当な培地中で、これらの細胞を増殖することができる。このような例においては、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンをその培地に加えることで（ＨＡＴ 培地）、ＨＧＰＲＴ−欠陥細胞の増殖を妨げる一方で、ハイブリドーマを増殖させることができる。
【００７６】
不朽化細胞は、効率的に融合し、ＨＡＴのような培地中における淘汰により雑多の個体群から単離することができ、そして融合のあと安定且つ高レベルの抗体の発現を維持するものが好ましい。好ましい不朽化細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能な骨髄腫細胞株が挙げられる。
【００７７】
ハイブリドーマ細胞は典型的には細胞外に抗体を分泌するので、その培養培地を、ＭＤ クラスのアンフェタミン誘導体に特異的なモノクローナル抗体の存在に関してアッセイすることができる。免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ［例えば、ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）］を用いることでモノクローナル抗体の結合特異性を測定することができる。
【００７８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は限界希釈法で単一クローンとして単離し、そして継代培養することができる。好適な培養培地としては、限定するものではないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ 社の Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ−１６４０、およびポリペプチド不含有もしくはポリペプチド低減型または無血清培地［例えば、 Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手可能な Ｕｌｔｒａ ＤＯＭＡ ＰＦ または ＨＬ−１）が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を腹水としてインビボで増殖させることもできる。
【００７９】
モノクローナル抗体は在来の Ｉｇ 精製法、例えば、限定するものではないが、ポリペプチド Ａ−セファローズ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー；ゲル電気浸透；透析；硫酸アンモニウム沈降；およびアフィニティークロマトグラフィーなどにより、培養培地または腹水液から単離および／または精製することができる。
【００８０】
また、例えば米国特許第 ４，１６６，４５２ 号に記載されているもののような遺伝子組換え法によりモノクローナル抗体を製造することもできる。在来の方法を用いて（例えば、ネズミ重および軽鎖抗体遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、好ましくは、エクスタシー薬物に特異的な抗体を分泌するモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株から単離された ＤＮＡ を調べることで、モノクローナル抗体をコードする ＤＮＡ を単離し、配列決定することができる。この単離された ＤＮＡ 断片を、発現ベクターにサブクローニングしその後宿主細胞（例えば、さもなければ Ｉｇ ポリペプチドを産生しないサル ＣＯＳ−７ 細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）の中にトランスフェクトしてモノクローナル抗体を発現させることができる。米国特許第 ４，８１６，５６７号に記載されているように、この相同ネズミ配列に代えてヒト重および軽鎖定常領域のコード配列で置き換えることで、あるいは Ｉｇ をコードする配列を、非−Ｉｇ ポリペプチドのコード配列の全部または一部と融合させることにより、単離された ＤＮＡ 断片を改変することができる。このような非−Ｉｇ ポリペプチドは、抗体の定常領域に代えて置き換えることができ、あるいは１つの抗原結合性部位の可変領域に代えて置き換えることにより、キメラ２価抗体をつくることができる。
【００８１】
【実施例】
以下の、本発明の特徴を具現する免疫原の代表的な調製方法およびエクスタシー薬物に対するハイブリドーマの製造方法は、説明のためだけに提供するものであって、特許請求の範囲またはそれと均等なものの限定を意図するものではない。
【００８２】
実施例共通事項
特に断らない限り、試薬は Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ， ＵＳＡ）から入手した。また特に断らない限り、溶剤は、Ｊ Ｔ Ｂａｋｅｒ または Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ から入手し、ＡＣＳ または ＨＰＬＣ グレードまたはそれ以上であった。塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、水素化カルシウムを用いた蒸留により脱水させた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、ナトリウムおよびベンゾフェノンを用いた蒸留により脱水させた。脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、密封 ＳＵＲＥＳＥＡＬ ボトルの形で Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から入手した。カラムクロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ のフラッシュグレード（ｆｌａｓｈ−ｇｒａｄｅ）のシリカゲル（カタログ番号 ９３８５−９；Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０；２３０−４００ ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ）を用いて行った。薄層クロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ から入手したシリカゲルプレート（カタログ番号 ５７１５−７；厚み ０．０２５ ｃｍ）を用いて行った。「ＫＰｉ」は、リン酸カルシウム緩衝液を意味する。混合溶媒は、容量パーセントとして容量で表わされる（例えば、１０％ ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３ または ＣＨＣｌ３ 中 １０％ ＭｅＯＨとは、メタノールを １０容量％ 含有するクロロホルムである）。
【００８３】
代表的合成方法
ＭＤＡ 誘導体４の合成
ａ）塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）中メチレンジオキシアンフェタミン臭化水素酸塩の懸濁液／溶液 ７００ ｍｇ を、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）飽和水溶液（略してｓａｔ． ａｑ．）と一緒にして十分振盪した。得られた層を分離し、水性層を追加の ＣＨ２Ｃｌ２ で、抽出される有機物質が無視できる程度となるまで繰り返し抽出した。合わせた有機層を減圧下で乾燥するまで蒸発させ（ロータリーエバポレータ−；略して ｒｏｔｏｖａｐ）、その後さらに高真空下でしばらく乾燥させて、メチレンジオキシアンフェタミンの遊離塩基 ４０８ ｍｇ を油状物として得た。
【００８４】
ｂ）脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５ ｍＬ 中遊離塩基２ ４００ ｍｇ の溶液に、４−ブロモブチル酸エチルエステル（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）３８７ μＬ（１．２ モル当量）を加え、反応をアルゴン下、室温（略して ＲＴ）で、一晩（略して Ｏ．Ｎ．）撹拌した。反応混合物を ＣＨ２Ｃｌ２ ２０ｍＬ で希釈し、ＮａＨＣＯ３ 飽和水溶液 ２５ ｍＬ と一緒に撹拌し、各層を分離し、水性層を ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ ｍＬ 、次いで酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）５０ ｍＬ で抽出し、有機抽出物を合わせ、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で脱水させ、減圧下（ｒｏｔｏｖａｐ）で蒸発させ、そして残渣を高真空（マニホールド）下で乾燥させて生成物４ ５２０ ｍｇ（ １Ｈ−ＮＭＲ により約 ９０％ の純度であることが示された）を得た。この物質をこれ以上精製することなく次の工程で用いた。
【００８５】
水性クェンチ後の同様な反応の抽出から得られる物質から、１Ｈ−ＮＭＲ により、生成物４が少量の二置換生成物と一緒に ＨＢｒ 塩として存在していることが示された。シリカゲルクロマトグラフィー精製［第１カラム：クロロホルム（ＣＨＣｌ３）中 ２０％ メタノール（ＭｅＯＨ）を溶離液として；第２カラム：ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−アセトン−水（６：１：１：１）を溶離液として］により純粋な生成物４を得た。マススペク：Ｍ−Ｈ、２９２。
【００８６】
６の合成
アルゴン下で且つ〜０℃（アイスバス）に冷却された、脱水 ＣＨ２Ｃｌ２ 中粗生成物４ ５００ ｍｇ およびトリエチルアミン ９５０ μＬ（４ モル当量）の溶液に、トリフルオロ無水酢酸（ＴＦＡＡ）２８９ μＬ（１．２モル当量）を加えた。反応を、一晩撹拌しながら ＲＴ まで昇温させた。反応を ＣＨ２Ｃｌ２ で容量 ５０ ｍＬ に希釈し、水（２×５０ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ． ＮａＨＣＯ３（２×５０ ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ．塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水させ、蒸発させ（ｒｏｔｏｖａｐ）、そして高真空下で乾燥させて粗生成物〜７３０ ｍｇ を得た。この物質を、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン中 ３０％ ＥｔＯＡｃ で溶出して生成物６ ４４９ ｍｇ を薄青色の液体として得た。マススペク（Ｍ＋Ｈ）：実測値、３８９．１４４９；計算値、３８９．１４５０。
【００８７】
８の合成
ＴＨＦ ２ ｍＬ および ３ 規定（３Ｎ）過塩素酸 ２ ｍＬ 中６ ４４５ ｍｇ の溶液を、アルゴン下 ５０ ℃（オイルバス）で、４．５ 時間撹拌した。反応物を水 ７５ ｍＬ 中に流し込み、この混合物を ＥｔＯＡｃ（２×５０ ｍＬ）で抽出を行い、この有機抽出物を水で洗浄し、脱水（Ｎａ２ＳＯ４）させ、そして蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）させて粗生成物 ４１６ ｍｇ を得た。この物質をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、ＣＨ２Ｃｌ２中 ５％ ＭｅＯＨで溶出させ、生成物を含有する分画を合わせ、蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）させ、そして高真空下で乾燥させて生成物８ ３２０ ｍｇ を崩壊性泡状物として得た。低分解能質量分析（Ｌｏｗ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃ）：（Ｍ＋Ｈ）：実測値、３６２．１。高分解能質量分析：（Ｍ＋Ｎａ）：実測値、３８４．１０２４；計算値、３８４．１０３５。
【００８８】
１０の合成
アルゴン下にある脱水 ＣＨ２Ｃｌ２ ２０ ｍＬ 中８ ３１０ ｍｇ の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ２９６ ｍｇ（３ モル当量）で、続いて １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ．ＨＣｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） ３２９ ｍｇ（２ モル当量）で処理し、そのあと ＲＴ で Ｏ．Ｎ． 撹拌した。反応物を水（１×２０ ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ． ＮａＨＣＯ３（２×２０ ｍＬ）、ｓａｔ． ａｑ． ＮａＣｌ（１×２０ ｍＬ）で洗浄し、脱水（Ｎａ２ＳＯ４）させ、そして蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）させた。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン中 ３０％ ＥｔＯＡｃ で溶出を行い、生成物分画を合わせ、そして蒸発（ｒｏｔｏｖａｐ）を行った。残渣を脱水 ＣＨ２Ｃｌ２ 中に再溶解させ且つ再蒸発（×６）させ、次いで高真空下で乾燥させて ＮＨＳ エステル誘導体１０２８０ ｍｇ を白色〜無色崩壊性泡状物として得た。Ｈｉｇｈ Ｒｅｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ：（Ｍ＋Ｈ）：実測値、４５９．１３８１；計算値、４５９．１３７９。
【００８９】
ＭＤＭＡ 免疫原１２（ Ｔ ＝ ＫＬＨ ；１２ａ）の合成
アイス−ウォーターバス中で冷却されている ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ １３ ｍＬ 中キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ） ２２０ ｍｇ の撹拌溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ４．３３ ｍＬ を滴下で加えて、２５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の ＫＬＨ 溶液を得た。１．５８ ｍＬ（タンパク質〜２０ ｍｇ に相当）を、対照として使用するために採取した。残りのものに、ＤＭＳＯ 合計 １．５ ｍＬ 中に溶解された１０ ２６ ｍｇ（ＫＬＨ 中のリシン当たり〜０．６当量）の溶液を加え、〜３１％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の１０と ＫＬＨ との反応を起こさせた。アイスバスを取り外し、反応物（ストッパー付きフラスコ）を一晩撹拌した。乳白灰色の反応物を透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ（３×１．１ Ｌ）、１５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ、そのあと ＫＰｉ（１×２．２ Ｌ／ＲＴ −＞ 〜４ ℃；５×２．２ Ｌ／〜４ ℃）に対して透析を順次行った（全ての ＫＰｉ は ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ であった）。対照用 ＫＬＨ もまた透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、別個に ３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ に対して透析を行い、そのあと １５％ ＤＭＳＯ − ＫＰｉ に下げる時に免疫原と共に同じ透析容器中に入れた。不透析液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）１ ｍＬ をリシン改変の程度を決定するために取り出した。残りのものを、５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３（４×２．２ Ｌ／ＲＴ／２ 日）に対して、そのあと ＫＰｉ（４×２．２ Ｌ／〜４ ℃）に対して透析を行った。アミンの脱保護を、ｐＨ １３ の緩衝液（ＫＯＨ で ｐＨ １３ に塩基性化された５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３ ）に対して ＲＴ で〜７ 日間再透析を行い、そのあと ｐＨ ７．５ の ＫＰｉ ５０ ｍＭ（３ 回交換）中に逆透析を行うことにより完了して ＭＤＭＡ 免疫原 １２（Ｔ ＝ ＫＬＨ；１２ａ）をほとんど無色の透明な溶液として得た。クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）タンパク質アッセイ（改変ブラッドフォードアッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ））（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ））によりタンパク質 １．９ ｍｇ／ｍＬ を得た。脱保護されていない免疫原（上記参照）に関するトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイ（クーマシーブルーアッセイによるタンパク質濃度測定のあと）により、ＫＬＨ 上の利用可能なリシンの ３８％ が改変されていたという結果を得た。
【００９０】
ＭＤＭＡ コンジュゲート１２（ Ｔ ＝ ＢＳＡ ；１２ｂ）の合成
アイスウォーターバス中で冷却されている ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ １１ ｍＬ 中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｐｅｎｔｅｘ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．， Ｋａｎｋａｋｅｅ， ＩＬ， ＵＳＡ）０．５５ ｇ の撹拌溶液に ＤＭＳＯ ４．０ ｍＬ を滴下で加えた。必要な場合対照として用いるために、得られた〜２７％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の ＢＳＡ 溶液から１．３６ ｍＬ（ＢＳＡ 〜０．０５ ｇ を含有している）を抜き出した。残った溶液に、合計 ０．６ ｍＬ の ＤＭＳＯ に溶解されている１０ ８．２ ｍｇ（〜２．４ モル当量）を加え、３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ 中の１０と ＢＳＡ の混合物を得た。アイスウォーターバスを取り外し、反応物をストッパー付きのフラスコ中で一晩撹拌した。この透明な反応物を透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、そして ３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ（１．１ Ｌ）、１５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ／ＲＴ（１．１ Ｌ）、ＫＰｉ／ＲＴ（１×１．１）、次いで ５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３（４×１．１ Ｌ／ＲＴ／２ 日）に対してそのあと ＫＰｉ（４×２．２ Ｌ／〜４ ℃）（全ての ＫＰｉ は ｐＨ ７．５ で ５０ ｍＭ であった）に対して順次透析を行った。対照用 ＫＬＨ もまた透析チュービング（カットオフ ＭＷ １５，０００；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）に移し、そして別個に ３０％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ に対して透析を行い、そのあと １５％ ＤＭＳＯ−ＫＰｉ に下げるときに免疫原と共に同じ透析容器に入れ、そして平行して進めた。ここにおける不透析液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の一部の分析を行ったところ、タンパク質濃度が １８．９ ｍｇ／ｍＬ（クーマシーブルータンパク質アッセイ）であり、ハプテンによる置換が〜１．６（対照 ＢＳＡ に対する、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ＵＶ）であった。アミンの脱保護を、ｐＨ １３ の緩衝液（ＫＯＨ で ｐＨ １３ に塩基性化された５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３）に対して ＲＴ で〜４日間再透析を行い、そのあと ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ（４ 回交換）中に逆透析を行うことで完了し、ＭＤＭＡコンジュゲート１２（Ｔ ＝ ＢＳＡ；１２ｂ）を無色透明な溶液として得た。タンパク質濃度を ＵＶ（コンジュゲートのＯＤ２８０ は、親 ＢＳＡ の ＯＤ２８０［＝ １ ｍｇ／ｍＬ で ０．６］と略同じとした）により測定したところ、約 １．９ ｍｇ／ｍＬ のタンパク質であった。
【００９１】
Ｎ− エチルアンフェタミン１６の合成
ｄ−アンフェタミンサルフェート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）５．０ ｇ を、ＣＨ２Ｃｌ２ １００ ｍＬ および １Ｎ ＮａＯＨ ３０ ｍＬ で処理し、そして１５分間激しく撹拌した。各層を分離し、水性部分を ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ ｍＬ で抽出を行った。有機部分を合わせ、無水 Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水させ、そして減圧下で濃縮してｄ−アンフェタミン不含有塩基１４ ３．６６ｇ を透明な油状物として得た。これを無水 ＤＭＦ ３０ ｍＬ 中に溶解し、臭化エチル ２．９ ｇ で処理し、そして室温で３日間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮して ６．６ ｇ を得、次の工程の原料とした。この生成物は、カラムクロマトグラフィーでは精製するのが困難であるいくらかの出発原料およびジエチル化された副生成物を含んでいる。
【００９２】
１８の合成
無水 ＣＨ２Ｃｌ２ ７５ ｍＬ 中粗 Ｎ−エチルアンフェタミン ６．６ ｇ の溶液をトリエチルアミン １０ ｍＬ で処理した。この混合物をアイスバスで冷却し、無水トリフルオロ酢酸 ４．３ ｍＬ で処理し、そしてアルゴン下室温で一晩撹拌を加えた。この混合物を減圧下で濃縮した。その残渣を ＥｔＯＡｃ ７５ ｍＬ に溶解し、そして飽和 ＮａＨＣＯ３ ３×２５ ｍＬ、Ｈ２Ｏ ２５ ｍＬ、飽和ブライン ２５ ｍＬ で洗浄を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水を行い、そして減圧下で濃縮を行った。この残渣を、溶離液として ３０％ ＥｔＯＡｃ−ヘキサンを用いてシリカゲル ３００ ｇ 上のクロマトグラフィーにかけ、透明な油状物 ４．０ ｇ を得た（これは、前の工程からのジエチル化された副生成物をなおいくらか含んでいた）。これを、溶離液として ５％ ＥｔＯＡｃ−ヘキサンを用いてシリカゲル ２５０ ｇ 上のクロマトグラフィーにかけ、１８ ２．６ ｇ を透明な油状物として得た。
【００９３】
２０の合成
アルゴン下の無水 ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ ｍＬ 中１８ ２．０ ｇ の溶液を、無水コハク酸 １．２ｇ で処理した。この混合物をアイスバスで冷やし、そのあと ＡｌＣｌ３ ４．０ ｇ を少しずつ加えることで処理した。反応物を ０ ℃で２ 時間撹拌し、そのあと室温にて一晩撹拌した。この混合物を、３Ｎ ＨＣｌ １８ ｍＬ を最初はゆっくり加え、そのあと ３０ 分間激しく撹拌することで処理した。各層を分け、有機層を Ｈ２Ｏ ２５ ｍＬ および飽和ブライン ２５ ｍＬ で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして減圧下で濃縮してアンバー色の油状物とした。これを、溶離液として ３％ ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２ を用いてシリカゲル １５０ ｇ 上のクロマトグラフィーにかけることにより２０ ２．６ ｇ をアンバー色の油状物として得た。
【００９４】
２２の合成
５００ ｍＬ のパー（Ｐａｒｒ）ボトルに １０％ Ｐｄ／Ｃ １１５ ｍｇを入れ、続いて酢酸 ３０ ｍＬ 中２０ ６００ ｍｇ の溶液を入れ、そして ５０ ＰＳＩ で １７ 時間水素化を行った。Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商品名 ＣＥＬＩＴＥ で販売されている濾過材（Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から入手可能）を通すことで触媒を濾過分離し、濾液を減圧下で濃縮した。残留酢酸は、トルエン ２５ ｍＬ を用いて ５ 回蒸発を行うことにより追い出した。このトルエンを ＣＨ２Ｃｌ２ を用いた ５ 回の蒸発により追い出して２２ ５７６ ｍｇ をアンバー色の油状物として得た。
【００９５】
２４の合成
アルゴン下の無水 ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ ｍＬ 中２２ ５７６ ｍｇ の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ２６０ ｍｇで処理し、続いて １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ＨＣｌ ４３５ ｍｇ で処理し、そして室温で一晩撹拌を加えた。この混合物を ０．１Ｎ ＨＣｌ ２５ ｍＬ、Ｈ２Ｏ ２５ ｍＬ、飽和 ＮａＨＣＯ３ ２×２５ ｍＬ、飽和ブライン２５ ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして減圧下で濃縮して２４ ７３５ ｍｇ をアンバー色の油状物として得た。
【００９６】
３２の合成
Ｈ２Ｏ ５ ｍＬ 中 ４−（アミノメチル）安息香酸 １０８ ｍｇ と蒸留 ＴＨＦ １０ ｍＬ との混合物を、蒸留 ＴＨＦ １０ ｍＬ 中２４ ３１５ ｍｇ の溶液で、続いて １Ｎ ＮａＯＨ １．２ ｍＬ で処理し、そして室温にて１時間撹拌を加えた。反応物の ｐＨ は９であった。ＴＨＦ を減圧下で除去し、水性残渣を Ｈ２Ｏ ５ ｍＬ で希釈し、そして ６Ｎ ＨＣｌ を用いて ｐＨ ６ に酸性化した。これを、ＥｔＯＡｃ ２×１５ ｍＬ で抽出を行った。この ＥｔＯＡｃ 抽出物を合わせて、無水 Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして真空下で濃縮して３２ ２９０ ｍｇ を白色無定形固体として得た。
【００９７】
３４の合成
アルゴン下の無水 ＣＨ２Ｃｌ２ １０ ｍＬ 中３２ ２７０ ｍｇ の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ８５ ｍｇ で、続いて １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド ＨＣｌ １４０ ｍｇ で処理し、そして室温で一晩撹拌を加えた。この混合物を ＣＨ２Ｃｌ２ １０ ｍＬ で希釈し、０．１Ｎ ＨＣｌ １０ ｍＬ、飽和ブライン １０ ｍＬ、飽和 ＮａＨＣＯ３ ２×１０ ｍＬ、飽和ブライン １０ ｍＬ で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ 上で脱水し、そして減圧下で濃縮して白色無定形固体とした。これを、溶離液として ＥｔＯＡｃ を用いてシリカゲル ８０ ｇ 上のクロマトグラフィーを行い３４ １９０ ｍｇ を白色無定形固体として得た。
【００９８】
Ｎ− エチルアンフェタミン免疫原２６（ Ｑ ＝ ＫＬＨ ２６ａ）の合成
ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ １０ ｍＬ 中精製 ＫＬＨ ３４２ ｍｇ の溶液をアイスバスで冷やし、ＤＭＳＯ ４ ｍＬ を滴下で加えることで処理した。１．７ ｍＬ を採りだし、これを参照として用いた。これにより ＫＬＨ ３００ ｍｇ が溶液に残った。このあとこれを ＤＭＳＯ １．０ ｍＬ 中２４ ５０ ｍｇ の溶液を滴下で加えることで処理した。この反応物を室温で一晩撹拌した。この反応物と前記参照サンプルを別々の １０，０００ ＭＷ カットオフ透析チュービング（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）の中に入れ、室温にあるｐＨ ７．５ の ３３％ ＤＭＳＯ−５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中で、３ 回交換（３ ｃｈａｎｇｅｓ）、少なくともそれぞれ ３ 時間、最後の１つは一晩の透析を行った。このあとこれを、２０％ ＤＭＳＯ １ リットル、１０％ ＤＭＳＯ １ リットル、１００％ ＫＰｉ １ リットル中の降下勾配を用いて、室温 ｐＨ ７．５ でそれぞれ少なくとも ３ 時間透析を行った。バッグをこのあと ５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３（ｐＨ １１．４）１ リットル中に入れ、４０ ℃で ４ 日間（２ 日目に１度交換を行った）透析を行った。これをこのあと ５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中、４ ℃ ｐＨ ７．５ で、各回それぞれ少なくとも ６ 時間の ６ 回交換で透析した。クーマシーブルータンパク質アッセイにより、タンパク質濃度 ８．１６ ｍｇ／ｍＬ の結果を得る。保護サンプルに関するトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイにより、利用可能なリシンの ４１．４％ が改変されていたという結果を得る。
【００９９】
Ｎ− エチルアンフェタミンコンジュゲート２６（ Ｑ ＝ ＢＳＡ ；２６ｂ）の合成
ｐＨ ７．５ の ５０ ｍＭ ＫＰｉ ８ ｍＬ 中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ 改質粉末（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｗｄｅｒ）；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｕｒｃｈａｓｅ， ＮＹ， ＵＳＡ） ５００ ｍＬ の溶液をアイスバスで冷やし、 ＤＭＳＯ １１ ｍＬ をゆっくり滴下で加えることで処理した。これをこのあと ＤＭＳＯ １ ｍＬ 中２４ ６．７ ｍｇ の溶液を滴下で加えることにより処理し、そして室温で一晩撹拌した。この混合物を １０，０００ ＭＷ カットオフ透析チュービング（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ７）の中に入れ、室温で ｐＨ ７．５ の ６０％ ＤＭＳＯ−５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中で、各回それぞれ少なくとも ３ 時間の ３ 回交換で且つ最後の１回は１晩、透析を行った。これをそのあと、室温で ｐＨ ７．５ にある ４０％ ＤＭＳＯ １ リットル、２０％ ＤＭＳＯ １ リットル、１０％ ＤＭＳＯ １ リットルおよび １００％ ５０ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中の降下勾配を用いて、それぞれ少なくとも ３ 時間透析した。これを次に ５０ ｍＭ Ｋ２ＣＯ３ １ リットル（ＫＯＨ で ｐＨ １３ に調整されている）中で ４ 日間、緩衝液の交換 ４ 回で透析した。これをこのあと ４ ℃で ｐＨ７．５ にある ５０ ｍＭ ＫＰｉ １ リットル中で、各回それぞれ少なくとも ６ 時間の ６回交換で透析した。クーマシーブルータンパク質アッセイによりタンパク質濃度 １２．２ ｍｇ／ｍＬ の結果を得た。
【０１００】
ＭＤＭＡ 免疫原を用いた、エクスタシー薬物に対するハイブリドーマの開発
免疫化
１８〜２４週齡の ＢＡＬＢ／ｃ 雌のマウスを１２（Ｔ ＝ ＫＬＨ；１２ａ）で免疫化した。免疫原はフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）中に乳化し、腹腔内（ＩＰ）注射により投与した。注射は２１日以上の間隔で行い、典型的には、生理食塩水が ５０％ 、アジュバント乳濁液が ５０％ で構成される １００ μＬ 中に当該コンジュゲート ５０ μｇを含む。完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を１次免疫に用い、不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）をそのあと用いた。融合の ４ 日前に、同じ乳濁液中のブースター免疫 ５０ μｇ を ＩＰ 投与した。
【０１０１】
融合：
融合を行うその日にマウスを頚椎脱臼により絶命させ、血液サンプルを採取した。脾臓および膝窩、鼠径、鎖骨下ならびに深鎖骨下リンパ節を回収、貯留した。これらを２枚の滅菌スライドグラスの間ですり潰しリンパ球をリリースさせた。得られたリンパ球の半分は Ｆ０ 骨髄腫細胞株と融合させるのに使い、残りの半分は Ｐ３ 骨髄腫細胞と融合させた（両骨髄腫細胞とも ＡＴＣＣ から入手）。
【０１０２】
融合は、骨髄腫細胞の添加（リンパ球の数の １／５）、遠心沈殿法による洗浄、無血清加温アイスコブ変法ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉａ）中への再懸濁、および再遠心分離により行った。得られたペレットが入っている遠心分離管を軽く叩いて細胞を解し、そのあと加温した ＰＥＧ／ＤＭＳＯ 溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１ ｍＬ を穏やかにかき混ぜながらゆっくりと加えた。これらの細胞を加温条件下に １．５ 分間保持し、そしてこのあと予備加温された無血清 ＩＭＤＭ を以下：１ ｍＬ／ｍｉｎ、２ ｍＬ／ｍｉｎ、４ ｍＬ／ｍｉｎ、１０ ｍＬ／ｍｉｎ、の速度で加え、そして遠心分離管を ５０ ｍＬ まで満たし、密封し、そして １５ 分間インキュベートした。この細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを静かに別の容器に移し、１０％ ウシ胎仔血清を含んでいる ＩＭＤＭ を加えた。これらの細胞をもう一度遠心分離にかけ、そして完全クローニング培地中に再懸濁させた。これは、ＩＭＤＭ、１０％ ＦＣＳ、１０％ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）、４ ｍＭ グルタミン、５０ μＭ ２−メルカプトエタノール、４０ μＭ エタノールアミン、および ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ 抗生物質から構成される。細胞を密度 ４ｘ１０５ リンパ球／ｍＬ で懸濁させ、１００ μＬ／ウェルを滅菌 ９６−ウェル無菌ミクロ培養プレート中に分注し、５％ 二酸化炭素中 ３７ ℃で ２４ 時間インキュベートした。次の日、ＨＭＴ 選択培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手のクローニング培地 ＋ １：２５ ＨＭＴ サプリメント）１００ μＬ を加えた。インキュベーションの ６ 日目の日、低真空源に連結さた滅菌 ８ 分岐マニホールドを用いてそれぞれのウェルから培地約 １５０ μＬ を採取した。ＨＴ 培地 １５０ μＬをそのあと加えた。これはクローニング培地（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ） ＋ １：５０ ＨＴ サプリメントからなる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。プレートをインキュベーターに戻し、増殖の兆候について毎日検査した。増殖が十分であると判断されたとき、ウェルを ＥＬＩＳＡ により抗体産生に関しスクリーニングした。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ スクリーニング：
ミクロプレートを濃度 １ ｍｇ／ｍＬ でメチレンジオキシメトアンフェタミン−ＢＳＡ コンジュゲート１２（Ｔ ＝ ＢＳＡ；１２ｂ）１００ μＬ でコーティングし、別のプレートを濃度 １ ｍｇ／ｍＬ でメトアンフェタミン−ＢＳＡ（ＭＡＭＰ−ＢＳＡ）２８
【化９】
【化１０】
【０１０４】
プレートをカバーしたまま ３７ ℃（加湿されている）で １ 時間インキュベートした。そのあとプレートを空にし、Ｔｒｉｓ 緩衝液、１％ ゼラチン水解物、２％ スクロース、および ０．１７％ Ｔｗｅｅｎ−２０（全ての試薬は Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から入手）からなるポストコーティング溶液（ｐｏｓｔ−ｃｏａｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で満たした。プレートをさらに １ 時間 ３７ ℃（加湿されている）でカバーしたままインキュベートし、そのあと ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。そのあとプレートを ｐＨ ７．２〜７．４ にある ０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ中 ２％ スクロース溶液で一時的に満たし、次いで空にし、そして室温で空気乾燥させた。乾いたあと、プレートをいくつかの乾燥剤ピロー（ｐｉｌｌｏｗｓ）が入っているジップロックバッグ（ｚｉｐ−ｌｏｃｋ ｂａｇ）の中にパックし、密封し、そして使用の時まで ４ ℃ で保存した。
【０１０５】
一次融合スクリーニング
融合プレートからの増殖中のクローンの一次スクリーニングには、ＭＤＭＡ−ＢＳＡ（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）でコーティングされたプレートのみを使用した。ＰＢＳ ５０ マイクロリットルを各ウェルに加えたあと、融合プレート上のウェルからの培地のサンプル ５０ μＬ を加え、ＰＢＳ 中に １：１０ に希釈した。プレートを ３７ ℃ で １ 時間カバーしたままインキュベートし、そのあと ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で洗浄した。次いでウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ 中に希釈されたヤギ抗マウス ＩｇＧ−ＨＲＰ コンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ）１００ μＬで満たし、プレートを １ 時間再度インキュベートした。プレートをこのあと再度洗浄し、Ｋ−Ｂｌｕｅ 基質（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）１００ μＬ を加えた。これを ５〜１５ 分間成長させ、反応を １ Ｎ ＨＣｌ １００ μＬ を加えることにより停止させた。色を ４５０ ｎｍ のミクロプレート読み取り機により読み取り、コンピューターによりデータ収集して分析した。ＭＤＭＡ−ＢＳＡ（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）に結合している抗体の存在を示したウェルを選択しその次の処理を行う。細胞に限界希釈サブクローニングを行い、増殖が出現した時点で、二次スクリーニングにより検定を行った。
【０１０６】
二次スクリーニング
ＭＤＭＡ−ＢＳＡ コンジュゲート（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）でコーティングされた４枚のプレートに、１枚のプレートのウェルに ５０ μＬ のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２枚目のプレートに遊離 ＭＤＭＡの溶液（８００ ｎｇ／ｍＬ） ５０ μＬ 、３枚目のプレートに ＭＤＥＡの溶液（８００ ｎｇ／ｍＬ） ５０ μＬ 、４枚目のプレートにプソイドエフェドリンの溶液（８ μｇ／ｍＬ） ５０ μＬ を加えて準備した。全ての薬物は ＰＢＳ 中に溶解した。ＭＡＭＰ−ＢＳＡ（２８）および ＡＭＰ−ＢＳＡ（３０）でコーティングされたプレートのウェルに ＰＢＳ ５０μＬ を加える。
【０１０７】
増殖段階にあるサブクローンが検定可能と判断された時点で、ウェルから上澄み ２５ μＬ を採取し、９６−ウェルフレキシブルプレートに移した。それぞれのウェルに培養液を加えて培養サンプルの １：１０ の希釈とした。この希釈サンプルの５０ μＬ を上記のコーティングされたプレートのそれぞれに移した。以降の処理は１次スクリーニングの場合と全く同じであった。選択の基準は、ＭＤＭＡ−ＢＳＡ（メチレンジオキシメトアンフェタミン−ＢＳＡ）コンジュゲート（１２；Ｔ ＝ ＢＳＡ， １２ｂ）との結合、および遊離の ＭＤＭＡ および／または ＭＤＥＡによる阻害の徴候、およびプソイドエフェドリンによる阻害がほとんどないしは全くないことであった。ＡＭＰ−ＢＳＡ（３０）および ＭＡＭＰ−ＢＳＡ コンジュゲート（２８）との結合は参考のためだけであった。
【０１０８】
選択されたクローンを直ちにサブクローニングし、そして可能となった時点で、二次スクリーニング手順により再検定した。安定サブクローンを増殖させ、凍結させ、費やした培地を使って交差反応性アッセイにより特異性を測定した。サブクローンは、親クローンの名称の後にサフィックス「．」を加えることにより識別されており、また数字は選択の順番を表わす。
【０１０９】
表４はこのスクリーニング結果の一部を示す。
【０１１０】
【表１】
交差反応性アッセイ
上澄みを順次希釈していき、上記のＥＬＩＳＡスクリーニングで再検定した。最大 ＯＤ から約 ５０％ の低下を与える希釈を選択して交差反応性試験に進めた。これは、先のアッセイを、選択された希釈にある抗体を用いてまた各種濃度の薬物の存在下で繰り返すことで行った。図５および図６に示されているチャートはこのような測定の結果を表わしている。
【０１１２】
Ｎ− エチルアンフェタミン免疫原を用いた、エクスタシー薬物に対するハイブリドーマの開発
免疫化
週齡 １８〜２４ のＳＪＬ 雌マウスを改変 ＲＩＭＭＳ 法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＩＭＭＳ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １９９７， １６：４， ｐｐ． ３８１−３８９）により免疫化した。簡潔に述べると、免疫原２６（Ｑ ＝ ＫＬＨ， ２６ａ）
【化１１】
【０１１３】
融合
１３ の日に全採血により２匹のマウスを絶命させた。膝窩、鼠径、鎖骨下および深鼠径のリンパ節を回収し、貯留した。これらのリンパ節を２枚のスライドグラスに挟んですり潰してリンパ球をリリースした。得られたリンパ球懸濁液の半分を使って Ｆ０ 骨髄腫細胞株と融合させた。残りの半分を Ｐ３ 骨髄腫細胞（両骨髄腫細胞は ＡＴＣＣ から入手した）と融合させた。
【０１１４】
融合は、骨髄腫細胞の添加（リンパ球数の１／５）、遠心分離による洗浄、無血清加温アイスコブ変法ダルベッコ培地中への再懸濁、および再遠心分離により行った。得られたペレットが入っている遠心分離管を軽く叩いて細胞を解し、そのあと加温した ＰＥＧ／ＤＭＳＯ 溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１ ｍＬ を穏やかにかき混ぜながらゆっくりと加えた。細胞を加温条件下に １．５ 分間保持し、そしてこのあと予備加温された無血清 ＩＭＤＭ を以下：１ ｍＬ／ｍｉｎ、２ ｍＬ／ｍｉｎ、４ ｍＬ／ｍｉｎ、および１０ ｍＬ／ｍｉｎ、の速度で加えた。そして遠心分離管を ５０ ｍＬ まで満たし、密封し、そして １５ 分間インキュベートした。この細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを静かに別の容器に移し、１０％ ウシ胎仔血清を含んでいる ＩＭＤＭ を加えた。細胞をもう一度遠心分離にかけ、そして完全クローニング培地中に再懸濁させた。これは、ＩＭＤＭ、１０％ ＦＣＳ、１０％ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）、４ ｍＭ グルタミン、５０ μＭ ２−メルカプトエタノール、４０ μＭ エタノールアミン、および ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ 抗生物質から構成される。細胞を密度 ４×１０５ リンパ球／ｍＬ で懸濁させ、１００ μＬ／ウェルを滅菌 ９６−ウェル無菌ミクロ培養プレート中に分注し、５％ ＣＯ２ 中 ３７ ℃で ２４ 時間インキュベートした。次の日、ＨＭＴ 選択培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ から入手のクローニング培地 ＋ １：２５ ＨＭＴ サプリメント）１００ μＬ を加えた。インキュベーションの ６ 日目の日、低真空源に連結さた滅菌 ８ 分岐マニホールドを用いてそれぞれのウェルから培地約 １５０ μＬ を採取した。ＨＴ 培地 １５０ μＬをそのあと加えた。これは クローニング培地（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ） ＋ １：５０ ＨＴ サプリメントからなる（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。プレートをインキュベーターに戻し、増殖の兆候について毎日検査した。増殖が十分であると判断されたとき、ウェルを ＥＬＩＳＡ により抗体産生に関しスクリーニングした。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡ スクリーニング：
３７ ℃（加湿されている）で １ 時間かけて、ｐＨ ９．５ の ０．１ Ｍ 炭酸塩緩衝液中濃度 １ μｇ／ｍＬ にあるメトアンフェタミン−ＢＳＡ コンジュゲート２８ １００ μＬ でミクロプレートを、また同じく Ｎ−エチルアンフェタミン−ＢＳＡ２６（Ｑ ＝ ＢＳＡ、２６ｂ）１００ μＬ で別のプレートをコーティングした。その後プレートを空にし、そしてＴｒｉｓ 緩衝液、１％ ゼラチン水解物、２％ スクロース、および ０．１７％ Ｔｗｅｅｎ−２０（全ての試薬は Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から入手）からなるポストコーティング溶液（ｐｏｓｔ−ｃｏａｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で満たした。プレートをさらに １ 時間 ３７ ℃（加湿されている）でインキュベートし、そのあと ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。そのあとプレートを ｐＨ ７．２〜７．４ にある ０．１５ Ｍ Ｔｒｉｓ 中 ２％ スクロース溶液で一時的に満たし、次いで空にし、そして室温で空気乾燥させた。乾いたあと、プレートをいくつかの乾燥剤ピロー（ｐｉｌｌｏｗｓ）が入っているジップロックバッグの中にパックし、密封し、そして使用の時まで ４ ℃ で保存した。
【０１１６】
増殖段階にあるクローンが検定可能と判断された時点で、ウェルから上澄み ２５ μＬ を採取し、９６−ウェルフレキシブルプレートに移した。それぞれのウェルに培地を加えて培養サンプルの １：１０ の希釈とした。この希釈サンプルの １００ μＬ を上記のコーティングされたプレートのそれぞれに移した。プレートを ３７ ℃ で １ 時間カバーしたままインキュベートし、そのあと ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次いでウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ 中に希釈されたヤギ抗マウス ＩｇＧ−ＨＲＰ コンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ）１００ μＬで満たし、プレートを １ 時間再インキュベートした。プレートをこのあと再度洗浄し、Ｋ−Ｂｌｕｅ 基質（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）１００ μＬ を加えた。これを ５〜１５ 分間成長させ、反応を １ Ｎ ＨＣｌ １００ μＬ を加えることにより停止させた。色を ４５０ ｎｍ でミクロプレート読み取り機により読み取り、コンピューターによりデータ収集して分析した。選択の基準はメトアンフェタミン−ＢＳＡ コンジュゲート２８との結合であった。表５は、メト−ＢＳＡ ２８ および ＮＥＡＭＰ−ＢＳＡ ２６（Ｑ ＝ ＢＳＡ， ２６ｂ）でコーティングされたプレートのスクリーニングの一部に対する結合データを示している。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
交差反応性アッセイ
上澄みを順次希釈していき、上記のＥＬＩＳＡスクリーニングで再検定した。最大 ＯＤ から約 ５０％ の低下を与える希釈を選択して次の交差反応性試験に進んだ。これは、先のアッセイを、選択された希釈にある抗体を用いてまた各種濃度の薬物の存在下で繰り返すことで行った。図７に示されているチャートはこのような測定の結果を表わし、表３（上記参照）は測定された交差反応性のパーセントを示す。
【０１１９】
ここまでの詳細な説明および実施例は説明と例示のために提供したものであり、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。当業者には、本明細書中で例示された本発明の好ましい実施形態の多くの変形が明らかであり、そしてそれらは本特許請求の範囲およびそれに相当するものの中に入る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の特徴を具現する化合物および免疫原を合成するための第１の代表的なスキームを示す図である。
【図２】
本発明の特徴を具現する化合物および免疫原を合成するための第２の代表的なスキームを示す図である。
【図３】
本発明の特徴を具現する化合物を合成するための第３の代表的なスキームを示す図である。
【図４】
本発明の特徴を具現する抗体の交差反応性データの表を示す図である。
【図５】ＭＤ クラスの薬物のメンバーによる、本発明の特徴を具現する抗体の競合阻害のＥＬＩＳＡプロットを示す図である。
【図６】
関連薬物誘導体による、本発明の特徴を具現する抗体の競合阻害のＥＬＩＳＡプロットを示す図である。
【図７】
各種薬物による、本発明の特徴を具現する抗体の競合阻害のＥＬＩＳＡプロットを示す図である。
【図８】
本発明の特徴を具現するコンジュゲートおよび抗体を用いて得られた曲線のデータを示す図である。
Claims (45)
- 構造
Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；
Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；
Ｒ３ は置換されていてもよいアルキル基であり；そして
Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ であり；
Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含み；
Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択され（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）；そして
Ｑ は、水素、ヒドロキシル、脱離基、マクロ分子キャリヤー、および標識から構成される群から選択される］
を有する化合物。 - 前記マクロ分子キャリヤーが、タンパク質、ポリペプチド、および多糖類から構成される群から選択される、請求項１に記載の化合物。
- 前記タンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、およびウシサイログロブリンから構成される群から選択される、請求項２に記載の化合物。
- Ｒ２ が保護基または水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｌ が １〜１１ 個の炭素原子を含む、請求項４に記載の化合物。
- Ｌ が−（ＣＨ２）ｊ−であり、ｊ が１、２、３、４、５、または ６ である、請求項５に記載の化合物。
- ｊ が ３ であり、Ｘ が−ＣＯ−である、請求項６に記載の化合物。
- Ｒ１ がエチル、ｎ−プロピル、およびｎ−ブチルから構成される群から選択され、Ｒ３ がメチル、エチル、ｎ−プロピル、およびｎ−ブチルから構成される群から選択される、請求項７に記載の化合物。
- Ｑ が脱離基である、請求項７に記載の化合物。
- Ｒ１ がエチルであり、Ｒ３ がメチルである、請求項７に記載の化合物。
- Ｑ が脱離基である、請求項１０に記載の化合物。
- Ｑ がＮ−オキシスクシンイミドを含む脱離基である、請求項７に記載の化合物。
- Ｑ がＮ−オキシスクシンイミドを含む脱離基である、請求項１０に記載の化合物。
- Ｑ が、ヘモシアニン、グロブリン、アルブミン、および多糖類から構成される群から選択されるマクロ分子キャリヤーである、請求項７に記載の化合物。
- Ｑ が、ヘモシアニン、グロブリン、アルブミン、および多糖類から構成される群から選択されるマクロ分子キャリヤーである、請求項１０に記載の化合物。
- ＭＤＥＡ に特異的な抗体。
- 構造
Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；
Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；
Ｒ３ は置換されていてもよいアルキル基であり；そして
Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ であり；
Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含み；
Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択され（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）；そして
Ｑ は、水素、ヒドロキシル、脱離基、マクロ分子キャリヤー、および標識から構成される群から選択される］
を含む検体に特異的な抗体。 - 前記マクロ分子キャリヤーが、タンパク質、ポリペプチド、および多糖類から構成される群から選択される、請求項１７に記載の抗体。
- 前記タンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、およびウシサイログロブリンから構成される群から選択される、請求項１７に記載の抗体。
- Ｒ２ が保護基または水素である、請求項１７に記載の抗体。
- Ｌ が １〜１１ 個の炭素原子を含む、請求項２０に記載の抗体。
- Ｌ が−（ＣＨ２）ｊ−であり、ｊ が１、２、３、４、５、または ６ である、請求項２１に記載の抗体。
- ｊ が ３ であり、Ｘ が−ＣＯ−である、請求項２２に記載の抗体。
- Ｒ１ がエチル、ｎ−プロピル、およびｎ−ブチルから構成される群から選択され、Ｒ３ がメチル、エチル、ｎ−プロピル、およびｎ−ブチルから構成される群から選択される、請求項２３に記載の抗体。
- Ｒ１ がエチルであり、Ｒ３ がメチルである、請求項２３に記載の抗体。
- Ｑ が、ヘモシアニン、グロブリン、アルブミン、および多糖類から構成される群から選択されるマクロ分子キャリヤーである、請求項２３に記載の抗体。
- Ｑ が、ヘモシアニン、グロブリン、アルブミン、および多糖類から構成される群から選択されるマクロ分子キャリヤーである、請求項２５に記載の抗体。
- 請求項１６に記載の抗体を含む試薬キット。
- 請求項１７に記載の抗体を含む試薬キット。
- 請求項２７に記載の抗体を含む試薬キット。
- 宿主に、構造
Ｒ１ は ２〜６ 個の炭素原子を含むアルキル基であり；
Ｒ２ は、水素、アルキル基、および保護基から構成される群から選択され；
Ｒ３ は置換されていてもよいアルキル基であり；そして
Ｚ は −Ｌ−Ｘ−Ｑ であり；
Ｌ は １〜１５ 個の炭素原子および ０〜６ 個のヘテロ原子を含み；
Ｘ は、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＳ）−、−ＮＨ（ＣＳ）ＮＨ−、−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、およびマレイミドチオエーテルから構成される群から選択され（式中 Ｒ４ は、水素およびアルキル基から構成される群から選択される）；そして
Ｑ はマクロ分子キャリヤーである］
を含む免疫原を接種する段階を有することを特徴とする抗体の製造方法。 - Ｒ２ が保護基または水素である、請求項３１に記載の方法。
- Ｌ が １〜１１ 個の炭素原子を含む、請求項３２に記載の方法。
- Ｌ が−（ＣＨ２）ｊ−であり、ｊ が１、２、３、４、５、または ６ である、請求項３３に記載の方法。
- ｊ が ３ であり、Ｘ が−ＣＯ−である、請求項３４に記載の方法。
- Ｒ１ がエチル、ｎ−プロピル、およびｎ−ブチルから構成される群から選択され、Ｒ３ がメチル、エチル、ｎ−プロピル、およびｎ−ブチルから構成される群から選択される、請求項３５に記載の方法。
- Ｒ１ がエチルであり、Ｒ３ がメチルである、請求項３５に記載の方法。
- Ｑ が、ヘモシアニン、グロブリン、およびアルブミンから構成される群から選択されるマクロ分子キャリヤーである、請求項３５に記載の方法。
- Ｑ が、ヘモシアニン、グロブリン、およびアルブミンから構成される群から選択されるマクロ分子キャリヤーである、請求項３７に記載の方法。
- サンプル中の検体を検出する方法であって：
サンプルを請求項１６に記載の抗体と接触させる段階；
抗体を検体と結合させる段階；および
抗体および検体により生成された付加生成物を検出する段階、
を有することを特徴とする上記方法。 - 前記検体が、アンフェタミン、アンフェタミン誘導体、エクスタシー薬物、エクスタシー薬物誘導体、ならびにこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項４０に記載の方法。
- 前記エクスタシー薬物がＭＤＥＡである、請求項４１に記載の方法。
- サンプル中の検体を検出する方法であって：
サンプルを請求項１７に記載の抗体と接触させる段階；
抗体を検体と結合させる段階；および
抗体および検体により生成された付加生成物を検出する段階、
を有することを特徴とする上記方法。 - 前記検体が、アンフェタミン、アンフェタミン誘導体、エクスタシー薬物、エクスタシー薬物誘導体、ならびにこれらの組み合わせから構成される群から選択される、請求項４３に記載の方法。
- 前記エクスタシー薬物がＭＤＥＡである、請求項４４に記載の方法。
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