JP2004037374A

JP2004037374A - クロマトグラフデータ処理装置

Info

Publication number: JP2004037374A
Application number: JP2002197407A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Kihara; 木原　隆幸
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2002-07-05
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2004-02-05

Abstract

【課題】ピーク保持時間やその許容幅を用いることなく複数の試料のピーク同士の成分の同一性を判定することができるデータ処理装置を提供する。
【解決手段】複数試料のクロマトグラムピークにおけるスペクトルの代表同士を比較し、所定の類似度閾値を上回ったものの中から最も類似度の高いスペクトルに対応するクロマトグラムピーク同士が同一成分によるピークであると判定する。更に、あらかじめレファレンスに登録された既知の成分のスペクトルと上記ピークの代表スペクトルとを比較することによってピーク成分を同定するようにしてもよい。
【選択図】　図５

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）装置などのクロマトグラフ装置において、検出されるクロマトグラムのピークを同定するための、或いは複数の試料のクロマトグラムのピーク成分の同一性を判定するための、データ処理装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のクロマトグラフ装置においては、クロマトグラムのピークに対応する成分を同定するために、予め標準ピーク保持時間及びその許容幅と成分の対応表（成分テーブル）を作成していた。また、複数試料に対して測定を行い、試料同士の含有成分や含有量の比較を行う場合には、試料ごとに成分テーブルとの比較を行っていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、このような成分テーブルを用いたピーク成分の同定方法には、以下の問題があった。
まず、クロマトグラム上の近接した位置にピークが現れる複数の成分が試料に含まれている場合、あるいはそのような複数の成分のいずれかが試料に含まれている場合には、ピーク保持時間とその許容幅からは正しくピーク成分を同定することが困難であった。その結果、あるピークを誤って実際とは異なる成分のピークとしてしまうことや、異なる成分に由来する複数のピークが重なっているものを１つのピークとしてしまうことがあった。
【０００４】
また、共存成分の影響や試料注入量の多寡により、クロマトグラムピークはシフトすることがある。この場合、成分テーブルの標準ピーク保持時間とのずれが生じ、ピークと成分との自動割り当てが行えないため、測定したクロマトグラムピークの保持時間に応じて成分テーブルの保持時間を適宜調整し、再度割り当て処理を行わなければならなかった。
【０００５】
一方、複数の試料を測定する際に、単に試料同士を比較してそれらに含有される成分の同一性のみを調べればよく、含まれる成分を同定する（成分名を決定する）必要まではないこともある。例えば、水のサンプルが複数ある場合、その成分を同定しなくとも、同じ成分が含まれているかどうかさえ分かれば、それらのサンプル同士が同じ水源から得られたものかどうかを知ることができる。しかし、従来の方法では、そのような場合でも各試料毎に同定テーブルとの比較を行い、含まれる成分を同定しなければ、試料同士の同一性を判定することができなかった。この場合、上記の原因によってクロマトグラムのピーク成分を誤って同定したり、或いは同定することができなかった場合、試料同士の同一性を正しく判定することもできない。
【０００６】
本発明はこのような課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、第１に、ピーク保持時間とその許容幅を用いることなくクロマトグラムピークに対応する成分を同定することができるデータ処理装置を提供することにある。第２に、ピーク保持時間とその許容幅を用いることなく、複数の試料のピーク同士の成分の同一性を判定することができるデータ処理装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明に係るクロマトグラフデータ処理装置の第１の態様は、
ａ）カラムから溶出する試料について逐次スペクトルを採取するスペクトル採取手段と、
ｂ）採取されたスペクトルからクロマトグラムを作成し、ピークを検出するピーク検出手段と、
ｃ）既知の成分のスペクトルであるレファレンススペクトルを記憶するレファレンススペクトル記憶手段と、
ｄ）検出されたピークに属するスペクトルの中からピーク代表スペクトルを決定する代表スペクトル決定手段と、
ｅ）ピーク代表スペクトルとレファレンススペクトルとの類似度を算出するスペクトル類似度算出手段と、
ｆ）目的ピークのピーク代表スペクトルとの類似度が所定の閾値を超えるレファレンススペクトルのうち最も類似度が高いものに対応する成分を、該目的ピークの成分と同定するピーク同定手段と、
を備えることを特徴とする。
【０００８】
本発明に係るクロマトグラフデータ処理装置の第２の態様は、
ａ）カラムから溶出する試料について逐次スペクトルを採取するスペクトル採取手段と、
ｂ）採取されたスペクトルからクロマトグラムを作成し、ピークを検出するピーク検出手段と、
ｃ）検出されたピークに属するスペクトルの中からピーク代表スペクトルを決定する代表スペクトル決定手段と、
ｄ）ピーク代表スペクトルを記憶する代表スペクトル記憶手段と、
ｅ）２つのピーク代表スペクトルの類似度を算出するスペクトル類似度算出手段と、
ｆ）第１の試料の目的ピークのピーク代表スペクトルとの類似度が所定の閾値を超える第２の試料のピーク代表スペクトルのうち最も類似度が高いものに対応するピークを、該目的ピークと同一成分によるピークであると判定する同一ピーク判定手段と、
を備えることを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
第１の態様のクロマトグラフ測定装置では、カラムから溶出する試料について、スペクトル採取手段が逐次スペクトルを採取する。スペクトルは、吸収スペクトル・反射スペクトルのいずれでも構わない。ピーク検出手段は、採取された多数のスペクトルからまずクロマトグラムを作成する。例えば、各スペクトルの所定波長範囲内の強度積分値を時間軸に対してプロットすることによりクロマトグラムを作成することができるが、その他の方法でも構わない。ピーク検出手段は、更に、こうして得られたクロマトグラムから所定の基準によりピークを検出する。この基準としては、従来より知られている閾値法や傾斜法（微分法）等を用いることができる。代表スペクトル決定手段は、こうして検出されたピークに属するスペクトルの中から、そのピークの代表スペクトルを決定する。その方法には、ピークトップの保持時間におけるスペクトルを選択する方法や、そのピークに属する全スペクトルの各波長毎の時間平均をとったものを選択する方法等がある。
【００１０】
レファレンススペクトル記憶手段には既知の成分のスペクトルであるレファレンススペクトルが記憶されている。多くの場合、複数の成分のレファレンススペクトルが記憶されているが、特殊な用途の場合には、単一の成分のレファレンススペクトルが記憶されているだけであってもよい。
【００１１】
スペクトル類似度算出手段は、ピーク代表スペクトルとレファレンススペクトルと間の類似度を算出する。この計算には、例えば特開昭６１−１１１４２５号公報に記載されている方法を用いることができる。その概略は以下の通りである。目的とするスペクトル中のｎ種類の波長λｋ（ｋは１〜ｎの整数）における強度Ｉｋを成分とするｎ次元ベクトルを定義する。代表スペクトルにより定義されるｎ次元ベクトルとレファレンススペクトルにより定義されるｎ次元ベクトルとの内積を両ベクトルの大きさの積で除したものをスペクトル類似度とする。両スペクトルが完全に一致した場合、スペクトル類似度は１となる。
【００１２】
ピーク同定手段は、スペクトル類似度算出手段を用いて未知試料のクロマトグラムの目的とするピークの代表スペクトルとレファレンススペクトル記憶手段に記憶されているレファレンススペクトルとの間の類似度を算出し、その類似度が所定の閾値を超えるレファレンススペクトルのうち、最も類似度の高いものに対応する成分を、その目的ピークの成分と同定する。目的ピークの代表スペクトルとの類似度が所定の閾値を超えるレファレンススペクトルが１つしかなかった場合、当然、そのレファレンススペクトルに対応する成分が目的ピークの成分であると同定される。また、所定の閾値を超える類似度を持つレファレンススペクトルが存在しなかった場合には、そのピークの成分は同定されない。目的ピークの代表スペクトルと比較されるレファレンススペクトルは、レファレンススペクトル記憶手段に記憶されている全てのレファレンススペクトルとしてもよいが、別の情報によりその範囲が限定され得る場合には、限定された範囲内のレファレンススペクトルとの類似度だけを算出するようにしてもよい。
【００１３】
第２の態様のクロマトグラフ測定装置では、複数の試料のピーク同士の成分の同一性を判定する。各試料の代表スペクトルの決定までは上記と同様である。ただし、レファレンススペクトル記憶手段は使用せず、代わりに、ピーク代表スペクトルを記憶する手段を設ける。
【００１４】
同一ピーク判定手段は、第１の試料のスペクトルの目的とするピークの代表スペクトルと第２の試料の各ピークのピーク代表スペクトルの類似度をスペクトル類似度算出手段を用いて算出し、所定値を超える類似度の中で最大のものに対応する第２の試料のピークを、第１の試料の目的ピークと同一成分によるものであると判定する。上記同様、所定値を超える類似度が１つしかなければ、それに対応する第２の試料のピークが、第１の試料の目的ピークと同一成分によるものであると判定され、所定値を超える類似度が１つもなければ、第１の試料の目的ピークと同一成分によるピークは第２の試料には無いと判定される。前記のように試料同士の成分の同一性さえ分かればよい場合は、ここまでの操作によってその目的を達することができる。
【００１５】
なお、第２の試料に同一成分によるピークが無いと判定された場合、上記第１の態様のクロマトグラフ測定装置と同様に、レファレンススペクトル記憶手段を使用し、そこに記憶されているレファレンススペクトルと比較することにより、成分を同定してもよい。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の第１の態様によれば、ピーク保持時間ではなくスペクトルによりピーク成分を同定するため、クロマトグラム上の近接した位置に複数のピークが現れる場合等においても、誤って近接ピークの成分と同定することがない。また、共存成分の影響や試料注入量の多寡等によりクロマトグラムピークがシフトしても、ピーク成分を正しく同定することができる。
【００１７】
本発明の第２の態様によれば、複数の試料のピーク成分の同一性を判定する際に、各試料のピーク成分を同定することなく、各試料のスペクトルのピーク同士を直接比較するため、ピーク成分の同定の際の誤りの可能性が排除され、より高い確率で同一性を正しく判定することができるようになる。
【００１８】
【実施例】
本発明の一実施例である高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）装置の概略を図１に示す。溶離液槽１１からポンプ１２により吸引された溶離液（移動相）に、インジェクタ１３で分析対象の試料液が注入され、分離カラム１４へと送り込まれる。試料中の各成分が分離カラム１４を通過する時間（保持時間）は成分により異なるため、分離カラム１４を通過した溶離液中において試料の各成分は時間的に分離して溶出する。溶出した試料を含む溶出液は検出器１５に送られる。検出器１５においては、溶出液がセル１５１を通過し、そのセル１５１に光源１５２からの白色光が照射される。白色光はセル１５１中の溶出液に含まれる成分に特有の波長において吸収を受ける。その透過光を、回折格子などの分光器１５３により波長分散させ、フォトダイオードアレイ１５４にて波長毎の強度を検出する。この検出器１５の検出信号は増幅器１６で増幅され、Ａ／Ｄ変換器１７でデジタル信号に変換され、コンピュータ１８に入力される。
【００１９】
図２にコンピュータ１８の本実施例における機能をブロック図で示す。一点鎖線で囲まれた領域４１はコンピュータ１８のＣＰＵが担い、領域４２はハードディスクやメモリ等の記憶装置が担う。
【００２０】
以下、図２〜図６を用いて、本実施例におけるデータ処理を説明する。まず、Ａ／Ｄ変換器１７より入力される信号から、スペクトル採取部３１は各時刻のスペクトル２１（図３）を作成する（図４のステップＳ１）。
【００２１】
ピーク検出部３２は、まずステップＳ２において、各時刻におけるスペクトル２１について全波長域で強度の積分または総和をとり、それを時間に対してプロットすることによりクロマトグラム２２を作成する（図３）。次に、得られたクロマトグラム２２から予め定められた方法によってクロマトグラムピークを検出する（ステップＳ３）。例えばクロマトグラム２２の接線の傾きが正の値でその絶対値が所定値以上になった時刻ｔ１から、接線の傾きが負の値でその絶対値が所定値以下になる時刻ｔ３までを１つのクロマトグラムピークとする。これによって、１番目の試料Ａに対する測定により、２つのクロマトグラムピークが検出される（図５）。ピーク検出部３２は検出されたクロマトグラムピークにそれぞれ記号Ａ１、Ａ２を付与する。
【００２２】
代表スペクトル決定部３３は、各ピークＡ１、Ａ２のピークトップに対応する保持時間（図３のｔ２）におけるスペクトルをそのピークの同定のための代表スペクトルと決定する（ステップＳ４）。代表スペクトル決定部３３は、代表スペクトルにもそれぞれのクロマトグラムピークに対応した記号＃Ａ＿１と＃Ａ＿２を付与し、この記号と共に代表スペクトルを代表スペクトル記憶部３７に記憶させる（ステップＳ５）。
【００２３】
以後、１番目の試料に対する処理と２番目以降の試料に対する処理とが異なるため、ステップＳ６において１番目の試料であるか否かの判別を行う。試料Ａは１番目の試料であるので、ステップＳ６からステップＳ１２に移る。ステップＳ１２において、スペクトル類似度算出部３４が、ピークＡ１の代表スペクトル＃Ａ＿１とレファレンススペクトル記憶部３８に登録された全てのレファレンススペクトルとのスペクトル類似度を算出する。このレファレンススペクトル記憶部３８には、登録された各レファレンススペクトルがそれぞれファイル名を付けてファイルに保存されている。ピークＡ２に対しても同様にスペクトル類似度を算出する。
【００２４】
ピーク同定部３６は、ピークＡ１について、得られたスペクトル類似度のうち最も値の大きいものを選択する（ステップＳ１３）。ピーク同定部３６は、そのスペクトル類似度とスペクトル類似度閾値記憶部４０に記憶された所定のスペクトル類似度閾値とを比較し（ステップＳ１４）、前者が後者よりも大きければそのレファレンススペクトルに対応する成分をピークＡ１のピーク成分と同定し（ステップＳ１５）、逆に前者が後者よりも小さければピークＡ１のピーク成分がレファレンススペクトル記憶部３８に登録された成分には該当するものがなく未知成分であると判断する（ステップＳ１６）。なお、スペクトル類似度閾値は、本実施例では測定前に測定者が入力することによって０．９０と設定されている。ピークＡ２についても上記と同様にピーク成分を同定するか、又は未知成分であるという判定を行う。本実施例では、ピークＡ１の代表スペクトル＃Ａ＿１と全てのレファレンススペクトルとのスペクトル類似度にはスペクトル類似度閾値を上回るものが無く、ピークＡ１のピーク成分は未知成分と判定される。一方、ピークＡ２の代表スペクトル＃Ａ＿２とのスペクトル類似度が最大であるのは、アスピリンのレファレンススペクトル（ファイル名：アスピリン．ｓｐｄ）であり、その値は０．９２である。これはスペクトル類似度閾値０．９０よりも大きいので、ピークＡ２のピーク成分はアスピリンと同定される。
【００２５】
ピーク同定部３６は、図６に示すように、ピークに付与された記号、ピーク保持時間、代表スペクトルの記号、比較対象スペクトル名（ここでは、レファレンススペクトルのファイル名）、スペクトル類似度及び同定されたピーク成分名を成分テーブル記憶部３９に記憶させる（ステップＳ１７）。ピーク成分が同定されたピークＡ２についてはこのすべての項目が記憶されるが、ピーク成分が未知成分と判断されたピークＡ１についてはスペクトル類似度及び比較対象スペクトル名が空欄とされ、ピーク成分名には仮の名称（本実施例では「＃Ａ＿１」）が記載される。なお、他の測定によってピークＡ１のピーク成分が判明すれば、測定者が成分名を入力し所定の登録操作を行うことにより、その代表スペクトルをレファレンススペクトルとして登録することができる。
【００２６】
以上で１番目の試料Ａに対するピーク同定が終了し、ステップＳ１８を経て２番目の試料Ｂに対する処理に移る。２番目の試料Ｂに対して、１番目の試料Ａと同様にステップＳ１〜ステップＳ５において、それぞれスペクトルの採取、クロマトグラムの作成及びピークの検出（図５のピークＢ１，　Ｂ２，　Ｂ３）、ピーク毎の代表スペクトルの決定が行われ、それらの代表スペクトルが代表スペクトル記憶部３７に記憶される。
【００２７】
今回は２番目の試料であるので、ステップＳ６からステップＳ７に移る。ここでスペクトル類似度算出部３４が各ピークの代表スペクトルについてスペクトル類似度を算出するが、１番目の試料における成分同定の場合とは異なり、１番目の試料の代表スペクトル＃Ａ＿１及び＃Ａ＿２を比較対象スペクトルとする。即ち、判定対象のピークの代表スペクトル＃Ｂ＿１、＃Ｂ＿２及び＃Ｂ＿３と比較対象のスペクトル＃Ａ＿１及び＃Ａ＿２とのスペクトル類似度を計算する。
【００２８】
同一ピーク判定部３５は、ピークＢ１の代表スペクトル＃Ｂ＿１について最もスペクトル類似度が大きい１番目の試料のピーク代表スペクトルを選択する（ステップＳ８）。同一ピーク判定部３５は、そのスペクトル類似度と上記スペクトル類似度閾値とを比較し（ステップＳ９）、前者が後者よりも大きければ、判定対象のピークが比較対象スペクトルに対応するクロマトグラムピークと同一成分によるものであると判定し（ステップＳ１０）。逆に前者が後者よりも小さければ、他の試料のいずれのピークのピーク成分とも同一成分ではないと判定する（ステップＳ１１）。ピークＢ２及びピークＢ３に対しても同様の判定を行う。データＢにおいては、クロマトグラムピークＢ１のピーク成分はピークＡ１と同一成分であり、Ｂ２のピーク成分はピークＡ２と同一成分であると判定され、Ｂ３のピーク成分は１番目の試料のいずれのピークのピーク成分とも同一成分ではないと判定される。
【００２９】
同一ピーク判定部３５は、ピークＢ１及びピークＢ２について、ピークに付与された記号、ピーク保持時間、代表スペクトルの記号、比較対象スペクトル名（ここでは、他の試料の代表スペクトル記号）、スペクトル類似度及び同一成分によるものであると判定されたピークの記号を成分テーブル記憶部３９に記憶させる（ステップＳ１７）。
【００３０】
ピークＢ３のように、他の試料のいずれのピークのピーク成分とも同一成分ではないと判定されたものに対しては、ステップＳ１１からステップＳ１２に移る。ピーク同定部３６は、１番目の試料と同様にレファレンススペクトル記憶部３８に登録されたスペクトルを比較対象スペクトルとしたピーク判定を、ステップＳ１２〜Ｓ１６において行う。本実施例ではクロマトグラムピークＢ３の代表スペクトルは、１番目の試料の代表スペクトル及びレファレンススペクトルのいずれにも類似しない。よって、ピークＢ３のピークは１番目の試料のいずれのピークのピーク成分とも同一成分ではなく、かつ未知成分であると判定される。
【００３１】
ピーク同定部３６は、ピークに付与された記号Ｂ３、代表スペクトルの記号を成分テーブル記憶部３９に記憶させ、仮のピーク成分名＃Ｂ＿３を記憶させる（ステップＳ１７）。このＢ３の代表スペクトル＃Ｂ＿３は、３番目以降の試料のピーク判定において、比較対象スペクトルとして用いられる。
【００３２】
なお、上記ではＢ２のピークがピークＡ２と同一成分によるものと判定したが、その成分までは同定していない。前記のように、異なる試料のピーク同士が同一成分によることさえ分かればよい場合もあるからである。ただし、更に同一ピーク判定部３５がピークＡ２の成分テーブルを参照することにより、Ｂ２のピーク成分をＡ２と同じアスピリンであると同定するようにすることもできる。図６のテーブルには、同一成分と判定されたピーク名と、同定された成分名の両方を記載する例を示した。この例では、ピークＡ２とのスペクトル比較により間接的にアスピリンであると同定したピークＢ２に対して、直接ピークＢ２の代表スペクトルとアスピリンのレファレンススペクトルとの類似度を計算し、その値を成分テーブルに記載することによって、ピークＢ２がアスピリンであるかどうかを直接判断する指標を与えている。
【００３３】
２番目の試料Ｂに対して行った上記操作を、３番目の試料Ｃ以降に対しても順次行う。本実施例では、３番目の試料Ｃの各ピークはまず１番目の試料Ａの各ピークと比較され、その後２番目の試料Ｂの各ピークと比較される。その結果、クロマトグラムピークＣ１のピーク成分はピークＡ１と同一成分、ピークＣ２のピーク成分はピークＡ２と同一成分、ピークＣ３のピーク成分はピークＢ３と同一成分であるとそれぞれ判定される。
【００３４】
上記実施例では、スペクトル類似度閾値のみをピーク判定の基準としたが、判定基準にピーク保持時間許容幅を加えてもよい。この場合、複数試料同士のピーク比較の対象を、ピーク保持時間許容幅範囲内にあるピークのみとする。これにより明らかにピーク保持時間の異なるピーク同士のスペクトルを比較することがなくなるため、そのようなピーク同士を誤って同一成分によるピークと判定する可能性がなくなり、また類似度計算の負荷を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）装置の構成例の概略図。
【図２】コンピュータ１８の本実施例における機能を表すブロック図。
【図３】クロマトグラムとスペクトルとの関係を表す図。
【図４】本実施例のデータ処理装置において行われる処理のフローチャート。
【図５】本実施例のクロマトグラムと対応するスペクトル及びレファレンススペクトルを表す図。
【図６】本実施例において作成されたテーブルを表す図。
【符号の説明】
１１…溶離液槽
１２…ポンプ
１３…インジェクタ
１４…分離カラム
１５…検出器
１５１…セル
１５２…光源
１５３…分光器
１５４…フォトダイオードアレイ
１６…アンプ
１７…Ａ／Ｄ変換器
１８…コンピュータ
２１…スペクトル
２２…クロマトグラム

Claims

ａ）カラムから溶出する試料について逐次スペクトルを採取するスペクトル採取手段と、
ｂ）採取されたスペクトルからクロマトグラムを作成し、ピークを検出するピーク検出手段と、
ｃ）既知の成分のスペクトルであるレファレンススペクトルを記憶するレファレンススペクトル記憶手段と、
ｄ）検出されたピークに属するスペクトルの中からピーク代表スペクトルを決定する代表スペクトル決定手段と、
ｅ）ピーク代表スペクトルとレファレンススペクトルとの類似度を算出するスペクトル類似度算出手段と、
ｆ）目的ピークのピーク代表スペクトルとの類似度が所定の閾値を超えるレファレンススペクトルのうち最も類似度が高いものに対応する成分を、該目的ピークの成分と同定するピーク同定手段と、
を備えることを特徴とするクロマトグラフデータ処理装置。
ａ）カラムから溶出する試料について逐次スペクトルを採取するスペクトル採取手段と、
ｂ）採取されたスペクトルからクロマトグラムを作成し、ピークを検出するピーク検出手段と、
ｃ）検出されたピークに属するスペクトルの中からピーク代表スペクトルを決定する代表スペクトル決定手段と、
ｄ）ピーク代表スペクトルを記憶する代表スペクトル記憶手段と、
ｅ）２つのピーク代表スペクトルの類似度を算出するスペクトル類似度算出手段と、
ｆ）第１の試料の目的ピークのピーク代表スペクトルとの類似度が所定の閾値を超える第２の試料のピーク代表スペクトルのうち最も類似度が高いものに対応するピークを、該目的ピークと同一成分によるピークであると判定する同一ピーク判定手段と、
を備えることを特徴とするクロマトグラフデータ処理装置。