JP2004024208A

JP2004024208A - 糖転移作用剤

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Publication number: JP2004024208A
Application number: JP2002204924A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Narimatsu; 成松　久; Masashiki Goto; 後藤　雅式; Hiroko Iwasaki; 岩崎　裕子; Toshikazu Yada; 矢田　俊量; Hideo Mochizuki; 望月　秀雄
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Seikagaku Corp
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Seikagaku Corp
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2004-01-29
Anticipated expiration: 2022-07-12
Also published as: JP4171791B2

Abstract

【課題】コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成における糖鎖とペプチド（タンパク質）との結合部位に存在するリンケージ四糖に対してＮ−アセチルガラクトサミン残基を転移する作用を有する糖転移作用剤を提供する。
【解決手段】コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質を遺伝子工学的に発現させ、それをコンドロイチン／コンドロイチン硫酸合成に使用する糖転移作用剤とする。
【選択図】　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−グルクロン酸残基と二残基のＤ−ガラクトース残基とＤ−キシロース残基とがグリコシド結合してなる四糖を含むＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に対してＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する糖転移作用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異性体はすべてＤ体を示すものとする。
【０００３】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下「ＧａｌＮＡｃ」とも記載する）にグルクロン酸（以下「ＧｌｃＵＡ」とも記載する）がβ１，３結合によりグリコシド結合した二糖がβ１，４グリコシド結合で結合して連なる基本骨格を有したグリコサミノグリカンの一種である。生体内においてコンドロイチン／コンドロイチン硫酸は、タンパク質に結合したコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして合成される。その合成には様々な酵素が関与していることが知られている（糖鎖工学：産業調査会バイオテクノロジー情報センター発行（発行日：１９９２年８月１日））。
【０００４】
コンドロイチンプロテオグリカンは、ペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸残基のうち、セリン残基の側鎖にコンドロイチン／コンドロイチン硫酸が結合した構造を有している。すなわちコンドロイチン／コンドロイチン硫酸とセリン残基との結合部分には下記式（４）で表される構造が存在する。
【０００５】
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（４）
式（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「Ｓｅｒ」は前記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基が側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「−」はグリコシド結合を示し、この構造中、下記式（１）で表される構造を便宜的に「リンケージ四糖」とも記載する。
【０００６】
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
【０００７】
上記式（４）で表される構造を合成するための酵素のうち、非還元末端のＧｌｃＵＡに対してＧｌａＮＡｃを転移する十分な作用を有する糖転移作用剤はこれまでは知られていなかった。すなわち、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７　（２００２），　８８４１−８８４６にはＧｅｎＢａｎｋ（商標名）受け入れ番号ＡＢ０７１４０３のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号４２乃至５３２からなるアミノ酸配列のタンパク質が有するコンドロイチン合成作用に関する記載が存在する。すなわち、当該タンパク質には上記式（４）の構造を合成しうる「合成開始作用（イニシエーション作用）」及びコンドロイチン骨格を連続的に合成しうる「基本骨格伸長作用（エロンゲーション作用）」の双方を有する旨記載されている。しかし当該文献の記述によるとＧａｌＮＡｃ−リンケージ四糖を生ずる活性は検出不能（０．０１ｐｍｏｌ／ｍｌ　培地／ｈ未満）であり、リンケージ四糖に対してＧａｌＮＡｃをＧａｌＮＡｃ供与体基質から転移する作用を実質的に有する糖転移作用剤は存在していなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一方、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸は生体由来の材料であり、これらの安定した供給を確保するためのコンドロイチン／コンドロイチン硫酸を人工的にプロテオグリカンとして合成する方法の探索が強く望まれている。しかし、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成の開始点となるリンケージ四糖に対してＮ−アセチルガラクトサミンを転移する十分な作用を有する糖転移作用剤は存在せず、そのような糖転移作用剤の探索が大いに期待されていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、公知のＤＮＡデータベースに掲載されたｃＤＮＡの部分配列を発現させた際に、リンケージ四糖に対してＧａｌＮＡｃを転移する強い作用を有するタンパク質が得られることを発見した。そしてそれを糖転移作用剤とすることで本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
（１）　下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質の下記式（１）における非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する作用を有することを特徴とする糖転移作用剤。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
（２）　下記式（２）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質の下記式（２）における非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する作用を有することを特徴とする糖転移作用剤。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（２）
式（２）中、「Ｓｅｒ」は上記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」及び「−」は式（１）と同様である。
（３）　Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基をβ１，４結合で転移することを特徴とする（１）又は（２）記載の糖転移作用剤。
（４）　糖転移作用剤が配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質を含むことを特徴とする（１）乃至（３）何れか記載の糖転移作用剤。
（５）　糖転移作用剤が配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質を含むことを特徴とする（１）乃至（３）何れか記載の糖転移作用剤。
（６）　　（１）乃至（５）何れか記載の糖転移作用剤を作用させて下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に対してＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式（３）で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（３）
式（１）及び（３）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
（７）　下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対して、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移して下記式（３）で示される構造を有する糖鎖を合成するための、（１）乃至（５）何れか記載の糖転移作用剤の使用。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（３）
式（１）及び（３）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
（８）　組織における配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量と、当該組織の癌化とを関連づけることを特徴とする癌化の検出方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下本発明を発明の実施の形態により詳説する。
１．本発明糖転移作用剤
本発明糖転移作用剤は下記式（１）で示される糖鎖を含むＧａｌＮＡｃ受容体基質の下記式（１）における非還元末端に存在するＧｌｃＵＡに対し、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃを転移する作用（イニシエーション作用）を有することを特徴とする。
【００１２】
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
【００１３】
本発明糖転移作用剤におけるＧａｌＮＡｃ受容体基質とは、ＧａｌＮＡｃが転移される対象となる上記式（１）の糖鎖を含むものであれば特に限定はされない。しかし、本発明糖転移作用剤はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を開始することができることから、好ましくは上記式（１）に示される糖鎖の還元末端に存在するＤ−キシロース残基はセリン残基（ペプチド鎖中の場合も含む）の側鎖に結合した構造（下記式（２）で示される構造）を有することが好ましい。
【００１４】
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（２）
式（２）中、「Ｓｅｒ」は上記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」及び「−」は式（１）と同様である。
【００１５】
上記式（２）のＧａｌＮＡｃ受容体基質に対して本発明糖転移作用剤を作用させてＧａｌＮＡｃを転移すると、下記式（４）で示す構造が得られる。
【００１６】
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（４）
式（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「Ｓｅｒ」は上記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」及び「−」は式（１）と同様である。
【００１７】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの構造中、リンケージ四糖（プロテオグリカンにおけるペプチド（タンパク質）とコンドロイチン／コンドロイチン硫酸とが結合した領域）のグリコシド結合は各々特定の結合様式を有している。本発明糖転移作用剤は、このような特定の結合様式を有するリンケージ四糖に対してＧａｌＮＡｃを転移することが好ましい。生体内でコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成に使用できるからである。すなわち上記式（２）の構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体基質は下記式（２’）の構造を有することがより好ましい。
【００１８】
ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（２’）
式（２’）中の「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」、「Ｘｙｌ」、「Ｓｅｒ」及び「−」は上記式（２）と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
【００１９】
本発明糖転移作用剤におけるＧａｌＮＡｃ供与体基質としてはＧａｌＮＡｃを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）などが例示され、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが最も好ましいが特に限定はされない。
【００２０】
本発明糖転移作用剤は、前記ＧａｌＮＡｃ受容体基質に対し前記ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃをβ１，４グリコシド結合で転移する。コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンにおけるリンケージ四糖へのＧａｌＮＡｃの結合はβ１，４グリコシド結合でなされているからである。
【００２１】
また更に、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸に共通の構造であるコンドロイチン骨格（（４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）_ｎ　ｎ≧１）中の非還元末端に存在するＧｌｃＵＡに対しても、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃを転移する作用を本発明糖転移作用剤は有することが好ましい。更に上記と同様にＧａｌＮＡｃをβ１，４グリコシド結合によって転移する作用を有していることが天然のコンドロイチン／コンドロイチン硫酸を構成する基本骨格であるため好ましい。
【００２２】
このような本発明糖転移作用剤の作用は、例えば実施例に記載した高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」とも記載する）を用いた方法によって容易に確認することが可能である。本発明糖転移作用剤のＧａｌＮＡｃ転移作用によって生じた生成物の検出は、例えば吸光度を測定して行うことが可能である。また予めＧａｌＮＡｃ供与体基質のＧａｌＮＡｃを蛍光色素や放射性同位元素（Ｈ^３（トリチウム）、Ｃ^１４など）で標識して、予想される生成物の分子量画分における標識物質の検出を組み合わせることによっても正確に検出することが可能である。本発明糖転移作用剤は本明細書中実施例２（３）記載の方法で転移作用を測定した結果、リンケージ四糖−メトキシフェニル（以下「リンケージ四糖−ＭＰ」と記載する）に対するＧａｌＮＡｃ転移作用が１０　ｐｍｏｌ／ｍｌ培地／ｈであることが好ましく、１５　ｐｍｏｌ／ｍｌ培地／ｈ以上であることがより好ましく、２０ｐｍｏｌ／ｍｌ培地／ｈ以上であることが最も好ましい。また同様にコンドロイチンに対するＧａｌＮＡｃ転移作用が１０ｐｍｏｌ／ｍｌ培地／ｈ以上であることが好ましく、１５ｐｍｏｌ／ｍｌ培地／ｈ以上であることがより好ましい。更に、リンケージ四糖−ＭＰに対するＧａｌＮＡｃ転移作用はコンドロイチンに対するＧａｌＮＡｃ転移作用よりも高いことが、効率よくコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成開始剤として働くため極めて好ましい。
【００２３】
本発明糖転移作用剤の活性は本明細書中実施例２（３）記載の方法で測定した場合には、生化学工業株式会社製のコンドロイチンに対するＧａｌＮＡｃ転移作用（Ｃ）とリンケージ四糖−ＭＰに対するＧａｌＮＡｃ転移作用（Ｌ）との相対活性比（（Ｃ）／（Ｌ））が０．９未満、好ましくは０．８５未満、０．７５未満であること最も好ましい。このような本発明糖転移作用剤は、イニシエーション作用が強くコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成への使用に極めて適している。
【００２４】
本発明糖転移作用剤の構造は、配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質であることが、上述したＧａｌＮＡｃ転移作用を強く有する観点から好ましい。特に配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質であることがリンケージ四糖に対するＧａｌＮＡｃ転移作用が強いことから極めて好ましい。
【００２５】
２．本発明糖転移作用剤の調製
本発明糖転移作用剤の調製は例えば以下の方法に従って行うことができる。
上記したように特に配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質が最も好ましい本発明糖転移作用剤であるので、それをコードするＤＮＡ（本発明糖転移作用剤のタンパク質をコードするＤＮＡ）の調製方法及びその発現方法を説明する
【００２６】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが存在するヒト組織のｃＤＮＡなどを用いることで効率的に該ＤＮＡを増幅することが可能である。このような組織としては例えば軟骨組織、骨髄組織、胎盤、甲状腺等が例示され、特に骨髄組織が好ましい。このような組織の細胞を使用して調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用するポリメラーゼ　チェイン　リアクション法（以下「ＰＣＲ法」とも記載する）等の既知の方法により本発明糖転移作用剤のタンパク質をコードするＤＮＡを比較的容易に調製することが可能である。ＰＣＲ法には例えば配列番号１４の塩基配列からなる５’プライマーと配列番号１５からなる３’プライマーとを使用することができ、常法に従って行うことができる。上記で例示したプライマーを用いる場合には約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅産物として生ずるので、この断片を単離する。単離の方法は常法によって行うことができ、例えばアガロースゲル電気泳動後に１．２ｋｂｐ近辺をのゲルを切り出し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（商標名：東洋紡株式会社製）などを用いて容易に単離することが可能である。増幅産物は常法に従って適当な宿主細胞で発現するための基本ベクターに組み込むことが可能である。宿主細胞と基本ベクターの組み合わせは当業者であれば培養に使用する宿主細胞に合わせて適宜選択することができ、その選択された基本ベクターに適切な方法で増幅産物を基本ベクターに組み込むことが可能である。宿主細胞しては原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌など）であっても真核細胞（例えば酵母、昆虫細胞、ほ乳類細胞など）であっても使用することは可能である。特に原核細胞を宿主細胞として用いた場合には、ＤＮＡ断片を発現させた際に得られる産物には糖鎖が付加されないため、「タンパク質」のみを得ることが可能である。しかし、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成は通常は真核生物で行われているため、本発明糖転移作用剤のタンパク質も真核細胞を宿主細胞として調製することが好ましい。その中でも特に昆虫細胞（大量合成の面で極めて優れる）又はほ乳類細胞（増幅産物が通常発現しているのはほ乳類細胞である）が例示される。
【００２７】
また上記基本ベクターに挿入したＤＮＡ断片の発現を行う際に、生じたタンパク質の同定・分析及び単離・精製を容易とするために、ＤＮＡ断片がコードするタンパク質と適当な識別ペプチドとの融合タンパク質としてＤＮＡ断片が発現しうるように構築することが好ましい。前記識別ペプチドとしては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、タンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６〜１０個並べて配したペプチド配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸配列からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸配列）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸配列）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸配列）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧからなる群から選択されるいずれかのペプチドが例示され、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法によるタンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、抗体を用いることで極めて容易にタンパク質の精製が可能となることから、特にＦＬＡＧペプチドが好ましい。
【００２８】
例えばＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質としてＤＮＡ断片を発現させた場合には、抗ＦＬＡＧ抗体（例えばＭ１など）が結合した樹脂などを使用することで、宿主細胞の培養物（培養上清や宿主細胞の抽出物など）からタンパク質を容易に単離・精製することが可能であり、またその樹脂をそのまま本発明糖転移作用剤として使用することも可能である。
【００２９】
３．本発明合成方法
本発明合成方法は、本発明糖転移作用剤を作用させて、下記式（１）で示される構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体基質に対してＧａｌＮＡｃを転移することを特徴とする、下記式（３）で示される構造を有する糖鎖の合成方法である。
【００３０】
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（３）
式（１）及び（３）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
【００３１】
本発明合成方法におけるＧａｌＮＡｃ受容体基質とは、ＧａｌＮＡｃが転移される対象となる上記式（１）の糖鎖を含むものであれば特に限定はされない。しかし、本発明糖転移作用剤はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を開始することができることから、好ましくは上記式（１）に示される糖鎖の還元末端に存在するＤ−キシロース残基はセリン残基（ペプチド鎖中の場合も含む）の側鎖に結合した構造（下記式（２）で示される構造）を有することが好ましい。
【００３２】
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（２）
式（２）中、「Ｓｅｒ」は上記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」及び「−」は式（１）と同様である。
【００３３】
上記式（２）のＧａｌＮＡｃ受容体基質に対して本発明糖転移作用剤を作用させてＧａｌＮＡｃを転移すると、下記式（４）で示す構造が得られる。
【００３４】
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（４）
式（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「Ｓｅｒ」は上記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」及び「−」は式（１）と同様である。
【００３５】
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの構造中、リンケージ四糖のグリコシド結合は各々特定の結合様式を有している。本発明合成方法におけるＧａｌＮＡｃ受容体基質も、このような特定の結合様式を有するリンケージ四糖であることが好ましい。生体内でコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成に使用できるからである。すなわち上記式（２）の構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体基質は下記式（２’）の構造を有することがより好ましい。
【００３６】
ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（２’）
式（２’）中の「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」、「Ｘｙｌ」、「Ｓｅｒ」及び「−」は上記式（２）と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
【００３７】
本発明合成方法におけるＧａｌＮＡｃはＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃ受容体基質に対して転移される。ここでＧａｌＮＡｃ供与体基質としてはＧａｌＮＡｃを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃなどが例示され、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが最も好ましいが特に限定はされない。生体内では主にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃがＧａｌＮＡｃ供与体基質として働いているからである。
【００３８】
本発明合成方法に使用する本発明糖転移作用剤は、前記ＧａｌＮＡｃ受容体基質に対し前記ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃをβ１，４グリコシド結合で転移する。コンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンにおけるリンケージ四糖へのＧａｌＮＡｃの結合はβ１，４グリコシド結合でなされているからである。
【００３９】
本発明合成方法におけるＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃ受容体基質へのＧａｌＮＡｃの転移作用は、安定した一定のｐＨ、温度条件下で行われることが好ましい。例えばｐＨは５．０乃至９．０が好ましく、５．５〜８．０がより好ましく、６．０〜７．５であることが最も好ましい。このような条件を保つために、上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましい。緩衝液としては酢酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（以下単に「ＭＥＳ」とも記載する）、ヒドロキシメチルアミノエタン−塩酸緩衝液（以下単に「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液」とも記載する）、及びリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、いずれも使用することは可能である。しかし本発明合成方法において最も好ましいｐＨ範囲（ｐＨ６．０〜７．５）全体において安定したｐＨを保つ作用が強いことからＭＥＳが最も好ましい。緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが１０〜２００ｍＭ、好ましい範囲としては２０〜１００ｍＭが例示される。
作用時の温度条件は２０〜４５℃が例示され、好ましくは２４〜４０℃、最も好ましくは３６〜３７℃が例示される。
【００４０】
なお、好ましい本発明糖転移作用剤はコンドロイチン及びコンドロイチン硫酸の基本骨格（（４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）_ｎ　ｎ≧１）中の非還元末端に存在するＧｌｃＵＡ残基に対しても、ＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃを転移する作用（「エロンゲーション作用」とも記載する）を有することが好ましい。
【００４１】
上記と同条件を用いて本発明糖転移作用剤により、（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎで示される受容体基質にＧａｌＮＡｃ供与体基質からＧａｌＮＡｃを転移して下記式（５）の構造を有する糖鎖の合成をすることも可能である。
【００４２】
ＧａｌＮＡｃ−（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ　　（５）
上記式（５）において「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチルガラクトサミン残基を、「ＧｌｃＵＡ」、及び「−」は式（１）におけるものと同義であり、ｎは１以上の整数を示す。
【００４３】
この場合において本発明糖転移作用剤は（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ（ｎは１以上の整数）の非還元末端に存在するＧｌｃＵＡにＧａｌＮＡｃを転移してＧａｌＮＡｃ−（ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎを生成する反応を触媒する作用を示す。転移における結合様式はβ１，４結合である。
本発明糖転移作用剤は、上述の式（３）及び式（５）記載の糖鎖の合成に使用することができ、式（３）又は式（５）の構造を有する糖鎖の式（３）又は式（５）中の非還元末端に存在するＧａｌＮＡｃを転移するための使用は本発明使用となる。
【００４４】
４．本発明検出方法
本発明検出方法は、組織における配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量と、当該組織の癌化とを関連づけることを特徴とする癌化の検出方法である。
本発明検出方法における組織とは、いずれの組織であってもよく、例えば神経、甲状腺、血球、骨髄、大腸、胃、皮膚、肝臓、膵臓、卵巣等が例示されるがこれに限定はされない。これらの組織は、例えば生検などの方法で採取して本発明検出方法に使用することができる。本発明検出方法においては配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量が定量されるが、当該発現量の定量は例えば後述の実施例に記載された定量的リアルタイムＰＣＲ法（例えば配列番号１８記載の塩基配列からなる５’プライマー、配列番号１９記載の塩基配列から３’プライマー、及びマイナーグルーブ結合物質などが結合した配列番号２０記載の塩基配列からなるプローブを用いる）等の常法を用いることで容易に行うことができる。ＰＣＲ法などを用いて発現量の定量を行う場合には、必ずしも配列番号１記載の全塩基配列を増幅して定量する必要はなく、その一部分の領域（例えば当該塩基配列記載の塩基番号２５乃至１６２３からなる領域の任意の０．１乃至１．５ｋｂの領域）を増幅して定量することができる。なお、当該ＤＮＡの発現量の定量は、当該ＤＮＡがコードするタンパク質の量を常法に従って定量することによっても行うことができる。
【００４５】
本発明検出方法においては、例えば生検によって得た患部域組織に含まれる健常組織部分と病変組織部分とで上記ＤＮＡの発現量を対比して、健常組織部分における上記ＤＮＡの発現量より病変組織部分における上記ＤＮＡの発現量が変化している場合、好ましくは低下している場合に、病変組織部分が癌化しているとすることで、癌化の検出を容易に行うことができる。例えば、後述の定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いて上記ＤＮＡの発現量の定量を行なった場合、健常組織部分と比して病変組織部分における上記ＤＮＡの発現量が１／２以下、好ましくは１／３以下、最も好ましくは１／５以下に低下している場合に、病変組織部分が癌化しているとして癌化の検出することが好ましいが、これに限定はされない。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明をより具体的に詳説する。
試験例１
ＨＰＬＣを用いた酵素活性の測定
基質を含む５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標名）、１ｍＭの糖残基供与体基質、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ_２及び５００μＭの糖残基受容体基質を含む）２０μｌと酵素懸濁液１０μｌとを混合し、３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応混液をウルトラフリー−ＭＣカラム（ミリポア社製）で濾過した。１０μｌの濾液を逆相カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ　ＱＡカラム：４．６×２５０ｍｍ　東ソー株式会社製）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。移動相としては０．１％　ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水を使用した。溶出は条件は流速１ｍｌ／分、５０℃で行なった。
【００４７】
溶出ピークの検出には２１０ｎｍにおける吸光度測定を用い、ＳＰＤ−１０Ａ_ｖｐ（島津製作所株式会社製）を使用した。また、糖残基によって修飾されたペプチドの検出には蛍光標識を用いた。すなわちＣｙ５（アマシャム　バイオサイエンス株式会社製）を用いて修飾されたペプチドの蛍光標識を行い、ＲＦ−１０Ａ_ＸＬ（島津製作所株式会社製）で検出した。
【００４８】
試験例２
質量分析法による反応生成物の分析
エレクトロスプレーイオン化質量分析（以下「ＥＳＩ−ＭＳ」と記載する）はＥｓｑｕｉｒｅ３０００ｐｌｕｓ（ブルッカーダルトニクス社製）で行なった。また、マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間質量分析（以下「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と記載する）はＲｅｆｌｅｘ　ＩＶ（ブルッカーダルトニクス社製）で行なった。
【００４９】
ＥＳＩ−ＭＳ用の試料の調製は以下の通り行った。すなわち試料２５ｐｍｏｌを蒸留水５μｌに溶解し、更に４５μｌの０．１％蟻酸及び５０μｌのメタノールを添加して試料溶液を調製した。試料溶液はキャピラリー電圧３ｋＶで３μｌ／分で注入した。ＥＳＩ−ＭＳでの１９２．００　ｍ／ｚのピークは再度エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を行った。これらの分析は陽イオン及び陰イオンの双方のモードで行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用の試料は１０ｐｍｏｌの試料を乾燥させ、１μｌの蒸留水に溶解して調製した。
【００５０】
試験例３
ＧａｌＮＡｃ転移作用の定量
試験例１と同様の反応液に、４０，０００から５５，０００　ｄｐｍのＵＤＰ−［^１４Ｃ］ＧａｌＮＡｃ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）、及び１μｇ又は１００μｇのＧａｌＮＡｃ受容体基質を添加し、３７℃で１時間ないし１６時間反応させた。反応液はＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＨＲ１０／３０（アマシャム　バイオサイエンス社製）でゲルろ過分画し、各画分の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。また、産物の定量は、１つのピークに相当する全画分の放射能を加算して行った。
【００５１】
調製例１
β４ガラクトース転移酵素７（β４Ｇａｌ−Ｔ７）、β３ガラクトース転移酵素６（β３Ｇａｌ−Ｔ６）及びグルクロン酸転移酵素Ｉ（ＧｌｃＡＴ−Ｉ）と、ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質の調製
β４Ｇａｌ−Ｔ７、β３Ｇａｌ−Ｔ６又はＧｌｃＡＴ−ＩはＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として昆虫細胞又はほ乳類細胞で発現するように構築した。
【００５２】
ヒト骨髄由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標名）　ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。β４Ｇａｌ−Ｔ７の増幅には配列番号３の塩基配列からなる５’プライマーと配列番号４からなる３’プライマーとを使用してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅した。同様にＧｌｃＡＴ−Ｉの増幅には配列番号５の塩基配列からなる５’プライマーと配列番号６からなる３’プライマーとを使用してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅した。増幅産物をＩｗａｉ，　Ｔらの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．発行準備中）によりプラスミドベクター　ｐＦＢＩＦに挿入してｐＦＢＩＦ−β４Ｇａｌ−Ｔ７及びｐＦＢＩＦ−ＧｌｃＡＴ−Ｉを得た。
【００５３】
β３Ｇａｌ−Ｔ６の増幅には配列番号７の塩基配列からなる５’プライマーと配列番号８からなる３’プライマーとを使用してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅し、断片をシグマ社製のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩサイトに常法により挿入してｐＦＬＡＧ−β３Ｇａｌ−Ｔ６を得た。
【００５４】
ｐＦＢＩＦ−β４Ｇａｌ−Ｔ７及びｐＦＢＩＦ−ＧｌｃＡＴ−Ｉは常法に従ってＳｆ２１（昆虫由来の培養細胞株）に導入し、ｐＦＬＡＧ−β３Ｇａｌ−Ｔ６は常法に従ってＣＯＳ−１（サル脾臓由来の培養細胞株）に導入した。ベクターにより組換えられた宿主細胞（組換体）を０．５％　ＣＯ_２／Ａｉｒ条件下、３７℃で２日間培養して各目的タンパク質を発現させた。その後培養上清を回収し、１０００×ｇで１５分間遠心処理して上清のみを５０ｍｌ回収し、抗ＦＬＡＧ　Ｍ１抗体が結合した樹脂（シグマ社製）と混合した。タンパク質と樹脂の混合物は１ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ　ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で二回洗浄し、活性測定用緩衝液１００μｌに懸濁した（各々β４Ｇａｌ−Ｔ７懸濁液、ＧｌｃＡＴ−Ｉ懸濁液、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ６懸濁液とした）。
【００５５】
実施例１
本発明糖転移作用剤の調製
（１）ＤＮＡ断片の単離
クローニングされたβ１，４−ガラクトース転移酵素（以下「β４Ｇａｌ−Ｔ１」と記載する）のアミノ酸配列を基にして、インターネット上の配列検索ソフト「ＢＬＡＳＴ」を用いて近似した配列を検索した。β４Ｇａｌ−Ｔ１の特徴的アミノ酸配列（配列番号９）を有するＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｔａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ（商標名）受け入れ番号　ＡＫ０５５１５４）を発見した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列を得るためにＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標名）　ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社製）を用いてｃＤＮＡ末端高速増幅法（５’ＲＡＣＥ法）を行なった。５’末端の配列は二段階の５’ＲＡＣＥ法で増幅した。第一段の５’ＲＡＣＥ法には、ＰＣＲ法のために配列番号１０の塩基配列からなるプライマーを使用し、ネステッドＰＣＲ法のために配列番号１１記載の塩基配列からなるプライマーを使用した。第二段の５’ＲＡＣＥ法には配列番号１２記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１３記載の塩基配列からなるプライマーとを用いて行なった。得られた約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従って塩基配列の解析をしたところ、配列番号１記載の塩基配列からなることが確認された。このｃＤＮＡをＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ　ｃＤＮＡとし、それがコードするタンパク質をＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔとした。この塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２記載の通りだった。また、上記ＢＬＡＳＴでの検索に用いたβＧａｌ−Ｔ１とのアミノ酸配列の対比を図１に示した。この対比により得られたＤＮＡがβＧａｌ−Ｔ１と相同性が見られたことから、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔは糖転移酵素の可能性が示唆された。
【００５６】
（２）ＦＬＡＧ−ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ（活性部位）融合タンパク質の構築と精製
上記で得られたＤＮＡ断片がコードするアミノ酸配列（配列番号２）から、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの活性部位はアミノ酸番号３７乃至５３２の領域と予測された。この領域のアミノ酸配列からなるタンパク質とＦＬＡＧペプチドとが融合した分泌型のタンパク質を昆虫細胞に分泌させて得るために、付属マニュアルに従ってＧＡＴＥＷＡＹ（商標名）システム（インビトロゲン社製）を行なった。
【００５７】
まず、ヒト骨髄由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標名）　ｃＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１４の塩基配列からなる５’プライマーと配列番号１５からなる３’プライマーとを使用してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅した。増幅産物をＩｗａｉ，　Ｔらの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．発行準備中）によりプラスミドベクター　ｐＦＢＩＦに挿入してｐＦＢＩＦ−ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ（活性部位）を得た（「ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの活性部位」を以下「ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣ」と記載する）。このｐＦＢＩＦ−ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣを昆虫由来の培養細胞株　Ｓｆ２１に常法に従って導入し、その後細胞を２７℃で４日間培養した培養上清を１次ウィルスとした。さらに、同様の操作を４回繰り返し、４度目の培養上清を回収した。その後培養上清を１０００×ｇで１５分間遠心処理して上清のみを５０ｍｌ回収し、抗ＦＬＡＧ　Ｍ１抗体が結合した樹脂（シグマ社製）と混合した。タンパク質と樹脂の混合物は１ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ　ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で二回洗浄し、活性測定用緩衝液１００μｌに懸濁した（作用剤懸濁液）。
【００５８】
実施例２
ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣの基質特異性の検討
ＧａｌＮＡｃ供与体基質としてウリジン二リン酸−ＧａｌＮＡｃ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：シグマ社製）、ＧａｌＮＡｃ受容体基質としてＧｌｃＵＡ−β−パラニトロフェニル（ＧｌｃＵＡ−β−ｐＮｐ）を使用して試験例１に従ってＨＰＬＣによる酵素活性の分析を行った。アセトニトリルによる濃度勾配溶出法による溶出は０〜１５％の濃度勾配を使用した。その結果、対照には見られなかった新たな溶出ピークが５５．４分に検出された（図２Ｂ：Ａは対照）。
【００５９】
５５．４分のピークを回収し試験例２に従ってＥＳＩ−ＭＳを行なった。陽イオンモードでは５１９．０５ｍ／ｚのピークが観察された（図３Ａ）。このピークはＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ｐＮｐの分子量に相当していた。このピークを回収し、試験例２に従ってＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで更に分析したところ、２０３．９１ｍ／ｚ及び２９８．９７ｍ／ｚに新たなピークが観察された（図３Ｂ）。２０３．９１ｍ／ｚのピークはＧａｌＮＡｃの分子量に相当し、２９８．９７ｍ／ｚのピークはＧｌｃＵＡ−ｐＮｐのピークに相当した。
【００６０】
更に５５．４分のピークを回収して試験例２に従ってＥＳＩ−ＭＳを陰イオンモードで行なったところ生成物はＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−ｐＮｐに相当する５１７．１９ｍ／ｚと水を失ったＧｌｃＵＡ−ｐＮｐに相当する２９６．００ｍ／ｚが観察された。
【００６１】
これらの結果から、ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣはＧｌｃＵＡにＧａｌＮＡｃを転移する活性を有することが明らかになった。従来知られているＧａｌＮＡｃとＧｌｃＵＡとの結合は、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸にしか存在が知られていない。従ってＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣはコンドロイチン／コンドロイチン硫酸のＧｌｃＵＡにＧａｌＮＡｃを転移する作用を有しているものと考えられた。
【００６２】
（１）エロンゲーション作用の検討
コンドロイチン／コンドロイチン硫酸鎖中でのＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ結合は、二糖の繰り返し構造（３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＵＡβ１−）_ｎ中での結合、及びコンドロイチン硫酸とリンケージ四糖（ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ）との結合の二種類が知られている。ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣがエロンゲーション作用を有するか否かを調べるために、コンドロイチン（生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製））がＧｌｃＮＡｃ受容体基質として働くか否かを調べた。糖残基受容体としてコンドロイチン及びコンドロイチン硫酸Ｃを用いて試験例１に従ってＨＰＬＣを用いて酵素活性の分析を行ったところ、逆相クロマトグラフィーで双方ともに新たなピークが観察された（コンドロイチン硫酸Ｃを糖残基受容体として使用した場合には溶出ピークは極めて低かった）（図４矢印）。この溶出ピークを回収し、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）で消化して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＨＲ１０／３０（ファルマシア社製）でゲルろ過分析した。その結果、ＧａｌＮＡｃがＧｌｃＵＡにβ１−４結合で付加されていることが確認された。
【００６３】
（２）イニシエーション作用の検討
イニシエーション作用は合成基質のリンケージ四糖−メトキシフェニル（ＧｌｃＵＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−ＭＰ：生化学工業株式会社提供）をＧａｌＮＡｃ受容体基質として用いて試験例１記載の方法により観察した。その結果、ＧａｌＮＡｃ受容体基質の２９．７分の溶出ピーク（Ｓ）の他に、２８．９分の新たな溶出ピーク（Ｐ）が生じた（図５Ｂ：Ａは対照）。
【００６４】
これらのピークを回収して試験例２に従ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳで解析した。ピークＳは質量７７９．２０ｍ／ｚを示し、この質量はリンケージ四糖の質量と同じであった（図６Ａ）。一方、ピークＰの分析においては９８２．２３ｍ／ｚ及び１００４．２１ｍ／ｚの二つのピークが観察された（図６Ｂ）。９８２．２３ｍ／ｚはＧａｌＮＡｃが結合したリンケージ四糖−ＭＰの質量に相当し、１００４．２１ｍ／ｚはＧａｌＮＡｃが結合したリンケージ四糖−ＭＰとナトリウムイオンとが結合した質量に相当していた。更に、ピークＰの物質は、「（１）コンドロイチン伸長作用の検討」で記載した方法と同様の方法でコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）で消化して調べた結果、ＧａｌＮＡｃは非還元末端に結合していることが明かとなった。
これらの結果からＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣはリンケージ四糖の非還元末端のＧｌｃＵＡに対してＧａｌＮＡｃを転移してコンドロイチン／コンドロイチン硫酸合成の開始を行うことが明かとなった。
【００６５】
（３）各種基質に対するＧａｌＮＡｃ転移作用の定量
ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣの各種ＧａｌＮＡｃ受容体基質に対するＧａｌＮＡｃ転移活性を比較した。使用したＧａｌＮＡｃ受容体基質としては、コンドロイチン（クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａから酸性メタノール溶液で脱硫酸して調製したもの：生化学工業株式会社製）、コンドロイチンのオリゴマー（１４糖、１２糖、１０糖、８糖、６糖：生化学工業株式会社より恵与）、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社））、コンドロイチン硫酸のオリゴマー（１４糖、１２糖、１０糖、８糖、６糖：Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２２６（１９８５），　７０５−７１４に従って調製した）およびリンケージ四糖−ＭＰ（生化学工業株式会社より恵与）である。また、方法は実施例２に示した方法を用いた（表１）。
【００６６】
【表１】

【００６７】
ＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣは、他の基質と比較してリンケージ四糖−ＭＰにＧａｌＮＡｃを転移する作用が最も強いことがこの結果から明かとなった。また、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸伸長作用に関しては、何れも低い活性であるが、長いオリゴ糖へのＧａｌＮＡｃ転移作用の方が短いオリゴ糖へのＧａｌＮＡｃ転移作用よりも強いことが明かとなった。
【００６８】
実施例３
組織におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現の解析
（１）組織におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の転写産物及びその量の解析
組織におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の転写産物の分子量はノザンブロットハイブリダイゼーション法によって解析した。ノザンブロットハイブリダイゼーション法は実施例１（１）で調製したＤＮＡ断片の３’末端部に存在する６９５ｂｐの翻訳されない領域をプローブとして行なった。プローブの調製は、上記ＤＮＡ断片を鋳型として用い、配列番号１６の塩基配列からなる５’プライマーと配列番号１７の塩基配列からなる３’プライマーとを用いて常法に従ってＰＣＲ法により増幅して６．９ｋｂｐの断片として回収した。
【００６９】
ノザンブロットハイブリダイゼーションはクロンテック社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ＩＩＩをハイブリダイズ用ＲＮＡとして用いて行なった。またプローブのラベルと検出はＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ（アマシャム　バイオサイエンス株式会社製）及び、ＣＤＰ−ＳｔａｒとＨｙｐｅｒｆｉｌｍとを含んだ検出システム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）。
【００７０】
ハイブリダイズは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ：２．９７Ｍ　ＮａＣｌ、０．２Ｍ　ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の水溶液）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト液：１ｇのフィコール４００（ファルマシア社製）、１ｇのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−３６０：シグマ社製）、１ｇのＢＳＡフラクションＶ（牛血清アルブミン：シグマ社製）を５０ｍｌの水に溶解した水溶液）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、サケ精子ＤＮＡの存在下、４２℃で１６時間のインキュベートして行い、更にその後の０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＰＥによる５５℃での順次洗浄を行なった。
【００７１】
その結果、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの転写産物は約４．４ｋｂｐであることが明かとなった（図７）。組織毎にその量には差異があったものの、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの転写産物は解析した全ての組織で検出された。
【００７２】
（２）組織及び培養細胞株におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ転写量の定量的リアルタイムＰＣＲ法による解析
定量的リアルタイムＰＣＲ法はＩｗａｉ，　Ｔ．ら（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７７（２００２），　１２８０２−１２８０９）、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　６（１９９６），　９９５−１００１、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　６（１９９６），　９８６−９９４等に記載された方法によって行なった。様々なヒト組織から増幅されたＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及び培養細胞株（ＧＯＴＯ、ＳＣＣＨ−２６：神経芽腫由来細胞、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１：膠芽腫由来細胞、ＳＷ１７３６：甲状腺癌由来細胞、ＨＬ−６０：前骨髄球白血病由来細胞、Ｎａｍａｌｗａ：Ｂ細胞白血病由来細胞、Ｄａｕｄｉ：Ｂ細胞バーキットリンパ腫由来細胞、Ｕ９３７：単球由来白血病由来細胞、Ｋ５６２：赤芽球様白血病由来細胞、Ｕ２６６：骨髄腫由来細胞、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ１５、ＬＳＢ、ＳＷ４８０：大腸癌由来細胞、ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯ　ＩＩＩ：胃癌由来細胞、Ｇ−３６１：黒色腫由来細胞、ＨｅｐＧ２：肝臓癌由来細胞、Ｃａｐａｎ−２：膵臓癌由来細胞、ＰＡ−１：卵巣奇形腫由来細胞）から常法により増幅して得たｃＤＮＡライブラリーを用いた。定量の基準としては段階希釈したｐＣＲ２．１（インビトロゲン社製：グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のＤＮＡを含んでいる）を用いた。
【００７３】
プライマー、プローブの組み合わせは配列番号１８記載の塩基配列からなる５’プライマー、配列番号１９記載の塩基配列からなる３’プライマー、及びマイナーグルーブ結合物質がついた配列番号２０記載の塩基配列からなるプローブの組み合わせを用いた。ＰＣＲ産物はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００シークエンス検出システム（アプライドバイオシステムス社製）で継続的に検出した。ＧＡＰＤＨ転写物の量によりＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ転写産物量を標準化した。
その結果、何れの組織に於いてもＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの転写は観察されたが、特に甲状腺と胎盤における転写量が高いことが明かとなった（図８）。また、いずれの癌由来の細胞においてもＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの転写量は極めて低いことが判明した（図９）。このことから、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの転写量の低下は癌化の示標となりうることが示され、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔは癌化の検出に使用できる可能性が示唆された。
【００７４】
（３）ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析
ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析に使用するためのリボプローブは、実施例１（１）で調製したＤＮＡ断片の翻訳されない３’末端の６９５ｂｐの領域をｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ（プロメガ社製）に挿入して調製した。デオキシゲニンで標識したセンス及びアンチセンスのプローブはこのプラスミドのＴ７プロモータ及びＳＰ６プロモータによって生ずるように構築した（センスプローブは陰性対照として働く）。胎盤組織の固定及びハイブリダイズはＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３（１９９８），　２６７２９−２６７３８記載の方法に従って行なった（図１０）。その結果、胎盤の脱落膜、合胞体層、栄養膜細胞層、線維細胞などの全ての種類の細胞でＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現が観察された。センスプローブで検出した試料に於いては何も検出されなかった。
【００７５】
実施例４
コンドロイチン五糖の酵素的合成
四種類の糖転移酵素（調製例１で調製したβ４Ｇａｌ−Ｔ７・β３Ｇａｌ−Ｔ６及びＧｌｃＡＴ−Ｉ、及びＣＳＧａｌＮＡｃ−ＴＣ）及び四糖合成系の受容体基質（キシロース結合ペプチド（配列番号２１：第９番目のアミノ酸残基であるセリンに側鎖としてキシロースが結合しているビクニンのＮ−末端配列：ペプチド研究所製））を使用し、合成された五糖合成系の受容体基質であるリンケージ四糖と、リンケージ四糖にＧａｌＮＡｃが結合した五糖の酵素学的合成を各々行なった。そして各々の反応後の産物を試験例１記載のＨＰＬＣによって分析した（四糖合成：図１１Ｂ，五糖合成：図１１Ｃ）。
【００７６】
反応液の組成は下表の通りで、反応は３７℃で１６時間行った。既知酵素によるそれぞれの産物は、各酵素を一つずつ添加していき、新たに一種類のみのピークが生じることを確認した。また、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔによる産物は、実施例２で示したコンドロイチナーゼＡＣ−ＩＩ消化により確認した。これらの結果から、四糖合成系ではセリン残基の側鎖にリンケージ四糖が結合したビクニンのＮ−末端配列（プロテオグリカン）が合成され、また五糖合成系では同様にリンケージ四糖とＧａｌＮＡｃとが結合した五糖を糖鎖として有するコンドロイチンプロテオグリカンが合成されたことが明かとなった。
【００７７】
【表２】

【００７８】
【発明の効果】
リンケージ四糖に対してＧａｌＮＡｃをＧａｌＮＡｃ供与体基質から転移する十分な作用を有する糖転移作用剤が本発明により提供され、それによりコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの効率よい合成が可能となる。
【００７９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔのアミノ酸配列とβ４Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列とのホモロジーを示す図である。
【図２】ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＧｌｃＵＡ−β−ｐＮｐへのＧａｌＮＡｃ転移活性をＨＰＬＣによって分析したチャートを示す図。Ａは対照を示す。
【図３】ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＧｌｃＵＡ−β−ｐＮｐへのＧａｌＮＡｃ転移活性をＥＳＩ−ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで観察したチャートを示す図。ＡはＥＳＩ−ＭＳのチャートを示し、ＢはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳのチャートを示す。
【図４】コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸Ｃに対するＧａｌＮＡｃ転移活性をＨＰＬＣによって分析したチャートを示す図。
【図５】ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからリンケージ四糖−ＭＰへのＧａｌＮＡｃ転移活性をＨＰＬＣによって分析したチャートを示す図。Ａは対照　を示す。
【図６】ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからリンケージ四糖−ＭＰへのＧａｌＮＡｃ転移活性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析したチャートを示す図。Ａは図５ＢのＳピークを分析した図であり、Ｂは図５ＢのＰピークを分析した図である。
【図７】組織におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現のノザンブロットハイブリダイゼーションによる像を示す写真である。
【図８】各組織におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現量のリアルタイムＰＣＲでの相対比較を示す図である。
【図９】各培養細胞におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現量のリアルタイムＰＣＲでの相対比較を示す図である。
【図１０】ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで胎盤組織におけるＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現を観察した写真である。
【図１１】本発明糖転移作用剤によるコンドロイチンプロテオグリカン合成を示す図である。Ａはキシロース結合ペプチドをＨＰＬＣで分析したチャートを示す。Ｂは四糖合成系での反応生成物をＨＰＬＣで分析したチャートを示す図であり、Ｃは五糖合成系での反応生成物をＨＰＬＣで分析したチャートを示す図である。Ｄは各ピークに存在する物質を模式的に示した図である。

Claims

下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質の下記式（１）における非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する作用を有することを特徴とする糖転移作用剤。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
下記式（２）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質の下記式（２）における非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する作用を有することを特徴とする糖転移作用剤。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ　　（２）
式（２）中、「Ｓｅｒ」は上記Ｘｙｌで示されるＤ−キシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Ｘｙｌ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖に結合したＤ−キシロース残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」、「Ｇａｌ」及び「−」は式（１）と同様である。
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に対し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基をβ１，４結合で転移することを特徴とする請求項１又は２記載の糖転移作用剤。
糖転移作用剤が配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質を含むことを特徴とする請求項１乃至３何れか一項記載の糖転移作用剤。
糖転移作用剤が配列番号２中アミノ酸番号３７乃至５３２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質を含むことを特徴とする請求項１乃至３何れか一項記載の糖転移作用剤。
請求項１乃至５何れか一項記載の糖転移作用剤を作用させて下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質に対してＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式（３）で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（３）
式（１）及び（３）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対して、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移して下記式（３）で示される構造を有する糖鎖を合成するための、請求項１乃至５何れか一項記載の糖転移作用剤の使用。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（１）
ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ　　（３）
式（１）及び（３）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
組織における配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡの発現量と、当該組織の癌化とを関連づけることを特徴とする癌化の検出方法。