JP2007254455A - コンドロイチン硫酸合成促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 関節疾患、椎間板疾患などの治療に有用なコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
【解決手段】 コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１のタンパク質、またはそれらをコードする遺伝子をコンドロイチン硫酸合成促進剤の有効成分とする。
【選択図】図７
【解決手段】 コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１のタンパク質、またはそれらをコードする遺伝子をコンドロイチン硫酸合成促進剤の有効成分とする。
【選択図】図７
Description
本発明は、コンドロイチン硫酸合成促進剤、及び、それを用いた関節疾患及び椎間板疾患処置剤に関する。
軟骨組織は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンにより主に構成されるアグリカンと呼ばれる巨大分子を含有しており、アグリカンは、硫酸化多糖がコアタンパクに共有結合してできるプロテオグリカンの一種であり、生体において重要な機能を有していることが知られている。軟骨組織において、コアタンパク部分にヒアルロン酸結合ドメインを有するアグリカンは、リンクタンパクと共にヒアルロン酸と巨大な複合体を形成しており、更に、アグリカンのコアタンパク部分に１００本以上のコンドロイチン硫酸鎖が結合していることにより、アグリカン分子中に多くの水分子を保持している。これにより、アグリカンは、高度に水和したゲル体を形成して存在し、衝撃力を吸収する作用や摩擦の低減作用（潤滑作用）のような軟骨組織における重要な機能を担っていると考えられている。
一方、最近、コンドロイチン硫酸鎖の合成に関与しているグリコシルトランスフェラーゼについて、コンドロイチン合成酵素−１（CSS-1、非特許文献１）、コンドロイチン合成酵素−２（CSS-2、非特許文献２、特許文献１）、コンドロイチン合成酵素−３（CSS-3、非特許文献３、特許文献２）、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ（CSGlcAT、非特許文献４）、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１（CSGalNAcT-1、非特許文献５）及びコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−２（CSGalNAcT-2、非特許文献６、特許文献３）が単離されたとの報告がある。
これら酵素の一般的機能は知られているが、これら酵素の生体内における役割は解明されておらず、上記アグリカンの生合成工程の一部であるコンドロイチン硫酸の生合成に関与している酵素も断定されていなかったため、これらの酵素が生体内でコンドロイチン硫酸の量を増加させうるかは不明であった。
J. Biol. Chem., Oct 2001; 276: 38721-38726 J. Biol. Chem., Aug 2003; 278: 30235-30247 J. Biol. Chem., Oct 2003; 278: 39711-39725 J. Biol. Chem., Oct 2002; 277:No.41: 38179-38188 J. Biol. Chem., Mar 2002; 277:No.11:8841-8846 J. Biol. Chem., Jan 2003; 278: 3063-3071 WO03/102194
WO03/102193
特開2003-289883号公報
これら酵素の一般的機能は知られているが、これら酵素の生体内における役割は解明されておらず、上記アグリカンの生合成工程の一部であるコンドロイチン硫酸の生合成に関与している酵素も断定されていなかったため、これらの酵素が生体内でコンドロイチン硫酸の量を増加させうるかは不明であった。
J. Biol. Chem., Oct 2001; 276: 38721-38726 J. Biol. Chem., Aug 2003; 278: 30235-30247 J. Biol. Chem., Oct 2003; 278: 39711-39725 J. Biol. Chem., Oct 2002; 277:No.41: 38179-38188 J. Biol. Chem., Mar 2002; 277:No.11:8841-8846 J. Biol. Chem., Jan 2003; 278: 3063-3071
軟骨組織は加齢や過負荷により障害が生じやすい。例えば、近年の高齢化に伴い、ひざ軟骨の摩耗により膝関節に痛みを生じる高齢者は増加しており、軟骨組織の機能を改善する方法は切望されている。高齢者の軟骨組織は、衝撃力を吸収する作用や摩擦の低減作用（潤滑作用）が著しく損なわれており、この軟骨組織特有の機能喪失はアグリカンをはじめとするプロテオグリカンの持つコンドロイチン硫酸鎖量の減少によるところが大きいと言われている。本発明者らは、これらを鑑み、アグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の生合成を促進することにより、軟骨組織の修復及び軟骨組織の機能改善を行うことを検討した。
本発明者らは上記課題の解決を目指し、鋭意検討を行った結果、コンドロイチン硫酸合成関連酵素であるコンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ（以下、CSGlcATとも言う）とコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１（以下、CSGalNAcT-1とも言う）が、マウス胎仔軟骨組織及びマウス軟骨分化細胞において、従来から知られているアグリカンの発現パターンと非常に強く相関して発現することを見出し、また、軟骨様細胞におけるCSGlcATとCSGalNAcT-1の強制的な過剰発現において、コンドロイチン硫酸合成が顕著に増加したという知見を得た。更に、マウス椎間板へのCSGalNAcT-1遺伝子の導入によるコンドロイチン硫酸の増加をin vivo実験にて確認し、本発明に至った。
本発明は、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）の核酸である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または配列番号１記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であって、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
本発明はまた、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子が下記（ｃ）又は（ｄ）の核酸である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（ｃ）配列番号３記載の塩基配列からなる核酸、又は
（ｄ）配列番号３記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または、配列番号３記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であって、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮ−アセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
本発明はまた、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼが下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転
移する活性を有するタンパク質。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１が下記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（Ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（Ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮーアセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有するタンパク質。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
本発明はまた、上述の（a）又は（b）の核酸であるコンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又は上述の(c)又は(d)の核酸であるコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物が発現可能なベクターに組み込み作製した発現ベクターを有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤、および、当該遺伝子構築物又は当該遺伝子構築物を含む発現ベクターを導入した細胞を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、前記何れかのコンドロイチン硫酸合成促進剤を有効成分とする関節又は椎間板疾患処置剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）の核酸である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または配列番号１記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であって、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
本発明はまた、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子が下記（ｃ）又は（ｄ）の核酸である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（ｃ）配列番号３記載の塩基配列からなる核酸、又は
（ｄ）配列番号３記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または、配列番号３記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であって、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮ−アセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
本発明はまた、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼが下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転
移する活性を有するタンパク質。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１が下記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である前記コンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
（Ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（Ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮーアセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有するタンパク質。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
本発明はまた、上述の（a）又は（b）の核酸であるコンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又は上述の(c)又は(d)の核酸であるコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物が発現可能なベクターに組み込み作製した発現ベクターを有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤、および、当該遺伝子構築物又は当該遺伝子構築物を含む発現ベクターを導入した細胞を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤を提供する。
本発明はまた、前記何れかのコンドロイチン硫酸合成促進剤を有効成分とする関節又は椎間板疾患処置剤を提供する。
本発明のコンドロイチン硫酸合成促進剤はアグリカンをはじめとするプロテオグリカンが有するコンドロイチン硫酸の合成を促進することができるため、軟骨の機能改善や関節疾患、椎間板疾患の治療などに好適に使用される。
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
本発明のコンドロイチン硫酸合成促進剤の第一の態様は、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤である。
本発明のコンドロイチン硫酸合成促進剤の第一の態様は、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤である。
コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ（CSGlcAT）をコードする遺伝子としては、配列番号１記載の塩基配列からなるヒトCSGlcATをコードする核酸を挙げることができる。この核酸は、例えば、ヒトの骨培養細胞などからRNAを単離し、配列番号１に基づいて設計したプライマーを用いてRT-PCRを行うことによって得ることができる。
また、CSGlcATをコードする遺伝子は、配列番号1の塩基配列を有するものに限定されず、CSGlcATの活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、通常のサザンブロッティングの洗浄の条件が挙げられ、具体的には、65℃、0.1×SSC、0.1%SDSの溶液中で洗浄する条件が挙げられる。
また、CSGlcATをコードする遺伝子は、CSGlcATの活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号１記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。ここで、数個とは、好ま
しくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
更に、CSGlcATをコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列と高い相同性を有するものも包含される。ここで、「高い相同性」とは、例えば、75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上であり、以下順次、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%に例示されるより高いパーセンテージがより好ましい。
上記のようなホモログ遺伝子には、種の違いによって天然に生じる変異体や紫外線照射や変異誘発剤などによる変異処理によって得られる変異体などが含まれる。CSGlcATをコードする遺伝子はヒト以外の生物由来の遺伝子であってもよいが、ヒトに対する医薬として使用する場合は、ヒト由来の遺伝子が好ましい。従って、CSGlcATをコードする遺伝子としては、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を挙げることもできる。
なお、CSGlcAT活性とは、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性をいう。この活性は、例えば、J. Biol. Chem. 2002 Oct 11;277(41):38179-88.に記載の方法によって測定することができる。
また、CSGlcATをコードする遺伝子は、配列番号1の塩基配列を有するものに限定されず、CSGlcATの活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、通常のサザンブロッティングの洗浄の条件が挙げられ、具体的には、65℃、0.1×SSC、0.1%SDSの溶液中で洗浄する条件が挙げられる。
また、CSGlcATをコードする遺伝子は、CSGlcATの活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号１記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。ここで、数個とは、好ま
しくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
更に、CSGlcATをコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列と高い相同性を有するものも包含される。ここで、「高い相同性」とは、例えば、75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上であり、以下順次、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%に例示されるより高いパーセンテージがより好ましい。
上記のようなホモログ遺伝子には、種の違いによって天然に生じる変異体や紫外線照射や変異誘発剤などによる変異処理によって得られる変異体などが含まれる。CSGlcATをコードする遺伝子はヒト以外の生物由来の遺伝子であってもよいが、ヒトに対する医薬として使用する場合は、ヒト由来の遺伝子が好ましい。従って、CSGlcATをコードする遺伝子としては、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を挙げることもできる。
なお、CSGlcAT活性とは、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性をいう。この活性は、例えば、J. Biol. Chem. 2002 Oct 11;277(41):38179-88.に記載の方法によって測定することができる。
コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１（CSGalNAcT-1）をコードする遺伝子としては、配列番号３記載の塩基配列からなるヒトCSGalNAcT-1をコードする核酸を挙げることができる。この核酸は、例えば、ヒトの骨培養細胞などからRNAを単離し、配列番号３に基づいて設計したプライマーを用いてRT-PCRを行うことによって得ることができる。
また、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有するものに限定されず、CSGalNAcT-1の活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号３記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、通常のサザンブロッティングの洗浄の条件が挙げられ、具体的には、65℃、0.1×SSC、0.1%SDSの溶液中で洗浄する条件が挙げられる。
また、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子は、CSGalNAcT-1の活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号３記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。ここで、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
更に、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列と高い相同性を有するものも包含される。ここで、「高い相同性」とは、例えば、75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上であり、以下順次、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%に例示されるより高いパーセンテージがより好ましい。
上記ようなホモログ遺伝子には、種の違いによって天然に生じる変異体や変異処理によって得られる変異体などが含まれる。CSGalNAcT-1をコードする遺伝子はヒト以外の生物由来の遺伝子であってもよいが、人に対する医薬として使用する場合は、ヒト由来の遺伝子が好ましい。従って、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子としては、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を挙げることもできる。
CSGalNAcT-1活性とは、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮーアセチルガラクトサミン残基を転移する活性をいう。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
CSGalNAcT-1活性は、例えば、J. Biol. Chem. 2002 Mar 15;277(11):8841-6.に記載の方法によって測定することができる。
また、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有するものに限定されず、CSGalNAcT-1の活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号３記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、通常のサザンブロッティングの洗浄の条件が挙げられ、具体的には、65℃、0.1×SSC、0.1%SDSの溶液中で洗浄する条件が挙げられる。
また、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子は、CSGalNAcT-1の活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号３記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。ここで、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
更に、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列と高い相同性を有するものも包含される。ここで、「高い相同性」とは、例えば、75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上であり、以下順次、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%に例示されるより高いパーセンテージがより好ましい。
上記ようなホモログ遺伝子には、種の違いによって天然に生じる変異体や変異処理によって得られる変異体などが含まれる。CSGalNAcT-1をコードする遺伝子はヒト以外の生物由来の遺伝子であってもよいが、人に対する医薬として使用する場合は、ヒト由来の遺伝子が好ましい。従って、CSGalNAcT-1をコードする遺伝子としては、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を挙げることもできる。
CSGalNAcT-1活性とは、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮーアセチルガラクトサミン残基を転移する活性をいう。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。
CSGalNAcT-1活性は、例えば、J. Biol. Chem. 2002 Mar 15;277(11):8841-6.に記載の方法によって測定することができる。
上記コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子を、遺伝子治療等に用いるためのコンドロイチン硫酸合成促進剤の有効成分とするには、通常の遺伝子治療に使用される遺伝子製剤の製剤化法に準じて製剤化すればよい。
例えば、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を、標的組織で発現可能なプロモーターに連結した遺伝子構築物を作製し、これを直接またはベクターに組み込んだ形で標的組織に導入する。プロモーターとしてはＣＭＶプロモーターのような構成的に発現するプロモーターでもよいが、組織特異的プロモーターが好ましい。標的組織としては、例えば、関節軟骨組織や椎間板組織などが挙げられ、軟骨細胞及び髄核細胞を標的とする場合、プロモーターとしては軟骨細胞及び髄核細胞で機能しうるプロモーター、例えば、コラーゲン遺伝子のプロモーターなどを使用することができる。ベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターやプラスミドベクターを用いることができる。一例としては、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子に２型コラーゲンプロモーターを連結した遺伝子構築物を作成し、当該構築物をアデノウイルスベクターに組み込み、当該本発明遺伝子を標的組織（例えば、椎間板組織など）に導入又は投与する方法等が挙げられる。
他にも、遺伝子構築物としては、配列番号１記載の塩基配列又は配列番号３記載の塩基配列に、遺伝子組み換え技術で通常用いられているタグ配列などを連結させた遺伝子構築物を作成することも可能であり、例えば、Ｖ５エピトープタグを連結させた遺伝子構築物などを作成することも出来る。勿論、プロモーター配列とタグ配列の両方を連結させた遺伝子構築物も作成可能である。なお、通常の遺伝子組み換え技術で行われているように、他の配列を連結させた遺伝子構築物を発現させることにより融合タンパク質を発現させることも可能である。
CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を含む遺伝子構築物又はそれを含むベクターは、薬学的に許容される担体と組合わせて標的組織に導入又は投与してもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水溶液、安定化剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡなどの複合体化剤などが挙げられる。また、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を含む遺伝子構築物又はそれを含むベクターは、リポソームと複合体化することにより導入することも可能である。また、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を含む遺伝子構築物又はそれを含むベクターを形質導入（トランスフェクト）した軟骨細胞等をコンドロイチン硫酸合成促進剤として軟骨組織等に投与することもできる。
本発明のCSGlcAT遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子は、外来遺伝子を保持させた担体や外来遺伝子を含む組成物を細胞や組織に圧力などによって打ち込むことにより、当該外来遺伝子を細胞や組織に導入する装置である遺伝子銃（例えば、ジーンガン、パーティクル銃等）を用いる遺伝子治療に適用することが出来る。すなわち、本発明は、本発明遺伝子が保持された遺伝子導入用の担体を軟骨組織や髄核細胞などに打ち込んで本発明遺伝子を導入するために、ヘリウムなどの気体を加速する管、遺伝子が保持された遺伝子導入用の担体を格納するための機構などを備え、標的組織への導入に適したサイズなどを有する遺伝子銃も提供することが出来る。遺伝子銃によって導入する方法に用いられる担体としては、細胞や組織に対して影響が少ないものを用いるのが好ましく、例えば、金粒子などが挙げられる。
一例としては、スペルミジンでコーティングされた金粒子の表面に本発明のCSGlcAT遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を物理的又は化学的に保持させた担体を作成し、当該担体を遺伝子銃により軟骨組織のような標的組織や細胞に打ち込むことにより、当該本発明遺伝子を標的組織や細胞に導入する方法が挙げられる。
遺伝子製剤の投与法は特に制限されないが、標的組織に局所的に投与することが好ましい。遺伝子製剤の投与量は核酸の発現効率や疾患の程度などに基づいて適宜調節される。
例えば、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を、標的組織で発現可能なプロモーターに連結した遺伝子構築物を作製し、これを直接またはベクターに組み込んだ形で標的組織に導入する。プロモーターとしてはＣＭＶプロモーターのような構成的に発現するプロモーターでもよいが、組織特異的プロモーターが好ましい。標的組織としては、例えば、関節軟骨組織や椎間板組織などが挙げられ、軟骨細胞及び髄核細胞を標的とする場合、プロモーターとしては軟骨細胞及び髄核細胞で機能しうるプロモーター、例えば、コラーゲン遺伝子のプロモーターなどを使用することができる。ベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターやプラスミドベクターを用いることができる。一例としては、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子に２型コラーゲンプロモーターを連結した遺伝子構築物を作成し、当該構築物をアデノウイルスベクターに組み込み、当該本発明遺伝子を標的組織（例えば、椎間板組織など）に導入又は投与する方法等が挙げられる。
他にも、遺伝子構築物としては、配列番号１記載の塩基配列又は配列番号３記載の塩基配列に、遺伝子組み換え技術で通常用いられているタグ配列などを連結させた遺伝子構築物を作成することも可能であり、例えば、Ｖ５エピトープタグを連結させた遺伝子構築物などを作成することも出来る。勿論、プロモーター配列とタグ配列の両方を連結させた遺伝子構築物も作成可能である。なお、通常の遺伝子組み換え技術で行われているように、他の配列を連結させた遺伝子構築物を発現させることにより融合タンパク質を発現させることも可能である。
CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を含む遺伝子構築物又はそれを含むベクターは、薬学的に許容される担体と組合わせて標的組織に導入又は投与してもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水溶液、安定化剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡなどの複合体化剤などが挙げられる。また、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を含む遺伝子構築物又はそれを含むベクターは、リポソームと複合体化することにより導入することも可能である。また、CSGlcAT 遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を含む遺伝子構築物又はそれを含むベクターを形質導入（トランスフェクト）した軟骨細胞等をコンドロイチン硫酸合成促進剤として軟骨組織等に投与することもできる。
本発明のCSGlcAT遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子は、外来遺伝子を保持させた担体や外来遺伝子を含む組成物を細胞や組織に圧力などによって打ち込むことにより、当該外来遺伝子を細胞や組織に導入する装置である遺伝子銃（例えば、ジーンガン、パーティクル銃等）を用いる遺伝子治療に適用することが出来る。すなわち、本発明は、本発明遺伝子が保持された遺伝子導入用の担体を軟骨組織や髄核細胞などに打ち込んで本発明遺伝子を導入するために、ヘリウムなどの気体を加速する管、遺伝子が保持された遺伝子導入用の担体を格納するための機構などを備え、標的組織への導入に適したサイズなどを有する遺伝子銃も提供することが出来る。遺伝子銃によって導入する方法に用いられる担体としては、細胞や組織に対して影響が少ないものを用いるのが好ましく、例えば、金粒子などが挙げられる。
一例としては、スペルミジンでコーティングされた金粒子の表面に本発明のCSGlcAT遺伝子又はCSGalNAcT-1遺伝子を物理的又は化学的に保持させた担体を作成し、当該担体を遺伝子銃により軟骨組織のような標的組織や細胞に打ち込むことにより、当該本発明遺伝子を標的組織や細胞に導入する方法が挙げられる。
遺伝子製剤の投与法は特に制限されないが、標的組織に局所的に投与することが好ましい。遺伝子製剤の投与量は核酸の発現効率や疾患の程度などに基づいて適宜調節される。
本発明のコンドロイチン硫酸合成促進剤の第二の態様は、コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤である。
CSGlcATタンパク質としては、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるヒトCSGlcATを挙げることができる。このタンパク質は生物体より抽出、精製したり、遺伝子工学的手法により得ることも出来る。例えば、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子を大腸菌や動物細胞または非ヒトトランスジェニック動物等に導入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによって得ることができる。該遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしてはpETベクター（Novagen社）やpGEXベクター（Amersham Pharmacia社）などが挙げられ、動物細胞に導入するためのベクターとしては、pcDNAベクター（Invitrogen社）などが挙げられる。
また、CSGlcATタンパク質は、種の違いなどによってアミノ酸置換などの配列変化が生じることが容易に予想され、特定のアミノ酸が類似の性質を有する別のアミノ酸に置換されたり（保存的置換）、活性に不要な部位のアミノ酸が欠失してもCSGlcAT活性に影響はないと考えられるため、CSGlcAT活性を保持する限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列において、一または数個のアミノ酸が付加、欠失、置換又は転位された配列を有するものであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
CSGlcATタンパク質はヒト以外の生物由来のタンパク質であってもよいが、ヒトに投与する医薬として使用する場合は、ヒト由来のタンパク質が好ましい。
また、CSGlcATタンパク質は、種の違いなどによってアミノ酸置換などの配列変化が生じることが容易に予想され、特定のアミノ酸が類似の性質を有する別のアミノ酸に置換されたり（保存的置換）、活性に不要な部位のアミノ酸が欠失してもCSGlcAT活性に影響はないと考えられるため、CSGlcAT活性を保持する限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列において、一または数個のアミノ酸が付加、欠失、置換又は転位された配列を有するものであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
CSGlcATタンパク質はヒト以外の生物由来のタンパク質であってもよいが、ヒトに投与する医薬として使用する場合は、ヒト由来のタンパク質が好ましい。
CSGalNAcT-1タンパク質としては、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるヒトCSGalNAcT-1を挙げることができる。このタンパク質は、生物体より抽出、精製したり、遺伝子工学的手法により得ることも出来る。例えば、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子を大腸菌や動物細胞または非ヒトトランスジェニック動物等に導入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによって得ることができる。
また、CSGalNAcT-1タンパク質は、種の違いなどによってアミノ酸置換などの配列変化が生じることが容易に予想され、特定のアミノ酸が類似の性質を有する別のアミノ酸に置換されたり（保存的置換）、活性に不要な部位のアミノ酸が欠失してもCSGalNAcT-1活性に影響はないと考えられるため、CSGalNAcT-1活性を保持する限りにおいて、配列番号４のアミノ酸配列において、一または数個のアミノ酸が付加、欠失、置換又は転位された配列を有するものであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
CSGalNAcT-1タンパク質はヒト以外の生物由来のタンパク質であってもよいが、ヒトに投与する医薬として使用する場合は、ヒト由来のタンパク質が好ましい。
また、CSGalNAcT-1タンパク質は、種の違いなどによってアミノ酸置換などの配列変化が生じることが容易に予想され、特定のアミノ酸が類似の性質を有する別のアミノ酸に置換されたり（保存的置換）、活性に不要な部位のアミノ酸が欠失してもCSGalNAcT-1活性に影響はないと考えられるため、CSGalNAcT-1活性を保持する限りにおいて、配列番号４のアミノ酸配列において、一または数個のアミノ酸が付加、欠失、置換又は転位された配列を有するものであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
CSGalNAcT-1タンパク質はヒト以外の生物由来のタンパク質であってもよいが、ヒトに投与する医薬として使用する場合は、ヒト由来のタンパク質が好ましい。
なお、一般に、酵素の作用発現のために糖鎖を必要としタンパク質に糖鎖が付加している酵素や、遺伝子工学的に製造された酵素において糖鎖が付加している場合があることが知られている。本発明においては、CSGlcAT又はCSGalNAcT-1活性を有する酵素であれば、糖鎖などを含有するものも、CSGlcAT又はCSGalNAcT-1に包含する。例えば、CSGlcATとしては、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられるが、当該タンパク質に糖鎖などが付加したものも包含する。 CSGlcATタンパク質又はCSGalNAcT-1タンパク質をそのままコンドロイチン硫酸合成促進剤として用いてもよいが、薬学的に許容される担体と配合することによって得られるものを用いてもよい。このような担体としては、賦形剤、安定化剤、等張化剤、界面活性剤、緩衝剤などが挙げられる。CSGlcATタンパク質又はCSGalNAcT-1タンパク質の剤型は特に制限されないが、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、湿布剤、塗布剤などが挙げられる。
タンパク質製剤の投与法は特に制限されないが、標的組織に局所的に投与することが好ましい。タンパク質製剤の投与量は疾患の程度などに基づいて適宜調節される。
タンパク質製剤の投与法は特に制限されないが、標的組織に局所的に投与することが好ましい。タンパク質製剤の投与量は疾患の程度などに基づいて適宜調節される。
本発明のコンドロイチン硫酸合成促進剤の適用としては、コンドロイチン硫酸の量を増加させることによって治療しうる疾患や障害であれば特に制限されないが、関節軟骨組織及び椎間板組織の機能改善に好ましく使用される。例えば、老化、疾病、傷害などによって起こる軟骨組織の減少、変形性関節症、外傷性関節障害等の関節疾患、椎間板変性や椎間板ヘルニア等の椎間板疾患などに対する治療剤として使用することができる。
また、本発明において、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1が、軟骨様細胞においてコンドロイチン硫酸の合成を促進することが示されたため、CSGlcAT遺伝子またはCSGalNAcT-1遺伝子の発現を増加させる化合物はコンドロイチン硫酸合成促進効果を有する低分子医薬となる可能性がある。例えば、軟骨培養細胞に試験化合物を添加し、CSGlcATまたはCSGalNAcT-1のmRNAまたはタンパク質量を測定し、CSGlcATまたはCSGalNAcT-1のmRNAまたはタンパク質量を増加させる化合物を選択することにより、コンドロイチン硫酸合成促進剤をスクリーニングすることができる。
また、生体外において、CSGlcAT遺伝子及び／またはCSGalNAcT-1遺伝子を培養軟骨細胞に発現させてコンドロイチン硫酸合成能が向上した細胞を作製し、これを移植用軟骨細胞とすることもできる。培養軟骨細胞はヒト由来のものが好ましく、CSGlcAT遺伝子及び／またはCSGalNAcT-1遺伝子を含むウイルスベクターやプラスミドベクターを用いて培養軟骨細胞にこれらの遺伝子を発現させ、コンドロイチン硫酸合成の向上を確かめた後に、遺伝子導入培養軟骨細胞を障害部位に移植すればよい。
また、本発明は、ヒト、家畜（馬、牛、豚など）、ペット（犬、猫など）等の哺乳類をはじめとする関節や椎間板及び軟骨組織や軟骨細胞を有する生物体に、CSGlcATをコードする遺伝子及びCSGalNAcT-1をコードする遺伝子の少なくとも１つを導入することからなるコンドロイチン硫酸合成促進方法を提供することも可能である。生物体への遺伝子の導入方法としては、遺伝子治療について説明した上述の方法が挙げられる。例えば、CSGlcATをコードする遺伝子又はCSGalNAcT-1をコードする遺伝子を物理的又は化学的に保持させた担体を作成し、当該担体を遺伝子銃により生物体へ導入する方法や、これら遺伝子の遺伝子構築物を組み込んだベクターや当該ベクターを形質導入した細胞を遺伝子銃や注入により生物体へ導入する方法が挙げられる。更に、本発明は、前記の哺乳類をはじめとする関節や椎間板及び軟骨組織や軟骨細胞を有する生物体に、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の少なくとも１つを投与（例えば、注入）することからなるコンドロイチン硫酸合成促進方法を提供することも可能である。
また、本発明は、ヒト、家畜（馬、牛、豚など）、ペット（犬、猫など）等の哺乳類をはじめとする関節や椎間板及び軟骨組織や軟骨細胞を有する生物体に、CSGlcATをコードする遺伝子及びCSGalNAcT-1をコードする遺伝子の少なくとも１つを導入することからなるコンドロイチン硫酸合成促進方法を提供することも可能である。生物体への遺伝子の導入方法としては、遺伝子治療について説明した上述の方法が挙げられる。例えば、CSGlcATをコードする遺伝子又はCSGalNAcT-1をコードする遺伝子を物理的又は化学的に保持させた担体を作成し、当該担体を遺伝子銃により生物体へ導入する方法や、これら遺伝子の遺伝子構築物を組み込んだベクターや当該ベクターを形質導入した細胞を遺伝子銃や注入により生物体へ導入する方法が挙げられる。更に、本発明は、前記の哺乳類をはじめとする関節や椎間板及び軟骨組織や軟骨細胞を有する生物体に、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の少なくとも１つを投与（例えば、注入）することからなるコンドロイチン硫酸合成促進方法を提供することも可能である。
軟骨におけるコンドロイチン硫酸糖転移酵素の発現
軟骨におけるコンドロイチン硫酸糖転移酵素の発現を確認する為、マウスE16.5胎仔由来上腕骨を用いて、in situハイブリダイゼーションを行った。
マウスのCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2、アグリカン、バーシカン及び１０型コラーゲンα１鎖（Col10a1）それぞれに対応するジゴキシゲニン（DIG）結合11-UTP-ラベル化一本鎖アンチセンスＲＮＡプローブは、DIG RNAラベル化キット（Boehringer Mannheim社製）を用い、製造指示書に従って作成した。マウスE16.5胎仔より上腕骨を採取し、パラフィン切片を作成した。当該パラフィン切片を脱パラフィンした後、切片を4％パラフォルムアルデヒドで10分間固定し、更に、20ng/mLプロテインキナーゼK（Roche社製）で37度、7分間処理した。処理した切片を4％パラフォルムアルデヒドで10分間再固定した後、0.2mol/ L塩酸で10分間、0.25mol/ L無水酢酸/0.1mol/Lトリエチルアミン（TEA）で10分間、処理した。切片をエタノールで脱水して風乾させた後、上述の方法で作成した各種ＲＮＡプローブ（濃度1.0μg/mL）と50℃、20時間のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに付した切片を2×SSC（0.3mol/L クエン酸
ナトリウム、3mol/L塩化ナトリウムから成る緩衝液）／50％ホルムアミドで洗浄した後、20μg/mL RNaseA/TNE緩衝液（10mmol/L トリス塩酸(ｐＨ8.0)、0.5mol/L塩化ナトリウム、1mmol/Lエチレンジアミン四酢酸二水素ナトリウム(EDTA)からなる緩衝液）で37℃、20分間処理し、更に、2×SSCで50℃、10分、20×SSCで50℃、20分間洗浄した。次いで、切片について1.5％Blocking reagent（Applied Biosystems社製）で37℃、1時間のブロッキングを行い、更に、500倍希釈した抗DIG抗体（Roche社製）で37℃、１時間反応させ、最後にNBT/BIP（ニトロブルーテトラゾリウム塩酸／ブロモクロロインドリルリン酸、Roche社製）により、切片におけるCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2、アグリカン、バーシカン及び１０型コラーゲンα１鎖（Col10a1）の核酸それぞれについて、室温で56時間の発色を行った。また、ヘマトキシリン染色およびアルシアンブルー染色も同時に行った。
結果を図１に示す。
６種類のコンドロイチン硫酸糖転移酵素において、軟骨でmRNAの発現が強く確認されたのは、CSS-1、CSS-2、CSGlcAT、CSGalNAcT-1の４種類であり、CSS-3及びCSGalNAcT-2は発現が認められなかった。これら４種類の糖転移酵素は、関節面を覆っている関節軟骨及び成長軟骨において、アグリカンやバーシカンのコアプロテインと局在が一致し、発現が確認された。
軟骨におけるコンドロイチン硫酸糖転移酵素の発現を確認する為、マウスE16.5胎仔由来上腕骨を用いて、in situハイブリダイゼーションを行った。
マウスのCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2、アグリカン、バーシカン及び１０型コラーゲンα１鎖（Col10a1）それぞれに対応するジゴキシゲニン（DIG）結合11-UTP-ラベル化一本鎖アンチセンスＲＮＡプローブは、DIG RNAラベル化キット（Boehringer Mannheim社製）を用い、製造指示書に従って作成した。マウスE16.5胎仔より上腕骨を採取し、パラフィン切片を作成した。当該パラフィン切片を脱パラフィンした後、切片を4％パラフォルムアルデヒドで10分間固定し、更に、20ng/mLプロテインキナーゼK（Roche社製）で37度、7分間処理した。処理した切片を4％パラフォルムアルデヒドで10分間再固定した後、0.2mol/ L塩酸で10分間、0.25mol/ L無水酢酸/0.1mol/Lトリエチルアミン（TEA）で10分間、処理した。切片をエタノールで脱水して風乾させた後、上述の方法で作成した各種ＲＮＡプローブ（濃度1.0μg/mL）と50℃、20時間のハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに付した切片を2×SSC（0.3mol/L クエン酸
ナトリウム、3mol/L塩化ナトリウムから成る緩衝液）／50％ホルムアミドで洗浄した後、20μg/mL RNaseA/TNE緩衝液（10mmol/L トリス塩酸(ｐＨ8.0)、0.5mol/L塩化ナトリウム、1mmol/Lエチレンジアミン四酢酸二水素ナトリウム(EDTA)からなる緩衝液）で37℃、20分間処理し、更に、2×SSCで50℃、10分、20×SSCで50℃、20分間洗浄した。次いで、切片について1.5％Blocking reagent（Applied Biosystems社製）で37℃、1時間のブロッキングを行い、更に、500倍希釈した抗DIG抗体（Roche社製）で37℃、１時間反応させ、最後にNBT/BIP（ニトロブルーテトラゾリウム塩酸／ブロモクロロインドリルリン酸、Roche社製）により、切片におけるCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2、アグリカン、バーシカン及び１０型コラーゲンα１鎖（Col10a1）の核酸それぞれについて、室温で56時間の発色を行った。また、ヘマトキシリン染色およびアルシアンブルー染色も同時に行った。
結果を図１に示す。
６種類のコンドロイチン硫酸糖転移酵素において、軟骨でmRNAの発現が強く確認されたのは、CSS-1、CSS-2、CSGlcAT、CSGalNAcT-1の４種類であり、CSS-3及びCSGalNAcT-2は発現が認められなかった。これら４種類の糖転移酵素は、関節面を覆っている関節軟骨及び成長軟骨において、アグリカンやバーシカンのコアプロテインと局在が一致し、発現が確認された。
軟骨細胞の分化におけるコンドロイチン硫酸糖転移酵素の発現パターン
軟骨分化系細胞であるATDC5細胞を、５％ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/F-12培地の混合培地で培養し、更に、軟骨細胞の分化を誘導する為、confluence状態の培養細胞を、10μg/mLのウシインスリン、10μg/mLのヒトトランスフェリン、3x10-8mol/L亜セレン酸ナトリウムで処理した。
分化誘導前の約80％confluenceな状態（growing phase）を０日目とし、分化誘導後１日目、３日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目に、 マウス由来のCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2及びアグリカン各々に対応する遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量をそれぞれreal time RT-PCRにより測定した。
ｍRNAはMicro-FastTrack（Invitrogen社製）を用いて抽出し、抽出したmRNAを元にしてSuperScript First-Strand（Invitrogen社製）を用いてｃDNA を作成した。各遺伝子に対するプライマーと蛍光標識プローブは下記表１に示すものを用いた。なお、当該プライマーとプローブはPrimer Express 1.0 softwareを用いてデザインした。PCR反応は、cDNA水溶液を５μL、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems社製)を２５μL、更に100nmol/L プローブと100nmol/L プライマーを加えて、総計50μLで行い、96-well plate上でABI Prism 7700 (Applied Biosystems社製)を用いて行いて測定した。
軟骨分化系細胞であるATDC5細胞を、５％ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/F-12培地の混合培地で培養し、更に、軟骨細胞の分化を誘導する為、confluence状態の培養細胞を、10μg/mLのウシインスリン、10μg/mLのヒトトランスフェリン、3x10-8mol/L亜セレン酸ナトリウムで処理した。
分化誘導前の約80％confluenceな状態（growing phase）を０日目とし、分化誘導後１日目、３日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目に、 マウス由来のCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2及びアグリカン各々に対応する遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量をそれぞれreal time RT-PCRにより測定した。
ｍRNAはMicro-FastTrack（Invitrogen社製）を用いて抽出し、抽出したmRNAを元にしてSuperScript First-Strand（Invitrogen社製）を用いてｃDNA を作成した。各遺伝子に対するプライマーと蛍光標識プローブは下記表１に示すものを用いた。なお、当該プライマーとプローブはPrimer Express 1.0 softwareを用いてデザインした。PCR反応は、cDNA水溶液を５μL、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems社製)を２５μL、更に100nmol/L プローブと100nmol/L プライマーを加えて、総計50μLで行い、96-well plate上でABI Prism 7700 (Applied Biosystems社製)を用いて行いて測定した。
なお、上記mRNAの測定値は、上述の方法で同様に測定されたグリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の遺伝子転写産物量（mRNA量）で標準化した。標準化されたmRNA発現量は、分化誘導前（0日目）における発現量に対する倍数として示した（図２）。
軟骨細胞の分化におけるコンドロイチン硫酸糖転移酵素の発現パターン
軟骨分化系細胞であるN1511細胞を、10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを補足した最小必須培地アルファ（α-ＭＥＭ培地）において、３７℃、５％二酸化炭素下で培養し、更に、confluence状態の培養細胞を、1x10-6mol/Lのデキサメタゾン水溶液及び1x10-7mol/Lのラット由来パラチロイドホルモン（PTH）水溶液で処理することにより、分化を誘導させた。分化誘導前の約80％confluenceな状態（growing phase）を０日目とし、分化誘導後1日目、3日目、5日目、7日目、14日目、21日目に、実施例２の方法に従いCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2及びアグリカン各々に対応する
遺伝子の転写産物であるmRNAをそれぞれ測定し、mRNAの測定値は、実施例２と同様にGAPDHのmRNA量で標準化した。標準化されたmRNA発現量は、分化誘導前における発現量に対する倍数として示した（図３）。
軟骨分化系細胞であるN1511細胞を、10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを補足した最小必須培地アルファ（α-ＭＥＭ培地）において、３７℃、５％二酸化炭素下で培養し、更に、confluence状態の培養細胞を、1x10-6mol/Lのデキサメタゾン水溶液及び1x10-7mol/Lのラット由来パラチロイドホルモン（PTH）水溶液で処理することにより、分化を誘導させた。分化誘導前の約80％confluenceな状態（growing phase）を０日目とし、分化誘導後1日目、3日目、5日目、7日目、14日目、21日目に、実施例２の方法に従いCSS-1、CSS-2、CSS-3、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2及びアグリカン各々に対応する
遺伝子の転写産物であるmRNAをそれぞれ測定し、mRNAの測定値は、実施例２と同様にGAPDHのmRNA量で標準化した。標準化されたmRNA発現量は、分化誘導前における発現量に対する倍数として示した（図３）。
結果より、実施例２におけるATDC５細胞及び実施例３におけるN1511細胞共に、分化誘導を行うことにより、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の転写産物量は、他の酵素と比較して顕著な増加が確認された。一方、ATDC５細胞やN1511細胞の様な軟骨分化系細胞においては、分化誘導による分化過程においてアグリカン合成が増加することが既に知られており、例えばATDC5細胞では分化誘導後７〜１０日でアグリカンのコアタンパク質の転写産物量（ｍＲＮＡ）がピークに達することが知られている。今回の実験結果においても、アグリカンの転写産物量は７日目辺りでピークを示しており、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の転写産物量については、アグリカンのコアプロテインに対する遺伝子の転写産物量の変化との間に相関性が確認出来る。よって、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1は、軟骨組織におけるコンドロイチン硫酸鎖合成を担っていると推測される。
なお、CSS-3の転写産物（mRNA）は全経過にわたり検出できなかった。
なお、CSS-3の転写産物（mRNA）は全経過にわたり検出できなかった。
マウス胎仔繊維芽細胞におけるコンドロイチン硫酸糖転移酵素の発現パターン
マウス胎仔繊維芽細胞（MEFs）（BD Bioscience社製）を、１０％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地において、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。
約８０％confluenceな状態であるGrowing phaseとconfluent状態から１週間後とに、実施例２の方法に従いCSS-1、CSS-2、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2及びアグリカン各々に対応する遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量をそれぞれ測定した。mRNAの測定値は、実施例２と同様にGAPDHのmRNA量で標準化した。
実施例２、３における分化誘導前のgrowing phase時（０日目）と分化誘導から１週間後における各遺伝子のmRNA発現量と、実施例４におけるgrowing phase時とconfluent状態から一週間後における各遺伝子のmRNA発現量とを、実施例２で測定されたATDC5細胞におけるgrowing phase時のmRNA発現量に対する倍数として各々示した（図４）。
CSGlcAT、CSGalNAcT-1及びアグリカンのmRNA発現量は、軟骨分化系細胞であるATDC5細胞及びN1511細胞では分化誘導後１週間目において著しい増加が見られ、また、アグリカンの増加との相関性も確認された。一方、軟骨細胞に分化しない線維芽細胞（MEF）においては、CSGlcATのmRNA発現量はほとんど測定されず、CSGalNAcT-1のmRNA発現量も、軟骨分化系細胞に比べて変化は少なかった。
実施例２、３、４の結果を鑑みると、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の発現は軟骨分化系細胞における軟骨分化との相関性が非常に高いことが確認された。
また、実施例１の結果と同様に、CSGalNAcT-2のmRNA発現量は、線維芽細胞において多く検出され、軟骨分化系細胞においては殆ど検出されなかった。
マウス胎仔繊維芽細胞（MEFs）（BD Bioscience社製）を、１０％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地において、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。
約８０％confluenceな状態であるGrowing phaseとconfluent状態から１週間後とに、実施例２の方法に従いCSS-1、CSS-2、CSGlcAT、CSGalNAcT-1、CSGalNAcT-2及びアグリカン各々に対応する遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量をそれぞれ測定した。mRNAの測定値は、実施例２と同様にGAPDHのmRNA量で標準化した。
実施例２、３における分化誘導前のgrowing phase時（０日目）と分化誘導から１週間後における各遺伝子のmRNA発現量と、実施例４におけるgrowing phase時とconfluent状態から一週間後における各遺伝子のmRNA発現量とを、実施例２で測定されたATDC5細胞におけるgrowing phase時のmRNA発現量に対する倍数として各々示した（図４）。
CSGlcAT、CSGalNAcT-1及びアグリカンのmRNA発現量は、軟骨分化系細胞であるATDC5細胞及びN1511細胞では分化誘導後１週間目において著しい増加が見られ、また、アグリカンの増加との相関性も確認された。一方、軟骨細胞に分化しない線維芽細胞（MEF）においては、CSGlcATのmRNA発現量はほとんど測定されず、CSGalNAcT-1のmRNA発現量も、軟骨分化系細胞に比べて変化は少なかった。
実施例２、３、４の結果を鑑みると、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の発現は軟骨分化系細胞における軟骨分化との相関性が非常に高いことが確認された。
また、実施例１の結果と同様に、CSGalNAcT-2のmRNA発現量は、線維芽細胞において多く検出され、軟骨分化系細胞においては殆ど検出されなかった。
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の形質転換体の作製
ヒト由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各発現ベクターをラット軟骨様腫瘍細胞（ＬＴＣ細胞）に形質移入して培養し、1mg/mL のG418二硫酸塩水溶液（Nacalai tesque社製）によって各形質転換体の細胞を選別し得た。
具体的には、ラット軟骨様腫瘍細胞（LTC細胞）を、１０％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地において３７℃、５％二酸化炭素下で培養し、次いで、それぞれの発現ベクターを制限酵素PvuI（New England Biolabs社製）で切断して直線化させ、FuGENE６（Roche社製）を用いて製造指示書に従い形質導入を行った。形質導入の翌日に、前記培養液中に1mg/mLの G418二硫酸塩水溶液を加え、更に10日間培養して形質
転換体を選別した。なお、発現ベクターは、ヒト由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各cDNAをpcDNA3.1(+)（Invitrogen社製）ベクターに組み込み、作製されているもの（産業技術総合研究所糖鎖工学研究センター後藤博士より供与）を用いた。
また、対照として、同様の方法で各酵素の代わりにpcDNA3.1（＋）（Invitrogen社製）を形質導入した形質転換体（Mock）を作製した。
ヒト由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各発現ベクターをラット軟骨様腫瘍細胞（ＬＴＣ細胞）に形質移入して培養し、1mg/mL のG418二硫酸塩水溶液（Nacalai tesque社製）によって各形質転換体の細胞を選別し得た。
具体的には、ラット軟骨様腫瘍細胞（LTC細胞）を、１０％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地において３７℃、５％二酸化炭素下で培養し、次いで、それぞれの発現ベクターを制限酵素PvuI（New England Biolabs社製）で切断して直線化させ、FuGENE６（Roche社製）を用いて製造指示書に従い形質導入を行った。形質導入の翌日に、前記培養液中に1mg/mLの G418二硫酸塩水溶液を加え、更に10日間培養して形質
転換体を選別した。なお、発現ベクターは、ヒト由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各cDNAをpcDNA3.1(+)（Invitrogen社製）ベクターに組み込み、作製されているもの（産業技術総合研究所糖鎖工学研究センター後藤博士より供与）を用いた。
また、対照として、同様の方法で各酵素の代わりにpcDNA3.1（＋）（Invitrogen社製）を形質導入した形質転換体（Mock）を作製した。
形質転換体の分析
実施例５において製作した各形質転換体について以下の分析を行った。
（１）各酵素の発現量の測定
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各形質転換体、及び、Mockにおける、各外来性酵素（ヒト由来）の発現量と内因性酵素（ラット由来）の発現量とを実施例２の方法に従いreal time RT-PCR法により測定した。それぞれの遺伝子に対するプライマーと蛍光標識プローブは、Primer Express1.0 softwareを用いてデザインした。それぞれの発現ベクターをコントロールとして測定し、ヒト由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1、および、ラット由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1のコピー数（転写産物量）で表した。（図５）
実施例５において製作した各形質転換体について以下の分析を行った。
（１）各酵素の発現量の測定
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各形質転換体、及び、Mockにおける、各外来性酵素（ヒト由来）の発現量と内因性酵素（ラット由来）の発現量とを実施例２の方法に従いreal time RT-PCR法により測定した。それぞれの遺伝子に対するプライマーと蛍光標識プローブは、Primer Express1.0 softwareを用いてデザインした。それぞれの発現ベクターをコントロールとして測定し、ヒト由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1、および、ラット由来CSGlcAT及びCSGalNAcT-1のコピー数（転写産物量）で表した。（図５）
（２）アルシアンブルー染色及び免疫染色
次の方法にてアルシアンブルー染色を行った。6-well plateを用いた10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地に、各形質転換体を播種し、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。１日後、80%confluenceの状態で、４％パラフォルムアルデヒドで培地中の各形質転換体を固定し、０．１mol/L塩酸に溶解し調製した０．１％アルシアンブルーで３０分間処理し、アルシアンブルー染色を行った（図６上段）。
また、免疫染色は、コンドロイチン４−硫酸（C4S）に対するマウスモノクローナル抗体（Ab-Chondroitin-4Sulfate／chicken(LY111)、生化学工業株式会社製）及びアグリカンに対するウサギポリクローナル抗体（愛知医科大学分子医科学研究所矢田博士より供与）を用いて行った（図６下段）。
次の方法にてアルシアンブルー染色を行った。6-well plateを用いた10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地に、各形質転換体を播種し、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。１日後、80%confluenceの状態で、４％パラフォルムアルデヒドで培地中の各形質転換体を固定し、０．１mol/L塩酸に溶解し調製した０．１％アルシアンブルーで３０分間処理し、アルシアンブルー染色を行った（図６上段）。
また、免疫染色は、コンドロイチン４−硫酸（C4S）に対するマウスモノクローナル抗体（Ab-Chondroitin-4Sulfate／chicken(LY111)、生化学工業株式会社製）及びアグリカンに対するウサギポリクローナル抗体（愛知医科大学分子医科学研究所矢田博士より供与）を用いて行った（図６下段）。
（３）コンドロイチン硫酸合成活性の測定
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各遺伝子を導入したＬＴＣ細胞の形質転換体を、細胞培養皿（Falcon社製、3003）を用い、10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地において、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。翌日、100μCi／mLの35Ｓ硫酸塩水溶液を培地に加え、更に２４時間培養してラベル化した。次いで、形質転換体細胞と培養基質を各々回収し、０．１mol/L水酸化ナトリウム水溶液で、４℃、１６時間処理し、グリコサミノグリカン（GAG）鎖を溶出した。その後、当該溶出液を４mol/L酢酸で中和し、更に、20mmol/Lトリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液にプロテインキナーゼＫ（20mg/mL、Roche社製）５μLを加えたものを添加し、３７℃、１２時間処理した。１００℃でプロテインキナーゼＫを不活化した後、ＤＮａｓｅＩ（10mg/mL、Boehringer Mannheim社製）１０μL及びＲＮａｓｅＡ（10mg/mL、Wako社製）１０μLを加えて、３７℃、２時間処理し、反応液よりグリコサミノグリカン鎖を回収した。回収したＧＡＧ鎖をＤＥＡＥ-セファロースを充填したカラムに付し、０．２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液でカラムを洗浄した後、２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液でＧＡＧ画分を溶出した。得られたＧＡＧを、１．３％酢酸カリウム水溶液及び９５％エタノールで沈殿させ、得られた沈殿を、５０ｍmol/Lトリス塩酸（p H７．５）及び０．２mol/Lの塩化ナトリウム緩衝液に懸濁させた。ＧＡＧ懸濁液を３つに分け、それぞれ、ヘパリチナーゼI、ヘパリチナーゼII及びヘパリナーゼ（全て生化学工業株式会社製）を含むヘパリチナーゼ混合物処理、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）処理、及び、無処理を行った。引き続き、５０ｍmol/Lトリス塩酸（p H７．５）と０．２mol/Lの塩化ナトリウムからなる水溶液で平衡化したスーパーロース６（Amersham Biosciences社製）を充填したカラムに、各々の処理を行ったＧＡＧを付し、５０mmol/Lトリス塩酸（ｐＨ７．５）と０．２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液からなる水溶液で溶出し、０．５ｍＬ画分毎に回収した。各画分におけるラベル化ＧＡＧの放射能を液体シンチレーションカウンターを用いて計測し、溶出曲線を作成した（図７下段）。
図７上段のグラフは、溶出曲線グラフ中のコンドロイチナーゼＡＢＣ処理したサンプル（一番下のグラフ）について、形質転換体細胞と培養基質それぞれについて、コンドロイチン硫酸の分解物が溶出している画分である１９．５ｍＬ〜２１ｍＬ画分の放射能カウント数を合計して表したものである。
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各遺伝子を導入したＬＴＣ細胞の形質転換体を、細胞培養皿（Falcon社製、3003）を用い、10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地において、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。翌日、100μCi／mLの35Ｓ硫酸塩水溶液を培地に加え、更に２４時間培養してラベル化した。次いで、形質転換体細胞と培養基質を各々回収し、０．１mol/L水酸化ナトリウム水溶液で、４℃、１６時間処理し、グリコサミノグリカン（GAG）鎖を溶出した。その後、当該溶出液を４mol/L酢酸で中和し、更に、20mmol/Lトリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液にプロテインキナーゼＫ（20mg/mL、Roche社製）５μLを加えたものを添加し、３７℃、１２時間処理した。１００℃でプロテインキナーゼＫを不活化した後、ＤＮａｓｅＩ（10mg/mL、Boehringer Mannheim社製）１０μL及びＲＮａｓｅＡ（10mg/mL、Wako社製）１０μLを加えて、３７℃、２時間処理し、反応液よりグリコサミノグリカン鎖を回収した。回収したＧＡＧ鎖をＤＥＡＥ-セファロースを充填したカラムに付し、０．２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液でカラムを洗浄した後、２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液でＧＡＧ画分を溶出した。得られたＧＡＧを、１．３％酢酸カリウム水溶液及び９５％エタノールで沈殿させ、得られた沈殿を、５０ｍmol/Lトリス塩酸（p H７．５）及び０．２mol/Lの塩化ナトリウム緩衝液に懸濁させた。ＧＡＧ懸濁液を３つに分け、それぞれ、ヘパリチナーゼI、ヘパリチナーゼII及びヘパリナーゼ（全て生化学工業株式会社製）を含むヘパリチナーゼ混合物処理、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）処理、及び、無処理を行った。引き続き、５０ｍmol/Lトリス塩酸（p H７．５）と０．２mol/Lの塩化ナトリウムからなる水溶液で平衡化したスーパーロース６（Amersham Biosciences社製）を充填したカラムに、各々の処理を行ったＧＡＧを付し、５０mmol/Lトリス塩酸（ｐＨ７．５）と０．２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液からなる水溶液で溶出し、０．５ｍＬ画分毎に回収した。各画分におけるラベル化ＧＡＧの放射能を液体シンチレーションカウンターを用いて計測し、溶出曲線を作成した（図７下段）。
図７上段のグラフは、溶出曲線グラフ中のコンドロイチナーゼＡＢＣ処理したサンプル（一番下のグラフ）について、形質転換体細胞と培養基質それぞれについて、コンドロイチン硫酸の分解物が溶出している画分である１９．５ｍＬ〜２１ｍＬ画分の放射能カウント数を合計して表したものである。
（４）コンドロイチナーゼＡＢＣ処理により生じたＧＡＧ分解物における二糖組成
Analytical Biochemistry, 177, 327-332 (1989)の方法を参考にして、形質転換体により合成されるグリコサミノグリカン鎖のコンドロイチナーゼＡＢＣ処理分解物について二糖組成を検討した。
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各遺伝子を導入したＬＴＣ細胞の形質転換体を、細胞培養皿（Falcon社製；3003）を用いた10％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地に播種し、３７℃、５％二酸化炭素下で24時間培養した。次いで、形質転換体細胞と培養基質を各々回収し、0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液で4℃、16時間処理しGAG鎖を溶出した。その後、当該溶出液を４mol/L酢酸で中和した後、更に、20ｍmol/Lトリス塩酸（ｐH8.0）緩衝液にプロテインキナーゼK（20mg/mL、Roche社製）５μＬを加えたものによって、３７℃、12時間処理した。100度でプロテインキナーゼＫを不活化した後、DNaseI（10mg/mL、Boehringer Mannheim社製）10μL、RNaseA（10mg/mL、Wako社製）10μＬを加えて、３７℃、2時間処理し、反応液よりグリコサミノグリカン鎖（GAG鎖）を回収した。回収したGAG鎖をDEAE-セファロースを充填したカラムに付し、0.2mol/Lの塩化ナトリウム水溶液でカラムを洗浄後、GAG画分を２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。溶出液中のGAGを1.3％酢酸カリウム水溶液及び95％エタノールで沈殿させ、得られた沈殿を50ｍmol/Lトリス塩酸（p H7.5）と0.2mol/Lの塩化ナトリウム緩衝液とから成る水溶液に懸濁させた。当該GAG懸濁液をコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）により処理した。
コンドロイチナーゼＡＢＣ処理により生じたＧＡＧ分解物について蛍光分析用postcolume高速液体クロマトグラフィーにより当該分解物の二糖組成を分析した（図８）。
図８上段のグラフは、形質転換体細胞と培養基質について、得られたMock、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の２糖組成グラフ（図８下段）の各ピーク（０S、４S、Di(4,6)S）の面積を計測し合計した値に基づくグラフである。なお、計測値は、同様の方法で計測した１０μmol/Lの２糖スタンダードサンプルで標準化し、１dishあたりのGAG量に換算した。
ちなみに、Ｄｉ(４,６)Ｓは、コンドロイチン硫酸の構成二糖単位を構成するＮ-アセチルガラクトサミンの４位水酸基と６位水酸基にのみ硫酸基を有している不飽和二糖を示し、４Ｓは、当該構成二糖単位におけるＮ-アセチルガラクトサミンの４位硫酸基にのみ硫酸基を有している不飽和二糖を示し、０Ｓは、構成二糖単位中に硫酸基を有していない不飽和二糖単位を示す。
Analytical Biochemistry, 177, 327-332 (1989)の方法を参考にして、形質転換体により合成されるグリコサミノグリカン鎖のコンドロイチナーゼＡＢＣ処理分解物について二糖組成を検討した。
CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各遺伝子を導入したＬＴＣ細胞の形質転換体を、細胞培養皿（Falcon社製；3003）を用いた10％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したDMEM培地に播種し、３７℃、５％二酸化炭素下で24時間培養した。次いで、形質転換体細胞と培養基質を各々回収し、0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液で4℃、16時間処理しGAG鎖を溶出した。その後、当該溶出液を４mol/L酢酸で中和した後、更に、20ｍmol/Lトリス塩酸（ｐH8.0）緩衝液にプロテインキナーゼK（20mg/mL、Roche社製）５μＬを加えたものによって、３７℃、12時間処理した。100度でプロテインキナーゼＫを不活化した後、DNaseI（10mg/mL、Boehringer Mannheim社製）10μL、RNaseA（10mg/mL、Wako社製）10μＬを加えて、３７℃、2時間処理し、反応液よりグリコサミノグリカン鎖（GAG鎖）を回収した。回収したGAG鎖をDEAE-セファロースを充填したカラムに付し、0.2mol/Lの塩化ナトリウム水溶液でカラムを洗浄後、GAG画分を２mol/Lの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。溶出液中のGAGを1.3％酢酸カリウム水溶液及び95％エタノールで沈殿させ、得られた沈殿を50ｍmol/Lトリス塩酸（p H7.5）と0.2mol/Lの塩化ナトリウム緩衝液とから成る水溶液に懸濁させた。当該GAG懸濁液をコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製）により処理した。
コンドロイチナーゼＡＢＣ処理により生じたＧＡＧ分解物について蛍光分析用postcolume高速液体クロマトグラフィーにより当該分解物の二糖組成を分析した（図８）。
図８上段のグラフは、形質転換体細胞と培養基質について、得られたMock、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の２糖組成グラフ（図８下段）の各ピーク（０S、４S、Di(4,6)S）の面積を計測し合計した値に基づくグラフである。なお、計測値は、同様の方法で計測した１０μmol/Lの２糖スタンダードサンプルで標準化し、１dishあたりのGAG量に換算した。
ちなみに、Ｄｉ(４,６)Ｓは、コンドロイチン硫酸の構成二糖単位を構成するＮ-アセチルガラクトサミンの４位水酸基と６位水酸基にのみ硫酸基を有している不飽和二糖を示し、４Ｓは、当該構成二糖単位におけるＮ-アセチルガラクトサミンの４位硫酸基にのみ硫酸基を有している不飽和二糖を示し、０Ｓは、構成二糖単位中に硫酸基を有していない不飽和二糖単位を示す。
（１）の結果より、CSGlcATとCSGalNAcT-1の遺伝子を導入した各形質転換体は、対照に比べて、非常に高い導入遺伝子の発現が確認された。
（２）の免疫染色の結果より、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各形質転換体は、対照（Mock）と比較して、コンドロイチン４硫酸含量は高く、アグリカンのコアタンパク含量はほぼ同じであった。形質転換体の作製に用いたＬＴＣ細胞は、成熟軟骨様細胞であり、基本的には培養を続けても細胞性質は変わらず、常に一定のアグリカン分子を合成する細胞であることを考慮すると、アグリカンのコアタンパク質量は変化していないことが判明した。
（３）の結果より、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1を強制的に発現させた各形質転換体は、対照に比べ、それぞれ、１．６倍、２．２倍のコンドロイチン硫酸合成活性を示した。溶出曲線で、培養溶液におけるヘパリチナーゼ混合物処理したサンプル（図７下図の中段の右グラフ）において、コンドロイチン硫酸画分である曲線のピークが、Mock、CSGlcAT、CSGalNAcT-1の形質転換体間で変わらないことから、合成されて培養溶液中に放出されたコンドロイチン硫酸鎖の大きさは、どの検体においても同じであることが分かった。
よって、（１）、(２)、（３）の結果を併せて考えると、CSGlcAT、CSGalNAcT-1の形質転換体では、アグリカンのコアタンパク質の量は変化せず、同じ長さのコンドロイチン硫酸鎖がそれぞれ１．６倍、２．２倍に合成されていることから、アグリカン1分子あたりの持つコンドロイチン硫酸鎖の数がそれぞれ１．６倍、２．２倍に増加しているのが分かった。
（４）の結果より、各形質転換体において合成されるコンドロイチン硫酸は、４硫酸構造である構成二糖単位を多く含むコンドロイチン硫酸であり、CSGalNAcT-1の形質転換体はCSGlcATの形質転換体よりもコンドロイチン硫酸を多く合成していた。
実施例２、３、４の結果より、コンドロイチン硫酸の生合成に関与すると考えられているコンドロイチン硫酸糖転移酵素の中で、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1が軟骨組織におけるコンドロイチン硫酸の生合成に特に関与しており、中でもCSGalNAcT-1は非常に密接に関与していることが判明した。更に、CSGlcATやCSGalNAcT-1の発現量の増加に伴って、１つのアグリカンのコアタンパク質に結合しているコンドロイチン硫酸鎖量が通常より増加することが判明した。
よって、これら酵素の発現を増強したり、活性を促進したりすることにより、又は、これら酵素の外的投与により、軟骨組織におけるコンドロイチン硫酸鎖の合成が促進され、アグリカンを構成するコンドロイチン硫酸鎖が増加すると考えられる。
（２）の免疫染色の結果より、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1の各形質転換体は、対照（Mock）と比較して、コンドロイチン４硫酸含量は高く、アグリカンのコアタンパク含量はほぼ同じであった。形質転換体の作製に用いたＬＴＣ細胞は、成熟軟骨様細胞であり、基本的には培養を続けても細胞性質は変わらず、常に一定のアグリカン分子を合成する細胞であることを考慮すると、アグリカンのコアタンパク質量は変化していないことが判明した。
（３）の結果より、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1を強制的に発現させた各形質転換体は、対照に比べ、それぞれ、１．６倍、２．２倍のコンドロイチン硫酸合成活性を示した。溶出曲線で、培養溶液におけるヘパリチナーゼ混合物処理したサンプル（図７下図の中段の右グラフ）において、コンドロイチン硫酸画分である曲線のピークが、Mock、CSGlcAT、CSGalNAcT-1の形質転換体間で変わらないことから、合成されて培養溶液中に放出されたコンドロイチン硫酸鎖の大きさは、どの検体においても同じであることが分かった。
よって、（１）、(２)、（３）の結果を併せて考えると、CSGlcAT、CSGalNAcT-1の形質転換体では、アグリカンのコアタンパク質の量は変化せず、同じ長さのコンドロイチン硫酸鎖がそれぞれ１．６倍、２．２倍に合成されていることから、アグリカン1分子あたりの持つコンドロイチン硫酸鎖の数がそれぞれ１．６倍、２．２倍に増加しているのが分かった。
（４）の結果より、各形質転換体において合成されるコンドロイチン硫酸は、４硫酸構造である構成二糖単位を多く含むコンドロイチン硫酸であり、CSGalNAcT-1の形質転換体はCSGlcATの形質転換体よりもコンドロイチン硫酸を多く合成していた。
実施例２、３、４の結果より、コンドロイチン硫酸の生合成に関与すると考えられているコンドロイチン硫酸糖転移酵素の中で、CSGlcAT及びCSGalNAcT-1が軟骨組織におけるコンドロイチン硫酸の生合成に特に関与しており、中でもCSGalNAcT-1は非常に密接に関与していることが判明した。更に、CSGlcATやCSGalNAcT-1の発現量の増加に伴って、１つのアグリカンのコアタンパク質に結合しているコンドロイチン硫酸鎖量が通常より増加することが判明した。
よって、これら酵素の発現を増強したり、活性を促進したりすることにより、又は、これら酵素の外的投与により、軟骨組織におけるコンドロイチン硫酸鎖の合成が促進され、アグリカンを構成するコンドロイチン硫酸鎖が増加すると考えられる。
マウス椎間板におけるCSGalNAcT-1遺伝子の導入によるコンドロイチン硫酸生合成
ヒト由来CSGalNAcT-1（hCSGalNAcT-1）をコードするc ＤＮＡは、プライマー（5'-CACCATGATGATGGTTCGCCG-3'（配列番号３８）、5'-TGTTTTTTTGCTACTTGTCTTCTG-3'（配列番号３９））を用い、hCSGalNAcT-1／pcDNA3.1プラスミドをテンプレートにしたPCR法により得た。これをエントリーベクター（pENT/D-TOPO、インビトロジェン社製）を通じてアデノウィルス発現ベクターpAd/CMV/V5-DEST（インビトロジェン社製）にサブクローニングし
、hCSGalNAcT-1発現アデノウイルスベクターを作製した。次いで、ViraPowerTM Adenovirus Expression System（インビトロジェン社製）を用い、製造指示書に従って、hCSGalNAcT-1発現アデノウイルスベクターを293A細胞（ヒト胎児腎臓から樹立された細胞株、インビトロジェン社製）に形質導入し、hCSGalNAcT-1発現アデノウィルス粒子を作製した。当該アデノウィルス粒子の力価を測定し、１．５ｘ１０7 plaque-forming unit (pfu)のhCSGalNAcT-1発現アデノウィルス粒子を３０μLのリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、４ヶ月齢ICRマウスの尾椎椎間板内に注射器で注入した（注入量は３０μL）。対照としてpAd/CMV/V5-GW/Lac-Z（インビトロジェン社製）を用い、同様の手順に従ってアデノウイルス粒子を作製し、４ヶ月齢ICRマウスの尾椎椎間板内に注入した。注入後７日目に、マウスを剖検し、椎間板をアルシアンブルー染色し、組織学的分析を行った（図９）。また、染色結果についてＮＩＨ−ｉｍａｇｅ（National Institute of Health製）による画像解析を行い、染色結果を定量的に示した（図１０）。
hCSGalNAcT-1のc DNAを導入したマウスの椎間板においては、対照と比較し、椎間板の髄核細胞と脊椎端板の軟骨細胞の細胞周囲領域において、強くアルシアンブルー染色された。この結果は、hCSGalNAcT-1の導入により、椎間板におけるコンドロイチン硫酸の蓄積（生合成）が増加したことを教示している。
よって、当該遺伝子を関節に導入する遺伝子治療により、関節におけるコンドロイチン硫酸量が増加し、コンドロイチン硫酸の減少が関与している疾患や症状が改善されると推察される。
ヒト由来CSGalNAcT-1（hCSGalNAcT-1）をコードするc ＤＮＡは、プライマー（5'-CACCATGATGATGGTTCGCCG-3'（配列番号３８）、5'-TGTTTTTTTGCTACTTGTCTTCTG-3'（配列番号３９））を用い、hCSGalNAcT-1／pcDNA3.1プラスミドをテンプレートにしたPCR法により得た。これをエントリーベクター（pENT/D-TOPO、インビトロジェン社製）を通じてアデノウィルス発現ベクターpAd/CMV/V5-DEST（インビトロジェン社製）にサブクローニングし
、hCSGalNAcT-1発現アデノウイルスベクターを作製した。次いで、ViraPowerTM Adenovirus Expression System（インビトロジェン社製）を用い、製造指示書に従って、hCSGalNAcT-1発現アデノウイルスベクターを293A細胞（ヒト胎児腎臓から樹立された細胞株、インビトロジェン社製）に形質導入し、hCSGalNAcT-1発現アデノウィルス粒子を作製した。当該アデノウィルス粒子の力価を測定し、１．５ｘ１０7 plaque-forming unit (pfu)のhCSGalNAcT-1発現アデノウィルス粒子を３０μLのリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、４ヶ月齢ICRマウスの尾椎椎間板内に注射器で注入した（注入量は３０μL）。対照としてpAd/CMV/V5-GW/Lac-Z（インビトロジェン社製）を用い、同様の手順に従ってアデノウイルス粒子を作製し、４ヶ月齢ICRマウスの尾椎椎間板内に注入した。注入後７日目に、マウスを剖検し、椎間板をアルシアンブルー染色し、組織学的分析を行った（図９）。また、染色結果についてＮＩＨ−ｉｍａｇｅ（National Institute of Health製）による画像解析を行い、染色結果を定量的に示した（図１０）。
hCSGalNAcT-1のc DNAを導入したマウスの椎間板においては、対照と比較し、椎間板の髄核細胞と脊椎端板の軟骨細胞の細胞周囲領域において、強くアルシアンブルー染色された。この結果は、hCSGalNAcT-1の導入により、椎間板におけるコンドロイチン硫酸の蓄積（生合成）が増加したことを教示している。
よって、当該遺伝子を関節に導入する遺伝子治療により、関節におけるコンドロイチン硫酸量が増加し、コンドロイチン硫酸の減少が関与している疾患や症状が改善されると推察される。
以上の実験結果に鑑みると、CSGalNAcT-1遺伝子及び／又はCSGlcAT遺伝子の導入やこれら酵素の外的投与などにより、軟骨組織や椎間板組織などの関節において、これら酵素の発現増強や活性促進が起こり、これら組織におけるコンドロイチン硫酸鎖の合成が促進され、アグリカンを構成するコンドロイチン硫酸鎖が増加する。更に、コンドロイチン硫酸鎖の増加によるアグリカンの保水力の改善や、それに伴う、衝撃力を吸収する作用や摩擦低減作用（潤滑作用）の様な軟骨組織の機能が改善される。よって、CSGalNAcT-1又はCSGlcATを有効成分とする医薬やCSGalNAcT-1又はCSGlcATをコードする遺伝子を用いた遺伝子治療により、軟骨組織の形成促進剤、傷害を有する軟骨組織のための軟骨修復剤や関節疾患又は椎間板疾患処置剤を提供することが出来る。
Claims (14)
- コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤。
- コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）の核酸である請求項１記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または配列番号１記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であって、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質をコードする核酸。 - コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸である請求項１記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤。
- コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子が下記（ｃ）又は（ｄ）の核酸である請求項１記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤。
（ｃ）配列番号３記載の塩基配列からなる核酸、又は
（ｄ）配列番号３記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または、配列番号３記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有する塩基配列からなる核酸であって、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮ−アセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有するタンパク質をコードする核酸。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。 - コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１をコードする遺伝子が配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸である請求項１記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤。
- コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤。
- コンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼが下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である請求項６記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ、コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端のＮ−アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性を有するタンパク質。 - コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−１が下記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質である請求項６記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤。
（Ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（Ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記式（１）で示される糖鎖を含むＮ−アセチルガラクトサミン受容体基質の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対し、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体からＮーアセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有するタンパク質。
ＧｌｃＵＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ 式（１）
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「Ｇａｌ」はＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」はＤ−キシロース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。 - 請求項２の(a)若しくは(b)で示される核酸であるコンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、又は、請求項４の(c )若しくは(d)で示される核酸であるコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物が、発現可能なベクターに組み込まれた発現ベクターを有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤。
- 請求項２の(a)若しくは(b)で示される核酸であるコンドロイチン硫酸グルクロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、又は、請求項４の(c )若しくは(d)で示される核酸であるコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物若しくは当該遺伝子構築物を含むベクターを形質導入した細胞を有効成分として含有するコンドロイチン硫酸合成促進剤。
- 請求項１〜１０の何れか一項に記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤を有効成分とする関節又は椎間板疾患処置剤。
- 軟骨組織におけるコンドロイチン硫酸の合成を促進する請求項１１記載の関節又は椎間板疾患処置剤。
- 請求項１〜１０の何れか一項に記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤を有効成分とする、コンドロイチン硫酸合成促進機能を有する軟骨修復剤。
- 請求項１〜１０の何れか一項に記載のコンドロイチン硫酸合成促進剤を有効成分とする軟骨組織形成促進剤。
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| JP2019142853A (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 学校法人東海大学 | ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を含有するｎ‐アセチルガラクトサミン転移酵素発現促進剤 |
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