JP2004000018A - イマチニブに対する感受性の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】イマニチブの投与により治療を行うＣＭＬのような疾病にある患者が罹患している場合に、当該患者がイマニチブに対して感受性を有するか否かを判定する、すなわち、当該患者に対してイマニチブを投与することがその疾病の治療に有効か否かを予測する方法を提供すること。
【解決手段】生体から分離された検体細胞中における７７の特定の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定し、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比する。
【選択図】 図４
【解決手段】生体から分離された検体細胞中における７７の特定の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定し、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比する。
【選択図】 図４
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イマニチブ若しくはその誘導体に又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法に関する。本発明の方法は、例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に対するイマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩による治療効果を判定する場合等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＭＬは、造血幹細胞の癌化に起因するクローン性疾患であり、そのほとんどは、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）の存在及びＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼの構成的活性化により特徴付けられる（Ｓ． Ｆａｄｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４１， １６４−７２． （１９９９））。ＣＭＬは、慢性期、加速期（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｐｈａｓｅ）及び必ず死に至る急性転化期（ｂｌａｓｔ ｃｒｉｓｉｓ）の３つの段階を経て進行する。従来より、ＣＭＬの治療として、インターフェロン−αの投与及び同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）の幹細胞移植（ＳＣＴ）が選択可能である。インターフェロン−α投与により、生存期間を延長することができるが、強い副作用がある。ＳＣＴが唯一の根治療法であるが、合併症の発生頻度がかなり高く、また、治療を受けられるのは適当なドナーが見つかった患者に限定される。従って、ＣＭＬの予後は依然として良くない。
【０００３】
ＡＢＬ−選択的チロシンキナーゼ阻害剤であるイマニチブ（４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ベンズアミド、開発コード名ＳＴＩ５７１）が開発され、ＣＭＬの治療が大きく進歩した（Ｅ． Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ， Ａ． Ｍａｔｔｅｒ， Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５５１， Ｍ１１−８． （２００１）； Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２， ５６１−６． （１９９６））。この薬剤により、約９０％のＣＭＬ患者において、血液学的に完全な寛解が得られ、また、６０％以上の患者において、激しい副作用なしにＰｈ染色体陽性白血病細胞が完全になくなり又は部分的に減少する（Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４， １０３１−７． （２００１））。このため、イマニチブは、ＣＭＬ治療の第１の選択肢になった。
【０００４】
なお、イマニチブは、下記式［Ｉ］で示される化学構造を有する抗癌剤であり、ＣＭＬの治療に広く用いられているのみならず、消化管間質腫瘍（ＧＳＩＴ）等の他の腫瘍の治療にも有効であることが報告されている。また、イマニチブのメシル酸塩が、グリベック（Ｇｌｉｖｅｃ）という商品名で、スイス国ＢａｓｅｌのＮｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から市販されており、ＣＭＬの治療のために臨床的に用いられている。
【０００５】
【化１】
［Ｉ］
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、イマニチブは、全てのＣＭＬ患者に有効なわけではなく、イマニチブ投与が無効なＣＭＬ患者もいる。イマニチブは、有効な場合にはその治療効果が顕著であるので、ＳＣＴを行うか否かをタイミング良く決断するのが難しくなった（Ｊ． Ｍ． Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ， Ｂｌｏｏｄ ９８， ２０３９−４２． （２００１））。また、イマニチブが効かない患者に対してイマニチブを投与することは、時間と医薬コストの無駄遣いであり、また、患者が他の治療を受けるチャンスを逸してしまう危険性もある。従って、もし、イマニチブの投与が治療に有効か否かを予め知ることができれば、ＣＭＬの治療に非常に有利である。
【０００７】
本発明の目的は、イマニチブの投与により治療を行うＣＭＬのような疾病にある患者が罹患している場合に、当該患者がイマニチブに対して感受性を有するか否かを判定する、すなわち、当該患者に対してイマニチブを投与することがその疾病の治療に有効か否かを予測する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、イマニチブに対して感受性を有する患者、すなわち、イマニチブ投与が有効な応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と、イマニチブに対して感受性を有さない患者、すなわち、イマニチブ投与が無効な非応答者（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）とでは、特定の遺伝子の発現量が有意に異なっているかもしれないということに想到した。そこで、２万種類以上のｃＤＮＡを固定したｃＤＮＡマイクロアレイを用い、ＣＭＬ患者の単球中の各種遺伝子の発現量を測定し、応答者と非応答者で統計学的な有意差が存在する遺伝子が存在するか否かを調べたところ、７７種の遺伝子の発現量に有意な差があることを見出し、さらに、上記統計処理に用いていない新規ＣＭＬ患者について、これらの遺伝子の発現量に基づき応答者か非応答者かを予測できることを実験的に確認して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、生体から分離された検体細胞中における下記（１）〜（７７）の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定し、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比することを含む、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法を提供する。
（１）ＨＮ１（ＡＩ０８６８７１）、（２）ＡＫＲ１Ｃ３（Ｄ１７７９３）、（３）ＱＡＲＳ（Ｘ７６０１３）、（４）ＫＩＡＡ１１０５（ＡＡ１３６１８０）、（５）ＫＩＡＡ０６６８（ＡＡ５０６９７２）、（６）ＢＬＣＡＰ（ＡＦ０５３４７０）、（７）ＡＤＦＰ（Ｘ９７３２４）、（８）ＦＬＪ１０４２２（ＡＡ８９４８５７）、（９）ＨＭＧＣＬ（Ｌ０７０３３）、（１０）ＥＳＴ（ＡＩ０５１４５４）、（１１）ＫＬＦ４（ＡＩ２９０８７６）、（１２）Ｈ３Ｆ３Ａ（Ｍ１１３５４）、（１３）ＡＣＴＢ（Ｖ００４７８）、（１４）ＤＫＦＺＰ５６６Ｄ１９３（ＡＡ４０１３１８）、（１５）ＡＰＥＸ（Ｕ７９２６８）、（１６）ＤＲＩＬ１（Ｕ８８０４７）、（１７）ＢＩＮ１（ＡＦ００１３８３）、（１８）ＥＳＴ（ＡＡ４９５９８４）、（１９）ＣＬＴＨ（Ｎ４１９０２）、（２０）Ｍ６ＰＲ（ＡＡ１７９８３２）、（２１）ＫＩＡＡ０１０６（Ｄ１４６６２）、（２２）ＩＧＦ２Ｒ（Ｊ０３５２８）、（２３）ＩＤＨ１（ＡＡ３３００１４）、（２４）ＥＳＴ（ＡＩ３３３４４９）、（２５）ＳＤＨＢ（ＡＡ３６５９８６）、（２６）ＴＮＲＣ３（ＡＩ７４３１３４）、（２７）ＭＧＰ（ＡＡ１５６４８８）、（２８）ＣＢＬＢ（Ｕ２６７１０）、（２９）ＥＳＴ（ＡＡ０５５３５５）、（３０）ＦＬＪ１０８０３（Ｔ７０７８２）、（３１）ＩＭＰＤＨ１（Ｊ０５２７２）、（３２）ＦＬＪ２０４８９（ＡＩ０９１４５９）、（３３）ＧＴＦ２Ｉ（Ｕ７７９４８）、（３４）ＣＧＩ−５７（ＡＦ０７０６３８）、（３５）ＬＯＣ５１３１２（．ＡＩ１２８５３８）、（３６）ＣＨＡＣ（ＡＡ２２８８７４）、（３７）ＡＴＰ１Ｂ１（Ｘ０３７４７）、（３８）ＣＰＴ１Ａ（ＡＡ６３２２２５）、（３９）ＣＴＳＧ（Ｍ１６１１７）、（４０）ＡＸＵＤ１（ＡＩ０９１３７２）、（４１）ＨＬＡ−Ｂ（Ｍ２８２０４）、（４２）ＧＯＬＧＡ４（Ｕ３１９０６）、（４３）ＥＳＴ（ＡＡ７４３４６２）、（４４）ＳＣＹＡ１３（Ｕ４６７６７）、（４５）Ｂ４ＧＡＬＴ１（Ｄ２９８０５）、（４６）ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０４６３（ＡＡ１４３０４８）、（４７）ＨＳＪ１（Ｘ６３３６８）、（４８）ＭＲＰＬ３（Ｘ０６３２３）、（４９）Ｃ９ｏｒｆ１０（Ｄ８０００５）、（５０）ＤＤＸ１（Ｘ７０６４９）、（５１）ＥＳＴ（ＡＡ４２１３２６）、（５２）ＨＬＡ−Ａ（ＡＦ０５５０６６）、（５３）ＳＴＩＭ１（ＡＡ１０１８３４）、（５４）ＡＭＰＤ２（Ｍ９１０２９）、（５５）ＳＴＸ５Ａ（Ｕ２６６４８）、（５６）ＩＦＮＢ１（Ｍ２５４６０）、（５７）ＭＡＥＡ（ＡＩ２９１７４５）、（５８）ＬＢＲ（Ｌ２５９４１）、（５９）ＬＩＭＫ２（Ｄ４５９０６）、（６０）ＥＳＴ（ＡＩ３６５６８３）、（６１）ＲＰＬ２６（ＡＡ７７８１６１）、（６２）ＦＬＪ１０２０９（ＡＬ１３７２７１）、（６３）ＦＡＡＨ（ＡＡ１３２５１９）、（６４）Ｃ２１ＯＲＦ３３（Ｙ０７５７２）、（６５）ＥＳＴ（Ｚ４４５１３）、（６６）ＰＲＫＡＣＡ（Ｘ０７７６７）、（６７）ＥＰＢ４９（Ｌ１９７１３）、（６８）ＥＳＴ（Ｕ５１７１２）、（６９）ＣＲＳＰ９（ＡＩ３３４３９６）、（７０）ＥＳＴ（ＡＡ６００３２３）、（７１）ＳＴＫ２２Ｂ（Ｌ７７５６４）、（７２）ＴＲＢ＠（Ｘ０１４１０）、（７３）ＥＥＦ１Ｄ（Ｚ２１５０７）、（７４）ＲＰＧＲ（Ｕ５７６２９）、（７５）ＡＲＲＢ１（ＡＡ９１８７２５）、（７６）ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（ＡＡ６０２４９０）、（７７）ＩＧＬ＠（Ｍ８７７９０） （ただし、各遺伝子シンボルの後の括弧内の文字はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を示す）。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いることができる７７種の遺伝子は、下記実施例に詳述する方法により、ＣＭＬ患者の単球中での発現量が、応答者と非応答者とで統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有するか否かを判定することにより選択されたものである。これらの７７種の遺伝子の順位、Ｐ値、シンボル名、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．、遺伝子名及び非応答者における発現量が応答者における発現量よりも多いか少ないか（多い場合を「↑」、少ない場合を「↓」で示す）を下記表１〜４にまとめて示す。なお、表中の記載順序は、Ｐ値の小さいもの順、すなわち、統計学的有意差の大きい順である。これらの遺伝子の全てについてＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．が付与されていることから明らかなように、これらの遺伝子自体は既に公知であり、その塩基配列も公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。ＧｅｎＢａｎｋは、遺伝子やタンパク質の配列を集めた米国の政府系機関によるデータベースであり、誰でも無料でインターネットでアクセスして利用することができるので、各遺伝子の配列は容易に入手できる。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【表２】
【００１３】
【表３】
【００１４】
【表４】
【００１５】
なお、請求項１に記載した（１）〜（７７）の番号は、表１に示すＰ値の小さいもの順に付した番号であり、番号が若い遺伝子ほど、統計学的な有意差が大きいことを示している。
【００１６】
本発明の方法では、生体から分離された検体細胞中における上記（１）〜（７７）の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定する。発現量を測定する遺伝子の数が多いほど判定の確度が高くなるというものではなく、測定する遺伝子の数は１０〜３５程度が好ましい。特に、上記した（１）〜（３５）の遺伝子の、番号の若いものから１０〜３５種類の遺伝子の発現量を調べることが好ましく、さらには、前記遺伝子のうち（１）〜（１５）の遺伝子、又は、（１）〜（３０）の遺伝子の発現量を調べることが好ましい。
【００１７】
生体から分離した検体細胞としては、イマニチブ投与により治療しようとする疾病の症状を現している細胞が好ましく、例えば、ＣＭＬの場合には、単球のような白血球細胞が好ましい。また白血病細胞の遺伝子発現を解析することから、６５％を超える細胞がフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体陽性（ｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子を検出するＦＩＳＨ解析により判定）である試料が好ましい。
【００１８】
細胞中の各遺伝子の発現量は、細胞中の各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することにより測定することができ、ｍＲＮＡ量の測定は周知の方法により行うことができる。例えば、下記実施例に記載するように、調査対象となる遺伝子のｃＤＮＡを等量ずつ固定化したＤＮＡマイクロアレイを作製し、一方、検体細胞中の各ＲＮＡを鋳型として、標識ヌクレオチドの存在下でｃＤＮＡを合成することにより標識ｃＤＮＡを合成し、これを前記ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートしてＤＮＡマイクロアレイ上のｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、洗浄後、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットの標識量を測定することにより測定することができる。なお、検体細胞中の各遺伝子の発現量の測定方法は、この方法に限定されるものではなく、各遺伝子の発現量を測定できる方法であれば他のいずれの方法をも採用することができる。例えば、リアルタイム検出逆転写ＰＣＲ法やノーザンブロット法等によっても細胞中の各ＲＮＡを測定することが可能である。好ましい態様では、比較的多数の遺伝子の発現量を調べるので、後述の実施例に記載したような、検体細胞から調製した標識ｃＤＮＡを、マイクロアレイ上に固定化された各遺伝子とハイブリダイズさせてその標識量を測定する方法が簡便で好ましい。なお、ここで、「発現量」とは、絶対量である必要はなく、相対量でよい。また、必ずしも数値的に表現される必要はなく、例えば、標識に蛍光標識等の可視的な標識を用い、目視により判定する場合等も「発現量の測定」にあたる。
【００１９】
次に、測定された各遺伝子の発現量を、イマニチブに対する感受性を有する応答者及び有さない非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比する。これを行うためには、当然ながら、予め、既知の応答者及び非応答者における各遺伝子の発現量を調べておく必要がある。そして、これらと、検体細胞中の各遺伝子の発現量を対比する。対比は、検体細胞中の各遺伝子の発現量を、既知の応答者及び非応答者における各遺伝子の発現量の平均値と比較し、どちらの平均値に近いか、それが統計学的に有意か否か等を判定することによっても行うことができるが、より的確に判定を行うためには、統計学的手法により予測スコア（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ、ＰＳ値）を算出し、この予測スコアに基づきイマニチブに対する感受性を判定することが好ましい。このように、本明細書において、「対比」とは、発現量をそのまま比較することのみならず、測定された発現量並びに既知の応答者及び非応答者における測定値について統計学的な処理を行うことをも包含する。予測スコアの算出方法自体は、公知である（Ｔ． Ｒ． Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ５３１−７． （１９９９）； Ｔ． Ｊ． ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９， １４３−５２． （２００１））。すなわち、各遺伝子（ｇｉ）は、その発現レベル（ｘｉ）が、応答者又は非応答者の発現レベルの平均値のどちらに近いのかに基づき、応答者又は非応答者のいずれかに投票する。投票の大きさ（ｖｉ）は、２つの群の平均からの試料中の発現レベルの偏差を反映する。
Ｖｉ＝｜ｘｉ−（μｒ＋μｎ）／２｜
なお、上記式中、μｒ及びμｎは、それぞれ、応答者群及び非応答者群における発現量の平均値を示す。投票を合計して応答者（Ｖｒ）及び非応答者（Ｖｎ）のそれぞれについて合計投票を算出し、ＰＳ値を次式により算出する。
ＰＳ＝（（Ｖｒ−Ｖｎ）／（Ｖｒ＋Ｖｎ））×１００
【００２０】
この定義から明らかなように、ＰＳ値は、−１００〜１００の間にあり、正の値の場合には応答者、負の値の場合には非応答者であると判定され、それぞれの絶対値が大きいほど判定の確実さが高くなる。下記実施例において具体的に示されるように、この方法で、上記（１）〜（１５）の遺伝子、及び上記（１）〜（３０）の遺伝子について発現量を測定し、ＰＳ値を求めた結果、遺伝子の選出に用いた「学習例」１８例及び本発明の方法の妥当性を確認するために用いた「試験例」４例の合計２２例のいずれにおいても、ＰＳ値が正か負かにより、１例の例外もなく正しく判定することができた。特に、上記（１）〜（１５）の遺伝子を用いた場合には、１例の例外もなく、ＰＳ値の絶対値が３０以上であった。なお、絶対値が大きいほど判定の確度が高くなるので、例えば、絶対値が５以上又は２０以上等の場合に判定し、それ以下の場合には判定留保にするというような判定基準を適宜設けることも可能である。
【００２１】
上記の方法により、被験者がイマニチブに対する感受性を有するか否か、すなわち、イマニチブによる治療の応答者であるか非応答者であるかを判定することができる。
【００２２】
なお、上記した本発明の方法により、それに対する感受性を測定できる薬剤はイマニチブに限定されるものではなく、イマニチブの誘導体、すなわち、上記式［Ｉ］で示されるイマニチブを構成する１又は複数の任意の原子上の水素原子が、任意の置換基で置換された化合物であって、イマニチブと同じ性質の薬効を示すものに対する感受性をも測定できる。ここで、置換基の数は、特に限定されないが５個以下が好ましく、また、置換基としては、炭素数１〜６の低級アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、ニトロ基及びカルボキシル基等、特に炭素数１〜６の低級アルキル基を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、イマニチブ又はその誘導体は、薬理学的に許容できる酸付加塩の形態にあってもよい。ここで、薬理学的に許容できる酸付加塩としては、メシル酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２４】
試料の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た２２名の成人骨髄性白血病患者から、イマニチブ治療に先立って末梢血試料を得た。次いで、各患者は、イマニチブの抗白血病効果を評価するための臨床試験フェーズＩＩの被験者になった。治療前において、６５％を超える細胞がフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体陽性（ｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子を検出するＦＩＳＨ解析により判定）である１８試料からのｍＲＮＡを、本願発明者らが作製したｃＤＮＡマイクロアレイシステム（後述）で解析した。慢性期にある１６名の患者には、４００ ｍｇ／日のイマニチブ（イマニチブメシル酸塩（商品名グリベック、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製、投与量の数値はイマニチブ換算）を投与した。急性転化期にある２名の患者には、６００ ｍｇ／日のイマニチブを投与した。細胞遺伝学的応答、すなわち、細胞分裂中期において、Ｐｈ染色体が依然として陽性（上記ＦＩＳＨ解析により判定）である細胞の割合に基づいてイマニチブに対する細胞遺伝学的応答性を決定した（Ｂ．Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３４４， １０３１−７（２００１））。高い細胞遺伝学的応答（Ｐｈ染色体陽性の細胞の割合が３５％未満になる）を示した１２名の患者を「応答者」（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）に分類し、イマニチブ治療を５ヶ月行った後のＰｈ染色体陽性細胞の割合が６５％を超える６名の患者を「非応答者」（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と定義した。このように、予測スコアシステムの構築に用いた１８名の患者は、応答者又は非応答者のいずれかに分類された。残る４名は、後述する予測スコアシステムの妥当性を試験するために試験症例としてとっておいた。２２名のうち、２名の「学習」症例（後述の予測スコアシステムの構築の際に用いた症例）が急性転化の状態にあり、２名の試験症例（後述の予測スコアシステムの妥当性を試験するために用いた症例）が移行期の状態にあった。これら４名の患者では、イマニチブが臨床的に無効であり、１２週間以内にイマニチブによる治療が停止されたので、細胞遺伝学的応答は、治療開始１２週間後に解析を行った。マイクロアレイのコントロールとして、１１名の健常ボランティアの末梢血由来の単球細胞混合物を用いた。
【００２５】
ｃＤＮＡマイクロアレイの作製
上記ｃＤＮＡマイクロアレイシステムは次のようにして作製した。はじめに、ガラススライドにスポットするためのｃＤＮＡを得るために、公知の方法（Ｈ． Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１， ２１２９−３７． （２００１））により、各遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲを行った。より詳細には、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから選択した２３，０４０ 種類のｃＤＮＡを固定化したｃＤＮＡマイクロアレイを次のようにして作製した。すなわち、１２種類の正常なヒトの器官（脳、心臓、肝臓、骨格筋、小腸、脾臓、胎盤、甲状腺、胎児脳、胎児腎臓、胎児肺及び胎児肝臓）の組織から得られたポリアデニル化ＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ） （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をｃＤＮＡの調製に用いた。オリゴ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ 逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ製）を用いてＲＮＡを逆転写した。その後ＰＣＲ法にて、上述の通り選択した各遺伝子特異的配列をもつｐｒｉｍｅｒを用いて、繰り返し配列又はポリ（Ａ）を含まない２００〜１１００ ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に電気泳動し、予想されるサイズの単一のバンドを示すかをチェックし、示すものをスポッティングに用いた。これらのＰＣＲ産物を精製し、マイクロアレイスポッター（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｐｏｔｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ （ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いてＴｙｐｅ−７ガラススライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上にスポットした。異なる５組のスライド（１組４，６０８個のｃＤＮＡで、５組で合計２３，０４０個のｃＤＮＡ）を作製した。各スライドには、それぞれ同じ５２種類のハウスキーピング遺伝子及び２種類の陰性対照遺伝子もスポットした。
【００２６】
なお、上記のＰＣＲにおいて、上記した７７種類の遺伝子の増幅のために用いたプライマーセットは、下記表５〜７に示す通りであった。なお、表５〜７中の遺伝子番号は、上記した表１〜表４中に示す遺伝子番号を示す。また、上記ＰＣＲの温度サイクル条件は、はじめに９５℃、５分間熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとしたものを４０サイクルで、最後に７２℃１０分間である。
【００２７】
【表５】
表５
【００２８】
【表６】
表６
【００２９】
【表７】
表７
【００３０】
２． 各遺伝子の発現量の測定
解析に用いた試料は、共通コントロールとして１１人の健常人の末梢血より調製した白血球細胞を用い、それに対してＣＭＬ患者それぞれの末梢血より調製した白血病細胞の遺伝子発現解析を行った。その際の試料の調製は以下の通りである。Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて単球細胞を調製し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＮＹ）を用い、製品の使用説明書記載の方法により全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン社製）処理後、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを用いたＲＮＡ増幅法を行った。このＲＮＡ増幅法は、Ｌｕｏ， Ｌ． （Ｎａｔ Ｍｅｄ．， ５； １１７−１２２， １９９９）の方法に従って行った。すなわち、具体的には次のように行った。試料より抽出したＲＮＡとＴ７ プロモーター配列を付加した Ｔ７−ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）２１ ｐｒｉｍｅｒをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いた逆転写反応を行い、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。次にこの１本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして再度Ｔ７ プロモーター配列を付加した Ｔ７−ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）２１ ｐｒｉｍｅｒをＤＮＡポリメラーゼＩを用いて反応させて、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡを精製後、最後にこの２本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼによるＲＮＡ合成を行った。最終的には２μｇの全ＲＮＡを出発物質として用いて、上述のＲＮＡ増幅法による増幅を２サイクル行うことにより、４０〜１００μｇの増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）が得られた。コントロール試料についても同様な増幅を行い、十分量のａＲＮＡを得た。得られたａＲＮＡの量は分光光度計にて測定し、変性アガロースゲル電気泳動にてＲＮＡの質についても調べた。なお、この方法により増幅されたＲＮＡは、鋳型として全ＲＮＡを用いた場合においてもａＲＮＡを用いた場合でも、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果と一致することが確認されている（Ｋ． Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０， ５００７−１１． （２０００））。
【００３１】
標識、ハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニング及びシグナルの定量は、全ての操作を公知の自動化スライドプロセッサー（Ｈ． Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６１， ２１２９−３７． （２００１））を用いて行ったことを除き、Ｋ． Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６０， ５００７−１１． （２０００）に記載の方法により行った。すなわち、具体的には、これらは次のようにして行った。健常人ボランティア又はＣＭＬ患者の末梢血中の単球細胞から得たａＲＮＡ ２．５μｇを、それぞれＣｙ５−ｄＣＴＰ及びＣｙ３−ｄＣＴＰの存在下で上記と同様に逆転写した。得られた標識プローブをマイクロアレイハイブリダイゼーション溶液バージョン２（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ２ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びホルムアミド（Ｓｉｇｍａ社製）と終濃度５０％で混合した。ハイブリダイゼーション及び洗浄は、市販の自動スライドプロセッサー（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｌｉｄｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用い、その使用説明書に従って行った。次いで、アレイスキャナー（Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））を用いて、マイクロアレイ上の各蛍光標識を測定した。
【００３２】
３． 統計学的処理
はじめに遺伝子を次の２つの基準を用いて選択した。（ｉ）少なくとも８０％の症例において、シグナル強度がカットオフ値よりも高い、（ｉｉ）｜ Ｍｅｄｒ − Ｍｅｄｎ ｜ ≧０．５（ただし、Ｍｅｄは応答者又は非応答者における対数変換した相対的発現量比（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）から得られるメジアンを示している）。各ハイブリダイゼーションシグナル強度を市販のソフト（Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））を用いて光学的に評価し、ハウスキーピング遺伝子の平均シグナルに正規化した。スポットを平均化することにより各試料についてのＣＹ３：ＣＹ５比を算出した。発現レベルの前記カットオフ値は、バックグランド変動（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）に従って自動計算したものである。変動は、Ｃｙ３：Ｃｙ５の対数比の分散から、高発現遺伝子（上位３０％。バックグランド変動が小さい場合には無視できる）のＣｙ３：Ｃｙ５の対数比の分散を差し引いた値により評価することができる。変動が臨界値（１．０）未満である、発現レベルが約１０５を超える遺伝子を用いた。なぜなら、発現レベルが低い他の遺伝子は、バックグランド変動の中に埋もれてしまうからである。また、マイクロアレイにおけるスライド上のスポット量の不均一性（ある一定の範囲で制御していはいるものの）には、コントロール（対象）をもうけることで、そのコントロールと比較してサンプルでの発現量比と言う形でデータを解析する。いわゆるサンプルでの発現量をコントロールの発現量で割ることによって得られる比を「相対的発現量比」とする。
【００３３】
次いで、順列テスト（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を行い、応答者と非応答者の判別分離に有用な遺伝子を選択した。これは次のようにして行った。応答者（ｒ）及び非応答者（ｎ）における各遺伝子の対数変換相対的発現量比から平均（μ）及び標準偏差（σ）を計算した。判別スコア（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ， ＤＳ）を次のように定義した。
ＤＳ ＝ （μｒ−μｎ）／（σｒ＋σｎ）
各遺伝子の、応答者と非応答者を識別する能力を評価するために、これら２つの群をランダムに１０，０００回順列を入れ替えて順列テスト（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を行った。個々の遺伝子のＤＳデータセットが正規分布を示したので、ユーザー規定グループ分け（ｕｓｅｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）のために、公知の方法（Ｔ． Ｒ． Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ５３１−７． （１９９９）によりＰ値を計算した。すなわち、Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔを行うことによって、各遺伝子においてＤＳ値で構成される正規分布が形成され、平均値と標準偏差が求まる。この平均値と標準偏差を用いて式を求めＰ値を算出した。
【００３４】
その結果、順列のＰ値が０．０５未満である７７種類の遺伝子が候補としてリストされた（表１〜４）。これらの７７種類の遺伝子のうち、３３遺伝子は、応答者に比べて非応答者において発現レベルが増大しており、４４の遺伝子は発現レベルが減少していた。
【００３５】
この情報を用い、イマニチブ治療の有効性を予測するスコアリングシステムを確立することを試みた。公知の方法（Ｔ． Ｒ． Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ５３１−７．（１９９９）； Ｔ． Ｊ． ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９， １４３−５２． （２００１））に従って、予測スコア（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ， ＰＳ）を算出した。すなわち、各遺伝子（ｇｉ）は、その発現レベル（ｘｉ）が、応答者又は非応答者の発現レベルの平均値のどちらに近いのかに基づき、応答者又は非応答者のいずれかに投票する。投票の大きさ（ｖｉ）は、２つの群の平均からの試料中の発現レベルの偏差を反映する。
Ｖｉ＝｜ｘｉ−（μｒ＋μｎ）／２｜
投票を合計して応答者（Ｖｒ）及び非応答者（Ｖｎ）のそれぞれについて合計投票を算出し、ＰＳ値を次式により算出した。
ＰＳ＝（（Ｖｒ−Ｖｎ）／（Ｖｒ＋Ｖｎ））×１００
これは、応答者又は非応答者の方向におけるマージンオブビクトリー（ｍａｒｇｉｎ ｏｆｖｉｃｔｏｒｙ）を反映している。ＰＳ値は−１００〜１００の範囲にあり、絶対値が大きい程より確かな予測を反映している。
【００３６】
７７種類の候補遺伝子を順列Ｐ値の大きさの順に並べ（表１〜４）、このランク順リストの上位５， １０， １５， ２０， ２５， ３０， ３５， ４０， ４５， ５０， ５５， ６０， ６５， ７０， ７５及び７９遺伝子を用いて、ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎのためのリーブ−ワン−アウトテスト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ ｔｅｓｔ）を行った。これは次のようにして行った。すなわち、１つの試料を除外し、残りの試料について順列Ｐ値及び平均発現レベルを算出し、次いで、予測スコアを算出することにより、除外した試料の群を決定した。この操作を１８の試料のそれぞれについて行った。
【００３７】
次いで、２つの群の分離を最も良く行うことができる遺伝子の数を決定するために、それぞれの遺伝子の組についてクラス分けスコア（ＣＳ）を算出した。これは次のようにして行った。すなわち、クラス分けスコア（ＣＳ）は、応答者の予測スコア（ＰＳｒ）と非応答者の予測スコア（ＰＳｎ）を用いて次式により算出した。
ＣＳ ＝ （μＰＳｒ − μＰＳｎ） ／ （σＰＳｒ ＋ σＰＳｎ）
ＣＳ値が大きいほど、予測スコアリングシステムによる２つの群の分離がより良く行われることを示している。
【００３８】
計算に用いた遺伝子の数は、２つの群を分離する能力に影響を与える。表１〜４に示す遺伝子のトップ１５（（１）〜（１５））又はトップ３０（（１）〜（３０））を用いた際に最も応答者と非応答者を明瞭に分離することができた（図１）。これら２種類の遺伝子セットを用いた「予測スコア」システムにより、２つの患者群が明瞭に分離された（図２）。同じ遺伝子組を用いた階層的クラスター分割もまた、イマニチブ感受性についてグループ分けすることが可能であった（図３）。階層的クラスターは次のように行った。順列テストにより最も高くランクされた１５又は３０の識別遺伝子（表１〜４参照）を用いて、階層的クラスター法を適用した。この分析は、Ｍ． Ｅｉｓｅｎにより開発され、インターネットのウェブから利用できるソフトウェアである「ｃｌｕｓｔｅｒ」及び「ｔｒｅｅｖｉｅｗ」（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ５／ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ／ＳＭＤ／ｒｅｓｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。クラスター分割アルゴリズムを適用する前に、各スポットについての蛍光比を対数変換し、次いで、各試料についてのデータをメジアン中央化（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒ）して実験的なバイアスを除去した。
【００３９】
４． 試験例の判定
この予測システムの有効性を実証するために、システムの確立に用いた１８の「学習」症例とは全く独立したさらなる４症例の「試験」症例について、末梢血中の単球中の全ＲＮＡを出発物質とした上記と全く同様な解析を行った。これらの４つの試料のそれぞれについて、上記と同様に遺伝子発現プロファイルを調べ、上記トップ１５（（１）〜（１５））又はトップ３０（（１）〜（３０））の識別遺伝子（表１〜４参照）を用いて予測スコアを計算した。図４に示すように、イマニチブに対する４名の各患者の応答性は、１００％の正確さで予測することができた。
【００４０】
【配列表】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【図面の簡単な説明】
【図１】識別遺伝子の数とクラス分けスコア（ＣＳ）との関係を示す図である。
【図２】識別遺伝子の数を変えた場合における予測スコアを示す図である。Ｒは応答者、Ｎは非応答者を示す。
【図３】１５又は３０の予測遺伝子セットを用いたクラスター分析の結果を示す図である。全ての試料は、イマニチブに対する感受性によりクラス分けされた。
【図４】個々の患者の予測スコアを示す図である。黒丸及び黒三角は、発現データを識別遺伝子の選択に用いた患者の妥当化症例（学習症例）におけるスコアを示す。白丸及び白三角は、４つの追加的症例（試験症例）についてのスコアを示す。丸は、ＣＭＬ患者が慢性期にあることを示し、三角は、ＣＭＬ患者が、それぞれ急性転化（学習症例）及び移行期（試験症例）にあることを示す。絶対値が大きいほど、信頼性が高いことを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、イマニチブ若しくはその誘導体に又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法に関する。本発明の方法は、例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に対するイマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩による治療効果を判定する場合等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＭＬは、造血幹細胞の癌化に起因するクローン性疾患であり、そのほとんどは、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）の存在及びＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼの構成的活性化により特徴付けられる（Ｓ． Ｆａｄｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４１， １６４−７２． （１９９９））。ＣＭＬは、慢性期、加速期（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｐｈａｓｅ）及び必ず死に至る急性転化期（ｂｌａｓｔ ｃｒｉｓｉｓ）の３つの段階を経て進行する。従来より、ＣＭＬの治療として、インターフェロン−αの投与及び同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）の幹細胞移植（ＳＣＴ）が選択可能である。インターフェロン−α投与により、生存期間を延長することができるが、強い副作用がある。ＳＣＴが唯一の根治療法であるが、合併症の発生頻度がかなり高く、また、治療を受けられるのは適当なドナーが見つかった患者に限定される。従って、ＣＭＬの予後は依然として良くない。
【０００３】
ＡＢＬ−選択的チロシンキナーゼ阻害剤であるイマニチブ（４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ベンズアミド、開発コード名ＳＴＩ５７１）が開発され、ＣＭＬの治療が大きく進歩した（Ｅ． Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ， Ａ． Ｍａｔｔｅｒ， Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５５１， Ｍ１１−８． （２００１）； Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２， ５６１−６． （１９９６））。この薬剤により、約９０％のＣＭＬ患者において、血液学的に完全な寛解が得られ、また、６０％以上の患者において、激しい副作用なしにＰｈ染色体陽性白血病細胞が完全になくなり又は部分的に減少する（Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４， １０３１−７． （２００１））。このため、イマニチブは、ＣＭＬ治療の第１の選択肢になった。
【０００４】
なお、イマニチブは、下記式［Ｉ］で示される化学構造を有する抗癌剤であり、ＣＭＬの治療に広く用いられているのみならず、消化管間質腫瘍（ＧＳＩＴ）等の他の腫瘍の治療にも有効であることが報告されている。また、イマニチブのメシル酸塩が、グリベック（Ｇｌｉｖｅｃ）という商品名で、スイス国ＢａｓｅｌのＮｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から市販されており、ＣＭＬの治療のために臨床的に用いられている。
【０００５】
【化１】
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、イマニチブは、全てのＣＭＬ患者に有効なわけではなく、イマニチブ投与が無効なＣＭＬ患者もいる。イマニチブは、有効な場合にはその治療効果が顕著であるので、ＳＣＴを行うか否かをタイミング良く決断するのが難しくなった（Ｊ． Ｍ． Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｂ． Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ， Ｂｌｏｏｄ ９８， ２０３９−４２． （２００１））。また、イマニチブが効かない患者に対してイマニチブを投与することは、時間と医薬コストの無駄遣いであり、また、患者が他の治療を受けるチャンスを逸してしまう危険性もある。従って、もし、イマニチブの投与が治療に有効か否かを予め知ることができれば、ＣＭＬの治療に非常に有利である。
【０００７】
本発明の目的は、イマニチブの投与により治療を行うＣＭＬのような疾病にある患者が罹患している場合に、当該患者がイマニチブに対して感受性を有するか否かを判定する、すなわち、当該患者に対してイマニチブを投与することがその疾病の治療に有効か否かを予測する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、イマニチブに対して感受性を有する患者、すなわち、イマニチブ投与が有効な応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と、イマニチブに対して感受性を有さない患者、すなわち、イマニチブ投与が無効な非応答者（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）とでは、特定の遺伝子の発現量が有意に異なっているかもしれないということに想到した。そこで、２万種類以上のｃＤＮＡを固定したｃＤＮＡマイクロアレイを用い、ＣＭＬ患者の単球中の各種遺伝子の発現量を測定し、応答者と非応答者で統計学的な有意差が存在する遺伝子が存在するか否かを調べたところ、７７種の遺伝子の発現量に有意な差があることを見出し、さらに、上記統計処理に用いていない新規ＣＭＬ患者について、これらの遺伝子の発現量に基づき応答者か非応答者かを予測できることを実験的に確認して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、生体から分離された検体細胞中における下記（１）〜（７７）の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定し、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比することを含む、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法を提供する。
（１）ＨＮ１（ＡＩ０８６８７１）、（２）ＡＫＲ１Ｃ３（Ｄ１７７９３）、（３）ＱＡＲＳ（Ｘ７６０１３）、（４）ＫＩＡＡ１１０５（ＡＡ１３６１８０）、（５）ＫＩＡＡ０６６８（ＡＡ５０６９７２）、（６）ＢＬＣＡＰ（ＡＦ０５３４７０）、（７）ＡＤＦＰ（Ｘ９７３２４）、（８）ＦＬＪ１０４２２（ＡＡ８９４８５７）、（９）ＨＭＧＣＬ（Ｌ０７０３３）、（１０）ＥＳＴ（ＡＩ０５１４５４）、（１１）ＫＬＦ４（ＡＩ２９０８７６）、（１２）Ｈ３Ｆ３Ａ（Ｍ１１３５４）、（１３）ＡＣＴＢ（Ｖ００４７８）、（１４）ＤＫＦＺＰ５６６Ｄ１９３（ＡＡ４０１３１８）、（１５）ＡＰＥＸ（Ｕ７９２６８）、（１６）ＤＲＩＬ１（Ｕ８８０４７）、（１７）ＢＩＮ１（ＡＦ００１３８３）、（１８）ＥＳＴ（ＡＡ４９５９８４）、（１９）ＣＬＴＨ（Ｎ４１９０２）、（２０）Ｍ６ＰＲ（ＡＡ１７９８３２）、（２１）ＫＩＡＡ０１０６（Ｄ１４６６２）、（２２）ＩＧＦ２Ｒ（Ｊ０３５２８）、（２３）ＩＤＨ１（ＡＡ３３００１４）、（２４）ＥＳＴ（ＡＩ３３３４４９）、（２５）ＳＤＨＢ（ＡＡ３６５９８６）、（２６）ＴＮＲＣ３（ＡＩ７４３１３４）、（２７）ＭＧＰ（ＡＡ１５６４８８）、（２８）ＣＢＬＢ（Ｕ２６７１０）、（２９）ＥＳＴ（ＡＡ０５５３５５）、（３０）ＦＬＪ１０８０３（Ｔ７０７８２）、（３１）ＩＭＰＤＨ１（Ｊ０５２７２）、（３２）ＦＬＪ２０４８９（ＡＩ０９１４５９）、（３３）ＧＴＦ２Ｉ（Ｕ７７９４８）、（３４）ＣＧＩ−５７（ＡＦ０７０６３８）、（３５）ＬＯＣ５１３１２（．ＡＩ１２８５３８）、（３６）ＣＨＡＣ（ＡＡ２２８８７４）、（３７）ＡＴＰ１Ｂ１（Ｘ０３７４７）、（３８）ＣＰＴ１Ａ（ＡＡ６３２２２５）、（３９）ＣＴＳＧ（Ｍ１６１１７）、（４０）ＡＸＵＤ１（ＡＩ０９１３７２）、（４１）ＨＬＡ−Ｂ（Ｍ２８２０４）、（４２）ＧＯＬＧＡ４（Ｕ３１９０６）、（４３）ＥＳＴ（ＡＡ７４３４６２）、（４４）ＳＣＹＡ１３（Ｕ４６７６７）、（４５）Ｂ４ＧＡＬＴ１（Ｄ２９８０５）、（４６）ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０４６３（ＡＡ１４３０４８）、（４７）ＨＳＪ１（Ｘ６３３６８）、（４８）ＭＲＰＬ３（Ｘ０６３２３）、（４９）Ｃ９ｏｒｆ１０（Ｄ８０００５）、（５０）ＤＤＸ１（Ｘ７０６４９）、（５１）ＥＳＴ（ＡＡ４２１３２６）、（５２）ＨＬＡ−Ａ（ＡＦ０５５０６６）、（５３）ＳＴＩＭ１（ＡＡ１０１８３４）、（５４）ＡＭＰＤ２（Ｍ９１０２９）、（５５）ＳＴＸ５Ａ（Ｕ２６６４８）、（５６）ＩＦＮＢ１（Ｍ２５４６０）、（５７）ＭＡＥＡ（ＡＩ２９１７４５）、（５８）ＬＢＲ（Ｌ２５９４１）、（５９）ＬＩＭＫ２（Ｄ４５９０６）、（６０）ＥＳＴ（ＡＩ３６５６８３）、（６１）ＲＰＬ２６（ＡＡ７７８１６１）、（６２）ＦＬＪ１０２０９（ＡＬ１３７２７１）、（６３）ＦＡＡＨ（ＡＡ１３２５１９）、（６４）Ｃ２１ＯＲＦ３３（Ｙ０７５７２）、（６５）ＥＳＴ（Ｚ４４５１３）、（６６）ＰＲＫＡＣＡ（Ｘ０７７６７）、（６７）ＥＰＢ４９（Ｌ１９７１３）、（６８）ＥＳＴ（Ｕ５１７１２）、（６９）ＣＲＳＰ９（ＡＩ３３４３９６）、（７０）ＥＳＴ（ＡＡ６００３２３）、（７１）ＳＴＫ２２Ｂ（Ｌ７７５６４）、（７２）ＴＲＢ＠（Ｘ０１４１０）、（７３）ＥＥＦ１Ｄ（Ｚ２１５０７）、（７４）ＲＰＧＲ（Ｕ５７６２９）、（７５）ＡＲＲＢ１（ＡＡ９１８７２５）、（７６）ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（ＡＡ６０２４９０）、（７７）ＩＧＬ＠（Ｍ８７７９０） （ただし、各遺伝子シンボルの後の括弧内の文字はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を示す）。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いることができる７７種の遺伝子は、下記実施例に詳述する方法により、ＣＭＬ患者の単球中での発現量が、応答者と非応答者とで統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有するか否かを判定することにより選択されたものである。これらの７７種の遺伝子の順位、Ｐ値、シンボル名、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．、遺伝子名及び非応答者における発現量が応答者における発現量よりも多いか少ないか（多い場合を「↑」、少ない場合を「↓」で示す）を下記表１〜４にまとめて示す。なお、表中の記載順序は、Ｐ値の小さいもの順、すなわち、統計学的有意差の大きい順である。これらの遺伝子の全てについてＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．が付与されていることから明らかなように、これらの遺伝子自体は既に公知であり、その塩基配列も公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。ＧｅｎＢａｎｋは、遺伝子やタンパク質の配列を集めた米国の政府系機関によるデータベースであり、誰でも無料でインターネットでアクセスして利用することができるので、各遺伝子の配列は容易に入手できる。
【００１１】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
なお、請求項１に記載した（１）〜（７７）の番号は、表１に示すＰ値の小さいもの順に付した番号であり、番号が若い遺伝子ほど、統計学的な有意差が大きいことを示している。
【００１６】
本発明の方法では、生体から分離された検体細胞中における上記（１）〜（７７）の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定する。発現量を測定する遺伝子の数が多いほど判定の確度が高くなるというものではなく、測定する遺伝子の数は１０〜３５程度が好ましい。特に、上記した（１）〜（３５）の遺伝子の、番号の若いものから１０〜３５種類の遺伝子の発現量を調べることが好ましく、さらには、前記遺伝子のうち（１）〜（１５）の遺伝子、又は、（１）〜（３０）の遺伝子の発現量を調べることが好ましい。
【００１７】
生体から分離した検体細胞としては、イマニチブ投与により治療しようとする疾病の症状を現している細胞が好ましく、例えば、ＣＭＬの場合には、単球のような白血球細胞が好ましい。また白血病細胞の遺伝子発現を解析することから、６５％を超える細胞がフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体陽性（ｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子を検出するＦＩＳＨ解析により判定）である試料が好ましい。
【００１８】
細胞中の各遺伝子の発現量は、細胞中の各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することにより測定することができ、ｍＲＮＡ量の測定は周知の方法により行うことができる。例えば、下記実施例に記載するように、調査対象となる遺伝子のｃＤＮＡを等量ずつ固定化したＤＮＡマイクロアレイを作製し、一方、検体細胞中の各ＲＮＡを鋳型として、標識ヌクレオチドの存在下でｃＤＮＡを合成することにより標識ｃＤＮＡを合成し、これを前記ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートしてＤＮＡマイクロアレイ上のｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、洗浄後、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットの標識量を測定することにより測定することができる。なお、検体細胞中の各遺伝子の発現量の測定方法は、この方法に限定されるものではなく、各遺伝子の発現量を測定できる方法であれば他のいずれの方法をも採用することができる。例えば、リアルタイム検出逆転写ＰＣＲ法やノーザンブロット法等によっても細胞中の各ＲＮＡを測定することが可能である。好ましい態様では、比較的多数の遺伝子の発現量を調べるので、後述の実施例に記載したような、検体細胞から調製した標識ｃＤＮＡを、マイクロアレイ上に固定化された各遺伝子とハイブリダイズさせてその標識量を測定する方法が簡便で好ましい。なお、ここで、「発現量」とは、絶対量である必要はなく、相対量でよい。また、必ずしも数値的に表現される必要はなく、例えば、標識に蛍光標識等の可視的な標識を用い、目視により判定する場合等も「発現量の測定」にあたる。
【００１９】
次に、測定された各遺伝子の発現量を、イマニチブに対する感受性を有する応答者及び有さない非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比する。これを行うためには、当然ながら、予め、既知の応答者及び非応答者における各遺伝子の発現量を調べておく必要がある。そして、これらと、検体細胞中の各遺伝子の発現量を対比する。対比は、検体細胞中の各遺伝子の発現量を、既知の応答者及び非応答者における各遺伝子の発現量の平均値と比較し、どちらの平均値に近いか、それが統計学的に有意か否か等を判定することによっても行うことができるが、より的確に判定を行うためには、統計学的手法により予測スコア（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ、ＰＳ値）を算出し、この予測スコアに基づきイマニチブに対する感受性を判定することが好ましい。このように、本明細書において、「対比」とは、発現量をそのまま比較することのみならず、測定された発現量並びに既知の応答者及び非応答者における測定値について統計学的な処理を行うことをも包含する。予測スコアの算出方法自体は、公知である（Ｔ． Ｒ． Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ５３１−７． （１９９９）； Ｔ． Ｊ． ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９， １４３−５２． （２００１））。すなわち、各遺伝子（ｇｉ）は、その発現レベル（ｘｉ）が、応答者又は非応答者の発現レベルの平均値のどちらに近いのかに基づき、応答者又は非応答者のいずれかに投票する。投票の大きさ（ｖｉ）は、２つの群の平均からの試料中の発現レベルの偏差を反映する。
Ｖｉ＝｜ｘｉ−（μｒ＋μｎ）／２｜
なお、上記式中、μｒ及びμｎは、それぞれ、応答者群及び非応答者群における発現量の平均値を示す。投票を合計して応答者（Ｖｒ）及び非応答者（Ｖｎ）のそれぞれについて合計投票を算出し、ＰＳ値を次式により算出する。
ＰＳ＝（（Ｖｒ−Ｖｎ）／（Ｖｒ＋Ｖｎ））×１００
【００２０】
この定義から明らかなように、ＰＳ値は、−１００〜１００の間にあり、正の値の場合には応答者、負の値の場合には非応答者であると判定され、それぞれの絶対値が大きいほど判定の確実さが高くなる。下記実施例において具体的に示されるように、この方法で、上記（１）〜（１５）の遺伝子、及び上記（１）〜（３０）の遺伝子について発現量を測定し、ＰＳ値を求めた結果、遺伝子の選出に用いた「学習例」１８例及び本発明の方法の妥当性を確認するために用いた「試験例」４例の合計２２例のいずれにおいても、ＰＳ値が正か負かにより、１例の例外もなく正しく判定することができた。特に、上記（１）〜（１５）の遺伝子を用いた場合には、１例の例外もなく、ＰＳ値の絶対値が３０以上であった。なお、絶対値が大きいほど判定の確度が高くなるので、例えば、絶対値が５以上又は２０以上等の場合に判定し、それ以下の場合には判定留保にするというような判定基準を適宜設けることも可能である。
【００２１】
上記の方法により、被験者がイマニチブに対する感受性を有するか否か、すなわち、イマニチブによる治療の応答者であるか非応答者であるかを判定することができる。
【００２２】
なお、上記した本発明の方法により、それに対する感受性を測定できる薬剤はイマニチブに限定されるものではなく、イマニチブの誘導体、すなわち、上記式［Ｉ］で示されるイマニチブを構成する１又は複数の任意の原子上の水素原子が、任意の置換基で置換された化合物であって、イマニチブと同じ性質の薬効を示すものに対する感受性をも測定できる。ここで、置換基の数は、特に限定されないが５個以下が好ましく、また、置換基としては、炭素数１〜６の低級アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、ニトロ基及びカルボキシル基等、特に炭素数１〜６の低級アルキル基を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、イマニチブ又はその誘導体は、薬理学的に許容できる酸付加塩の形態にあってもよい。ここで、薬理学的に許容できる酸付加塩としては、メシル酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２４】
試料の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た２２名の成人骨髄性白血病患者から、イマニチブ治療に先立って末梢血試料を得た。次いで、各患者は、イマニチブの抗白血病効果を評価するための臨床試験フェーズＩＩの被験者になった。治療前において、６５％を超える細胞がフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体陽性（ｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子を検出するＦＩＳＨ解析により判定）である１８試料からのｍＲＮＡを、本願発明者らが作製したｃＤＮＡマイクロアレイシステム（後述）で解析した。慢性期にある１６名の患者には、４００ ｍｇ／日のイマニチブ（イマニチブメシル酸塩（商品名グリベック、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製、投与量の数値はイマニチブ換算）を投与した。急性転化期にある２名の患者には、６００ ｍｇ／日のイマニチブを投与した。細胞遺伝学的応答、すなわち、細胞分裂中期において、Ｐｈ染色体が依然として陽性（上記ＦＩＳＨ解析により判定）である細胞の割合に基づいてイマニチブに対する細胞遺伝学的応答性を決定した（Ｂ．Ｊ． Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３４４， １０３１−７（２００１））。高い細胞遺伝学的応答（Ｐｈ染色体陽性の細胞の割合が３５％未満になる）を示した１２名の患者を「応答者」（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）に分類し、イマニチブ治療を５ヶ月行った後のＰｈ染色体陽性細胞の割合が６５％を超える６名の患者を「非応答者」（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と定義した。このように、予測スコアシステムの構築に用いた１８名の患者は、応答者又は非応答者のいずれかに分類された。残る４名は、後述する予測スコアシステムの妥当性を試験するために試験症例としてとっておいた。２２名のうち、２名の「学習」症例（後述の予測スコアシステムの構築の際に用いた症例）が急性転化の状態にあり、２名の試験症例（後述の予測スコアシステムの妥当性を試験するために用いた症例）が移行期の状態にあった。これら４名の患者では、イマニチブが臨床的に無効であり、１２週間以内にイマニチブによる治療が停止されたので、細胞遺伝学的応答は、治療開始１２週間後に解析を行った。マイクロアレイのコントロールとして、１１名の健常ボランティアの末梢血由来の単球細胞混合物を用いた。
【００２５】
ｃＤＮＡマイクロアレイの作製
上記ｃＤＮＡマイクロアレイシステムは次のようにして作製した。はじめに、ガラススライドにスポットするためのｃＤＮＡを得るために、公知の方法（Ｈ． Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１， ２１２９−３７． （２００１））により、各遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲを行った。より詳細には、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから選択した２３，０４０ 種類のｃＤＮＡを固定化したｃＤＮＡマイクロアレイを次のようにして作製した。すなわち、１２種類の正常なヒトの器官（脳、心臓、肝臓、骨格筋、小腸、脾臓、胎盤、甲状腺、胎児脳、胎児腎臓、胎児肺及び胎児肝臓）の組織から得られたポリアデニル化ＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ） （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をｃＤＮＡの調製に用いた。オリゴ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ 逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ製）を用いてＲＮＡを逆転写した。その後ＰＣＲ法にて、上述の通り選択した各遺伝子特異的配列をもつｐｒｉｍｅｒを用いて、繰り返し配列又はポリ（Ａ）を含まない２００〜１１００ ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に電気泳動し、予想されるサイズの単一のバンドを示すかをチェックし、示すものをスポッティングに用いた。これらのＰＣＲ産物を精製し、マイクロアレイスポッター（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｐｏｔｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ （ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いてＴｙｐｅ−７ガラススライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上にスポットした。異なる５組のスライド（１組４，６０８個のｃＤＮＡで、５組で合計２３，０４０個のｃＤＮＡ）を作製した。各スライドには、それぞれ同じ５２種類のハウスキーピング遺伝子及び２種類の陰性対照遺伝子もスポットした。
【００２６】
なお、上記のＰＣＲにおいて、上記した７７種類の遺伝子の増幅のために用いたプライマーセットは、下記表５〜７に示す通りであった。なお、表５〜７中の遺伝子番号は、上記した表１〜表４中に示す遺伝子番号を示す。また、上記ＰＣＲの温度サイクル条件は、はじめに９５℃、５分間熱変性後、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとしたものを４０サイクルで、最後に７２℃１０分間である。
【００２７】
【表５】
表５
【表６】
表６
【表７】
表７
２． 各遺伝子の発現量の測定
解析に用いた試料は、共通コントロールとして１１人の健常人の末梢血より調製した白血球細胞を用い、それに対してＣＭＬ患者それぞれの末梢血より調製した白血病細胞の遺伝子発現解析を行った。その際の試料の調製は以下の通りである。Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて単球細胞を調製し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＮＹ）を用い、製品の使用説明書記載の方法により全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン社製）処理後、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを用いたＲＮＡ増幅法を行った。このＲＮＡ増幅法は、Ｌｕｏ， Ｌ． （Ｎａｔ Ｍｅｄ．， ５； １１７−１２２， １９９９）の方法に従って行った。すなわち、具体的には次のように行った。試料より抽出したＲＮＡとＴ７ プロモーター配列を付加した Ｔ７−ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）２１ ｐｒｉｍｅｒをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いた逆転写反応を行い、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。次にこの１本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして再度Ｔ７ プロモーター配列を付加した Ｔ７−ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）２１ ｐｒｉｍｅｒをＤＮＡポリメラーゼＩを用いて反応させて、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡを精製後、最後にこの２本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼによるＲＮＡ合成を行った。最終的には２μｇの全ＲＮＡを出発物質として用いて、上述のＲＮＡ増幅法による増幅を２サイクル行うことにより、４０〜１００μｇの増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）が得られた。コントロール試料についても同様な増幅を行い、十分量のａＲＮＡを得た。得られたａＲＮＡの量は分光光度計にて測定し、変性アガロースゲル電気泳動にてＲＮＡの質についても調べた。なお、この方法により増幅されたＲＮＡは、鋳型として全ＲＮＡを用いた場合においてもａＲＮＡを用いた場合でも、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果と一致することが確認されている（Ｋ． Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０， ５００７−１１． （２０００））。
【００３１】
標識、ハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニング及びシグナルの定量は、全ての操作を公知の自動化スライドプロセッサー（Ｈ． Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６１， ２１２９−３７． （２００１））を用いて行ったことを除き、Ｋ． Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６０， ５００７−１１． （２０００）に記載の方法により行った。すなわち、具体的には、これらは次のようにして行った。健常人ボランティア又はＣＭＬ患者の末梢血中の単球細胞から得たａＲＮＡ ２．５μｇを、それぞれＣｙ５−ｄＣＴＰ及びＣｙ３−ｄＣＴＰの存在下で上記と同様に逆転写した。得られた標識プローブをマイクロアレイハイブリダイゼーション溶液バージョン２（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ２ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びホルムアミド（Ｓｉｇｍａ社製）と終濃度５０％で混合した。ハイブリダイゼーション及び洗浄は、市販の自動スライドプロセッサー（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｌｉｄｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用い、その使用説明書に従って行った。次いで、アレイスキャナー（Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））を用いて、マイクロアレイ上の各蛍光標識を測定した。
【００３２】
３． 統計学的処理
はじめに遺伝子を次の２つの基準を用いて選択した。（ｉ）少なくとも８０％の症例において、シグナル強度がカットオフ値よりも高い、（ｉｉ）｜ Ｍｅｄｒ − Ｍｅｄｎ ｜ ≧０．５（ただし、Ｍｅｄは応答者又は非応答者における対数変換した相対的発現量比（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）から得られるメジアンを示している）。各ハイブリダイゼーションシグナル強度を市販のソフト（Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））を用いて光学的に評価し、ハウスキーピング遺伝子の平均シグナルに正規化した。スポットを平均化することにより各試料についてのＣＹ３：ＣＹ５比を算出した。発現レベルの前記カットオフ値は、バックグランド変動（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）に従って自動計算したものである。変動は、Ｃｙ３：Ｃｙ５の対数比の分散から、高発現遺伝子（上位３０％。バックグランド変動が小さい場合には無視できる）のＣｙ３：Ｃｙ５の対数比の分散を差し引いた値により評価することができる。変動が臨界値（１．０）未満である、発現レベルが約１０５を超える遺伝子を用いた。なぜなら、発現レベルが低い他の遺伝子は、バックグランド変動の中に埋もれてしまうからである。また、マイクロアレイにおけるスライド上のスポット量の不均一性（ある一定の範囲で制御していはいるものの）には、コントロール（対象）をもうけることで、そのコントロールと比較してサンプルでの発現量比と言う形でデータを解析する。いわゆるサンプルでの発現量をコントロールの発現量で割ることによって得られる比を「相対的発現量比」とする。
【００３３】
次いで、順列テスト（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を行い、応答者と非応答者の判別分離に有用な遺伝子を選択した。これは次のようにして行った。応答者（ｒ）及び非応答者（ｎ）における各遺伝子の対数変換相対的発現量比から平均（μ）及び標準偏差（σ）を計算した。判別スコア（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ， ＤＳ）を次のように定義した。
ＤＳ ＝ （μｒ−μｎ）／（σｒ＋σｎ）
各遺伝子の、応答者と非応答者を識別する能力を評価するために、これら２つの群をランダムに１０，０００回順列を入れ替えて順列テスト（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を行った。個々の遺伝子のＤＳデータセットが正規分布を示したので、ユーザー規定グループ分け（ｕｓｅｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）のために、公知の方法（Ｔ． Ｒ． Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ５３１−７． （１９９９）によりＰ値を計算した。すなわち、Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔを行うことによって、各遺伝子においてＤＳ値で構成される正規分布が形成され、平均値と標準偏差が求まる。この平均値と標準偏差を用いて式を求めＰ値を算出した。
【００３４】
その結果、順列のＰ値が０．０５未満である７７種類の遺伝子が候補としてリストされた（表１〜４）。これらの７７種類の遺伝子のうち、３３遺伝子は、応答者に比べて非応答者において発現レベルが増大しており、４４の遺伝子は発現レベルが減少していた。
【００３５】
この情報を用い、イマニチブ治療の有効性を予測するスコアリングシステムを確立することを試みた。公知の方法（Ｔ． Ｒ． Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ５３１−７．（１９９９）； Ｔ． Ｊ． ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９， １４３−５２． （２００１））に従って、予測スコア（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ， ＰＳ）を算出した。すなわち、各遺伝子（ｇｉ）は、その発現レベル（ｘｉ）が、応答者又は非応答者の発現レベルの平均値のどちらに近いのかに基づき、応答者又は非応答者のいずれかに投票する。投票の大きさ（ｖｉ）は、２つの群の平均からの試料中の発現レベルの偏差を反映する。
Ｖｉ＝｜ｘｉ−（μｒ＋μｎ）／２｜
投票を合計して応答者（Ｖｒ）及び非応答者（Ｖｎ）のそれぞれについて合計投票を算出し、ＰＳ値を次式により算出した。
ＰＳ＝（（Ｖｒ−Ｖｎ）／（Ｖｒ＋Ｖｎ））×１００
これは、応答者又は非応答者の方向におけるマージンオブビクトリー（ｍａｒｇｉｎ ｏｆｖｉｃｔｏｒｙ）を反映している。ＰＳ値は−１００〜１００の範囲にあり、絶対値が大きい程より確かな予測を反映している。
【００３６】
７７種類の候補遺伝子を順列Ｐ値の大きさの順に並べ（表１〜４）、このランク順リストの上位５， １０， １５， ２０， ２５， ３０， ３５， ４０， ４５， ５０， ５５， ６０， ６５， ７０， ７５及び７９遺伝子を用いて、ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎのためのリーブ−ワン−アウトテスト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ ｔｅｓｔ）を行った。これは次のようにして行った。すなわち、１つの試料を除外し、残りの試料について順列Ｐ値及び平均発現レベルを算出し、次いで、予測スコアを算出することにより、除外した試料の群を決定した。この操作を１８の試料のそれぞれについて行った。
【００３７】
次いで、２つの群の分離を最も良く行うことができる遺伝子の数を決定するために、それぞれの遺伝子の組についてクラス分けスコア（ＣＳ）を算出した。これは次のようにして行った。すなわち、クラス分けスコア（ＣＳ）は、応答者の予測スコア（ＰＳｒ）と非応答者の予測スコア（ＰＳｎ）を用いて次式により算出した。
ＣＳ ＝ （μＰＳｒ − μＰＳｎ） ／ （σＰＳｒ ＋ σＰＳｎ）
ＣＳ値が大きいほど、予測スコアリングシステムによる２つの群の分離がより良く行われることを示している。
【００３８】
計算に用いた遺伝子の数は、２つの群を分離する能力に影響を与える。表１〜４に示す遺伝子のトップ１５（（１）〜（１５））又はトップ３０（（１）〜（３０））を用いた際に最も応答者と非応答者を明瞭に分離することができた（図１）。これら２種類の遺伝子セットを用いた「予測スコア」システムにより、２つの患者群が明瞭に分離された（図２）。同じ遺伝子組を用いた階層的クラスター分割もまた、イマニチブ感受性についてグループ分けすることが可能であった（図３）。階層的クラスターは次のように行った。順列テストにより最も高くランクされた１５又は３０の識別遺伝子（表１〜４参照）を用いて、階層的クラスター法を適用した。この分析は、Ｍ． Ｅｉｓｅｎにより開発され、インターネットのウェブから利用できるソフトウェアである「ｃｌｕｓｔｅｒ」及び「ｔｒｅｅｖｉｅｗ」（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ５／ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ／ＳＭＤ／ｒｅｓｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ）を用いて行った。クラスター分割アルゴリズムを適用する前に、各スポットについての蛍光比を対数変換し、次いで、各試料についてのデータをメジアン中央化（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒ）して実験的なバイアスを除去した。
【００３９】
４． 試験例の判定
この予測システムの有効性を実証するために、システムの確立に用いた１８の「学習」症例とは全く独立したさらなる４症例の「試験」症例について、末梢血中の単球中の全ＲＮＡを出発物質とした上記と全く同様な解析を行った。これらの４つの試料のそれぞれについて、上記と同様に遺伝子発現プロファイルを調べ、上記トップ１５（（１）〜（１５））又はトップ３０（（１）〜（３０））の識別遺伝子（表１〜４参照）を用いて予測スコアを計算した。図４に示すように、イマニチブに対する４名の各患者の応答性は、１００％の正確さで予測することができた。
【００４０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】識別遺伝子の数とクラス分けスコア（ＣＳ）との関係を示す図である。
【図２】識別遺伝子の数を変えた場合における予測スコアを示す図である。Ｒは応答者、Ｎは非応答者を示す。
【図３】１５又は３０の予測遺伝子セットを用いたクラスター分析の結果を示す図である。全ての試料は、イマニチブに対する感受性によりクラス分けされた。
【図４】個々の患者の予測スコアを示す図である。黒丸及び黒三角は、発現データを識別遺伝子の選択に用いた患者の妥当化症例（学習症例）におけるスコアを示す。白丸及び白三角は、４つの追加的症例（試験症例）についてのスコアを示す。丸は、ＣＭＬ患者が慢性期にあることを示し、三角は、ＣＭＬ患者が、それぞれ急性転化（学習症例）及び移行期（試験症例）にあることを示す。絶対値が大きいほど、信頼性が高いことを示す。
Claims (9)
- 生体から分離された検体細胞中における下記（１）〜（７７）の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定し、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比することを含む、イマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法。
（１）ＨＮ１（ＡＩ０８６８７１）、（２）ＡＫＲ１Ｃ３（Ｄ１７７９３）、（３）ＱＡＲＳ（Ｘ７６０１３）、（４）ＫＩＡＡ１１０５（ＡＡ１３６１８０）、（５）ＫＩＡＡ０６６８（ＡＡ５０６９７２）、（６）ＢＬＣＡＰ（ＡＦ０５３４７０）、（７）ＡＤＦＰ（Ｘ９７３２４）、（８）ＦＬＪ１０４２２（ＡＡ８９４８５７）、（９）ＨＭＧＣＬ（Ｌ０７０３３）、（１０）ＥＳＴ（ＡＩ０５１４５４）、（１１）ＫＬＦ４（ＡＩ２９０８７６）、（１２）Ｈ３Ｆ３Ａ（Ｍ１１３５４）、（１３）ＡＣＴＢ（Ｖ００４７８）、（１４）ＤＫＦＺＰ５６６Ｄ１９３（ＡＡ４０１３１８）、（１５）ＡＰＥＸ（Ｕ７９２６８）、（１６）ＤＲＩＬ１（Ｕ８８０４７）、（１７）ＢＩＮ１（ＡＦ００１３８３）、（１８）ＥＳＴ（ＡＡ４９５９８４）、（１９）ＣＬＴＨ（Ｎ４１９０２）、（２０）Ｍ６ＰＲ（ＡＡ１７９８３２）、（２１）ＫＩＡＡ０１０６（Ｄ１４６６２）、（２２）ＩＧＦ２Ｒ（Ｊ０３５２８）、（２３）ＩＤＨ１（ＡＡ３３００１４）、（２４）ＥＳＴ（ＡＩ３３３４４９）、（２５）ＳＤＨＢ（ＡＡ３６５９８６）、（２６）ＴＮＲＣ３（ＡＩ７４３１３４）、（２７）ＭＧＰ（ＡＡ１５６４８８）、（２８）ＣＢＬＢ（Ｕ２６７１０）、（２９）ＥＳＴ（ＡＡ０５５３５５）、（３０）ＦＬＪ１０８０３（Ｔ７０７８２）、（３１）ＩＭＰＤＨ１（Ｊ０５２７２）、（３２）ＦＬＪ２０４８９（ＡＩ０９１４５９）、（３３）ＧＴＦ２Ｉ（Ｕ７７９４８）、（３４）ＣＧＩ−５７（ＡＦ０７０６３８）、（３５）ＬＯＣ５１３１２（．ＡＩ１２８５３８）、（３６）ＣＨＡＣ（ＡＡ２２８８７４）、（３７）ＡＴＰ１Ｂ１（Ｘ０３７４７）、（３８）ＣＰＴ１Ａ（ＡＡ６３２２２５）、（３９）ＣＴＳＧ（Ｍ１６１１７）、（４０）ＡＸＵＤ１（ＡＩ０９１３７２）、（４１）ＨＬＡ−Ｂ（Ｍ２８２０４）、（４２）ＧＯＬＧＡ４（Ｕ３１９０６）、（４３）ＥＳＴ（ＡＡ７４３４６２）、（４４）ＳＣＹＡ１３（Ｕ４６７６７）、（４５）Ｂ４ＧＡＬＴ１（Ｄ２９８０５）、（４６）ＤＫＦＺＰ５６４Ｏ０４６３（ＡＡ１４３０４８）、（４７）ＨＳＪ１（Ｘ６３３６８）、（４８）ＭＲＰＬ３（Ｘ０６３２３）、（４９）Ｃ９ｏｒｆ１０（Ｄ８０００５）、（５０）ＤＤＸ１（Ｘ７０６４９）、（５１）ＥＳＴ（ＡＡ４２１３２６）、（５２）ＨＬＡ−Ａ（ＡＦ０５５０６６）、（５３）ＳＴＩＭ１（ＡＡ１０１８３４）、（５４）ＡＭＰＤ２（Ｍ９１０２９）、（５５）ＳＴＸ５Ａ（Ｕ２６６４８）、（５６）ＩＦＮＢ１（Ｍ２５４６０）、（５７）ＭＡＥＡ（ＡＩ２９１７４５）、（５８）ＬＢＲ（Ｌ２５９４１）、（５９）ＬＩＭＫ２（Ｄ４５９０６）、（６０）ＥＳＴ（ＡＩ３６５６８３）、（６１）ＲＰＬ２６（ＡＡ７７８１６１）、（６２）ＦＬＪ１０２０９（ＡＬ１３７２７１）、（６３）ＦＡＡＨ（ＡＡ１３２５１９）、（６４）Ｃ２１ＯＲＦ３３（Ｙ０７５７２）、（６５）ＥＳＴ（Ｚ４４５１３）、（６６）ＰＲＫＡＣＡ（Ｘ０７７６７）、（６７）ＥＰＢ４９（Ｌ１９７１３）、（６８）ＥＳＴ（Ｕ５１７１２）、（６９）ＣＲＳＰ９（ＡＩ３３４３９６）、（７０）ＥＳＴ（ＡＡ６００３２３）、（７１）ＳＴＫ２２Ｂ（Ｌ７７５６４）、（７２）ＴＲＢ＠（Ｘ０１４１０）、（７３）ＥＥＦ１Ｄ（Ｚ２１５０７）、（７４）ＲＰＧＲ（Ｕ５７６２９）、（７５）ＡＲＲＢ１（ＡＡ９１８７２５）、（７６）ＮＯＰ５／ＮＯＰ５８（ＡＡ６０２４９０）、（７７）ＩＧＬ＠（Ｍ８７７９０） （ただし、各遺伝子シンボルの後の括弧内の文字はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を示す）。 - イマニチブ又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性を判定する請求項１記載の方法。
- 前記遺伝子のうち、１０〜３５種類の遺伝子の発現量を調べる請求項１又は２記載の方法。
- 前記遺伝子のうち、（１）〜（３５）の遺伝子の、番号の若いものから１０〜３５種類の遺伝子の発現量を調べる請求項３記載の方法。
- 前記遺伝子のうち（１）〜（１５）の遺伝子、又は、（１）〜（３０）の遺伝子の発現量を調べる請求項４記載の方法。
- 測定された発現量を、前記応答者及び非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比する工程は、統計学的に予測スコアを算出することを含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
- 慢性骨髄性白血病に対するイマニチブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩による治療効果を予測する方法である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検体細胞が白血球細胞である請求項７記載の方法。
- 前記白血球細胞が単球細胞である請求項８記載の方法。
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