WO2003097830A1 - Procede pour evaluer la sensibilite a l'imatinib - Google Patents

Procede pour evaluer la sensibilite a l'imatinib Download PDF

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WO2003097830A1
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est
imatinib
seq
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Ryozo Ohno
Takashi Tsuruo
Yusuke Nakamura
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Japan Represented By President Of The University Of Tokyo
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining sensitivity to imatinib or a derivative thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the method of the present invention is useful, for example, for determining the therapeutic effect of imatinib or a derivative thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof on chronic myeloid leukemia (GML).
  • GML chronic myeloid leukemia
  • CML is a clonal disease resulting from canceration of hematopoietic stem cells, most of which are characterized by the presence of the Philadelphia chromosome (Ph) and the constitutive activation of the BGR-ABL thymic synkinase (S. Fader I et al., N Engl J Med 341, 164-72. (1999)).
  • GNIL progresses through three phases: a chronic phase, an accelerated phase, and a blast crisis, which always results in death.
  • administration of interferon-1 and allogeneic (a 11 ogen ic) stem cell transplantation (SCT) can be selected. Interferon- ⁇ administration can prolong survival, but has strong side effects.
  • SGT is the only radical treatment, complications are quite common and can be treated only in patients who have found a suitable donor. Therefore, the prognosis of CML is still poor.
  • Imatinib (4- (4-methylbiperazin-1-ylmethyl) -N- [4-methyl-3- (4-pyridin-3-ylpyrimidine-2-ylamino) phenyl) is an ABL-selective inhibitor of thymic synthase ] Benzamide, codename STI571) was developed, and the treatment of GML has greatly advanced (E. Buchdunger, A. Matter, BJ Druker, Biochim Biophys Acta 1551, Ml 1-8. (2001); BJ Druker et. al., Nat Med 2, 561-6. (1996)).
  • Imatinib is an anticancer drug having the chemical structure represented by the following formula [I], and is not only widely used for the treatment of CML but also for other tumors such as gastrointestinal stromal tumor (GS). It has been reported that it is also effective for treatment.
  • Imatinib mesylate is also commercially available from Novart is Pharmaceuticals, Inc. of Basel, Switzerland under the trade name Gli vec and is used clinically for the treatment of CML. ing.
  • imatinib is not effective in all GML patients, and some patients with CML do not respond to imatinib.
  • Imatinib when effective, has a remarkable therapeutic effect, making it difficult to decide in a timely manner whether or not to perform SGT (M. Goldman, BJ Druker, Blood 98, 2039- 42. (2001)) 0
  • administering imatinib to patients who do not respond to imatinib is a waste of time and medicine, and the risk that patients lose their chance to receive other treatments. There is also. Therefore, if it is possible to know in advance whether imatinib administration is effective for the treatment, it is very advantageous for the treatment of GML.
  • An object of the present invention is to determine whether a patient is susceptible to imatinib when a patient suffering from a disease such as CML is treated by administering imatinib. It is intended to provide a method for predicting whether or not imatinib administration is effective for treating the disease.
  • the inventors of the present invention are categorized into patients who are sensitive to imatinib, that is, responders who are effective in imatinib administration, and patients who are not sensitive to imatinib, that is, non-responders who are ineffective in imatinib administration.
  • the present inventors completed the present invention by experimentally confirming that a responder or a non-responder could be predicted based on the expression level of the gene.
  • the present invention measures the expression levels of a plurality of genes of the following gene groups (1) to (77) in specimen cells isolated from a living body, and evaluates imatinib or its derivative or pharmacologically acceptable
  • a method for determining sensitivity to imatinib or an derivative thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof which comprises comparing the expression level of each of the above genes in responders and non-responders having sensitivity to the salt thereof. .
  • HN1 (A1086871), (2) AKR1C3 (D17793), (3) QARS (X76013), (4) KIAA1105 (AA1361 80), (5) KIAA0668 (AA506972), (6) BLGAP (AF053470), (7) ADFP (X97324), (8) FLJ10422 (AA894857), (9) HMGCL (L07033) (10) EST (A 1051454), (11) KLF4 (AI290876), (12) H3F3A (11354).
  • the present invention it can be predicted whether or not administration of imatinib to a patient is effective in treating the disease. Therefore, administration of imatinib to patients who are not effective in imatinib administration wastes time and medicine costs, and reduces the risk that patients lose their chances of receiving other treatments.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the number of discriminating genes and the classification score (GS).
  • FIG. 2 is a diagram showing prediction scores when the number of identification genes is changed. R indicates responder, N indicates non-responder.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of cluster analysis using 15 or 30 predicted gene sets. All samples were reclassified by sensitivity to imatinib.
  • FIG. 4 is a diagram showing predicted scores of individual patients. The filled circles and filled triangles show the scores in the validated cases (learned cases) of patients using the expression data for selection of the discriminating gene. Open circles and open triangles indicate scores for four additional cases (test cases). The circles indicate that the GML patient is in the chronic phase, and the triangles indicate that the GML patient is in the blast crisis (learning case) and transitional phase (test case), respectively. The larger the absolute value, the higher the reliability.
  • the 77 genes that can be used in the method of the present invention have statistically significant expression levels in monocytes of CML patients between responders and non-responders by the method described in detail in the Examples below. This is selected by determining whether or not there is a difference (P 0.05).
  • the rank, P value, symbol name, GenBank Accession No., gene name, and expression level in non-responders of these 77 genes are larger or smaller than those in responders.
  • ⁇ ”, and“ ⁇ ”when the number is small are summarized in Tables 1-4 below.
  • the order of description in the table is ascending order of ⁇ value, that is, The order is strict. As is clear from the fact that GenBank Accession Nos.
  • GenBank is a database of governmental agencies in the United States that collects gene and protein sequences.Everyone can access and use the Internet for free, so the sequence of each gene is easily available. .
  • the numbers (1) to (77) described in claim 1 at the time of filing are numbers assigned in ascending order of P value shown in Table 1, and the lower the number, the more statistically significant the gene is. This indicates that the difference is large.
  • the expression levels of a plurality of genes in the gene group of (1) to (77) in the specimen cells separated from the living body are measured. This does not mean that the accuracy of the determination increases as the number of genes whose expression level is measured increases, and the number of genes to be measured is preferably about 10 to 35.
  • the number of genes to be measured is preferably about 10 to 35.
  • the specimen cells separated from the living body cells exhibiting the symptoms of the disease to be treated by imatinib administration are preferable.
  • white blood cells such as monocytes are preferable.
  • a sample in which more than 65% of cells are positive for Philadelphia (Ph) chromosome is preferable.
  • the expression level of each gene in the cell can be measured by measuring the mRNA level of each gene in the cell, and the mRNA level can be measured by a well-known method.
  • a DNA microarray was prepared in which cDNAs of the gene to be investigated were immobilized in equal amounts, while each RNA in the sample cells was designated as type III in the presence of a labeled nucleotide.
  • a labeled cDNA is synthesized by synthesizing the cDNA with the DNA microarray, and this is incubated with the DNA microarray under hybridization conditions to hybridize with the cDNA on the DNA microarray. It can be measured by measuring the labeling amount of each spot above.
  • the method for measuring the expression level of each gene in the sample cells is not limited to this method, and any other method that can measure the expression level of each gene can be used. it can. For example, it is also possible to measure each RNA in cells by real-time detection reverse transcription PCR, Northern blot method, or the like. In a preferred embodiment, the expression level of a relatively large number of genes is determined. Therefore, a simple and preferable method for measuring the amount of labeling by hybridizing labeled cDNA prepared from a sample cell with each gene immobilized on a microarray, as described in Examples below, is preferred.
  • the “expression amount” does not need to be an absolute amount, but may be a relative amount.
  • the expression is not necessarily required to be expressed numerically. For example, a case where a visible label such as a fluorescent label is used as a label and the determination is made by visual observation corresponds to “measurement of expression level”.
  • the measured expression level of each gene is compared with the expression level of each gene in responders who have sensitivity to imatinib and non-responders who do not. To do this, it is, of course, necessary to check the expression levels of each gene in known responders and non-responders in advance. Then, these are compared with the expression level of each gene in the sample cells. The comparison compares the expression level of each gene in the sample cells with the average value of the expression level of each gene in known responders and non-responders. It can also be performed by determining whether or not the prediction score (prediction screen, PS value) is calculated by a statistical method. It is preferable to determine the sensitivity to imatinib based on the following.
  • “contrast” means not only comparing the expression level as it is, but also performing a statistical process on the measured expression level and the measured value in known responders and non-responders. It also includes doing.
  • the method of calculating the prediction score itself is known (TR Golub et al., Science 286, 531- 7. (1999); TJ MacDonald et al., Nat Genet 29, 143-52. (2001)). That is, each gene ( gi ) will vote for either responder or non-responder based on whether its expression level () is closer to the average of the expression levels of responders or non-responders. You.
  • the size of the vote (v reflects the deviation of the expression level in the sample from the average of the two groups.
  • ⁇ and ⁇ n indicate the average values of the expression levels in the responder group and the non-responder group, respectively.
  • the votes are summed to calculate a total vote for each of the responder (V r ) and the non-responder (V n ), and the PS value is calculated by the following equation.
  • PS ((V r -V n ) X (V r + V n )) X 100
  • the PS value is between -100 and 100. Positive values are judged as responders, and negative values are judged as non-responders. The larger the value, the higher the certainty of the judgment.
  • the expression levels of the genes (1) to (15) and the genes (1) to (30) were measured by this method, and the PS value was determined. As a result, the PS value was found to be low in any of the 18 “learning examples” used for gene selection and the “test j” total of 4 cases used to confirm the validity of the method of the present invention.
  • the drug whose sensitivity can be measured by the method of the present invention described above is not limited to imatinib, but is a derivative of imatinib, that is, the above formula
  • the number of substituents is not particularly limited, but is preferably 5 or less, and examples of the substituent include a lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen, an amino group, a hydroxyl group, a nitro group, and a propyloxyl group.
  • lower alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms can be exemplified, but not limited thereto.
  • imatinib or a derivative thereof may be in the form of a pharmacologically acceptable acid addition salt.
  • pharmacologically acceptable acid addition salts include, but are not limited to, mesylate, hydrochloride, sulfate, nitrate and the like.
  • Peripheral blood samples were obtained from 22 adult myeloid leukemia patients with informed consent prior to imatinib treatment. Each patient then became part of a Phase II clinical trial to evaluate the anti-leukemic effects of imatinib. Before the treatment, more than 65% of the cells were positive for Philadelphia (Ph) chromosome (determined by FISH analysis to detect the bcr / abl fusion gene). Analysis was performed using the cDNA microarray system (described later). Sixteen patients in the chronic phase received 400 mg / day of imatinib (imatinib mesylate (trade name Gleevec, Novartis Pharmaceuticals), dose values converted to imatinib).
  • imatinib imatinib mesylate (trade name Gleevec, Novartis Pharmaceuticals), dose values converted to imatinib).
  • the 18 patients used to build the predictive score system were classified as either responders or non-responders, and the remaining four were used to test the validity of the predictive score system described below.
  • two “learning” cases the ones used in the construction of the predictive score system described below
  • test cases The case used to test the validity of the predictive scoring system described below was in a transitional state.
  • imatinib was clinically ineffective and was treated with imatinib within 12 weeks.
  • cytogenetic responses were analyzed 12 weeks after the start of treatment.
  • a monocyte cell mixture derived from peripheral blood of one healthy volunteer was used.
  • cDNA microarray system was prepared as follows. First, in order to obtain cDNA for spotting on a glass slide, RT-PCR was performed for each gene by a known method (H. Okabe et al., Cancer Res 61, 2129-37. (2001)). Was done. More specifically, a cDNA microarray on which 23,040 kinds of GDNAs selected from the UniGene database of the National Cancer for Biotechnology Information were immobilized was prepared as follows.
  • RNA polyadenylation obtained from tissues of one of two normal human organs (brain, heart, liver, skeletal muscle, small intestine, spleen, placenta, thyroid, fetal brain, fetal kidney, fetal lung and fetal liver)
  • polyA + RNA (Glontech) was used for the preparation of cDNA.
  • RNA was reverse transcribed using an oligo (dT) primer and Superscript II reverse transcriptase (Ufe Technologies Inc). Thereafter, a region of 200 to 1100 bp that did not contain the repetitive sequence or poly (A) was amplified by the PGR method using primers having the gene-specific sequences selected as described above.
  • PCR product was electrophoresed on an agarose gel, checked for a single band of the expected size, and used for spotting.
  • PCR products were purified and spotted on a Type-7 glass slide (manufactured by Amersham Biosciences) using a microarray spotter (Microray spotter Generation III (Amersham Biosciences)).
  • Five different sets of slides (a set of 4,608 pieces of cDNA and a total of 23,040 pieces of cDNA) were produced. Each slide also spotted the same 52 housekeeping genes and two negative control genes.
  • primer sets used for amplification of the above-mentioned 77 types of genes were as shown in Tables 5 to 7 below.
  • the gene numbers in Tables 5 to 7 indicate the gene numbers shown in Tables 1 to 4 described above.
  • the temperature cycling conditions for the above PCR were as follows: first, heat denaturation at 95 ° C for 5 minutes, then 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. It is 10 minutes at 72 ° C. Table 5
  • SEQ ID NO: 1 5 SEQ ID NO: 1 6 U HMWlPboIL ( ⁇ "U” ⁇ 7 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ,) Rooster column number 1 7 Rooster system 'J number 1 8 SEQ ID NO: 1 9 SEQ ID NO: 20
  • STIM1 (AA101834) SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106
  • a PD2 (M91029) SEQ ID NO: 1 07 SEQ ID NO: 1 08
  • IFNB1 (NI25460) SEQ ID NO: 1 1 1 SEQ ID NO: 1 1 2
  • RPL26 (AA778161) SEQ ID NO: 1 2 1 SEQ ID NO: 1 2 2
  • EPB49 (L19713) SEQ ID NO: 1 3 3 SEQ ID NO: 1 3 4
  • EEF1D (Z21507) SEQ ID NO: 1 4 5 SEQ ID NO: 1 4 6
  • ARRB1 (AA918725) SEQ ID NO: 1 4 9 SEQ ID NO: "! 5 0
  • the samples used for analysis were white blood cells prepared from the peripheral blood of one healthy individual as a common control, and gene expression analysis of leukemia cells prepared from the peripheral blood of each GML patient was performed.
  • the preparation of the sample at that time is as follows. Monocyte cells were prepared using Ficol I (Amersham Biosciences), and total RNA was extracted using Trizol (Life Technologies, Inc. NY) according to the method described in the instruction manual for the product. After treatment with DNase I (manufactured by Nippon Gene), an RNA amplification method using T7 RNA polymerase was performed. This RNA amplification method was performed according to the method of Luo, L. (Nat Med., 5; 117-122, 1999). That is, specifically, I went.
  • RNA extracted from the sample and 7-oligod (T) 21 primer to which a T7 promoter sequence was added were subjected to a reverse transcription reaction using Superscript II to synthesize single-stranded cDNA.
  • T7-oligod (T) 21 primer to which the T7 promoter sequence was added again was reacted using DNA polymerase I to synthesize double-stranded cDNA. did.
  • T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase
  • RNA amplified RNA (aRNA) was obtained by performing 2 cycles of the above-mentioned RNA amplification using 2 ⁇ g of total RNA as a starting material. Similar amplification was performed for the control sample to obtain a sufficient amount of aRNA. The amount of the obtained aRNA was measured with a spectrophotometer, and the quality of RNA was also examined by denaturing agarose gel electrophoresis. The RNA amplified by this method was confirmed to be consistent with the results of the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PGR) whether using total RNA or aRNA as type III. (K. Ono et a, Cancer Res 60, 50 07-11. (2000)).
  • RT-PGR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • the resulting labeled probe was mixed with microarray hybridization solution solution 2 (manufactured by Amersham Biosciences) and formamide (manufactured by Sigma) at a final concentration of 50%. .
  • Hybridization and washing were performed using a commercially available automated slide processor (Automated Slide Processor (Amersham B osc ences)) according to the instruction manual.
  • Array Scanner Generation
  • genes were selected using the following two criteria.
  • Each of the insects was evaluated optically using a commercially available software (Array Vision computer program (Amersham Biosciences)) and normalized to the average signal of the housekeeping gene.
  • the CY3: GY5 ratio for each sample was calculated by averaging the spots.
  • the cut-off value of the expression level is automatically calculated according to the background fluctuation.
  • Fluctuations were evaluated by subtracting the variance of the log ratio of Cy3: Cy5 from the variance of the log ratio of Cy3: Cy5 from the variance of the log ratio of Cy3: Cy5 for highly expressed genes (top 30%; negligible if the background fluctuation is small) can do. Genes with an expression level of more than about 10 5 with fluctuations below the critical value (1.0) were used. This is because other genes with low expression levels are buried in background fluctuations.
  • the non-uniformity of the spot amount on the slide in the microarray (although it is controlled within a certain range) can be controlled by adding a control (subject) to the sample. Analyze the data in the form of the expression level ratio. The ratio obtained by dividing the expression level in the so-called sample by the expression level of the control is referred to as “relative expression level ratio”.
  • the mean (and standard deviation (b)) was calculated from the logarithmic transformed relative expression ratio of each gene in responders (r) and non-responders (n).
  • the discrimination score (DS) was calculated as follows. Defined.
  • a prediction score (prediction score, PS) was calculated. That is, each gene will vote for either the responder or the non-responder based on whether its expression level (X;) power is closer to the average of the expression levels of the responders or non-responders.
  • the size of the vote ( Vi ) reflects the deviation of the expression level in the sample from the average of the two groups.
  • the PS value is in the range of -100 to 100, and a larger absolute value reflects a more reliable prediction.
  • the seven types of candidate genes are arranged in the order of the permutation P value (Tables 1 to 4), and the top 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 of this rank order list are listed.
  • , 55, 60, 65, 70, 75 and 79 genes were subjected to a leave-one-out test for cross-validation. This was performed as follows. sand That is, one sample was excluded, the permutation P value and the average expression level were calculated for the remaining samples, and then the group of excluded samples was determined by calculating the prediction score. This operation was performed for each of the 18 samples.
  • a classification score (GS) was then calculated for each set of genes to determine the number of genes that could best separate the two groups. This was performed as follows. That is, the classification score (GS) was calculated by the following equation using the predicted score of the responder (PS) and the predicted score of the non-responder (PS n ).
  • the number of genes used in the calculation affects the ability to separate the two groups.
  • the responders and non-responders could be clearly separated.
  • Fig. 1 The “prediction score” system using these two sets of genes clearly separated the two patient groups (Fig. 2).
  • Figure 3 Hierarchical clustering was performed as follows: The 15 or 30 discriminating genes ranked highest by the permutation test (Table 1). The hierarchical clustering method was applied by using the “cluster” and “treeviewj (http: // genome-) software developed by M. Eisen and available from the Internet web.

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Description

イマチニブに対する感受性の判定方法
技術分野
本発明は、 イマチニブ若しくはその誘導体に又は薬理学的に許容できるその塩 に対する感受性の判定方法に関する。 本発明の方法は、 例えば慢性骨髄性白血病 (GML)に対するイマチニブ若しくはその誘導体又は薬理学的に許容できるその塩 による治療効果を判定する場合等に有用である。
背景技術
CML は、 造血幹細胞の癌化に起因するクローン性疾患であり、 そのほとんどは、 フィラデルフィァ染色体 (Ph)の存在及び BGR- ABLチ口シンキナーゼの構成的活性 化により特徴付けられる（S. Fader I et al. , N Engl J Med 341, 164-72. (1999 ))。 GNILは、 慢性期、 加速期（accelerated phase)及び必ず死に至る急性転化期（ blast crisis)の 3つの段階を経て進行する。 従来より、 GMLの治療として、 ィ ンターフェロン一 の投与及び同種異系 (a 11 ogen i c)の幹細胞移植 (SCT)が選択可 能である。 インターフヱロン一 α?投与により、 生存期間を延長することができる が、 強い副作用がある。 SGTが唯一の根治療法であるが、 合併症の発生頻度がか なり高く、 また、 治療を受けられるのは適当なドナーが見つかった患者に限定さ れる。 従って、 CMLの予後は依然として良くない。
ABL-選択的チ口シンキナーゼ阻害剤であるイマチニブ （4- (4-メチルビペラジ ン -1-ィルメチル) - N-[4 -メチル - 3-(4-ピリジン- 3-ィルピリミジン- 2-ィルァミノ )フエニル]ベンズアミ ド、 開発コード名 STI571) が開発され、 GMLの治療が大き く進歩した（E. Buchdunger, A. Matter, B. J. Druker, Biochim Biophys Acta 1551, Ml 1-8. (2001)； B. J. Druker et al. , Nat Med 2, 561-6. (1996))。 こ の薬剤により、 約 90%の GWIL患者において、 血液学的に完全な寛解が得られ、 また、 6 Oo/o以上の患者において、 激しい副作用なしに Ph染色体陽性白血病細 胞が完全になくなり又は部分的に減少する（B. J. Druker et al., N Engl J Med 344, 1031-7. (2001)) o このため、 イマチニブは、 GML治療の第 1の選択肢に なった。 なお、 イマチニブは、 下記式 [ I ]で示される化学構造を有する抗癌剤であり、 C MLの治療に広く用いられているのみならず、 消化管間質腫瘍（GS )等の他の腫 瘍の治療にも有効であることが報告されている。 また、 イマチニブのメシル酸塩 が、 グリベック（G l i vec)という商品名で、 スイス国 Base lの Novart i s Pharmace ut i ca l s社から市販されており、 CMLの治療のために臨床的に用いられている。
Figure imgf000004_0001
[ I ]
しかしながら、 イマチニブは、 全ての GML患者に有効なわけではなく、 ィマチ ニブ投与が無効な CML患者もいる。 イマチニブは、 有効な場合にはその治療効果 が顕著であるので、 SGTを行うか否かをタイミング良く決断するのが難しくなつ た（ M. Go l dman, B. J. Druker, B l ood 98, 2039-42. (2001 ) ) 0 また、 ィマチ ニブが効かない患者に対してイマチニブを投与することは、 時間と医薬コス卜の 無駄遣いであり、 また、 患者が他の治療を受けるチャンスを逸してしまう危険性 もある。 従って、 もし、 イマチニブの投与が治療に有効か否かを予め知ることが できれば、 GMLの治療に非常に有利である。
発明の開示
本発明の目的は、 イマチニブの投与により治療を行う CMLのような疾病にある 患者が罹患している場合に、 当該患者がイマチニブに対して感受性を有するか否 かを判定する、 すなわち、 当該患者に対してイマチニブを投与することがその疾 病の治療に有効か否かを予測する方法を提供することである。
本願発明者らは、 イマチニブに対して感受性を有する患者、 すなわち、 ィマチ ニブ投与が有効な応答者（responder)と、 イマチニブに対して感受性を有さない 患者、 すなわち、 イマチニブ投与が無効な非応答者 (non- responder)とでは、 特 定の遺伝子の発現量が有意に異なっているかもしれないということに想到した。 そこで、 2万種類以上の c D N Aを固定した GDNAマイクロアレイを用い、 CML 患者の単球中の各種遺伝子の発現量を測定し、 応答者と非応答者で統計学的な有 意差が存在する遺伝子が存在するか否かを調べたところ、 77種の遺伝子の発現 量に有意な差があることを見出し、 さらに、 上記統計処理に用いていない新規 G ML患者について、 これらの遺伝子の発現量に基づき応答者か非応答者かを予測 できることを実験的に確認して本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 生体から分離された検体細胞中における下記 (1)〜（77) の遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定し、 イマチニブ若しくはその誘 導体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者にお ける前記各遺伝子の発現量と対比することを含む、 イマチニブ若しくはその誘導 体又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法を提供する。
(1)HN1 (A 1086871), (2)AKR1C3 (D17793), (3)QARS(X76013) , (4)KIAA1105 (AA1361 80)、 （5)KIAA0668(AA506972)、 （6) BLGAP (AF053470)、 （7) ADFP (X97324)、 (8)FLJ1 0422(AA894857)、 (9) HMGCL (L07033) (10) EST (A 1051454)、 (11)KLF4(AI290876) , (12)H3F3A( 11354). (13) AGTB (V00478)、 (14)DKFZP566D193 (AA401318), (15) APE X0J79268)、 (16)DRIL1 (U88047) , (17)BIN1 (AF001383)、 (18) EST (AA495984) , (19 )GLTH(N41902)、 (20) M6PR (AA179832)、 (21)KIAA0106(D14662) , (22) IGF2R(J0352 8)、 (23)IDH1 (AA330014). (24) EST (A 1333449)、 (25) SDHB (AA365986)、 (26)薦 3 (A 1743134), (27) MGP(AA156488) , (28)CBLB(U26710)、 （29) EST (AA055355)、 (30) FLJ10803 (T70782)、 (31) I MPDH1 (J05272)、 (32) FLJ20489 (A 1091459)、 (33) GTF21 ( U77948)、 (34) CGI-57(AF070638) . (35)L0C51312(, AM28538)、 (36) CHAC (AA22887 4)、 (37)ATP1B1 (X03747), (38)CPT1A(AA632225)、 (39)CTSG( 16117) , (40)AXUD1 (A 1091372). (41)HLA-B( 28204) (42)G0LGA4(U31906) , (43) EST (AA743462)、 （4 4) SCYA13 (U46767)、 (45) B4GALT1 (D29805)、 (46) DKFZP56400463 (AA143048)、 (47) HSJ1 (X63368)、 (48) NIRPL3 (X06323)、 (49) C9orf10 (D80005)、 (50) DDX1 (X70649)、 (51)EST(AA421326), (52) HLA - A (AF055066)、 (53)STIM1 (AA101834)、 (54)AMPD2(M 91029)、 （55)STX5A(U26648)、 (56)IFNB1 (M25460) , (57)MAEA(AI291745)、 (58) LB R(L25941)、 (59)LI MK2 (D45906), (60) EST (A 1365683)、 (61)RPL26(AA778161), (6 2) FLJ10209 (AL137271), (63)FAAH(AA132519)、 （64)C210RF33(Y07572)、 (65) EST ( Z44513)、 （66)PRKAGA(X07767)、 (67)EPB49 (L19713). (68) EST (U51712), (69)CRS P9 (A 1334396)、 (70) EST (AA600323)、 (71 ) STK22B (L77564)、 (72) TRB@ (X01410)、 ( 73) EEF1 D (Z21507)、 (74) RPGR (U57629) (75) ARRB1 (AA918725)、 (76) N0P5/N0P58 ( AA602490) , (77) I GL@ ( 87790) (ただし、 各遺伝子シンボルの後の括弧内の文 字は GenBank Access i on No.を示す） 。
本発明によれば、 患者に対してイマチニブを投与することがその疾病の治療に 有効か否かを予測することができる。 したがって、 イマチニブの投与が有効では ない患者にイマチニブを投与して時間と医薬コストの無駄を強いたり、 また、 患 者が他の治療を受けるチャンスを逸してしまう危険性を低減することができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 識別遺伝子の数とクラス分けスコア（GS)との関係を示す図である。 図 2は、 識別遺伝子の数を変えた場合における予測スコアを示す図である。 R は応答者、 Nは非応答者を示す。
図 3は、 1 5又は 3 0の予測遺伝子セットを用いたクラスター分析の結果を示 す図である。 全ての試料は、 イマチニブに対する感受性によリクラス分けされた。 図 4は、 個々の患者の予測スコアを示す図である。 黒丸及び黒三角は、 発現デ ータを識別遺伝子の選択に用いた患者の妥当化症例 （学習症例） におけるスコア を示す。 白丸及び白三角は、 4つの追加的症例 （試験症例） についてのスコアを 示す。 丸は、 GML患者が慢性期にあることを示し、 三角は、 GML患者が、 それぞれ 急性転化 （学習症例） 及び移行期 （試験症例） にあることを示す。 絶対値が大き いほど、 信頼性が高いことを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法に用いることができる 7 7種の遺伝子は、 下記実施例に詳述する 方法により、 CML患者の単球中での発現量が、 応答者と非応答者とで統計学的有 意差 (Pく 0. 05)を有するか否かを判定することにより選択されたものである。 これ らの 7 7種の遺伝子の順位、 P値、 シンポル名、 GenBank Access i on No.、 遺伝子 名及び非応答者における発現量が応答者における発現量よりも多いか少ないか （ 多い場合を 「ΐ」 、 少ない場合を 「丄」 で示す） を下記表 1〜4にまとめて示す。 なお、 表中の記載順序は、 Ρ値の小さいもの順、 すなわち、 統計学的有意差の大 きい順である。 これらの遺伝子の全てについて GenBank Access i on No.が付与さ れていることから明らかなように、 これらの遺伝子自体は既に公知であり、 その 塩基配列も公知であり、 GenBankに登録されている。 GenBankは、 遺伝子やタンパ ク質の配列を集めた米国の政府系機関によるデータベースであり、 誰でも無料で インターネッ卜でアクセスして利用することができるので、 各遺伝子の配列は容 易に入手できる。
表 1
口
食 1鼠 Lrentsan lu ンノ ノレ ノニマ
退 to十る
Figure imgf000008_0001
1 U.UUU AiUduo / l MJ 丄 Lュ ―一— »一、, I
I
TM つ t
U.UUU3 A K1し j レ卜 ケ卜リタクタ— εファ リ― 1, ノ/ヽ一し: 5 1
1 i X76U1J CLARI ク/レタ —メレ- t jNAンノ 1 タ— E
4 U.UU15 AA1つ36180 1AA1105 IAA1105タ、ノ *ハ » ク 1
J U.UU 1ソ Π A Λ Π Q i lAAUOOO ノ /、ノ貝 1
D VJ.UVJ U RT C A O n BS¾HH*7Cd5sES:iiJ;3S$ >¾ノ,/、ノ暂 I
7 入プ / J H- Η脂曰 Β ノ〕 1し1蹈笑 J■3；¾室々 > ノ，ノ ノ ¾貝" t 1
Q f O U.UVJ プ WR ¾J^. ^ノ */ノゝノ暂貝 V
Γ-JbJ Τ1 ΟΑΊ1 1
U.UUJo rliV >ΓLΓ~,/U~,ΤL L- 卜 U十ン ナノレ-: 3— ナノレソノレ ソノレ- †
1 コェンザィム Aリア一ゼ
Figure imgf000008_0002
丄 1 U.UUoJ KLF4 クルツペル様因子 4 1
1 1ム 9 丄 V1JL 1 H3F3A H3ヒストン， ファミリ一 3A 1 1 J Q VUU4 ACTB 1
8—ァクチン
14. Z ΔL Δ +ΠU 11 ^ J丄1 o ¾ DKFZP566D193 D FZP566D193タンパク質 1
U.UlU i U79265 PEX APEXヌクレア一ゼ 个 1
16 0.0107 U88047 DRIL1 デッドリンゲル (ショウジヨウ/ ) 1 1
17 0.0113 AF001383 BIN1 ブリッジングィンテグレーター 1 i
18 0.0114 AA495984 EST EST †
19 0.0123 N41902 CLTH クラスリンアセンブリ一リン/ 1'生-骨髄性白血病遺伝子 i
20 0.0127 AA179832 M6PR マンノース -6-リン酸レセプタ― T
P値 GenBank ID シンボゾレ 遺伝子名 非応答者における発現
21 0 ΚΤΑΑ01Π6 抗ォキシダントタンパク質 2 ί
ur インシュリン様成長因子 2 レセプター i
Π Π〗 リリ ΓΠΤ 1 イソクェン酸デヒドロゲナ一ゼ 1 (NA P+),可溶性 T
リ LlQ EST τ
コハク酸デヒドロゲナ一ゼ複合体- サブュニット B i
トリヌクレオチドリピ一トコン亍イニング 3 ί
A 0171 リ MGP KIAA1008 タンパク質 Τ
00178 1176710 Cas-Br-M ェクトロピックレトロウイルス形質転換配列 b τ
29 00187 EST EST ί
30 00191 T70782 FT T 1080 仮定タンノ《ク質 FLJ10803 I
Ή 10^9717ム Τ ΡΠΤ-Γ1 IMP (イノシン一 ン酸） デヒドロゲナ一ゼ 1 1
Π v. Πu1iy Q7 / リ 仮定タ、 《ク質 FLJ20489 †
U.U UU し / /y4o i r l 一般的転写因子 II i 1
A U /Uo o し JL- / 仮定タンパク質 ϊ
ミトコンドリア溶質キャリア ι
36 0.0205 AA228874 ΓΗΑΓ EST †
37 0.0214 X03747 ATP1B1 ATPase,Na+/K+輸送， ベータ 1ポリべプチド τ
TO υ.υζζο 1 Λ カルニチンパルミ トイルトランスフェラーゼ I, 肝臓 τ
39 0.0262 M16117 CTSG カセプシン G †
40 0.0269 AI091372 AXUD1 ヒト m NA; cDNADKFZp566F164 ϊ
41 0.0270 M28204 HLA-B 主要組織適合性複合体， クラス I B ϊ
表 3
番号 P値 GenBank ID シンボル 遺伝子名 非応答者における発現
42 0.0271 U31906 GOLGA4 ゴルジ自己抗原、 ゴルジンサブファミリー a, 4 1
43 0.0272 AA743462 EST EST T
44 0.0279 U46767 SCYA13 小誘導可能サイトカインサブファミリ一 A, メンバー 13 1
45 0.0281 D29805 B4GALT1 1，4-ガラクトシルトランスフェラ一ゼ,ポリべプチド 1 i
46 0.0290 AA143048 DKFZP564O0463 D FZP564O0463 タンパク質 †
47 0.0314 X63368 HSJ1 ヒートショックタンパク質， ニューロナル DNA.I-様 1 J.
48 0.0315 X06323 M PL3 ミトコンドリアリボソームタンパク質し 3 ί
49 0.0320 D80005 C9orfl0 C9orfl0 タンパク質 1
50 0.0327 X70649 DDX1 DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) ボックスポリペプチド 1 †
51 0.0350 AA421326 EST ヒト cDNA: FLJ21918 fis, クローン HEP04006 τ
52 0.0353 AF055066 HLA-A 主要組織適合性複合体， クラス I，A 1
53 0.0359 AA101834 STIM1 ストローマ相互作用分子 1 1
54 0.0360 M91029 AMPD2 アデノシン一リン酸デアミナ一ゼ 2 1
55 0.0361 U26648 STX5A シンタキシン 5A i
56 0.0366 M25460 IFNB1 インターフェロン^ 1 ,線維芽 I
57 0.0370 AI291745 MAEA マクロファージ赤芽球ァタッチヤ一 †
58 0.0372 L25941 LBR ラミン B レセプター †
59 0.0373 D45906 LIMK2 LIM ドメインキナーゼ 2 1
60 0.0387 AI365683 EST ヒ卜 PACクローン RP4-751H13 from 7q35-qter 1
61 0.0391 AA778161 RPL26 リボソームタンパク質 L26 T
62 0.0395 AL137271 FLJ 10209 仮定タンパク質 FLJ10209 i
番号 Ρ値 GenBank ID シンボル 遺伝子名 非応答者における発現
63 0.0407 AA132519 FAAH EST 1
64 0.0415 Y07572 C210RF33 ESI (セフフフイツンュ）タンハク質， ヒト類似体 T
65 0.0427 Z44513 EST EST T
66 0.0432 X07767 PRKACA タンハク質キナーセ， cAMP-依存性，触媒的， 1
67 0.0433 L19713 EPB49 赤血球 fl莫タンハク質ハン卜 4.9 (丁マチン） 丄
68 0.0439 U51712 EST EST 1
69 0.0442 A1334396 CRSP9 Spl 転写活性化に必要なコファクター i
70 0.0442 AA600323 EST EST ί
71 0.0442 L77564 STK22B セリン /スレオニンキナーゼ 22B 1
72 0.0444 X01410 TRB@ T細胞レセプター 座 i
73 0.0446 Z21507 EEF1D 真核生物翻訳延長因子 1 デルタ I
74 0.0446 U57629 RPGR 色素性網膜炎 GTPaseレギュレーター i
75 0.0454 AA918725 AR B1 アレスチン， β ΐ 1
76 0.0458 AA602490 NOP5 NOP58 核タンパク質 ΝΟΡ5/ΝΟΡ58 †
77 0.0461 M87790 IGL@ 免疫グロブリンラムダ座 i 情報は、 NCBI (build#131)の Unigeneデータベースから得た。
なお、 出願時の請求項 1に記載した（1) ~ (77)の番号は、 表 1に示す P値の小 さいもの順に付した番号であり、 番号が若い遺伝子ほど、 統計学的な有意差が大 きいことを示している。
本発明の方法では、 生体から分離された検体細胞中における上記（1 )〜（77)の 遺伝子群のうちの複数の遺伝子の発現量を測定する。 発現量を測定する遺伝子の 数が多いほど判定の確度が高くなるというものではなく、 測定する遺伝子の数は 1 0〜3 5程度が好ましい。 特に、 上記した（1 )〜（35)の遺伝子の、 番号の若い ものから 1 0〜3 5種類の遺伝子の発現量を調べることが好ましく、 さらには、 前記遺伝子のうち（1 )〜（15)の遺伝子、 又は、 （1 )〜（30)の遺伝子の発現量を調べ ることが好ましい。
生体から分離した検体細胞としては、 イマチニブ投与により治療しょうとする 疾病の症状を現している細胞が好ましく、 例えば、 GMLの場合には、 単球のよう な白血球細胞が好ましい。 また白血病細胞の遺伝子発現を解析することから、 6 5 %を超える細胞がフイラデルフィァ (Ph)染色体陽性 （bcr/ab l融合遺伝子を検 出する F I SH解析により判定） である試料が好ましい。
細胞中の各遺伝子の発現量は、 細胞中の各遺伝子の m R N A量を測定すること によリ測定することができ、 m R N A量の測定は周知の方法によリ行うことがで きる。 例えば、 下記実施例に記載するように、 調査対象となる遺伝子の c D N A を等量ずつ固定化した D N Aマイクロアレイを作製し、 一方、 検体細胞中の各 R N Aを錶型として、 標識ヌクレオチドの存在下で c D N Aを合成することにより 標識 c D N Aを合成し、 これを前記 D N Aマイクロアレイとハイブリダィゼーシ ョン条件下でインキュベートして D N Aマイクロアレイ上の c D N Aとハイプリ ダイズさせ、 洗浄後、 D N Aマイクロアレイ上の各スポットの標識量を測定する ことにより測定することができる。 なお、 検体細胞中の各遺伝子の発現量の測定 方法は、 この方法に限定されるものではなく、 各遺伝子の発現量を測定できる方 法であれば他のいずれの方法をも採用することができる。 例えば、 リアルタイム 検出逆転写 P C R法やノーザンブロッ卜法等によっても細胞中の各 R N Aを測定 することが可能である。 好ましい態様では、 比較的多数の遺伝子の発現量を調べ るので、 後述の実施例に記載したような、 検体細胞から調製した標識 c D N Aを、 マイクロアレイ上に固定化された各遺伝子とハイブリダィズさせてその標識量を 測定する方法が簡便で好ましい。 なお、 ここで、 「発現量」 とは、 絶対量である 必要はなく、 相対量でよい。 また、 必ずしも数値的に表現される必要はなく、 例 えば、 標識に蛍光標識等の可視的な標識を用い、 目視により判定する場合等も Γ 発現量の測定」 にあたる。
次に、 測定された各遺伝子の発現量を、 イマチニブに対する感受性を有する応 答者及び有さない非応答者における前記各遺伝子の発現量と対比する。 これを行 うためには、 当然ながら、 予め、 既知の応答者及び非応答者における各遺伝子の 発現量を調べておく必要がある。 そして、 これらと、 検体細胞中の各遺伝子の発 現量を対比する。 対比は、 検体細胞中の各遺伝子の発現量を、 既知の応答者及び 非応答者における各遺伝子の発現量の平均値と比較し、 どちらの平均値に近いか、 それが統計学的に有意か否か等を判定することによつても行うことができるが、 より的確に判定を行うためには、 統計学的手法により予測スコア (prediction sc ore, PS値）を算出し、 この予測スコアに基づきイマチニブに対する感受性を判 定することが好ましい。 このように、 本明細書において、 「対比」 とは、 発現量 をそのまま比較することのみならず、 測定された発現量並びに既知の応答者及び 非応答者における測定値について統計学的な処理を行うことをも包含する。 予測 スコアの算出方法自体は、 公知である（T. R. Golub et al.， Science 286， 531- 7. (1999) ; T. J. MacDonald et al. , Nat Genet 29, 143-52. (2001) )。 すなわ ち、 各遺伝子 (gi)は、 その発現レベル ( )が、 応答者又は非応答者の発現レベル の平均値のどちらに近いのかに基づき、 応答者又は非応答者のいずれかに投票す る。 投票の大きさ（ν は、 2つの群の平均からの試料中の発現レベルの偏差を反 映する。
Vi = | X i - ( i r+ n) /2 |
なお、 上記式中、 ^及び^ nは、 それぞれ、 応答者群及び非応答者群における発 現量の平均値を示す。 投票を合計して応答者 (Vr)及び非応答者 (Vn)のそれぞれに ついて合計投票を算出し、 PS値を次式により算出する。 PS= ( (Vr -Vn) X (Vr+Vn) ) X 100
この定義から明らかなように、 PS値は、 - 100〜100の間にあり、 正の値の場合 には応答者、 負の値の場合には非応答者であると判定され、 それぞれの絶対値が 大きいほど判定の確実さが高くなる。 下記実施例において具体的に示されるよう に、 この方法で、 上記 (1 )〜（15)の遺伝子、 及び上記（1 )〜（30)の遺伝子について 発現量を測定し、 PS値を求めた結果、 遺伝子の選出に用いた 「学習例」 1 8例及 び本発明の方法の妥当性を確認するために用いた 「試験例 j 4例の合計 2 2例の いずれにおいても、 PS値が正か負かにより、 1例の例外もなく正しく判定するこ とができた。 特に、 上記（1 )〜（15)の遺伝子を用いた場合には、 1例の例外もな く、 PS値の絶対値が 3 0以上であった。 なお、 絶対値が大きいほど判定の確度が 高くなるので、 例えば、 絶対値が 5以上又は 2 0以上等の場合に判定し、 それ以 下の場合には判定留保にするというような判定基準を適宜設けることも可能であ る。
上記の方法により、 被験者がイマチニブに対する感受性を有するか否か、 すな わち、 イマチニブによる治療の応答者であるか非応答者であるかを判定すること ができる。
なお、 上記した本発明の方法により、 それに対する感受性を測定できる薬剤は イマチニブに限定されるものではなく、 イマチニブの誘導体、 すなわち、 上記式
[ I ]で示されるイマチニブを構成する 1又は複数の任意の原子上の水素原子が、 任意の置換基で置換された化合物であって、 イマチニブと同じ性質の薬効を示す ものに対する感受性をも測定できる。 ここで、 置換基の数は、 特に限定されない が 5個以下が好ましく、 また、 置換基としては、 炭素数 1〜6の低級アルキル基、 ハロゲン、 アミノ基、 水酸基、 ニトロ基及び力ルポキシル基等、 特に炭素数 1〜 6の低級アルキル基を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。 また、 イマチニブ又はその誘導体は、 薬理学的に許容できる酸付加塩の形態にあ つてもよい。 ここで、 薬理学的に許容できる酸付加塩としては、 メシル酸塩、 塩 酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩等を挙げることができるがこれらに限定されるものではな い。 実施例
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。
試料の臨床病理学的所見
インフォ一ムドコンセントを得た 22名の成人骨髄性白血病患者から、 ィマチ ニブ治療に先立って末梢血試料を得た。 次いで、 各患者は、 イマチニブの抗白血 病効果を評価するための臨床試験フェーズ IIの被験者になった。 治療前におい て、 65%を超える細胞がフィラデルフィア（Ph)染色体陽性 （bcr/abl融合遺伝 子を検出する FISH解析により判定） である 1 8試料からの mRNAを、 本願発 明者らが作製した c DNAマイクロアレイシステム （後述） で解析した。 慢性期 にある 1 6名の患者には、 400 mg/日のイマチニブ （イマチニブメシル酸塩 （商 品名グリベック、 Novartis Pharmaceuticals社製、 投与量の数値はイマチニブ 換算） を投与した。 急性転化期にある 2名の患者には、 600 mg/日のイマチニブ を投与した。 細胞遺伝学的応答、 すなわち、 細胞分裂中期において、 Ph染色体 が依然として陽性 (上記 FISH解析により判定）である細胞の割合に基づいてイマ チニブに対する細胞遺伝学的応答性を決定した (B.J. Druker et al., N Engl J Med344, 1031-7 (2001) )0 高い細胞遺伝学的応答 （Ph染色体陽性の細胞の割合が 35%未満になる） を示した 1 2名の患者を 「応答者 j (responder)に分類し、 イマチニブ治療を 5ヶ月行った後の Ph染色体陽性細胞の割合が 65%を超える 6名の患者を 「非応答者」 （non-responder)と定義した。 このように、 予測スコ アシステムの構築に用いた 1 8名の患者は、 応答者又は非応答者のいずれかに分 類された。 残る 4名は、 後述する予測スコアシステムの妥当性を試験するために 試験症例としてとつておいた。 22名のうち、 2名の 「学習」 症例 （後述の予測 スコアシステムの構築の際に用いた症例） が急性転化の状態にあり、 2名の試験 症例 （後述の予測スコアシステムの妥当性を試験するために用いた症例） が移行 期の状態にあった。 これら 4名の患者では、 イマチニブが臨床的に無効であり、 1 2週間以内にイマチニブによる治療が停止されたので、 細胞遺伝学的応答は、 治療開始 1 2週間後に解析を行った。 マイクロアレイのコントロールとして、 1 1名の健常ボランティアの末梢血由来の単球細胞混合物を用いた。
c DN Aマイクロアレイの作製
上記 c DN Aマイクロアレイシステムは次のようにして作製した。 はじめに、 ガラススライドにスポットするための c DN Aを得るために、 公知の方法（H. Ok abe et al. , Cancer Res 61, 2129-37. (2001))により、 各遺伝子について RT-P CRを行った。 より詳細には、 ational Cancer for Biotechnology Information の UniGeneデータベースから選択した 23, 040 種類の GDNAを固定化した C D N Aマイクロアレイを次のようにして作製した。 すなわち、 1 2種類の正常なヒト の器官 （脳、 心臓、 肝臓、 骨格筋、 小腸、 脾臓、 胎盤、 甲状腺、 胎児脳、 胎児腎 臓、 胎児肺及び胎児肝臓） の組織から得られたポリアデニル化 RNA(polyA+ RN A) (Glontech社製）を c DN Aの調製に用いた。 オリゴ (dT)プライマー及び Supe r script II 逆転写酵素（Ufe Technologies I nc製）を用いて R N Aを逆転写し た。 その後 PGR法にて、 上述の通り選択した各遺伝子特異的配列をもつ primer を用いて、 繰り返し配列又はポリ（A)を含まない 200~1100 bpの領域を増幅した。 P CR産物をァガロースゲル上に電気泳動し、 予想されるサイズの単一のバンド を示すかをチェックし、 示すものをスポッティングに用いた。 これらの P C R産 物を精製し、 マイクロアレイスポッター (Mi croar ray spotter Generation III ( Amersham Biosciences))を用しヽて Type - 7ガラススライ (Amersham Biosciences 社製)上にスポットした。 異なる 5組のスライ ド （1組 4,608個の0り^で、 5組 で合計 23,040個の c DN A) を作製した。 各スライドには、 それぞれ同じ 52 種類のハウスキーピング遺伝子及び 2種類の陰性対照遺伝子もスポットした。 なお、 上記の PCRにおいて、 上記した 77種類の遺伝子の増幅のために用い たプライマーセットは、 下記表 5〜 7に示す通りであった。 なお、 表 5〜 7中の 遺伝子番号は、 上記した表 1〜表 4中に示す遺伝子番号を示す。 また、 上記 P C Rの温度サイクル条件は、 はじめに 95°C、 5分間熱変性後、 95°C30秒、 6 0°C30秒、 7 2°C1分を 1サイクルとしたものを 40サイクルで、 最後に 7 2°C1 0分間である。 表 5
配列
遺伝子 （番号、 シンボル、 GenBank
フォワード側プ リバース側ブラ ID)
フィマー ィマー
HNl CAIUobo/ 1) 配列番号 1 配列番号 2 ) AK IOJ (D1 //9J) 配列番号 3 配列番号 4 ) UARo (X76013 配列番号 5 配列番号 6
(4； Kl AAl lUo (AAl bloU 酉己列番号フ 配列番号 8
(o K I AAUobo (AAoUby ii) 配列番号 9 配列番号 1 0
W tJLし Aド A卜 配列番号 1 1 配列番号 1 2 / AU卜ド (Ay/dZ4 配列番号 1 3 配列番号 1 4
,Qヽ C卜Iし J Ϊ11 Λ U40Zり (,A ΛA ΛoΟΩy4>1o Wo7、
1) 配列番号 1 5 配列番亏 1 6 U HMWlPboIL (し Λ U" Ι7ΛΌゥοゥ、) 酉己列番号 1 7 酉己歹 'J番号 1 8
Figure imgf000017_0001
配列番号 1 9 配列番号 2 0
/i 1 \ ι ι Γ卜Α I 0ΩΛ0"7Λ、
U l 4 vAI yUo/ J 配列番号 2 1 配列番号 2 2 卜 (IVn ioo4 配列番号 2 3 配列番号 2 4
( \ K TO \!f\f\A~10 配列番号 2 5 配列番号 2 6
(1 ； UK卜 Z bbbiJl \)o (AA4U1 l o) 配列番号 2 7 配列番号 2 8
(lb) APnX (U/9 bo) 配列番号 2 9 配列番号 3 0
(l ) DKILl (UooU4/ 配列番号 3 1 配列番号 3 2 1 "7、 D〖M1 , 匚 /"\1ゥ0ゥ、 配列番号 3 3 配列番号 3 4
0、 COT /A A ΛΩΠΠΟ>Π 「
目 c列番^ ·3 5 目 ci列番 3 6 f π、 TU M>| 1
(liJ しし IH(J\l4iyUZ) 配列番号 3フ 配列番号 3 8 配列番号 3 9 配列番号 4 0
(2DKIAA0106 (D14662) 配列番号 4 1 配列番号 4 2
(22) IGF2R(J03528) 配列番号 4 3 配列番号 4 4
(23) IDH1 (AA330014) 配列番号 4 5 配列番号 4 6
(24) EST (A 1333449) 配列番号 4 7 配列番号 4 8
(25)SDHB(AA365986) 配列番号 4 9 配列番号 5 0
(26)TNRC3(AI743134) 配列番号 5 1 配列番号 5 2
f 0 l ^"銎 ½3鹿 ε ο ι ½·¾½2Ι (990990JV)V-V1H(29)
Z 0 l ^"銎 ½2麗 l 0 L ½-¾fi^3l WVUSョ（LS)
00 I 66 (61^90 X)■ (09)
86 ¾½2鹿 L 6-¾-¾½SI (900080) 0 JO60(6l7)
96 粱½ 96
6 銎½2歷 ε 6-¾-S½3i (89SS9X) LPSH ( )
Z 6 ^"喿〖1 厘 L 6 番 SM
06-i-S½Si 68 銎 ½S (908620) U，V9
88 歷 L 8 ^銎 ½2 ( 99W1)SLV人 OS(l7l7)
98 銎½2里 98 - -ii½ai 9frsw_vv)isョ (ε^)
178 ε 8 ^-#½ai (906LSn)t?V910D(3t7)
Z 8 ^暴 ½2匪 (ΐ7038Ζ1ΛΙ)9-νΐΗ(ίΐ7)
08 - -#½31 6 乙 ε〖 60 iv) ι画 (ow
8 L 銎圆 L
Figure imgf000018_0001
U9LIN)9S10(6e)
9 L 銎½2 2厶^蓥½2显 (9322S9VV)VLld0(8C) L ½ "銎 ½2歷 ε L ^蓥 ½2鹿 ( εοχ) Laidiv s)
Z L (謂^ W)0VH0 (9S)
0厶 喿 ½2厘 69 ^-I D^ai (8S982UV -)21819001 (9S)
89 L 9 ½¾fi^2i (8S90Z dV S— 190 (
99 ½-S½Hi 99·^暴 ½S匿 (sm ) izdiD (εε)
179 里 ε 9 (69fr 160 IV) 68t703rid (Ζί)
Z 9 ^暴 ½3i L 9 ^銎 ½2歷 (2Ζ.390Γ) 1画 1 (IS)
09 巷 ½2M 69 蓥 ½ 80丄) S080LNd (OS)
89 L g ^mw (998990VV)1S3 (62)
99 (ou9zn)aiao (82) 9 匪 (889SlVV)d9W ( ） ー
^^ίιϊ — (αι
|UBgu99 、 、 べく、 -i-S)
w
9^
9 L
df/X3d 0C8.60/C0 OAV 表 7
配列
遣伝子 （番号、 シンポゾレ、 GenBank
フォワード側ブラ リバ —ス側プライ ID)
イマ一 マー
(53)STIM1 (AA101834) 配列番号 1 0 5 配列番号 1 0 6
(54)A PD2(M91029) 配列番号 1 0 7 配列番号 1 0 8
(55)STX5A(U26648) 配列番号 1 0 9 配列番号 1 1 0
(56) IFNB1 (NI25460) 配列番号 1 1 1 配列番号 1 1 2
(57) MAEA (A 1291745) 配列番号 1 1 3 配列番号 1 1 4
(58) LBRCL25941) 配列番号 1 1 5 配列番号 1 1 6
(59)LIMK2 (D45906) 配列番号 1 1 7 配列番号 1 1 8
(60) EST (A 1365683) 配列番号 1 1 9 配列番号 1 2 0
(61)RPL26(AA778161) 配列番号 1 2 1 配列番号 1 2 2
(62)FLJ10209 (AL137271) 配列番号 1 2 3 配列番号 1 2 4
(63) FAAH (AA132519) 配列番号 1 2 5 配列番号 1 2 6
(64) C210RF33 (Y07572) 配列番号 1 2フ 配列番号 1 2 8
(65) EST (Z44513) 配列番号 1 2 9 配列番号 1 3 0
(66) PRKACA(X07767) 配列番号 1 3 1 配列番号"! 3 2
(67) EPB49 (L19713) 配列番号 1 3 3 配列番号 1 3 4
(68) EST (U51712) 配列番号 1 3 5 配列番号 1 3 6
(69) GRSP9 (A 1334396) 配列番号 1 3 7 配列番号 1 3 8
(70) EST (AA600323) 配列番号 1 3 9 配列番号 1 4 0
(7DSTK22B (L77564) 配列番号 1 4 1 配列番号 1 4 2
(72) TRB@(X01410) 配列番号 1 4 3 配列番号 1 4 4
(73)EEF1D(Z21507) 配列番号 1 4 5 配列番号 1 4 6
(74) RPGR(U57629) 配列番号 1 4フ 配列番号 1 4 8
(75)ARRB1 (AA918725) 配列番号 1 4 9 配列番号"! 5 0
(76) N0P5/N0P58 (AA602490) 配列番号 1 5 1 配列番号 1 5 2
(77) I6L@(M87790) 配列番号 1 5 3 配列番号 1 5 4
2. 各遺伝子の発現量の測定
解析に用いた試料は、 共通コントロールとして 1 1人の健常人の末梢血よリ 調製した白血球細胞を用い、 それに対して GML患者それぞれの末梢血より調製 した白血病細胞の遺伝子発現解析を行った。 その際の試料の調製は以下の通り である。 Ficol I (Amersham Biosciences社製）を用いて単球細胞を調製し、 Triz ol (Life Technologies, Inc. NY)を用い、 製品の使用説明書記載の方法により 全 RN Aを抽出した。 DNase I (二ッポンジーン社製） 処理後、 T7 RNA ポリメ ラ一ゼを用いた RN A増幅法を行った。 この RNA増幅法は、 Luo， L. (Nat M ed. , 5; 117-122, 1999) の方法に従って行った。 すなわち、 具体的には次のよ うに行った。 試料より抽出した RNAと T7 プロモーター配列を付加した Τ7- ol ig od (T)21 primerを Superscript I I を用いた逆転写反応を行い、 1本鎖 cDNAを合 成した。 次にこの 1本鎖 cDNAを錶型にして再度 T7 プロモータ一配列を付加し た T7 - ol igod(T)21 primerを DNAポリメラ一ゼ I を用いて反応させて、 2本鎖 c DNAを合成した。 2本鎖 cDNAを精製後、 最後にこの 2本鎖 cDNAを錶型として T 7 RNA ポリメラ一ゼによる RNA合成を行った。 最終的には 2 μ gの全 R N Aを 出発物質として用いて、 上述の RN A増幅法による増幅を 2サイクル行うこと により、 40〜1 00 ;u gの増幅 R N A (aRNA)が得られた。 コント口一ル試料 についても同様な増幅を行い、 十分量の aRNAを得た。 得られた aRNAの量は分 光光度計にて測定し、 変性ァガロースゲル電気泳動にて RNAの質についても調 ベた。 なお、 この方法により増幅された RN Aは、 錶型として全 RNAを用い た場合においても aRNAを用いた場合でも、 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PG R)の結果と一致することが確認されている（K. Ono et aに， Cancer Res 60， 50 07-11. (2000))。
標識、 ハイブリダィゼ一シヨン、 洗浄、 スキャニング及びシグナルの定量は、 全ての操作を公知の自動化スライドプロセッサ一（H. Okabe et al.， Cancer Re s 61, 2129-37. (2001))を用いて行ったことを除き、 K. Ono et aに， Cancer R es 60, 5007-11. (2000)に記載の方法により行った。 すなわち、 具体的には、 これらは次のようにして行った。 健常人ボランティァ又は GML患者の末梢血中の 単球細胞から得た aRNA 2,5 gを、 それぞれ Cy5- dGTP及び Gy3- dGTPの存在下で上 記と同様に逆転写した。 得られた標識プローブをマイクロアレイハイブリダィ セ一ンヨン溶液バ一ンヨン 2 ni croarray hybridization solution version 2 (Amersham B i osc i ences社製）及びホルムアミ ド（Sigma社製） と終濃度 50%で 混合した。 ハイブリダィゼーシヨン及び洗浄は、 市販の自動スライドプロセッ サ一 (Automated Sl ide Processor (Amersham B ί osc ί ences) )を用し、、 その使用 説明書に従って行った。 次いで、 アレイスキャナー（Array Scanner Generation
I II (Amersham Biosciences社製））を用いて、 マイクロアレイ上の各蛍光標識 を測定した。 3. 統計学的処理
はじめに遺伝子を次の 2つの基準を用いて選択した。 （i)少なくとも 80%の 症例において、 シグナル強度がカットオフ値よりも高い、 （i i) | Medr - Medn | ≥0.5 (ただし、 Medは応答者又は非応答者における対数変換した相対的発現量 比（relative expression rat i o)から得られるメジアンを示している） 。 各ハイ フリタイセ一シヨンシヮナゾレ虫度を市販のソフ 卜 (Array Vision computer prog ram (Amersham B i osc i ences社製））を用いて光学的に評価し、 ハウスキーピング 遺伝子の平均シグナルに正規化した。 スポッ卜を平均化することによリ各試料 についての CY3:GY5比を算出した。 発現レベルの前記カットオフ値は、 バックグ ランド変動（background fluctuation)に従って自動計算したものである。 変動 は、 Cy3:Cy5の対数比の分散から、 高発現遺伝子 （上位 30%。 バックグランド変 動が小さい場合には無視できる） の Cy3:Cy5の対数比の分散を差し引いた値によ リ評価することができる。 変動が臨界値（1.0)未満である、 発現レベルが約 105 を超える遺伝子を用いた。 なぜなら、 発現レベルが低い他の遺伝子は、 バック グランド変動の中に埋もれてしまうからである。 また、 マイクロアレイにおけ るスライド上のスポット量の不均一性 （ある一定の範囲で制御していはいるも のの） には、 コントロール （対象） をもうけることで、 そのコントロールと比 較してサンプルでの発現量比と言う形でデータを解析する。 いわゆるサンプル での発現量をコントロールの発現量で割ることによって得られる比を 「相対的 発現量比」 とする。
次いで、 順列テスト（permutation test)を行い、 応答者と非応答者の判別分 離に有用な遺伝子を選択した。 これは次のようにして行った。 応答者（r)及び非 応答者 (n)における各遺伝子の対数変換相対的発現量比から平均 （ 及び標準 偏差 （び） を計算した。 判別スコア（discrimi nation score, DS)を次のように 定義した。
DS 二 （ ^一 Α«π)Ζ(σ +ση)
各遺伝子の、 応答者と非応答者を識別する能力を評価するために、 これら 2つ の群をランダムに 10, 000回順列を入れ替えて順列テス卜（permutation test)を 2 O
行った。 個々の遺伝子の DSデータセットが正規分布を示したので、 ユーザ一規 定グループ分け（user- defined group i ng)のために、 公知の方法（T. R. Golub e t al. , Science 286， 531-7. (1999)によレ J P値を計算した。 すなわち、 Permut at ion testを行うことによって、 各遺伝子において DS値で構成される正規分布 が形成され、 平均値と標準偏差が求まる。 この平均値と標準偏差を用いて式を 求め P値を算出した。
その結果、 順列の P値が 0.05未満である 7 7種類の遺伝子が候補としてリス 卜された'（表 1 〜 4 ) 。 これらの 7 7種類の遺伝子のうち、 3 3遺伝子は、 応 答者に比べて非応答者において発現レベルが増大しており、 4 4の遺伝子は発 現レベルが減少していた。
この情報を用い、 イマチニブ治療の有効性を予測するスコアリングシステム を確立することを試みた。 公知の方法（T. R. Golub et al. , Science 286, 531 —7. (1999)； T. J. MacDonald et al. , Nat Genet 29, 143-52. (2001))に従つ て、 予測スコア（prediction score, PS)を算出した。 すなわち、 各遺伝子 ） は、 その発現レベル（X;)力 応答者又は非応答者の発現レベルの平均値のどちら に近いのかに基づき、 応答者又は非応答者のいずれかに投票する。 投票の大き さ（Vi)は、 2つの群の平均からの試料中の発現レベルの偏差を反映する。
Figure imgf000022_0001
投票を合計して応答者 ( ）及び非応答者 (Vn)のそれぞれについて合計投票を算出 し、 PS値を次式により算出した。
PS=((Vr-Vn)/(Vr+Vn)) X100
これは、 応答者又は非応答者の方向におけるマ一ジンォブビクトリ一 (margin o f victory)を反映している。 PS値は- 100~100の範囲にあり、.絶対値が大きい 程よリ確かな予測を反映している。
7 7種類の候補遺伝子を順列 P値の大きさの順に並べ （表 1〜4) 、 このラ ンク順リス卜の上位 5, 10, 15， 20, 25, 30， 35， 40, 45, 50, 55, 60, 65， 7 0, 75及び 79遺伝子を用いて、 cross- val idationのためのリーブ一ワン一ァゥ 卜テス卜（leave- one - out test)を行った。 これは次のようにして行った。 すな わち、 1つの試料を除外し、 残りの試料について順列 P値及び平均発現レベル を算出し、 次いで、 予測スコアを算出することにより、 除外した試料の群を決 定した。 この操作を 1 8の試料のそれぞれについて行った。
次いで、 2つの群の分離を最も良く行うことができる遺伝子の数を決定する ために、 それぞれの遺伝子の組についてクラス分けスコア（GS)を算出した。 こ れは次のようにして行った。 すなわち、 クラス分けスコア（GS)は、 応答者の予 測スコァ（PS と非応答者の予測スコァ（PSn)を用いて次式により算出した。
GS二 （ PSr 一 μΡ8η) I 、CTPSr + σΡ5η)
GS値が大きいほど、 予測スコアリングシステムによる 2つの群の分離がより良 く行われることを示している。
計算に用いた遺伝子の数は、 2つの群を分離する能力に影響を与える。 表 1 〜4に示す遺伝子のトップ 1 5 ((わ〜（15)) 又はトップ 30 ((1)~(30))を用 いた際に最も応答者と非応答者を明瞭に分離することができた （図 1 ) 。 これ ら 2種類の遺伝子セットを用いた 「予測スコア」 システムにより、 2つの患者 群が明瞭に分離された （図 2) 。 同じ遺伝子組を用いた階層的クラスター分割 もまた、 イマチニブ感受性についてグループ分けすることが可能であった （図 3) 。 階層的クラスタ一は次のように行った。 順列テストにより最も高くラン クされた 1 5又は 30の識別遺伝子 （表 1 〜4参照） を用いて、 階層的クラス ター法を適用した。 この分析は、 M. Eisenにより開発され、 インターネットの ウェブから利用できるソフトウェアである 「cluster」 及び 「treeviewj (http: //genome - www5/ Stanford. edu/M ι croAr rav/SMD/restech. html)を用しゝて 了った。 クラスター分割アルゴリズムを適用する前に、 各スポッ卜についての蛍光比を 対数変換し、 次いで、 各試料についてのデータをメジアン中央化（median- cente r)して実験的なバイアスを除去した。
4. 試験例の判定
この予測システムの有効性を実証するために、 システムの確立に用いた 1 8 の 「学習」 症例とは全く独立したさらなる 4症例の 「試験」 症例について、 末 梢血中の単球中の全 RN Aを出発物質とした上記と全く同様な解析を行った。 これらの 4つの試料のそれぞれについて、 上記と同様に遺伝子発現プロフアイ ルを調べ、 上記トップ 1 5 ((1)〜（15))又はトップ 30 ((1)〜（30))の識別遺伝 子 （表 1〜4参照） を用いて予測スコアを計算した。 図 4に示すように、 イマ チニブに対する 4名の各患者の応答性は、 1 00%の正確さで予測することが できた。

Claims

請求の範囲
1 . 生体から分離された検体細胞中における下記（1)〜（77)の遺伝子群のうち の複数の遺伝子の発現量を測定し、 イマチニブ若しくはその誘導体又は薬理学 的に許容できるその塩に対する感受性の応答者及び非応答者における前記各遺 伝子の発現量と対比することを含む、 イマチニブ若しくはその誘導体又は薬理 学的に許容できるその塩に対する感受性の判定方法。
(1)HN1 (A 1086871)、 (2)A R1C3 (D17793), (3)QARS(X76013)、 (4)KIAA1105 (AA13 6180)、 （5)KIAA0668(AA506972)、 （6) BLGAP (AF053470)、 （7)ADFP(X97324)、 (8) FLJ10422 (AA894857), (9) HMGGL (L07033)、 （10) EST (A 1051454)、 (11)KLF4 (A 129 0876)、 （12)H3F3A(M11354)、 (13) ACTB (V00478) , (14) DKFZP566D193 (AA401318) , (15) APEX (U79268)、 (16) DR I L1 (U88047)、 (17)BIN1 (AF001383)、 (18) EST (AA495 984)、 (19)CLTH (N41902). (20) M6PR (AA179832) x (21) KIAA0106 (D14662)、 (22) IGF2R(J03528)、 （23) IDH1 (AA330014)、 （24) EST (A 1333449)、 (25) SDHB (AA36598 6)、 (26) TNRC3 (A 1743134). (27) MGP (AA156488)、 （28) GBLB (U26710)、 (29) EST ( AA055355)、 （30) FLJ10803 (T70782)、 （31) IMPDH1 (J05272)、 (32) FLJ20489 (A 109 1459)、 (33)GTF2I (U77948) , (34) CG卜 57 (AF070638)、 (35) L0G51312 (. Al 128538 )N (36)CHAG(AA228874)、 （37) ATP1 B1 (X03747)、 （38) CPT1 A (AA632225)、 (39) CT SG(M16117)、 (40)AXUD1 (A 1091372) (41) HLA- B (M28204)、 (42) G0LGA4 (U31906)、 (43) EST (AA743462)、 (44) SCYA13 (U46767)、 (45) B4GALT1 (D29805)、 (46) DKFZP5 6400463 (AA143048)、 （47) HSJ1 (X63368)、 （48) MRPL3 (X06323)、 (49) C9orf 10 (D8 0005)、 （50)DDX1 (X70649)、 （51) EST (AA421326)、 （52) HLA-A (AF055066)、 (53) S T I 1 (AA101834)、 (54) AMPD2 ( 91029)、 (55) STX5A (U26648)、 (56) I FNB1 ( 25460 )、 （57)MAEA(AI291745)、 （58) LBR(L25941)、 （59)LIMK2(D45906)、 （60) EST (A 13 65683)、 （61)RPL26(AA778161)、 （62) FLJ10209 (AL137271 )、 (63)FAAH (AA132519 )、 (64) C210RF33 (Y07572) , (65) EST. (Z44513)、 （66) PRKAGA (X07767)、 (67) EPB4 9(L19713)、 (68) EST (U51712)% (69) GRSP9 (AI334396)、 （70) EST (AA600323)、 (7 1)STK22B(L77564)、 (72)T B@ (X01410), (73) EEF1D(Z21507)、 (74) RPGR (U57629 )、 （75)ARRB1 (AA918725)、 (76) N0P5/N0P58 (AA602490) , (77) IGL@(M87790) ( ただし、 各遺伝子シンボルの後の括弧内の文字は GenBank Accession No.を示 す） 。
2. イマチニブ又は薬理学的に許容できるその塩に対する感受性を判定する 請求項 1記載の方法。
3. 前記遺伝子のうち、 1 0〜35種類の遺伝子の発現量を調べる請求項 1 又は 2記載の方法。
4. 前記遺伝子のうち、 （1)〜（35)の遺伝子の、 番号の若いものから 1 0〜3 5種類の遺伝子の発現量を調べる請求項 3記載の方法。
5. 前記遺伝子のうち（1)〜（15)の遺伝子、 又は、 （1)~(30)の遺伝子の発現 量を調べる請求項 4記載の方法。
6. 測定された発現量を、 前記応答者及び非応答者における前記各遺伝子の 発現量と対比する工程は、 統計学的に予測スコアを算出することを含む請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法。
7. 慢性骨髄性白血病に対するイマチニブ若しくはその誘導体又は薬理学的 に許容できるその塩による治療効果を予測する方法である請求項 1ないし 6の いずれか 1項に記載の方法。
8. 前記検体細胞が白血球細胞である請求項 7記載の方法。
9. 前記白血球細胞が単球細胞である請求項 8記載の方法。
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