JP2003528163A

JP2003528163A - カチオン性ブロックコポリマー

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Publication number: JP2003528163A
Application number: JP2001511526A
Authority: JP
Inventors: トーマス・キッセル; ホルガー・ペーターゼン; ダグマール・フィッシャー; クラウス・クーナート; アンケ・フォンハールペ
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2003-09-24
Anticipated expiration: 2020-07-04
Also published as: EP1226204B1; ES2256031T3; DE50012055D1; EP1226204A1; DE19933024C2; US20070036866A1; ATE315603T1; CA2379205A1; US20080125543A1; CA2379205C; WO2001005875A1; RU2269544C2; AU6821800A; RU2002103719A; DK1226204T3; CN1364179A; AU767661B2; DE19933024A1; PT1226204E; JP4614198B2

Abstract

(57)【要約】本発明は式Ａ(−Ｘ−Ｂ)_nまたはＣ(−Ｙ−Ｄ)_mの陽イオン性ブロックコポリマーであって、式中、Ａは親水性ポリマーを表し、Ｂはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を表し、Ｘは架橋を表し、ｎは１〜２００を表し、ＣはＰＥＩを表し、Ｄはポリエチレングリコールの残基を表し、Ｙは架橋を表し、およびｍは１〜２００を表す陽イオン性ブロックコポリマーに関する。本発明はまた、本発明の陽イオン性ブロックポリマーの製造方法、およびそれらをたとえば界面活性剤として使用すること、および核酸複合体化のために使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【説明】

ＷＯ９８／５９０６４は、ＰＥＩ−ＰＥＧブロックコポリマーおよび核酸を高
等真核細胞に輸送するための輸送手段としてそれらを使用することを開示してい
る。記載されたコポリマーは、枝分かれ状ＰＥＩおよび線状ＰＥＧから構成され
ている。ＰＥＩはメトキシ−スクシニミジル−プロピオネート−ＰＥＧを用いて
ＰＥＧ化された。

【０００２】 S．V．Vinogradov、T．K．BronichおよびA．V．Kabanov（Bioconjugate Chem
．1998、９、805〜812）は、枝分かれ状ＰＥＩおよび枝分かれ状ポリスペルミン
を使用した、１,１’−カルボニル−ジイミダゾールで活性化したモノメトキシ
−ＰＥＧとの結合反応によるＰＥＩ−ＰＥＧおよびポリスペルミン−ＰＥＧブロ
ックコポリマーの調製法を説明している。このコポリマーはオリゴヌクレオチド
の複合体化のために使用された。

【０００３】 L．M．Bronstein、M．Antonietti et al．（Inorganica Chimica Acta 1998、
280、348〜354）は、ＰＥＩ−ＰＥＧブロックコポリマーおよび枝分かれＰＥＩ
と末端酸クロリド基を有するモノメトキシ−ＰＥＧとの結合によるそれらの調製
法、および金属コロイドを調製するためにそれらを使用することを説明している
。

【０００４】 V．Tocheva et al．（Biochimica et Biophysika Acta 1998、138、354〜358
）は、ポリ（Ｌ−リジン）および多数の親水性ポリマー、たとえばＰＥＧ、デキ
ストランおよびポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミドから
成るブロックコポリマー、それらの調製方法および核酸遺伝子輸送用輸送手段と
してのそれらの使用に関している。

【０００５】これら公知のコポリマーは、通常以下の３点を有する。１．このカチオンポリマーは親水性非イオン性ポリマーの側枝を備えている。２．全ての場合において、この目的に備えて、親水性非イオン性ポリマーの反応
性末端は発生するコポリマーのブロック間のリンカーとなる試薬によってカチオ
ンポリマーとの結合反応のために活性化されている。３．この親水性非イオン性ポリマーは、全ての場合において線状ポリマーである
。

【０００６】一般式ＩおよびIIの新規カチオン性ブロックコポリマーが発見され、（Ｉ）Ａ(−Ｘ−Ｂ)_n （II）Ｃ(−Ｙ−Ｄ)_m 式中、Ａは分子量１００から１０００００００ｇ／mol、好ましくは１０００
から１０００００ｇ／mol、特に５０００から５００００ｇ／molの親水性非イオ
ン性線状または枝分かれ状ポリマーであり、Ｂは分子量１００から１００００００ｇ／mol、好ましくは４００から１００
０００ｇ／mol、特に４００から５００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ポリ
エチレンイミン（ＰＥＩ）であり、

【０００７】ＸはブロックＡとＢの直接結合または以下の構造 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_oＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｏ＝１から２０、好ましくは２か
ら１０、特に４から６である）、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（アリール＝融合して共に結合す
るか、または好ましくは１個の核、特にトリルを有するポリフェニル型で共に結
合した１個または複数の芳香族核から成る６〜１４個のＣ原子を有する芳香族単
位である）、 −Ｏ(ＣＨ₂)_pＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｐ＝１から１０、好ましくは１から３、特に１で
ある）、 −ＯＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂ＮＨ−、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ−、または −Ｏ(ＣＨ₂)_qＮＨ−（ｑ＝１から２０、好ましくは１から６、特に１から３で
ある）を有するリンカーであり、ｎは１）１から２００、好ましくは２）１から５０、３）１から１２、４）１から８または、特に好ましくは５）２から８の整数であり、Ｃは分子量１００から１００００００ｇ／mol、好ましくは４００から１００
０００ｇ／mol、特に４００から５００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ＰＥ
Ｉであり、

【０００８】Ｄは下式のＯを介して結合したポリエチレングリコールの残基であり、 −(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n'−Ｒ¹ 式中、ｎ’は３から２５０００、好ましくは１０から５０００、特に１０から１
０００であり、Ｒ¹は水素、脂肪族基、たとえば（Ｃ₁〜Ｃ₆）−アルキル（メチ
ル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルなど）、または他のＯＨ保護基、たとえばアシル
（たとえば、任意に置換されたベンゾキシカルボニル）、任意に置換されたベン
ジル、ピコリル、または細胞表面蛋白質、特に受容体と結合することによって核
酸−コポリマー複合体の特異的摂取をもたらすための細胞性リガンドであり、

【０００９】ＹはブロックＣおよびＤの直接結合または以下の構造 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_sＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（ｓ＝１から２０、好ましくは２か
ら１０、特に４から６である）、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（アリール＝融合して共に結合す
るか、または好ましくは１個の核、特にトリルを有するポリフェニル型で共に結
合した１個または複数の芳香族核から成る６から１４個のＣ原子を有する芳香族
単位である）、 −ＮＨ(ＣＨ₂)_tＣ(Ｏ)Ｏ−（ｔ＝２から１０、好ましくは２から３、特に２で
ある）、 −ＮＨＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂Ｏ−、または −ＮＨ(ＣＨ₂)_uＯ−（ｕ＝１から２０、好ましくは１から６、特に１から３で
ある）を有するリンカーであり、ｍは１）１から２００、好ましくは２）１から１００、特に３）１から５０の整数である。

【００１０】本発明のカチオン性ブロックコポリマーは、少なくとも以下の３点の特徴が公
知のブロックコポリマーとは異なっている。１．親水性非イオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーの側枝を備えている。２．このリンカーは公知のブロックコポリマーのリンカーとは異なる。３．これらは枝分かれ親水性、非イオン性ポリマーである。好ましくは、炭素および酸素から構成され、適切ならば環状、星状または樹状
構造を含む線状または枝分かれ状ポリマー、たとえば線状ＰＥＧ、多枝枝分かれ
状ＰＥＧ、星状ＰＥＧ、シクロデキストリンを含む多糖類、ＰＶＡ、arborol（
末端水酸基を有するデンドリマー）の残基などを意味するが、好ましくは直鎖お
よび多枝枝分かれ状および星状ＰＥＧを意味する。後者は特にAldrich、Fluka、
SIGMAおよびShearwaterから市販されている。

【００１１】ＢおよびＣは式IIIを有する線状または枝分かれ状ポリエチレンイミン残基を
意味しており、（III）−[ＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ(^Z+)(Ｒ²)_x]_y−Ｈ[Ａ^-]_w 式中、Ｒ²は同一かまたは異なる基で、水素または式IVの基であり、（IV）−[ＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ(^Z'+)(Ｒ³)_x']_y'−Ｈ[Ａ^-]_w' 式中、Ｒ³はＲ²として（回帰的に）定義される同一または異なる基であり、Ａ^-は適切な、好ましくはＯＨ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-などの無機陰イオンと同等であ
り、ｘおよびｘ’は同一または異なっていて、１または２であり、ｙおよびｙ’は同一または異なっていて、基ＢおよびＣが１００から１０００
０００ｇ／mol、好ましくは４００から１０００００ｇ／mol、特に４００から５
００００ｇ／molの構成分子量（constituent molecular weight）を有するよう
に選択された整数であり、ｙ’はまた０であることが可能であり、ｚおよびｚ’は同一かまたは異なっていて、ｚ＝ｘ−１かつｚ’＝ｘ−１であ
り、およびｗおよびｗ’は式IIIおよびIVの基の陽電荷の平衡を保つために選択された同
一または異なる整数である。

【００１２】ポリエチレンイミンはそれ自体公知の方法で調製することができるか、または
ＢＡＳＦ商標名Lupasol（登録商標）または４００から２００００００ｇ／molの
様々な分子量のポリエチレンイミンまたはエチレンイミンポリマーの名称で（Al
drich、SIGMA、Flukaまたは直接ＢＡＳＦから）市販されている。Ｂについては
分子量４００から２０００ｇ／molのポリエチレンイミン、Ｃについては分子量
４００から８０００００ｇ／mol、特に好ましくは４００から２５０００ｇ／mol
のポリエチレンイミンが好ましい。

【００１３】Ｄで説明した基は、基Ｒ¹、たとえばメチルまたは他の適切な保護基などによ
って１末端を保護されたポリエチレングリコール残基である。しかし、Ｒ¹はま
た、特異的または非特異的生物学的機能を果たす基、特にブロックコポリマー活
性物質複合体を高等真核細胞およびそれらの細胞核に標的細胞特異的に取り込ま
せる受容体との相互反応を行うためのリガンドであることが可能であり、この活
性物質はオリゴヌクレオチドまたは遺伝子であることが好ましい（遺伝子ターゲ
ティング）。したがって、Ｒ¹はまた特異的な相互反応および標的器官組織また
は細胞への取り込みのためのリガンド、たとえば蛋白質、特に抗体またはＦａｂ
、Ｆ(ａｂ)₂、ｓｃＦｖなどの抗体断片、インターロイキン（ＩＬ−２からｘ）、インターフェロンＧＭ−ＣＳＦなどの
サイトカインまたはリンホカイン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＰＯなど成長因子、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭなどインテグリン、またはレクチンなど糖蛋白質またはグリコシル化蛋白質（前記参照）またはＬＤＬ、ＨＤＬなどリポ蛋白質またはトランスフェリンなど輸送蛋白質またはＬＨ−ＲＨ、カルシトニン、オキシトシン、インシュリン、ソマトスタチン、
ＩＧＦ、ＲＧＤなどペプチドまたはガラクトース、マンノース、グルコース、ラクトースなどの炭化水素またはステロイド、ＴＨＲなどのホルモンまたはＢ₁₂、葉酸などのビタミンであることが可能である。

【００１４】本発明はまた、式Ｉの化合物を調製するための方法に関しており、ａ）一般式Ｖの化合物（Ｖ）Ａ−(ＯＨ)_n（Ａおよびｎ＝式Ｉと同様である）と、ジイソシアネート、好ましくはヘキサメチレンジイソシアネートとを反応さ
せ、それによって得られた化合物を一般式IIIおよびIVのポリエチレンと反応さ
せること、またはｂ）一般式ＶＩの化合物 (VI) Ａ−(ＮＨ₂)_n（Ａおよびｎ＝式Ｉと同様である）を、重合化開始の前、または重合化が進行しないうちにエチレンイミン重合化の
ための反応混合物に添加すること、またはｃ）一般式VIIの化合物（VII）Ａ−(ＯＳ(Ｏ)₂Ｒ⁴)_n（Ａは式Ｉと同様で、Ｒ⁴＝脂肪族または芳
香族基、好ましくはｐ−トリル、フルオリド、トリフルオロメチルまたはメチル
である）をエチレンイミン重合化のマクロ開始剤として使用することが含まれる。式VIの化合物は、様々な分子量でたとえばShearwaterから市販されている。一般式VIIの化合物は、一般式Ｖの化合物と一般式VIIIの化合物（VIII）Ｃｌ−Ｓ(Ｏ)₂Ｒ⁴（Ｒ⁴は前記で定義した通りである）との反応によって得られる。

【００１５】本発明はさらに、式IIの化合物を調製する方法に関しており、ｄ）最初に、一般式IXの化合物（IX）Ｄ−ＯＨ（Ｄは式IIで定義した通りである）と、ジイソシアネート、好ましくはヘキサメチレンジイソシアネートと反応させ
て、その後得られた化合物を線状または枝分かれ状ポリエチレンイミンと反応さ
せることを含む。適切ならばＯＨ基を保護するために導入された保護基をそれ自
体公知の方法で除去することができる（たとえば、Bullesbach、Kontakte（Merc
k）1／1980、pp.23以下参照）。

【００１６】ａ）で説明した方法は、ポリマーブロックＡの末端水酸基当たり４倍から２０
倍過剰なジイソシアネート、好ましくはヘキサメチレンジイソシアネートを使用
する様な方法で実施することが好ましい。この反応は、クロロホルム中で、室温
から溶媒の沸点までの温度で実施するが、溶媒の沸点で実施することが好ましい
。選択された反応時間は２から２４時間の間で、好ましくは４時間である。反応
混合物中のポリマー濃度は、１０ｇ／ｌと５００ｇ／ｌとの間、好ましくは１０
０ｇ／ｌである。減圧下で溶媒を除去することによって生成物を単離して、石油
エーテル（沸騰範囲：４０〜６０℃）で繰り返し抽出することによって過剰なジ
イソシアネートを除去する。この中間体を出発化合物の末端水酸基あたり３倍か
ら１０倍過剰なＰＥＩ高分子と反応させる。この反応は、クロロホルム中で、室
温から溶媒の沸点までの温度で実施するが、溶媒の沸点で実施することが好まし
い。選択された反応時間は６から７２時間の間で、好ましくは１２時間である。
反応混合物中のポリマー濃度、ＰＥＩおよびヘキサメチレンジイソシアネートで
活性化された非イオン性親水性ポリマーの両濃度は、１０ｇ／ｌと５００ｇ／ｌ
の間、好ましくは３０と２００ｇ／ｌの間である。生成物は体積で１０〜３０倍
過剰なジエチルエーテル中でポリマーを沈殿させることによって単離する。過剰
なＰＥＩは、溶媒としてエタノールおよびジエチルエーテルで繰り返し再沈殿さ
せることによってブロックコポリマーから除去することができる。

【００１７】ｂ）で説明した方法は、エチレンイミンとアミノ末端親水性非イオン性ポリマ
ーを水にそれぞれ１０ｇ／ｌから５００ｇ／ｌの濃度で溶かして混合することに
よって実施する。２成分のモル比は１：１０から１：１００００の間である。次
いで、エチレンイミン重合化を適切な触媒、たとえば塩酸を添加することによっ
て開始し、この混合物を４０〜１００℃にする。コポリマーは鎖終結反応によっ
て生じる。このブロックコポリマーを適切な溶媒、たとえばエタノールおよびジ
エチルエーテルを使用して繰り返し再沈殿させ、および／または圧力濾過によっ
て副産物と成り得るＰＥＩホモポリマーを除去する。この調製方法の１変法には
、３０分から７２時間までのある時間反応させてのみ、アミノ末端親水性非イオ
ン性ポリマーを熱い重合化混合物に添加することが含まれる。

【００１８】ｃ）で説明した方法は、ポリマーブロックＡの末端ヒドロキシル基を一般式VI
IIの塩化スルホニル、特にトルエンスルホニルクロリド（トシルクロリド）と反
応させることによって実施される。この反応は、水性および／または極性有機溶
媒中、好ましくは水／テトラヒドロフラン混合物中で、−１０℃から溶媒の沸点
までの温度、好ましくは−１０℃から溶媒の沸点までの温度、好ましくは０℃か
ら２５℃までの温度で、（必要ならば）触媒、たとえばトリエチルアミンまたは
水酸化ナトリウムの存在下で実施する。この生成物は、減圧下で溶媒を除去する
ことによって単離される。このポリマーはその後エチレンイミン重合化用のマク
ロ開始剤として使用される。この目的のために、一般式VIIを有する生成物を水
性または極性有機溶媒中で、０℃から溶媒の沸点までの温度でエチレンイミンと
反応させる。この２成分のモル比は、１：１０から１：１００００の間である。
この反応では副産物は形成されない。最終生成物は、適切な溶媒、たとえば、ジ
エチルエーテルなどでポリマーを沈殿させることによって単離することができる
。ｄ）で説明した方法は、一般式ＩＸの化合物と少し過剰の、好ましくは２倍か
ら１０倍過剰のジイソシアネート、好ましくはヘキサメチレンジイソシアネート
とを反応させることによって実施することが好ましい。この反応は、クロロホル
ム中で、２０℃から溶媒の沸点、好ましくは溶媒の沸点で実施する。選択した反
応時間は、２時間と２４時間の間、好ましくは１０時間と１４時間の間である。
反応混合物中のポリマー濃度は、１０ｇ／mlと５００ｇ／ｌの間、好ましくは３
０ｇ／ｌと１５０ｇ／ｌの間である。減圧下で溶媒を除去し、過剰なジイソシア
ネートを石油エーテル（沸騰範囲：４０〜６０℃）で繰り返し抽出することによ
って除去して、生成物を単離する。この中間体をＰＥＩ高分子と１：１から１０
０：１のモル比で反応させる。この反応は、クロロホルム中で、必要であればジ
メチルホルムアミドを添加して、室温から溶媒の沸点までの温度で、好ましくは
６０〜７０℃で実施する。選択した時間は６と７２時間の間で、好ましくは１２
時間である。反応混合物中のポリマー濃度は、ＰＥＩおよびヘキサメチレンジイ
ソシアネートで活性化した非イオン性親水性ポリマーとも１０ｇ／ｌと５００ｇ
／ｌとの間、好ましくは３０〜２００ｇ／ｌの間である。生成物は体積が１０〜
３０倍過剰のジエチルエーテル中でポリマーを沈殿させることによって単離され
る。

【００１９】ＰＥＩと比較して、この新規化合物は以下の特性を有する。このブロックコポリマーは細胞毒性試験でＰＥＩホモポリマーよりも毒性が低
く、血液循環系により長く維持される（「生物学的実施例」の項を参照のこと）
。このブロックコポリマーは少なくとも、構造に応じて、界面活性剤として使用
できる表面活性化合物である。

【００２０】さらに、このブロックコポリマーはまた、・添加物として接着系および被覆系において、・紙強度を増強するための固定剤として、・たとえば多層包装シートなどのポリマー組成物系用下塗り剤として、・プラスチックの変更のために（染色性、着色性、バリア効果を改善する）・綿への反応性色素の固定のために、・産業排水中の微小懸濁粒子凝固剤および分散剤として、・重金属塩の結合のために、・有機および無機色素の分散のために、・セラミックおよびセメント成分への添加物として、・皮膚および髪化粧品および歯科領域において多種多様な機能のために、・表面に医学的に活性な物質または生物活性化合物を固定するために、・血漿からエンドトキシンおよび病原体を濾過するために、・粘膜透過のために使用することができる。

【００２１】さらに水性系では、このブロックコポリマーは、リボザイムを含めたＤＮＡ、
ＲＮＡなどポリ核酸との複合体を形成する。この特性によって、遺伝子輸送の輸
送手段またはベクターとして適するようになる（細胞膜の透過および細胞核への
移動）。したがって、トランスフェクション実験、遺伝子治療および遺伝子診断
に使用することができる（「生物学的実施例」の項を参照のこと）。以下の実施例は本発明を限定することなく本発明を例示するために役立つ。

【００２２】

【化学実施例】

実施例１：ＰＥＩ（ＰＥＧ）_nブロックコポリマーの調製ｍＰＥＧ−５５０の活性化電磁攪拌子、還流冷却器および乾燥管を上部に具備した１００ml丸底フラスコ
にクロロホルム１０mlを導入し、７mlのヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭ
ＤＩ）（４３.６４mmol、８当量）を添加する。３ｇのポリエチレンオキシドモ
ノメチルエーテル（ｍＰＥＧ、Ｍ_n＝５５０ｇ／mol）（５.４５mmol、１当量）
をクロロホルム４０mlに溶解させる。そしてこの溶液をＨＭＤＩの攪拌溶液にゆ
っくり滴下添加する。混合物を１２時間加熱還流する。そして溶媒を減圧下に除
去し、過剰のＨＭＤＩを石油エーテル（４０〜６０）（５×５０ml）で抽出する
生成物を無色流動性オイルとしてほぼ定量的収率で得る（３.８ｇ、９７％）。

【００２３】ＰＥＩ−グラフト−ＰＥＧブロックコポリマーの調製電磁攪拌子、還流冷却器および乾燥管を上部に具備した１００ml丸底フラスコ
に１.７４ｇのｂＰＥＩ（Ｍ_w＝２５kDa、Ｍ_n＝１０kDa、０.１７３６mmol、１当
量）を秤量し、４０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解する。２.５ｇ
のＨＭＤＩ−活性化ｍＰＥＧ（Ｍ_n＝７２０Ｄａ、３.４７mmol）をクロロホルム
１０mlに溶解し、この溶液をＰＥＩの攪拌溶液にゆっくり滴下添加する。混合物
を１２時間６０〜７０℃に加熱する。そして混合物をジエチルエーテル５００ml
に滴下添加する。２時間後、粘稠性の黄色がかったオイルが沈着してきた。濁っ
た上澄みを廃棄し、オイルをエタノール３０mlに溶解する。再び本溶液をジエチ
ルエーテル５００mlに滴下添加し、再び分離してきたオイルをデカンテーション
により単離する。生成物をエタノールに溶解して濾過し、溶媒を真空乾燥器中５
０℃で除去する。２.８ｇの黄色がかった粘稠性から樹脂性のオイルを得る（収
率：４５％）。

【００２４】 ¹Ｈおよび¹³Ｃ−ＮＭＲ分光法およびゲル浸透クロマトグラフィによりポリマ
ーを確認した。実施例１において以下のデータを得た。これらは他の実施例の代
表であり、他の実施例でも同様のデータが得られた。 ¹ＨＮＭＲ（５００MHz、ＣＤＣｌ₃）：δ／ppm＝１.１７（イソシアネートＣＨ₂）、１.２６（イソシアネートＣＨ₂）、２.３０〜２.７２（エチレン
イミンＣＨ₂）、２.９６（イソシアネートＣＨ₂）、３.１５（イソシアネー
トＣＨ₂）、３.４９（エチレングリコールＣＨ₂）。 ¹³ＣＮＭＲ（１２５MHz、ＣＤＣｌ₃）：δ／ppm １４.３（イソシアネートＣＨ₂）、２６.２（イソシアネートＣＨ₂）、２９.６（イソシアネートＣ
Ｈ₂）、３６.２（イソシアネートＣＨ₂）、３７.５（エチレンイミンＣＨ₂
）、３９.１（エチレンイミンＣＨ₂）、４１.１（イソシアネートＣＨ₂）、
４７.２（エチレンイミンＣＨ₂）、４８.９（エチレンイミンＣＨ₂）、５２
.８（エチレンイミンＣＨ₂）、５４.１（エチレンイミンＣＨ₂）、５８.７
（イソシアネートＣＨ₂）、６９.３および７０.２および７１.６（エチレング
リコールＣＨ₂）、１５６.２（−ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−）、１６１．７（−ＮＨＣ(
Ｏ)ＮＨ−）。

【００２５】ＧＰＣ（メタクリル酸アミノエチルゲル、１％ギ酸、０.５ml／分、２５℃、
プルラン標準を用いて校正した）：Ｍ_n＝８８００、Ｍ_w＝１６４００００、Ｍ_p
＝８５０００、ＰＤ＝１９.６、単峰性。ＰＥＩ（アルドリッチ、２５kDa）およびｍＰＥＧ（アルドリッチ、５５０Ｄ
ａ）のブレンドとの比較：Ｍ_n＝６９０００、Ｍ_w＝１４８００００、Ｍ_p＝９９
０００および１１００、ＰＤ＝２.１、二峰性。実施例１のポリマーの表面活性を、張力計を用いた２２℃でのルコント・ド・
ヌーイ（Lecomte du Nouy）法（リング法）により検討した。空気に対する溶液
の表面張力を測定した。超純水で装置を校正し、これはポリマー試料用の溶媒と
しても用いた。測定データ：σ_min＝５１ｍＮ／ｍ、ＣＭＣ＝１５mg／ml。以下は同様の方法で調製できる：（全ての出発化合物はアルドリッチより入手
可能である。）

【００２６】

【表１】

【００２７】実施例２７：ＰＥＧ(ＰＥＩ)_nブロックコポリマーの調製枝分かれ状ＰＥＧの活性化電磁攪拌子、還流冷却器および乾燥管を上部に具備した１００ml丸底フラスコ
に、クロロホルム１０ml中、３.７９ｇのＨＭＤＩ（２２.５４mmol、８０当量）
を溶解する。２ｇの８−方枝枝分かれ状ＰＥＧ（ｂＰＥＧ、ＭＷ＝１０kDa、０.
２mmol、１当量）のクロロホルム２０ml溶液を、ＨＭＤＩの攪拌溶液にゆっくり
滴下添加する。混合物を４時間沸騰させ、そして更に８時間室温で攪拌する。溶
媒を減圧下に除去し、過剰のＨＭＤＩを石油エーテル（４０〜６０）（３×５０
ml）で抽出する赤味がかったオイルを収率５８％で得る（１.３８ｇ）。

【００２８】ＰＥＧ−グラフト−ＰＥＩブロックコポリマーの調製電磁攪拌子、還流冷却器および乾燥管を上部に具備した１００ml丸底フラスコ
に、クロロホルム２０ml中、２.２０ｇの枝分かれ状ＰＥＩ（ｂＰＥＩ、Ｍ_w＝８
００Ｄａ、Ｍ_n＝６００Ｄａ、３.６６mmol、２５当量）を溶解させる。１.２１
ｇのＨＭＤＩ−活性化ｂＰＥＧ（Ｍ_n＝８.５kDa、０.１４mmol、１当量）のクロ
ロホルム３０ml溶液を、ＰＥＩの攪拌溶液に室温でゆっくり滴下添加する。混合
物を１２時間沸騰させる。そして溶液をジエチルエーテル５００mlに攪拌しなが
らゆっくり滴下添加する。１２時間後、粘稠性の黄色がかったオイルが沈着して
きた。濁った上澄みを廃棄し、オイルをエタノール５０mlに溶解する。再び溶液
をジエチルエーテル５００mlに滴下添加し、再び分離してきたオイルをデカンテ
ーションにより単離する。生成物をエタノールに溶解して濾過し、溶媒を真空乾
燥器中５０℃で除去する。１.１３ｇの黄色がかった粘稠性から樹脂性のオイル
を得る（収率：５９％）。

【００２９】 ¹Ｈおよび¹³Ｃ−ＮＭＲ分光法およびゲル浸透クロマトグラフィによりポリマ
ーを確認した。実施例２７において以下のデータを得た。これらは他の実施例の
代表であり、他の実施例でも同様のデータが得られた。 ¹ＨＮＭＲ（５００MHz、ＣＤＣｌ₃）：δ／ppm＝１.２２（イソシアネートＣＨ₂）、１.３６（イソシアネートＣＨ₂）、２.４０〜２.７０（エチレン
イミンＣＨ₂）、３.０３（イソシアネートＣＨ₂）、３.１９（イソシアネー
トＣＨ₂）、３.５５（エチレングリコールＣＨ₂）。 ¹³ＣＮＭＲ（１２５MHz、ＣＤＣｌ₃）：δ／ppm＝２５.９（イソシアネートＣＨ₂）、２９.４（イソシアネートＣＨ₂）、３９.２（エチレンイミンＣ
Ｈ₂）、４１.２（イソシアネートＣＨ₂）、４７.０（エチレンイミンＣＨ₂
）、４８.９（エチレンイミンＣＨ₂）、５２.０（エチレンイミンＣＨ₂）、
５４.２（エチレンイミンＣＨ₂）、６１.１（イソシアネートＣＨ₂）、６９
.２および７１.１および７２.３（エチレングリコールＣＨ₂）、１５６.０（
−ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−）、１６２.１（−ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−）。

【００３０】ＧＰＣ（メタクリル酸アミノエチルゲル、１％ギ酸、０.５ml／分、２５℃、
プルラン標準を用いて校正した）：Ｍ_n＝２２０００、Ｍ_w＝４３０００、Ｍ_p＝
３１０００、ＰＤ＝１.９、単峰性。８方枝ＰＥＧ（シェアウォーター、１０kDa
）およびＰＥＩ（アルドリッチ、８００Ｄａ）のブレンドとの比較：Ｍ_n＝３１
００、Ｍ_w＝１５０００、Ｍ_p＝１２０００、ＰＤ＝４.９１、単峰性。

【００３１】実施例２７のポリマーの表面活性を、張力計を用いた２２℃でのルコント・ド
・ヌーイ（Lecomte du Nouy）法（リング法）により検討した。空気に対する溶
液の表面張力を測定した。超純水で装置を校正し、これはポリマー試料用の溶媒
としても用いた。測定データ：σ_min＝５６ｍＮ／ｍ、ＣＭＣ＝１２mg／ml。以下は同様の方法で調製できる。

【００３２】

【表２】

【００３３】

【表３】

【００３４】実施例５５ＰＥＧ−ＰＥＩコポリマーの調製（マクロレギュレータ経路）鎖の他末端にアミノ基を有するモノメチル化ＰＥＧ（ＭＷ５０００ｇ／mol
）１ｇ（０.２mmol）を、電磁攪拌子および還流冷却器を具備した５０ml丸底フ
ラスコに秤量し、蒸留水２０mlに溶解させる。エチレンイミン２ml（３９mmol）
をこのポリマー溶液に添加する。硫酸ジメチル２００μl（２mmol）を開始剤と
して用いて重合を開始し、混合物を６０℃で８日間加熱する。そして溶媒を減圧
下に除去し、残留物をエタノール２０mlに再溶解する。溶液をジエチルエーテル
２５０mlに滴下添加すると、ポリマーが分離する。ポリマーを濾過により単離し
、残留溶媒を真空乾燥器中５０℃で３週間除去する。１.９ｇの淡黄色がかった
樹脂性ポリマーを得る（収率：７３％）。以下は同様の方法で調製できる：（全てのアミノ修飾ＰＥＧ類はＲＡＰＰポリ
メーレ、テュービンゲン（RAPP Polymere、Tubingen）より入手可能である。）

【００３５】

【表４】

【００３６】 ¹Ｈおよび¹³Ｃ−ＮＭＲ分光法およびゲル浸透クロマトグラフィによりポリマ
ーを確認した。実施例５６において以下のデータを得た。これらは他の実施例の
代表であり、他の実施例でも極めて同様のデータが得られた。 ¹ＨＮＭＲ（５００MHz、Ｄ₂Ｏ）：δ／ppm＝２.６０〜３.００（エチレンイ
ミンＣＨ₂）、３.７８（エチレングリコールＣＨ₂）。 ¹³ＣＮＭＲ（１２５MHz、Ｄ₂Ｏ）：δ／ppm＝３８.２（エチレンイミンＣ
Ｈ₂）、３９.９（エチレンイミンＣＨ₂）、４６.２（エチレンイミンＣＨ₂
）、４７.９（エチレンイミンＣＨ₂）、５１.７（エチレンイミンＣＨ₂）、
５３.４（エチレンイミンＣＨ₂）、５４.８（エチレンイミンＣＨ₂）、７０
.２（エチレングリコールＣＨ₂）。ＧＰＣ（メタクリル酸アミノエチルゲル、１％ギ酸、０.５ml／分、２５℃、
プルラン標準を用いて校正した）：Ｍ_n＝２１０００、Ｍ_w＝４００００、Ｍ_p＝
１６０００、ＰＤ＝１.９、単峰性。ＣＨ₃Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ₂（ＲＡＰＰポリメ
ーレ、５０００Ｄａ）との比較：Ｍ_n＝９１００、Ｍ_w＝１４０００、Ｍ_p＝１６
０００、ＰＤ＝１.６、単峰性。

【００３７】実施例６７ＰＥＧ−ＰＥＩコポリマーの調製（マクロ開始剤経路）マクロ開始剤の調製２ｇ（０.４mmol、１当量）のポリエチレングリコールモノメチルエーテル（
アルドリッチ、ＭＷ５０００）を電磁攪拌子および還流冷却器を具備した５０ml
の丸底フラスコに秤量し、２５mlの蒸留クロロホルムに溶解させる。０.３１ｇ
のトシルクロリド（１.６mmol、４当量）をポリマーの攪拌溶液に添加する。最
後に、０.２２mlのトリエチルアミン（０.１６ｇ、１.６mmol、４当量）を触媒
として混合物に添加する。混合物を１８時間加熱還流する。ポリマーを単離し精
製するために、溶液を５００mlのジエチルエーテルに注ぎ入れる。沈殿したポリ
マーを濾別し、多量のジエチルエーテルで洗浄し、真空下に乾燥する。１.９０
ｇの白色鱗状物質を得る（９１％収率）。

【００３８】ＰＥＧ−ＰＥＩブロックコポリマーの調製０.５ｇのマクロ開始剤（０.０９６mmol、１当量）を電磁攪拌子および還流冷
却器を具備した２５mlの丸底フラスコに秤量し、１０mlの蒸留水に溶解させる。
攪拌しながら、１mlのエチレンイミン（０.８３２ｇ、１９.３２mmol、２００当
量）を滴下添加し、混合物を６０℃で２４時間加熱する。揮発性成分を減圧下に
除去する。白色樹脂性物質が残留し、１０mlの水に再溶解し、そして２００mlの
テトラヒドロフランで沈殿させる。ポリマーをデカンテーションにより単離し、
真空下に乾燥する。０.９５ｇの黄色がかった樹脂性物質を得る（７１％収率）
。以下は同様の方法で調製できる：（全てのモノメチル−ＰＥＧ類はアルドリッ
チより入手可能である。）

【００３９】

【表５】

【００４０】 ¹Ｈおよび¹³Ｃ−ＮＭＲ分光法およびゲル浸透クロマトグラフィによりポリマ
ーを確認した。実施例６７において以下のデータを得た。これらは他の実施例の
代表であり、他の実施例でも極めて同様のデータが得られた。 ¹ＨＮＭＲ（５００MHz、Ｄ₂Ｏ）：δ／ppm＝２.８０〜３.２０（エチレンイ
ミンＣＨ₂）、３.８０（エチレングリコールＣＨ₂）。 ¹³ＣＮＭＲ（１２５MHz、Ｄ₂Ｏ）：δ／ppm＝３７.９（エチレンイミンＣ
Ｈ₂）、３９.４（エチレンイミンＣＨ₂）、４６.１（エチレンイミンＣＨ₂
）、４７.２（エチレンイミンＣＨ₂）、５１.３〜５２.７（エチレンイミン
ＣＨ₂）、７０.２（エチレングリコールＣＨ₂）。ＧＰＣ（メタクリル酸アミノエチルゲル）、１％ギ酸、０.５ml／分、２５℃
、プルラン標準を用いて校正した）：Ｍ_n＝３５０００、Ｍ_w＝９００００、Ｍ_p
＝５２０００、ＰＤ＝２.６、単峰性。ＣＨ₃Ｏ−ＰＥＧ−Ｔｓ５０００Ｄａ）との比較：Ｍ_n＝４８００、Ｍ_w＝７
６００、Ｍ_p＝８６００、ＰＤ＝１.６、単峰性。

【００４１】略語ｂＰＥＧ枝分かれ状ポリエチレングリコールｂＰＥＩ枝分かれ状ポリエチレンイミンＣＭＣ臨界ミセル濃度ＤＭＦジメチルホルムアミドＨＭＤＩヘキサメチレンジイソシアネートｌＰＥＧ線状ポリエチレングリコールｌＰＥＩ線状ポリエチレンイミンＭ_n 数平均分子量Ｍ_p ピーク分子量ｍＰＥＧモノメトキシポリエチレングリコールＭ_w 重量平均分子量ＭＷ不特定平均分子量ＰＤ分子量分散度Ｔｓトシル σ_min 最小表面張力

【００４２】

【生物学実施例】

Ｉ．トランスフェクション実験ＰＥＩ(ＰＥＧ)₂₀（実施例１）およびＰＥＧ(ＰＥＩ)₈（実施例２７）ポリマ
ーのトランスフェクション特性を３Ｔ３細胞株で検討した。５００００細胞／ウ
ェルを１２のウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした（ＤＭＥＭ
＋２ｍＭグルタミン＋１０％ＦＣＳ、３７℃、１０％ＣＯ₂）。そして培養液を
交換した。ｐＧＬ３プラスミド４μgの１５０ｍＭ生理食塩水１００μl溶液を、
それぞれのウェル中、適切量のポリマーの１５０ｍＭ生理食塩水１００μl溶液
で複合化し、１０分後細胞に添加した。４時間後、培養液を再び交換し、そして
４８時間後、評価を行った。ベルトールドシリウス（Berthold Sirius）照度計
中、プロメガ（Promega）ルシフェラーゼアッセイキットを用いてルシフェラー
ゼ発現を測定した。蛋白質濃度を修飾ＢＣＡアッセイを用いて定量化した。示し
たデータはそれぞれの場合について、対応する窒素／リン比に関して３つのウェ
ルの平均±標準偏差である。

【００４３】実施例１：［ＰＥＩ(ＰＥＧ)₂₀］測定データ：Ｎ／Ｐ５：０.００５７±０.００３６ng／mg 蛋白質Ｎ／Ｐ１０：０.１７８６±０.１５２２ng／mg 蛋白質Ｎ／Ｐ２０：０.６９５２±０.５４９８ng／mg 蛋白質Ｎ／Ｐ５０：５.１９６３±２.６８６３ng／mg 蛋白質（プラスミドのみ：０.００００±０.００００４ng／mg 蛋白質）

【００４４】実施例２７：［ＰＥＧ(ＰＥＩ)₈］測定データ：Ｎ／Ｐ５：０.００２４±０.００１２ng／mg 蛋白質Ｎ／Ｐ１０：０.００４５±０.００４６ng／mg 蛋白質Ｎ／Ｐ２０：０.０１０９±０.００７８ng／mg 蛋白質Ｎ／Ｐ５０：０.０７６５±０.０４９８ng／mg 蛋白質（プラスミドのみ：０.００００±０.００００４ng／mg 蛋白質）両方の場合において、発生しているトランスフェクションに基づく遺伝子発現
が検出可能であった。更に、ＰＥＩ(ＰＥＧ)₂₀はＰＥＧ(ＰＥＩ)₈が行うより極
めて大きなトランスフェクション効率を示す。

【００４５】 II．ＭＴＴアッセイによるｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性の測定実施例１および２７のコポリマーについて、Mosmannの方法によるＭＴＴアッ
セイ（Ｊ．Immunol．Methods、65巻、55〜63頁(1983年)）を用いて、細胞培養モ
デル中でのこれらの細胞毒性を検討した。Ｌ９２９マウス繊維芽細胞８０００個
／ウェルを９６個のウェル中２４時間プレインキュベートし、種々の濃度のポリ
マー溶液で３、１２および２４時間処理した。ＭＴＴ染料のホルマザンへの変換
を通してミトコンドリア活性を測定した。ここでホルマザンは分光光度法により
定量した。５種の異なる濃度で、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ溶液としてポリマ
ーを使用した。必要であれば、ｐＨを７.４に合わせ、試料を濾過（０.２μm）
により無菌化した。（スペーサ量を差し引いて）２つの個々の成分を混合するこ
とによりブレンドを調製した。評価として、使用したポリマー濃度に対する細胞
生存度〔％〕をプロットし、ＩＣ５０を求めた。

【００４６】結果：・遊離ポリマーのｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性は、ポリマー濃度の増加とともに
、およびインキュベーション時間の増加とともに増加する。・実施例１のコポリマー：個々の成分ＰＥＩ２５kDaとＰＥＧ５５０Ｄａ
との混合物の毒性は、遊離のＰＥＩ２５kDaの毒性に相当する。２つの成分の
共有結合により耐容性は非常に高められる。２４時間後の毒性プロフィールは個
々の成分の毒性に対応し、それゆえに遊離のＰＥＩ２５kDaの毒性に対応する
が、インキュベーション時間が短くなると細胞毒性は低下する。ＰＥＧ被覆はポ
リエチレンイミンの正電荷を遮断し、それゆえ細胞膜での電荷媒介作用を低下さ
せる。・実施例２７のコポリマー：２つの個々の成分ＰＥＩ７００ＤａとＰＥＧ
１０kDaとの混合物では、１０mg／mlまで細胞生存率が低下しなかった。同じ濃
度範囲において、コポリマーでは３、１２および２４時間後での細胞生存率の限
界が増加し、これは分子量の増加によると説明できる。・実施例２７は実施例１より細胞毒性が低い。

【００４７】 III．ＬＤＨアッセイによるｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性の測定６−ウェルマルチディッシュにＭＴＴアッセイと同じ細胞密度でＬ９２９マウ
ス繊維芽細胞を播種し、４８時間プレインキュベートし、そしてポリマー溶液（
ＰＢＳ中、ｐＨ７.４）とともに１、２、３および６時間インキュベートした。
乳酸塩およびＬＤＨの存在下ＮＡＤ還元を光度測定することにより、細胞外ＬＤ
Ｈフラクションを標準キット（シグマ、ＤＧ−１３４０−Ｋ）で定量した。１０
０％値を決定するために、細胞を０.１％のトリトンＸ−１００で溶菌した。

【００４８】結果：ＬＤＨアッセイによりＭＴＴ試験の結果が確認される。２つのアッセイの相関
関係から、膜損傷が最初に起こり、暫くして、代謝活性の減少が起こることが示
される。ポリマーの膜損傷作用は、インキュベーション時間およびポリマー濃度
の増加とともにより強くなる。

【００４９】 IV．アガロースゲル電気泳動法により測定されたコポリマーのＤＮＡ結合実施例１および２７のコポリマーの結合能を、８０Ｖで１％アガロースゲルで
の電気泳動法により測定した。臭化エチジウム染色後、２５４nmでのＵＶ励起に
よりプラスミド（ＣＭＶ−ｎｌａｃＺ）を確認する。

【００５０】結果：・両ポリマーは、プラスミドと静電相互作用できる。・ブレンドと一致して、実施例１のポリマーは、窒素−ＰＥＩ／リン−ＤＮＡ
比（Ｎ／Ｐ比）１.７から完全にプラスミドを結合することができる。強いＤＮ
Ａ縮合の徴候である、ブレンド（Ｎ／Ｐ５.８から）で観察された臭化エチジウ
ム排除は、Ｎ／Ｐ２３.０までのコポリマーでは不完全である。・実施例２７のブレンドにおいては完全なプラスミド結合はＮ／Ｐ４.１か
らのみ観察されており、完全なエチジウム排除は観察されないのに対して、コポ
リマーではＮ／Ｐ２.４からプラスミド結合が示され、Ｎ／Ｐ１６.６から染料
排除が示された。

【００５１】Ｖ．赤血球凝集アッセイ ParnhamおよびWetzigの方法（Chem．Phys．Lipids、64巻、263〜274頁、1993
年）によってウィスターラットのクエン酸処理血液より赤血球を単離し、２４の
ウェル中に播種し、そして試験溶液とともに３７℃で２時間でインキュベートし
た。ポリマーの影響下赤血球の凝集および凝着を顕微鏡で観察した。未処理赤血
球をコントロールとして使用した。

【００５２】結果：・実施例１の遊離のコポリマーは、０.２７〜１８μg／ウェルの濃度で、ブレ
ンドおよびＰＥＩ２５kDaと比較して、赤血球の細胞培養ディッシュへの凝集
および凝着の低下を示した。低濃度（０.２７〜０.７μg／ウェル）では有意差
は見られないのに対して、濃度を上げると、コポリマーとブレンドまたはＰＥＩ２５kDaとの顕著な差異が検出可能であった。凝集作用はＮ／Ｐ比を上げるに
つれて増加した。・実施例２７のコポリマーは反対の挙動を示した。ブレンドのおよび遊離ＰＥ
Ｉの凝集は、コポリマーの凝集より少ない。・赤血球凝集は、遊離ポリマーと比較して、両ポリマーとプラスミドＤＮＡと
の反応中大きく減少する。

【００５３】 VI．赤血球溶血アッセイ ParnhamおよびWetzigの方法（Chem．Phys．Lipids、64巻、263〜274頁、1993
年）によってウィスターラットのクエン酸処理血液より赤血球を単離し、ポリマ
ー溶液と混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。赤血球を遠心分離
（１０分、２５℃、７００ｇ）によりペレット化し、そして赤血球溶血を上澄み
について５４０nmで光度測定する。

【００５４】結果：・個々の成分である８−枝状ＰＥＧ、ＰＥＧ５００ＤａおよびＰＥＩ７０
０Ｄａでは、０.００１〜１０mg／mlの濃度範囲（全て１〜３％）で、顕著な赤
血球溶血作用は見られない。・実施例２７などのコポリマーは、同じ濃度範囲で明白な作用（＜５％）は見
られない。・個々の成分ＰＥＩ２５kDaを用いおよび実施例１におけるブレンドを用い
ると、溶血活性は０.００１〜１０mg／mlで増加する（１０mg／mlで２２.１３％
）。・実施例１のコポリマーは、０.５mg／mlまでで１３.３０％までに溶菌活性が
増加し、１０mg／mlまでの高濃度で溶血作用は再び減少する（１０mg／mlで２.
９０％）。

【００５５】 VII．マウスにおけるポリマー−ＤＮＡ複合体の薬物動力学および器官分布実施例１および２７のコポリマーの薬物動力学および器官分布をｂａｌｂ／ｃ
マウスで測定した。ポリマーを¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（ファーマシアバイ
オテック（Pharmacia Biotech））を用いて放射標識した。マウス１kgに対して
ＰＥＩ（成分）０.４または０.０４または０.００８mg量を、５％グルコース溶
液中、全容量が８０μlで窒素／リン比Ｎ／Ｐ３.５またはＮ／Ｐ６で、適切な量
のＮＦ−ｋＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と複合化し、１０分
後、鎖骨下静脈を通して麻酔下のマウスに注射した。２０秒、１、２、５、１５
、３０、６０、９０および１２０分後、カテーテルを通して動脈大動脈幹から血
液サンプルを得た。１２０分間、膀胱カテーテルを通して尿を採集した。１２０
分後、マウスを断頭し、器官である皮質、腎臓、肝臓、心臓、肺、脾臓および脂
肪組織を除去した。

【００５６】サンプル中のポノマー量は、１２７７ガンママスター自動ガンマカウンター（
LKB Wallac）を用いて放射能を測定することにより定量した。 Kinetica １．１プログラムおよび静脈内大量瞬時投与における２−コンパー
トメントモデルを用いてデータを分析した。分布容積（Ｖ_c）、排除定数（ｋ_el
）およびＡＵＣを血中濃度プロットから算出した。３種の動物を分析した場合は
平均±標準偏差として示し、２種の動物の場合は中央値を示し、そしてただ１つ
の動物の場合は値を括弧に入れて示した。

【００５７】複合体調製および用量

【表６】

【００５８】結果：・比較的低い用量での観察では、ＰＥＩ(ＰＥＧ)₂₀の毒性はＰＥＩ２５kDa
の毒性より弱いことを示している。・全てのポリマーの血漿濃度は、２−コンパートメントモデルで記述できた。・コポリマーは、２５kDa ＰＥＩより高いＡＵＣおよび小さい分布容積を有
する。ＰＥＩ(ＰＥＧ)₂₀（実施例１）はＰＥＧ(ＰＥＩ)₈（実施例２７）より大
きな作用を有する。・排除はコポリマーで減少した。・Ｖ_cおよびｋ_elは検知できるほどの用量依存性を示さない。・ＰＥＩ２５kDaおよび実施例１において算出されたＡＵＣは、用量に比例
しており、ＡＵＣ／用量線の勾配は実施例１のコポリマーでより大きかった。・１２０分後の分布の主要器官は、肝臓、腎臓および脾臓であった。６：１複
合体において、コポリマーはＰＥＩ２５kDaと比較して、肝臓および脾臓にお
いて摂取が減少し、腎臓において摂取が増加している。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年７月２５日（２００２．７．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１８】ｃ）で説明した方法は、ポリマーブロックＡの末端ヒドロキシル基を一般式VI
IIの塩化スルホニル、特にトルエンスルホニルクロリド（トシルクロリド）と反
応させることによって実施される。この反応は、水性および／または極性有機溶
媒中、好ましくは水／テトラヒドロフラン混合物中で、−１０℃から溶媒の沸点
までの温度、好ましくは０℃から２５℃までの温度で、（必要ならば）触媒、た
とえばトリエチルアミンまたは水酸化ナトリウムの存在下で実施する。この生成
物は、減圧下で溶媒を除去することによって単離される。このポリマーはその後
エチレンイミン重合化用のマクロ開始剤として使用される。この目的のために、
一般式VIIを有する生成物を水性または極性有機溶媒中で、０℃から溶媒の沸点
までの温度でエチレンイミンと反応させる。この２成分のモル比は、１：１０か
ら１：１００００の間である。この反応では副産物は形成されない。最終生成物
は、適切な溶媒、たとえば、ジエチルエーテルなどでポリマーを沈殿させること
によって単離することができる。ｄ）で説明した方法は、一般式ＩＸの化合物と
少し過剰の、好ましくは２倍から１０倍過剰のジイソシアネート、好ましくはヘ
キサメチレンジイソシアネートとを反応させることによって実施することが好ま
しい。この反応は、クロロホルム中で、２０℃から溶媒の沸点、好ましくは溶媒
の沸点で実施する。選択した反応時間は、２時間と２４時間の間、好ましくは１
０時間と１４時間の間である。反応混合物中のポリマー濃度は、１０ｇ／mlと５
００ｇ／ｌの間、好ましくは３０ｇ／ｌと１５０ｇ／ｌの間である。減圧下で溶
媒を除去し、過剰なジイソシアネートを石油エーテル（沸騰範囲：４０〜６０℃
）で繰り返し抽出することによって除去して、生成物を単離する。この中間体を
ＰＥＩ高分子と１：１から１００：１のモル比で反応させる。この反応は、クロ
ロホルム中で、必要であればジメチルホルムアミドを添加して、室温から溶媒の
沸点までの温度で、好ましくは６０〜７０℃で実施する。選択した時間は６と７
２時間の間で、好ましくは１２時間である。反応混合物中のポリマー濃度は、Ｐ
ＥＩおよびヘキサメチレンジイソシアネートで活性化した非イオン性親水性ポリ
マーとも１０ｇ／ｌと５００ｇ／ｌとの間、好ましくは３０〜２００ｇ／ｌの間
である。生成物は体積が１０〜３０倍過剰のジエチルエーテル中でポリマーを沈
殿させることによって単離される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダグマール・フィッシャードイツ連邦共和国デー−35037マルブルク．シューマルクト２ (72)発明者クラウス・クーナートドイツ連邦共和国デー−35041マルブルク．エーミール−フォン−ベーリング−シュトラーセ13 (72)発明者アンケ・フォンハールペドイツ連邦共和国デー−35041マルブルク．アム・エンゲルスベルク31 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 DA03 EA04 GA11 HA17 4J031 AA53 AA57 AC07 AC08 AD01 AF03 AF09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式ＩまたはIIの化合物であって、（Ｉ）Ａ(−Ｘ−Ｂ)_n （II）Ｃ(−Ｙ−Ｄ)_m 式中、Ａは分子量１００から１０００００００ｇ／molの親水性非イオン性線
状または枝分かれ状ポリマーであり、Ｂは分子量１００から１００００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ポリエ
チレンイミン（ＰＥＩ）であり、ＸはブロックＡとＢの直接結合または以下の構造 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_oＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｏ＝１から２０である）、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（アリール＝芳香族単位である）
、 −Ｏ(ＣＨ₂)_pＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｐ＝１から１０である）、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ−、または −Ｏ(ＣＨ₂)_qＮＨ−（ｑ＝１から２０である）を有するリンカーであり、ｎは１から２００の整数であり、Ｃは分子量１００から１００００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ＰＥＩ
であり、Ｄは下式のＯを介して結合したポリエチレングリコールの残基であり、 −(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n'−Ｒ¹ 式中、ｎ’は３から２５０００であり、Ｒ¹は水素、脂肪族基または他のＯＨ
保護基または細胞性リガンドであり、ＹはブロックＣおよびＤの直接結合または以下の構造、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_sＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（ｓ＝１から２０である）、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（アリール＝芳香族単位である）
、 −ＮＨ(ＣＨ₂)_tＣ(Ｏ)Ｏ−（ｔ＝２から１０である）、 −ＮＨＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂Ｏ−、または −ＮＨ(ＣＨ₂)_uＯ−（ｕ＝１から２０である）を有するリンカーであり、ｍは１から２００の整数である化合物。
【請求項２】Ａは分子量１０００から１０００００ｇ／molの親水性非イ
オン性線状または枝分かれ状ポリマーであり、Ｂは分子量４００から１０００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ポリエチ
レンイミン（ＰＥＩ）であり、ＸはブロックＡとＢの直接結合または以下の構造 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_oＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｏ＝２から１０である）、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（アリール＝１個の核を有する芳
香族単位である）、 −Ｏ(ＣＨ₂)_pＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｐ＝１から３である）、 −ＯＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂ＮＨ−、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ−、または −Ｏ(ＣＨ₂)_qＮＨ−（ｑ＝１から６である）を有するリンカーであり、ｎは１から５０であり、Ｃは分子量４００から１０００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ＰＥＩで
あり、ＤはＯを介して結合した下式のポリエチレングリコールの残基であり、 −(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−Ｒ¹ 式中、ｎ’は１０から５０００であり、Ｒ¹は水素、脂肪族基または他のＯＨ
保護基または細胞性リガンドであり、ＹはブロックＣおよびＤの直接結合または以下の構造、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_sＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（ｓ＝２から１０である）、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（アリール＝１個の核を有する芳
香族単位である）、 −ＮＨ(ＣＨ₂)_tＣ(Ｏ)Ｏ−（ｔ＝２から３である）、 −ＮＨＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂Ｏ−、または −ＮＨ(ＣＨ₂)_uＯ−（ｕ＝１から６である）を有するリンカーであり、ｍは１から１００の整数である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】Ａは分子量５０００から５００００ｇ／molの親水性非イオ
ン性線状または枝分かれ状ポリマーであり、Ｂは分子量４００から５００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ポリエチレ
ンイミン（ＰＥＩ）であり、ＸはブロックＡとＢの直接結合または以下の構造 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_oＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｏ＝４から６である）、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−（アリール＝トリルである）、 −Ｏ(ＣＨ₂)_pＣ(Ｏ)ＮＨ−（ｐ＝１である）、 −ＯＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂ＮＨ−、 −ＯＣ(Ｏ)ＮＨ−、または −Ｏ(ＣＨ₂)_qＮＨ−（ｑ＝１から３である）を有するリンカーであり、ｎは１から１２であり、Ｃは分子量４００から５００００ｇ／molの線状または枝分かれ状ＰＥＩであ
り、ＤはＯを介して結合した下式のポリエチレングリコールの残基であり、 −(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n'−Ｒ¹ 式中、ｎ’は１０から１０００であり、Ｒ¹は水素、脂肪族基または他のＯＨ
−保護基または細胞性リガンドであり、ＹはブロックＣおよびＤの直接結合または以下の構造、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_sＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（ｓ＝４から６である）、 −ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(アリール)ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−（アリール＝トリルである）、 −ＮＨ(ＣＨ₂)_tＣ(Ｏ)Ｏ−（ｔ＝２である）、 −ＮＨＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂Ｏ−、または −ＮＨ(ＣＨ₂)_uＯ−（ｕ＝１から３である）を有するリンカーであり、およびｍは１から５０の整数である請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】式Ｉを有する請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】式IIを有する請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】Ｘが式−ＯＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_oＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−のリンカー
である請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】Ｙが式−ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ(ＣＨ₂)_sＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−のリンカー
である請求項１から３および５のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】ａ）一般式Ｖの化合物（Ｖ）Ａ−(ＯＨ)_n（Ａおよびｎ＝式Ｉと同様である）と、ジイソシアネートを反応させること、またはｂ）一般式VIの化合物 (VI)Ａ−(ＮＨ₂)_n（Ａおよびｎ＝式Ｉと同様である）を、重合化開始の前、または重合化が進行しないうちにエチレンイミン重合化の
ための反応混合物に添加すること、ｃ）一般式ＶＩＩの化合物（VII）Ａ−(ＯＳ(Ｏ)₂Ｒ⁴)_n（Ａは式Ｉと同様で、Ｒ⁴＝脂肪族または芳香
族基である）をエチレンイミン重合化のマクロ開始剤として使用することを含む
請求項１から４のいずれかに記載の式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項９】最初に一般式IXの化合物（IX）Ｄ−ＯＨ（Ｄは式IIで定義した通りである）とジイソシアネートを反応させて、その後得られた化合物を線状または枝分かれ
状ポリエチレンイミンと反応させることを含む請求項１から３および５のいずれ
かに記載の式IIの化合物の製造方法。
【請求項１０】界面活性剤としての請求項１から７のいずれかに記載の化
合物の使用。
【請求項１１】水性系でポリ核酸を複合体化するための請求項１から７の
いずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１２】水性系でＤＮＡを複合体化するための請求項１から７のい
ずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１３】水性系でＲＮＡを複合体化するための請求項１から７のい
ずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１４】水性系でリボザイムを複合体化するための請求項１から７
のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１５】少なくとも１個の核酸および請求項１から７のいずれかに
記載の１個の化合物を含む組成物。