RU2269544C2

RU2269544C2 - Катионные блок-сополимеры

Info

Publication number: RU2269544C2
Application number: RU2002103719/04A
Authority: RU
Inventors: Томас КИССЕЛЬ (DE); Томас КИССЕЛЬ; Хольгер ПЕТЕРСЕН (DE); Хольгер ПЕТЕРСЕН; Дагмар ФИШЕР (DE); Дагмар Фишер; Клаус КУНАТ (DE); Клаус КУНАТ; ХАРПЕ Анке ФОН (DE); ХАРПЕ Анке ФОН
Original assignee: Мединнова Гезелльшафт Фюр Медицинише Инновационен Аус Академишер Форшунг Мбх
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2006-02-10
Also published as: CA2379205A1; DE19933024C2; ES2256031T3; ATE315603T1; CN1364179A; RU2002103719A; US20070036866A1; EP1226204A1; CA2379205C; AU6821800A; JP2003528163A; US20080125543A1; PT1226204E; AU767661B2; DK1226204T3; DE50012055D1; JP4614198B2; WO2001005875A1; DE19933024A1; EP1226204B1

Abstract

Изобретение относится к катионным блок-сополимерам, используемым, в частности, в качестве поверхностно-активного вещества, к способу их получения, а также к композиции для проведения трансфекции на основе катионных блок-сополимеров. Катионные блок-сополимеры представляют собой соединения формулы

где А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 100 до 10000000, содержащий такие остатки, как остаток линейного полиэтиленгликоля, многократно разветвленного полиэтиленгликоля, звездообразного полиэтиленгликоля, полисахаридов, поливинилового спирта; В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин (PEI) с молекулярной массой от 100 до 1000000; Х означает прямую связь блоков А и В или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина: -OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=1-20; OC(O)NH(арил)NHC(O)-, где арил означает ароматическую структурную единицу; -O(СН₂)_рС(O)-, где р=1-10; -ОС(O)- или -O(CH₂)_q-, где q=1-20; n означает целое число 1-200; С означает линейный или разветвленный полиэтиленимин с молекулярной массой от 100 до 1000000; D означает остаток связанного через О полиэтиленгликоля формулы: -(СН₂СН₂O)_n'-R¹, где n' означает 3-25000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток или защитную для ОН группу; Y означает прямую связь блоков С и D или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина: -C(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает ароматическую структурную единицу; -(CH₂)_tC(O)O-, где t=2-10; -CH₂CH(OH)CH₂O- или -(CH₂)_uO-, где u=1-20; и m означает целое число 1-200; при условии, что остатки и переменные в формуле (II) имеют такие значения, что под эту формулу не подпадают соединения формулы (I). Соединение формулы (I) получают тремя способами. Первый способ заключается в том, что соединение общей формулы А-(ОН)_n, где А и n имеют вышеуказанное значение, вводят во взаимодействие с диизоцианатом и образующееся в результате этого соединение вводят во взаимодействие с полиэтиленимином. Второй способ заключается в том, что к соединению общей формулы A-(NH₂)_n, где А и n имеют вышеуказанное значение, добавляют этиленимин и проводят полимеризацию. Третий способ заключается в том, что к соединению общей формулы A-(OS(O)₂R⁴)_n, где А имеет вышеуказанное значение, R⁴ означает алифатический или ароматический остаток, добавляют этиленимин и проводят полимеризацию. Способ получения соединения формулы (II) заключается в том, что соединение общей формулы D-OH, где D имеет вышеуказанное значение, сначала вводят во взаимодействие с диизоцианатом, а затем полученное соединение вводят во взаимодействие с линейным или разветвленным полиэтиленимином. Если в соединении формулы (II) Y означает -C(O)NH(CH₂)_sNHC(O)O-, где s означает 1-20, то данные блок-сополимеры могут быть использованы в качестве комплексообразователя нуклеиновых кислот. Композиция для проведения трансфекции включает, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту и одно соединение формулы (I) или (II). 5 н. и 6 з.п. ф-лы.

Description

Из международной заявки WO-98/59064 известны блок-сополимеры полиэтиленимина (PEI) и полиэтиленгликоля (PEG) и их применение в качестве носителя для транспортировки нуклеиновой кислоты в высшие эукариотические клетки. Описанный сополимер состоит из разветвленного полиэтиленимина и линейного полиэтиленгликоля. Для обработки полиэтиленгликолем (ПЭГилирования) полиэтиленимина используют полиэтиленгликольметоксисукцинимидилпропионат.

S.V.Vinogradov, Т.К.Bronich и A.V.Kabanov (Bioconjugate Chem., 9, 805-812 (1998)) описывают получение блок-сополимеров полиэтиленимина и полиэтиленгликоля и блок-сополимеров полиспермина и полиэтиленгликоля за счет использования разветвленного полиэтиленимина и разветвленного полиспермина путем реакции сочетания с активированным с помощью 1,1'-карбонилдиимидазола монометоксиполиэтиленгликолем. Сополимеры применяют для комплексообразования с олигонуклеотидами.

В статье L.M.Bronstein, M.Antonietti и др. (Inorganica Chimica Acta, 280, 348-354 (1998)) описываются блок-сополимеры полиэтиленимина и полиэтиленгликоля и их получение путем реакции сочетания разветвленного полиэтиленимина с монометоксиполиэтиленгликолем, который обладает концевой группой хлорангидрида кислоты, и их применение для получения коллоидов металлов.

Статья V.Toncheva и др. (Biochimica et Biophysika Acta, 138, 354-358 (1998)) касается блок-сополимеров, состоящих из поли(L-лизина) и некоторых гидрофильных полимеров, также как полиэтиленгликоль, декстран и поли(N-(2-гидроксипропил)-метакриламид, способа их получения и их применения в качестве носителя для переноса гена нуклеиновой кислотой.

Общим для этих известных блок-сополимеров являются следующие три момента:

1) катионный полимер имеет ответвления гидрофильного неионного полимера;

2) во всех случаях для этого реакционноспособный конец гидрофильного неионного полимера для реакции сочетания с катионным полимером активируют с помощью реагента, который в получаемом сополимере представляет собой мостик между блоками;

3) гидрофильный неионный полимер во всех случаях является линейным полимером.

Далее, из заявки США А-5204196 известны полимеры, которые содержат полиэтилениминную основную цепь, с которой с помощью изоцианата связан простой полиэтиленгликолевый эфир формулы -О(CH₂-CH₂)_n-СН₃. Эти полимеры в комбинации с неорганическими солями используют в качестве твердых электрических проводников.

Предлагаются новые катионные блок-сополимеры общих формул (I) и (II):

где А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 100 до 10000000 г/моль, предпочтительно от 1000 до 100000 г/моль и в особенности от 5000 до 50000 г/моль;

В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин (PEI) с молекулярной массой от 100 до 1000000 г/моль, предпочтительно от 400 до 100000 г/моль и в особенности от 400 до 50000 г/моль;

Х означает прямую связь блоков А и В или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина:

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=1-20, предпочтительно 2-10, в особенности 4-6;

-ОС(O)NH(арил)NHC(О)-, где арил означает ароматическую структурную единицу предпочтительно с 6-14 атомами углерода, состоящую из одного или нескольких ароматических ядер, которые связаны друг с другом в конденсированной или полифенильной форме, предпочтительно с одним ядром, в особенности толуил;

-О(CH₂)_рС(О)-, где р=1-10, предпочтительно 1-3, в особенности 1;

-OCH₂СН(ОН)CH₂-;

-ОС(О)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-20, предпочтительно 1-6, в особенности 1-3;

n означает целое число:

1) 1-200, предпочтительно

2) 1-50,

3) 1-12,

4) 1-8, или, особенно предпочтительно,

5) 2-8;

С означает линейный или разветвленный полиэтиленимин с молекулярной массой от 100 до 1000000 г/моль, предпочтительно от 400 до 100000 г/моль и в особенности от 400 до 50000 г/моль;

D означает остаток связанного через О полиэтиленгликоля формулы:

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

где n' означает 3-25000, предпочтительно 10-5000 и в особенности 10-1000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток, как (C₁-C₆)-алкил (метил, этил, трет-бутил и т.п.), или другую, защитную для ОН группу, как ацил (например, возможно замещенный бензоксикарбонил), возможно замещенный бензил, пиколил, или клеточный лиганд, чтобы способствовать специфическому проникновению комплекса нуклеиновая кислота-сополимер благодаря связыванию с протеинами клеточной поверхности, в особенности с рецепторами;

Y означает прямую связь блоков С и D или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина:

-С(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает ароматическую структурную единицу предпочтительно с 6-14 атомами углерода, состоящую из одного или нескольких ароматических ядер, которые связаны друг с другом в конденсированной или полифенильной форме, предпочтительно с одним ядром, в особенности толуил;

-(CH₂)_tС(О)О-, где t=2-10, предпочтительно 2-3, в особенности 2;

-CH₂СН(ОН)CH₂O- или

-(CH₂)_uO-, где u=1-20, предпочтительно 1-6, в особенности 1-3;

и

m означает целое число:

1) 1-200, предпочтительно

2) 1-100, в особенности

3) 1-50;

при условии, что остатки и переменные в формуле (II) имеют такие значения, что под эту формулу не подпадают соединения формулы (I).

Предлагаемые согласно изобретению катионные блок-сополимеры отличаются от известных блок-сополимеров по меньшей мере одним из следующих трех признаков:

1) гидрофильный неионный полимер имеет ответвления катионного полимера;

2) мостики отличаются от мостиков известных блок-сополимеров;

3) они включают разветвленный гидрофильный неионный полимер.

Под А понимают состоящие предпочтительно из углерода и кислорода линейные или разветвленные полимеры, которые, в случае необходимости, также могут содержать циклические, звездообразные или дендритные структуры, как, например, остатки линейного полиэтиленгликоля, многократно разветвленных полиэтиленгликолей, звездообразных полиэтиленгликолей, полисахаридов, включая циклодекстрины, поливинилового спирта, арборолов (дендримеров с концевыми гидроксильными группами), предпочтительно, однако, линейного и многократно разветвленного и звездообразного полиэтиленгликоля. Указанные последними полимеры выпускаются, в частности, фирмами Aldrich, Fluka, Sigma и Shearwater.

Под В и С понимают линейные или разветвленные полиэтилениминные остатки, которые отвечают формуле (III):

в которой R² означает одинаковые или разные остатки и представляет собой атом водорода или остаток формулы (IV):

где R³ означает одинаковые или разные остатки, которые имеют указанное для R² значение;

А^- означает эквивалент пригодного, предпочтительно неорганического, аниона, как ОН^-, Cl^-, Br^- и т.п.;

х и х' являются одинаковыми или разными и означают 1 или 2;

y и y' являются одинаковыми или разными и означают целые числа, которые выбирают таким образом, что остатки В или соответственно С имеют долевую молекулярную массу от 100 до 1000000 г/моль, предпочтительно от 400 до 100000 г/моль и в особенности от 400 до 50000 г/моль, причем у' также может означать 0;

z и z' являются одинаковыми или разными и z=х-1 и z'=х'-1;

и

w и w' являются одинаковыми или разными целыми числами, которые выбирают таким образом, что компенсируются положительные заряды в остатках формул (III) и (IV).

Полиэтиленимины могут быть получены сами по себе известным образом или они выпускаются в продажу фирмой BASF под торговыми названиями Lupasol® или под названием полиэтиленимин или этилениминный полимер с различными молекулярными массами от 400 до 2000000 г/моль (фирмы Aldrich, Sigma, Fluka или непосредственно фирма BASF). В случае В предпочтительны полиэтиленимины с молекулярной массой от 400 до 2000 г/моль и в случае С предпочтительны полиэтиленимины с молекулярной массой от 400 до 800000 г/моль, особенно предпочтительно от 400 до 25000 г/моль.

Описанные под обозначением D группы представляют собой остатки полиэтиленгликолей, которые на конце защищены остатком R¹, как, например, метил или другая пригодная защитная группа. R¹, однако, также может означать группу, которая выполняет специфическую или неспецифическую биологическую функцию, в особенности лиганд для взаимодействий с рецепторами для специфического к клетке-мишени проникновения комплекса блок-сополимер - биологически активное вещество в высшие эукариотические клетки и их клеточные ядра, причем биологически активное вещество представляет собой предпочтительно олигонуклеотид или ген (ген-мишень). Следовательно, R¹ также может означать лиганд для специфического взаимодействия и проникновения в ткань или клетки органа-мишени, например, протеинов, в особенности антител или фрагментов антител, как Fab, F(ab)₂, scFv, цито- или лимфокинов, как интерлейкины (IL-2 до х), интерферона GM-CSF, факторов роста, как EGF, PDGF, FGF, ЕРО, интегринов, как ICAM, VCAM, или гликопротеинов, как лектины или гликозилированные протеины (см. выше), или липопротеинов, как LDL, HDL, или транспортных протеинов, как трансферрин, или пептидов, как LH-RH, кальцитонин, окситоцин, инсулин, соматостатин, IGF, RGD, или углеводов, как галактоза, манноза, глюкоза, лактоза, или гормонов, как стероиды, THR, или витаминов, как B₁₂, фолиевая кислота.

Изобретение относится также к способам получения соединений формулы (I), отличающимся тем, что:

а) соединения общей формулы (V):

где А и n имеют указанное для формулы (I) значение, вводят во взаимодействие с диизоцианатом, предпочтительно гексаметилен-диизоцианатом, и образующееся в результате этого соединение вводят во взаимодействие с полиэтилениминами общих формул (III) и (IV); или

b) соединения общей формулы (VI):

(где А и n имеют указанное для формулы (I) значение)

при полимеризации этиленимина добавляют к реакционной смеси с самого начала реакции полимеризации или лишь позднее в процессе реакции полимеризации; или

c) соединения общей формулы (VII):

где А имеет указанное для формулы (I) значение и R⁴ означает алифатический или ароматический остаток, предпочтительно п-толуил, фторид, трифторметил или метил,

используют в качестве макроинициатора для полимеризации этиленимина.

Соединения формулы (VI) выпускаются с различными молекулярными массами, например, фирмой Shearwater.

Соединения общей формулы (VII) получают путем взаимодействия соединений общей формулы (V) с соединениями общей формулы (VIII):

(где R⁴ имеет вышеуказанное значение).

Изобретение относится, далее, к способам получения соединений формулы (II), отличающимся тем, что:

d) соединения общей формулы (IX):

(где D имеет указанное для формулы (II) значение)

сначала вводят во взаимодействие с диизоцианатом, предпочтительно с гексаметилендиизоцианатом, и затем полученное соединение вводят во взаимодействие с линейным или разветвленным полиэтиленимином. В случае необходимости, введенные для защиты гидроксильных групп защитные группы само по себе известным образом отщепляют (см., например, Büllenbach, Kontakte (Merck), 1/1980, с. 23 и последующие).

Описанный в п. а) способ предпочтительно осуществляют таким образом, что, в расчете на каждую концевую гидроксильную группу полимерного блока А, используют 4-20-кратный избыток диизоцианата, предпочтительно гексаметилен-диизоцианата. Реакцию проводят в хлороформе при температурах от комнатной температуры до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре кипения растворителя. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 2 до 24 часов, предпочтительно, однако, она составляет 4 часа. Концентрация полимера в реакционной смеси составляет от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно 100 г/л. Продукт выделяют путем удаления растворителя при пониженном давлении и удаления избыточного диизоцианата путем многократной экстракции петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Этот промежуточный продукт вводят во взаимодействие, в расчете на каждую концевую гидроксильную группу исходного соединения, с 3-10-кратным избытком макромолекул полиэтиленимина. Реакцию проводят в хлороформе при температурах от комнатной температуры до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре кипения растворителя. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 6 до 72 часов, предпочтительно, однако, она составляет 12 часов. Концентрации полимеров, как концентрации полиэтиленимина, так и также концентрации активированного с помощью гексаметилендиизоцианата неионного гидрофильного полимера, в реакционной смеси составляют от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно от 30 г/л до 200 г/л. Продукт выделяют путем осаждения полимера в 10-30-кратном избытке по объему диэтилового эфира. Путем многократного переосаждения с помощью растворителей этанола и диэтилового эфира блок-сополимер можно очищать от избыточного полиэтиленимина.

Описанный в п. b) способ осуществляют тем, что как этиленимин, так и гидрофильный неионный полимер с концевой аминогруппой находится в воде в концентрации, соответственно, от 10 г/л до 500 г/л. Молярное соотношение обоих компонентов составляет от 1:10 до 1:10000. Затем реакцию полимеризации этиленимина инициируют путем добавления пригодного катализатора, например, соляной кислоты, и смесь доводят до температуры 40-100°С. Сополимер получают путем реакции обрыва цепи. Блок-сополимер очищают от возможно образующегося в качестве побочного продукта гомополимера полиэтиленимина путем многократного переосаждения с помощью пригодных растворителей, например этанола и диэтилового эфира, и/или путем фильтрации под давлением. Вариация этого способа получения состоит в том, что гидрофильный неионный полимер с концевой аминогруппой добавляют к горячей полимеризуемой смеси лишь после известной продолжительности реакции, составляющей от 30 минут до 72 часов.

Описанный в п. с) способ осуществляют тем, что концевую гидроксильную группу (концевые гидроксильные группы) полимерного блока А вводят во взаимодействие с хлорангидридом сульфокислоты общей формулы (VIII), в особенности, однако, с хлорангидридом толуолсульфокислоты (тозилхлоридом). Эту реакцию проводят в водном и/или полярном органическом растворителе, предпочтительно в смеси воды с тетрагидрофураном, при температурах от -10°С до температуры кипения растворителя, предпочтительно при температурах от 0°С до 25°С, и (в случае, если необходимо) в присутствии катализаторов, как, например, триэтиламин или гидроксид натрия. Продукт выделяют путем удаления растворителя при пониженном давлении. Этот полимер служит в дальнейшем в качестве макроинициатора при полимеризации этиленимина. Для этого продукт общей формулы (VII) вводят во взаимодействие с этиленимином в водном или полярном органическом растворителе при температурах от 0°С до температуры кипения растворителя. Молярное соотношение обоих компонентов составляет от 1:10 до 1:10000. В случае этой реакции не образуется никакой побочный продукт. Конечный продукт можно выделять путем осаждения полимера в пригодном растворителе, как, например, диэтиловый эфир.

Описанный в п.d) способ предпочтительно осуществляют таким образом, что соединение общей формулы (IX) вводят во взаимодействие с незначительным избытком, например, 2-10-кратным избытком, диизоцианата, предпочтительно гексаметилен-диизоцианата. Реакцию проводят в хлороформе при температурах от 20°С до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре кипения растворителя. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 2 до 24 часов, предпочтительно, однако, 10-14 часов. Концетрация полимера в реакционной смеси составляет от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно от 30 г/л до 150 г/л. Продукт выделяют путем удаления растворителя при пониженном давлении и удаления избыточного диизоцианата путем многократной экстракции петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Этот промежуточный продукт вводят во взаимодействие с макромолекулой полиэтиленимина в молярном соотношении от 1:1 до 100:1. Реакцию проводят в хлороформе и, в случае, если необходимо, с добавлением диметилформамида при температурах от комнатной до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре 60-70°С. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 6 до 72 часов, предпочтительно, однако, она составляет 12 часов. Концентрации полимера, как концентрации полиэтиленимина, так и концентрации активированного с помощью гексаметилендиизоцианата неионного гидрофильного полимера, в реакционной смеси составляют от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно от 30 г/л до 200 г/л. Продукт выделяют путем осаждения полимера в 10-30-кратном избытке по объему диэтилового эфира.

По сравнению с полиэтиленимином новые соединения обладают следующими свойствами.

Блок-сополимеры в тесте на цитотоксичность проявляют более незначительную токсичность, чем гомополимеры полиэтиленимина, и дольше остаются в кровообращении (см. раздел «Биологические примеры»).

Блок-сополимеры, в зависимости от структуры, являются в большей или меньшей степени поверхностно-активными веществами, которые могут найти применение в качестве поверхностно-активных веществ.

Сверх того, блок-сополимеры можно также применять:

- в клеевых и лакокрасочных системах в качестве добавки;

- в качестве фиксаторов для повышения прочности бумаги;

- в качестве грунтовки для полимерных многослойных систем, как, например, многослойные упаковочные пленки;

- для модификации пластмасс (улучшение окрашиваемости, лакируемости, барьерного действия);

- для фиксации реактивных красителей на хлопке;

- в качестве средств для флокуляции и диспергаторов в случае находящихся во взвешенном состоянии высокодисперсных веществ в промышленных сточных водах;

- для связывания солей тяжелых металлов;

- для диспергирования органических и неорганических пигментов;

- в качестве добавки в керамических и цементных составных частях;

- для самых различных функций в косметике по уходу за кожей и волосами, а также в области стоматологии;

- для фиксации лекарственных биологически активных веществ или биологически активных соединений на поверхностях;

- для фильтрации эндотоксинов и патогенов из плазмы крови;

- для пенетрации через слизистую оболочку.

Кроме того, блок-сополимеры в водных системах образуют комплексы с полинуклеиновыми кислотами, как ДНК и РНК, включая рибозимы. Благодаря этому свойству они пригодны в качестве носителей или векторов для переноса генов (пенетрация через клеточные мембраны и транслокация в клеточные ядра). Вследствие этого они могут найти применение в экспериментах по трансфекции, в генной терапии и диагностике (см. раздел «Биологические примеры»).

Изобретение, следовательно, также относится к применению соединений формулы (I) или (II), которые указаны выше и в которых, кроме того, Y означает -С(O)NH(CH₂)_sNHC(О)О-, где s может означать 1-20, предпочтительно 2-10, в особенности 4-6, для комплексования полинуклеиновых кислот, как ДНК, РНК и рибозимов, в водных системах, а также к композициям, которые включают по меньшей мере одну такую нуклеиновую кислоту и одно соединение формулы (I) или (II).

Изобретение относится также к применению указанных в вышеприведенном абзаце соединений формулы (I) или (II) в качестве поверхностно-активных веществ.

Следующие примеры служат для пояснения изобретения, не ограничивая его объема.

ХИМИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение блок-сополимера PEI(PEG)_n

Активирование mPEG-550

В круглодонную колбу емкостью 100 мл, со стержнем магнитной мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем, вносят 10 мл хлороформа и смешивают с 7 мл (43,64 ммоль; 8 эквивалентов) гексаметилендиизоцианата (HMDI). 3 г (5,45 ммоль; 1 эквивалент) Монометилового эфира полиэтиленоксида (mPEG; М_n=550 г/моль) растворяют в 40 мл хлороформа. Этот раствор медленно при перемешивании добавляют по каплям к раствору HMDI. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12 часов. Затем растворитель удаляют при пониженом давлении и избыточный HMDI экстрагируют 5 раз по 50 мл петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Продукт получают с почти количественным выходом (3,9 г, 97%) в виде бесцветного жидкотекучего масла.

Получение блок-сополимера PEG с привитым PEI

В круглодонную колбу емкостью 100 мл, со стержнем магнитной мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем, вносят 1,74 г (0,1736 ммоль, 1 эквивалент) bPEI (M_w=25 кДа, М_n=10 кДа) и растворяют в 40 мл диметилформамида (ДМФА). 2,5 г (3,47 ммоль) активированного с помощью HMDI mPEG (М_n=720 Да) растворяют в 10 мл хлороформа и этот раствор при перемешивании медленно добавляют по каплям к раствору полиэтиленимина. Смесь нагревают при температуре 60-70°С в течение 12 часов. Затем смесь добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира. Спустя 2 часа выделяется вязкотекучее желтоватое масло. Мутный супернатант отбрасывают и масло растворяют в 30 мл этанола. Раствор снова добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира и снова выделившееся масло выделяют путем декантации. Продукт для фильтрации растворяют в этаноле и растворитель удаляют в вакуумной сушильной печи при температуре 50°С. Получают 2,8 г желтоватого, от вязкотекучего до смолообразного, масла (выход: 45%).

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹Н-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №1. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены подобные данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 1,17 (изоцианат-CH₂); 1,26 (изоцианат-CH₂); 2,30-2,72 (этиленимин-CH₂); 2,96 (изоцианат-CH₂); 3,15 (изоцианат-CH₂); 3,49 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 14,3 (изоцианат-CH₂); 26,2 (изоцианат-CH₂); 29,6 (изоцианат-CH₂); 36,2 (изоцианат-CH₂); 37,5 (этиленимин-CH₂); 39,1 (этиленимин-CH₂); 41,1 (изоцианат-CH₂); 47,2 (этиленимин-CH₂); 48,9 (этиленимин-CH₂); 52,8 (этиленимин-CH₂); 54,1 (этиленимин-CH₂); 58,7 (изоцианат-CH₂); 69,3 и 70,2 и 71,6 (этиленгликоль-CH₂); 156,2 (-NHC(O)O-); 161,7 (-NHC(O)NH-).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=8800; M_w=16400000; М_р=85000; PD=19,6; мономодальное распределение. Сравнение со смесью из PEI (Aldrich, 25 кДа) и mPEG (Aldrich, 550 Да): M_n=69000; M_w=1480000; М_р=99000 и 1100, PD=2,1; бимодальное распределение.

Исследования в отношении активности на поверхности раздела фаз полимера согласно примеру №1 осуществляли с помощью тензиометра по методу Lecomte du Nouy (кольцевой метод) при температуре 22°С. Измеряли поверхностное натяжение на границе раздела фаз раствора против воздуха. Калибровку прибора осуществляли с помощью сверхчистой воды, которую использовали в качестве растворителя для образца полимера.

Данные измерения: σ_min=51 мН/м; CMC=15 мг/мл.

Таким же образом могут быть получены (все исходные соединения получены от фирмы Aldrich):

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Полиэтиленимин	Гидрофильный неионный полимер	Молярное соотношение PEI:PEG	Структура блок-сополимера
2	IPI M_n примерно 423	mPEG M_n примерно 550	1:1	АВ-диблок
3			1:2	АВ-триблок
4	bPI M_w примерно 800	mPEG M_n примерно 550	1:1	АВ-диблок
5			1:2	АВ-триблок
6			1:4	звездообразный
7	bPI M_w примерно 800	mPEG M_n примерно 5000	1:1	АВ-диблок
8			1:2	АВ-триблок
9			1:4	звездообразный
10	bPI M_w примерно 2000	mPEG M_n примерно 550	1:1	АВ-диблок
11			1:2	АВ-триблок
12			1:4	звездообразный
13	bPI M_w примерно 2000	mPEG М_n примерно 5000	1:1	АВ-диблок
14			1:2	АВ-триблок
15	bPI M_w примерно 25000	mPEG M_n примерно 550	1:1	АВ-диблок
16			1:2	АВ-триблок
17			1:4	звездообразный
18			1:20	звездообразный
19	bPI M_w примерно 25000	mPEG M_n примерно 2000	1:1	АВ-диблок
20			1:2	АВ-триблок
21			1:4	звездообразный
22			1:10	звездообразный
23	bPI M_w примерно 25000	mPEG M_n примерно 5000	1:1	АВ-диблок
24			1:2	АВ-триблок
25			1:4	звездообразный
26			1:10	звездообразный

Пример 27

Получение блок-сополимера PEG(PEI)_n

Активирование разветвленного полиэтиленгликоля (PEG)

В круглодонной колбе емкостью 100 мл со стержнем магнитной мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем 3,79 г (22,54 ммоль, 80 эквивалентов) HMDI растворяют в 10 мл хлороформа. К раствору HMDI при перемешивании медленно добавляют по каплям раствор 2 г (0,2 ммоль, 1 эквивалент) разветвленного PEG с восемью ответвлениями (bPEG, M_w=10 кДа) в 20 мл хлороформа. Смесь кипятят в течение 4 часов и дополнительно перемешивают в течение следующих 8 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении и избыточный HMDI экстрагируют 3 раза по 50 мл петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Получают красноватое масло с 58%-ным выходом (1,38 г).

Получение блок-сополимера PEI с привитым PEG

В круглодонной колбе емкостью 100 мл, со стержнем магнитой мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем, 2,20 г (3,66 ммоль, 25 эквивалентов) разветвленного полиэтиленимина (bPEI, M_w=800 Да, M_n=600 Да) растворяют в 20 мл хлороформа. К раствору PEI при комнатной температуре при перемешивании медленно добавляют по каплям раствор 1,21 г (0,14 ммоль, 1 эквивалент) активированного с помощью HMDI bPEG (M_n=8,5 кДа) в 30 мл хлороформа. Смесь кипятят в течение 12 часов. Раствор затем при перемешивании медленно добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира. Спустя 12 часов выделяется вязкотекучее желтоватое масло. Мутный супернатант отбрасывают и масло растворяют в 50 мл этанола. Раствор снова добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира и снова выделившееся масло выделяют путем декантации. Продукт для фильтрации растворяют в этаноле и растворитель удаляют в вакуумной сушильной печи при температуре 50°С. Получают 1,13 г (выход 59%) желтоватого, от вязкотекучего до смолообразного, масла.

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹H-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №27. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены подобные данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 1,22 (изоцианат-CH₂); 1,36 (изоцианат-CH₂); 2,40-2,70 (этиленимин-CH₂); 3,03 (изоцианат-CH₂); 3,19 (изоцианат-CH₂); 3,55 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125 МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 25,9 (изоцианат-CH₂); 29,4 (изоцианат-CH₂); 39,2 (этиленимин-CH₂); 41,2 (изоцианат-CH₂); 47,0 (этиленимин-CH₂); 48,9 (этиленимин-CH₂); 52,0 (этиленимин-CH₂); 54,2 (этиленимин-CH₂); 61,1 (изоцианат-CH₂); 69,2 и 71,1 и 72,3 (этиленгликоль-CH₂); 156,0 (-NHC(O)O-); 162,1 (-NHC(O)NH-).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=22000; M_w=43000; М_р=31000; PD=1,9; мономодальное распределение. Сравнение со смесью из PEG с 8 ответвлениями (Shearwater, 10 кДа) и PEI (Aldrich, 800 Да): М_n=3100; M_w=15000; М_р=12000; PD=4,91; мономодальное распределение.

Исследования в отношении активности на поверхности раздела фаз полимера согласно примеру №27 осуществляли с помощью тензиометра по методу Lecomte du Nouy (кольцевой метод) при температуре 22°С. Измеряли поверхностное натяжение на границе раздела фаз раствора против воздуха. Калибровку прибора осуществляли с помощью сверхчистой воды, которую использовали также в качестве растворителя для образца полимера.

Данные измерения: σ_min=56 мН/м; CMC=12 мг/мл.

Таким же образом могут быть получены:

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Гидрофильный неионный полимер	Полиэтиленимин	Структура блок-сополимера
28	MPEG M_n примерно 5000 (Aldrich)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	АВ
29		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	АВ
30		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	АВ
31	LPEG M_n примерно 5000 (Aldrich)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	АВА
32		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	АВА
33		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	АВА
34	с 4 ответвлениями PEG MW примерно 15000 (Shearwater)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	АВ₄
35		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	АВ₄
36		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	АВ₄
37	с 8 ответвлениями PEG MW примерно 10000 (Shearwater)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	АВ₈
38		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	АВ₈
39		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	АВ₈
40	звездообразный-PEG 429 MW примерно 250000 (Shearwater)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	AB₁₃
41		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	AB₁₃
42		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	AB₁₃
43	α-циклодекстрин (Aldrich)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	AB₁₈
44		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	AB₁₈
45		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	AB₁₈
46	β-циклодекстрин (Aldrich)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	AB₂₁
47		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	AB₂₁
48		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	AB₂₁
49	γ-циклодекстрин (Aldrich)	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	AB₂₄
50		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	AB₂₄
51		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	AB₂₄
52	гидролизованный на 80% ПВА M_w=9000-10000	IPI M_n примерно 423 (Aldrich)	AB_n
53		bPI M_n примерно 800 (Aldrich)	AB_n
54		bPI M_n примерно 2000 (Aldrich)	AB_n

Пример 55

Получение сополимера полиэтиленгликоля и полиэтиленимина (способ с макрорегулятором)

В крутлодонную колбу емкостью 50 мл, со стержнем магнитной мешалки и обратным холодильником, вносят 1 г (0,2 ммоль) монометилированного полиэтиленгликоля (молекулярная масса = 5000 г/моль), который на другом конце цепи содержит аминогруппу, и растворяют в 20 мл дистиллированной воды. К этому раствору полимера добавляют 2 мл (39 ммоль) этиленимина. Полимеризацию начинают с помощью 200 мкл (2 ммоль) диметилсульфата в качестве инициатора и смесь нагревают при температуре 60°С в течение 8 дней. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, для того чтобы остающуюся массу снова растворить в 20 мл этанола. Раствор добавляют по каплям к 250 мл диэтилового эфира, причем полимер осаждается. Полимер выделяют путем отфильтровывания и путем выдерживания в течение 3 недель при температуре 50°С в вакуумном сушильном шкафу из него удаляют остатки растворителя. Получают 1,9 г (выход: 73%) слабо-желтоватого смолообразного полимера.

Таким же образом могут быть получены (все аминомодифицированные полиэтиленгликоли получены от фирмы RAPP Polymere, Тюбингем):

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Полиэтиленгликоль	Полиэтиленимин	Молярное соотношение EG:EI^*)	Структура блок-сополимера
56	CH₃O-PEG-NH₂ M_n примерно 2000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
57			1:2	АВ-диблок
58			1:10	АВ-диблок
59	CH₃O-PEG-NH₂ M_n примерно 5000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
60			1:10	АВ-диблок
61	CH₃O-PEG-NH₂ M_n примерно 10000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
62			1:2	АВ-диблок
63			1:10	АВ-диблок
64	CH₃O-PEG-NH₂ M_n примерно 20000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
65			1:2	АВ-диблок
66			1:10	АВ-диблок
^*): EG = этиленгликоль, EI = этиленимин

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹Н-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №56. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены очень похожие данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, D₂O): δ (м.д.) = 2,60-3,00 (этиленимин-CH₂); 3,78 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125 МГц, D₂O): δ (м.д.) = 38,2 (этиленимин-CH₂); 39,9 (этиленимин-CH₂); 46,2 (этиленимин-CH₂); 47,9 (этиленимин-CH₂); 51,7 (этиленимин-CH₂); 53,4 (этиленимин-CH₂); 54,8 (этиленимин-CH₂); 70,2 (этиленгликоль-CH₂).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=21000; M_w=40000; М_р=16000; PD=1,9; мономодальное распределение. Сравнение с СН₃О-PEG-NH₂ (RAPP Polymere; 5000 Да): М_n=9100; M_w=14000; М_р=16000; PD=1,6; мономодальное распределение.

Пример 67

Получение сополимера полиэтиленимина и полиэтиленгликоля (способ с макроинициатором)

Получение макроинициатора

В круглодонную колбу емкостью 50 мл, со стержнем магнитной мешалки и обратным холодильником, вносят 2 г (0,4 ммоль, 1 эквивалент) монометилового эфира полиэтиленгликоля (Aldrich; молекулярная масса 5000) и растворяют в 25 мл перегнанного хлороформа. К раствору полимера при перемешивании добавляют 0,31 г (1,6 ммоль, 4 эквивалента) тозилхлорида. Затем к смеси добавляют 0,22 мл (0,16 г, 1,6 ммоль, 4 эквивалента) триэтиламина в качестве катализатора. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 18 часов. Для выделения и очистки полимера раствор выливают в 500 мл диэтилового эфира. Выпавший в осадок полимер отфильтровывают, дополнительно промывают большим количеством диэтилового эфира и высушивают в вакууме. Получают 1,90 г (выход: 91%) хлопьеобразного вещества белого цвета.

Получение блок-сополимера полиэтиленимина и полиэтиленгликоля

В круглодонную колбу емкостью 25 мл, со стержнем магнитной мешалки и обратным холодильником, вводят 0,5 г (0,096 ммоль, 1 эквивалент) макроинициатора и растворяют в 10 мл дистиллированной воды. При перемешивании добавляют по каплям 1 мл (0,832 г, 19,32 ммоль, 200 эквивалентов) этиленимина и смесь нагревают при температуре 60°С в течение 24 часов. Летучие компоненты удаляют при пониженном давлении. Остается смолообразное вещество белого цвета, которое снова растворяют в 10 мл воды и осаждают с помощью 200 мл тетрагидрофурана. Полимер выделяют путем декантации и высушивают в вакууме. Получают 0,95 г (выход: 71%) желтоватого смолообразного вещества.

Таким же образом могут быть получены (все монометилполиэтиленгликоли получены от фирмы Aldrich):

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Полиэтиленгликоль	Полиэтиленимин	Молярное соотношение EG:EI ^*)	Структура блок-сополимера
68	СН₃О-PEG-тозил М_n примерно 750	этиленимин	1:10	АВ-диблок
69			1:50	АВ-диблок
70			1:200	АВ-диблок
71	СН₃О-PEG-тозил М_n примерно 550	этиленимин	1:10	АВ-диблок
72			1:50	АВ-диблок
73			1:200	АВ-диблок
74	СН₃О-PEG-тозил М_n примерно 2000	этиленимин	1:10	АВ-диблок
75			1:50	АВ-диблок
76			1:200	АВ-диблок
77	СН₃О-PEG-тозил М_n примерно 5000	этиленимин	1:10	АВ-диблок
78			1:50	АВ-диблок
^*): EG = этиленгликоль; EI = этиленимин

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹Н-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №67. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены очень похожие данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, D₂O): δ (м.д.) = 2,80-3,20 (этиленимин-CH₂); 3,80 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125 МГц, D₂O): δ (м.д.) = 37,9 (этиленимин-CH₂); 39,4 (этиленимин-CH₂); 46,1 (этиленимин-CH₂); 47,2 (этиленимин-CH₂); 51,3-52,7 (этиленимин-CH₂); 70,2 (этиленгликоль-CH₂).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=35000; M_w=90000; М_р=52000; PD=2,6; мономодальное распределение. Сравнение с СН₃О-РЕС-тозил (5000 Да): М_n=4800; М_w=7600; М_р=8600; PD=1,6; мономодальное распределение.

Сокращения

bPEG разветвленный полиэтиленгликоль

bPEI разветвленный полиэтиленимин

CMC критическая концентрация мицеллообразования

DMF диметилформамид

HMDI гексаметилендиизоцианат

lPEG линейный полиэтиленгликоль

lPEI линейный полиэтиленимин

М_n среднечисловая молекулярная масса

М_р пик молекулярной массы

mPEG монометоксиполиэтиленгликоль

M_w среднемассовая молекулярная масса

MW неопределенное среднее значение молекулярной массы

PD полидисперсность

Ts тозил

σ_min минимальное поверхностное натяжение

Биологические примеры

I. Эксперименты по трансфекции

Трансфекционные свойства полимеров PEI(PEG)₂₀ (пример 1) и PEG(PEI)₈ (пример 27) исследовали при использовании клеточной линии 3Т3. Осуществляли посев 50000 клеток на лунку в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла + 2 мМ глутамина + 10% фетальной телячьей сыворотки; 37°С, 10% CO₂). Затем среду заменяли. На лунку, соответственно, комплексовали 4 мкг плазмиды pGL3 в 100 мкл 150 мМ раствора хлорида натрия с соответствующим количеством полимера в 100 мкл 150 мМ раствора хлорида натрия и спустя 10 минут добавляли к клеткам. Спустя 4 часа среду снова заменяли, спустя 48 часов осуществляли оценку. Экспрессию люциферазы определяли с помощью набора для анализа люциферазы фирмы Promega на люминометре Berthold Sirius. Концентрацию протеина количественно определяли с помощью модифицированного ВСА теста. Указанные данные представляют собой, соответственно, среднее значение из трех лунок ± стандартное отклонение для соответствующих соотношений азот:фосфор.

Пример 1: [PEI(PEG)₂₀]

Данные измерений:

N/P 5: 0,0057±0,0036 нг/мг протеина

N/P 10: 0,1786±0,1522 нг/мг протеина

N/P 20: 0,6952±0,5498 нг/мг протеина

N/P 50: 5,1963±2,6863 нг/мг протеина

(только плазмида: 0,0000±0,00004 нг/мг протеина)

Пример 27: [PEG(PEI)₈]

Данные измерений:

N/P 5: 0,0024±0,0012 нг/мг протеина

N/P 10: 0,0045±0,0046 нг/мг протеина

N/P 20: 0,0109±0,0078 нг/мг протеина

N/P 50: 0,0765±0,0498 нг/мг протеина

(только плазмида: 0,0000±0,00004 нг/мг протеина)

В обоих случаях можно определять экспрессию гена на основании осуществленной трансфекции. При этом [PEI(PEG)₂₀] обладает отчетливо более высокой трансфекционной эффективностью, чем [PEG(PEI)₈].

II. Определение in vitro цитотоксичности с помощью теста с ММТ

Сополимеры согласно примерам 1 и 27 исследовали в отношении их цитотоксичности на модели клеточной культуры с помощью теста с ММТ по методу Mosmann (J.Immunol. Methods, 65, 55-63 (1983) ). Мышиные фибробласты L929 в количестве 8000 на лунку в 96-луночном планшете предварительно инкубировали в течение 24 часов и обрабатывали растворами полимеров различных концентраций в течение 3, 12 и 24 часов. Митохондриальную активность определяли путем превращения красителя МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолийбромид] в формазан, который количественно оценивали спектрофотометрически. Полимеры использовали в виде растворов в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 10% фетальной телячьей сыворотки в пяти различных концентрациях. В случае, если необходимо, устанавливали значение рН, равное 7,4, и образцы стерилизовали при фильтрации (0,2 мкм). Смеси получали путем смешения обоих отдельных компонентов (за вычетом количества спейсера). Для оценки определяли клеточную жизнеспособность [%] по отношению к используемым концентрациям полимера, а также ИК₅₀ (ингибирующая на 50% концентрация).

Результат:

- цитотоксичность in vitro свободных полимеров возрастает с увеличением концентрации полимера и увеличением продолжительности инкубации;

- сополимер согласно примеру 1: токсичность смеси отдельных компонентов PEI (25 кДа) и PEG (550 Да) соответствует токсичности свободного PEI (25 кДа). За счет ковалентного связывания обоих компонентов отчетливо улучшается совместимость. Спустя 24 часа профиль токсичности, правда, еще соответствует таковому отдельных компонентов и вместе с тем профилю свободного PEI (25 кДа), при более коротких фазах инкубации, напротив, цитотоксичность снижается. Благодаря слою PEG маскируется положительный заряд полиэтиленимина и вместе с тем уменьшаются опросредованные зарядом воздействия на клеточные мембраны;

- сополимер согласно примеру 27: смесь обоих отдельных компонентов PEI (700 Да) и PEG (10 кДа) вплоть до концентрации 10 мг/мл не вызывает никакого снижения жизнеспособности клеток. В той же области концентраций сополимер вызывает повышенное ограничение клеточной жизнеспособности спустя 3, 12 и 24 часа, что можно объяснить молекулярно-массовым распределением;

- при сравнении полимер согласно примеру 27 обладает более незначительной цитотоксичностью, чем полимер согласно примеру 1.

III. Определение in vitro цитотоксичности с помощью теста с лактатдегидрогеназой (LDH)

Производили посев мышиных фибробластов L929 при такой же плотности клеток, как в тесте с МТТ, в 6-луночные планшеты, предварительно инкубировали в течение 48 часов и инкубировали с растворами полимеров (в забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,4) в течение 1, 2, 3 и 6 часов. Внеклеточную долю LDH количественно оценивали с помощью стандартного набора (Sigma, DG-1340-K) путем фотометрического определения восстановления никотинамидаденин-динуклеотида (NAD) в присутствии лактата и LDH. Для определения 100%-ного значения клетки лизировали с помощью 0,1% Тритон-Х 100.

Результат

Тест с LDH подтверждает результаты теста с МТТ. Корреляция обоих тестов показывает, что происходит прежде всего повреждение мембран и замедленное по времени снижение метаболической активности. С увеличивающейся продолжительностью инкубации и концентрации полимера усиливается повреждающее мембраны действие полимеров.

IV. Связывание ДНК с сополимерами, определяемое с помощью электрофореза в агарозном геле

Способность связывания сополимеров согласно примерам 1 и 27 определяли электрофоретически с помощью 1%-ных агарозных гелей при напряжении 80 вольт. Локализацию плазмид (CMV-nlacZ) осуществляют с помощью УФ-возбуждения при 254 нм после окрашивания этидиумбромидом.

Результат:

- оба полимера способны электростатически взаимодействовать с плазмидой;

- при совпадении со смесью полимер согласно примеру 1 способен полностью связывать плазмиду начиная с соотношения азот PEI/фосфат-ДНК (соотношение N/P), составляющего 1,1. Наблюдаемое в случае смеси исключение этидиумбромида (начиная с соотношения N/P=5,8), признак интенсивной конденсации ДНК, является неполным вплоть до соотношения N/P=23,0 для сополимера;

- в то время как для смеси согласно примеру 27 можно наблюдать полное связывание плазмиды, лишь начиная с соотношения N/P=4,1, и никакого полного исключения этидиумбромида, сополимер связывается с плазмидой начиная с соотношения N/P=2,4 и вызывает исключение красителя, начиная с соотношения N/P=16,6.

V. Тест в отношении агрегации эритроцитов

Эритроциты выделяли из нитратной крови крыс Wistar по методу Parnham и Wetzig (Chem. Phys. Lipids, 64, 263-274 (1993)), производили их посев в 24-луночные планшеты и инкубировали в течение 2 часов с тестируемыми растворами при температуре 37°С. С помощью микроскопа исследовали агрегацию и адгезию эритроцитов под действием полимера. В качестве контроля служили необработанные эритроциты.

Результат:

- свободный сополимер согласно примеру 1 при концентрациях 0,27-18 мкг на лунку по сравнению со смесью и с PEI (25 кДа) вызывал уменьшенную агрегацию и адгезию эритроцитов в чашках для клеточных культур. В то время как при низких концентрациях (0,27-0,7 мкг/лунка) не наблюдали никаких значительных различий, с повышающейся концентрацией можно определить отчетливое различие между сополимером и смесью соответственно PEI (25 кДа). Эффект агрегации увеличивается при возрастающем соотношении N/P;

- сополимер согласно примеру 27 обладал противоположным поведением. Агрегация за счет смеси или, соответственно, свободного PEI выражена слабее, чем агрегация в случае сополимера;

- за счет комплексования с плазмидной ДНК в случае обоих сополимеров значительно уменьшается агрегация эритроцитов по сравнению со свободным полимером.

VI. Тест на гемодиз

Эритроциты выделяли из цитратной крови крыс Wistar по методу Parnham и Wetzig (Chem. Phys. Lipids, 64, 263-274 (1993)), смешивали с растворами полимеров и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. Эритроциты осаждали путем центрифугирования в течение 10 минут при температуре 25°С и ускорении 700 g и фотометрически при 540 нм определяли гемолизат в супернатанте.

Результат:

- отдельные компоненты PEG с 8 ответвлениями, PEG (500 Да) и PEI (700 Да) в области концентраций 0,001-10 мг/мл не проявляют никаких значительных гемолитических эффектов (все 1-3%);

- сополимер согласно примеру 27 в той же области концентраций также не проявляет никаких ярко выраженных эффектов (<5%);

- в случае отдельного компонента PEI (25 лДа), а также смеси согласно примеру 1 гемолитическая активность возрастает при концентрации 0,001-10 мг/мл (22,13% при концентрации 10 мг/мл);

- сополимер согласно примеру 1 вплоть до концентрации 0,5 мг/мл обладает возрастающей гемолитической активностью вплоть до 13,30%, при более высокой концентрации вплоть до 10 мг/мл гемолитический эффект снова снижается (2,90% при концентрации 10 мг/мл).

VII. Фармакокинетика и распределение в органах мыши комплексов полимер-ДНК

Фармакокинетику и распределение в органах сополимеров согласно примерам 1 и 27 определяли в случае мышей balb/c. Полимеры радиоактивно метили с помощью содержащего ¹²⁵I реагента Bolton Hunter (Pharmacia Biotech). Соответственно, долю 0,4 мг или 0,04 мг или 0,008 мг PEI на кг массы мыши комплексовали с соответствующим количеством олигодезоксинуклеотида (ODN) NF-kB decoy при соотношении азот/фосфор (N/P) 3,5 или 6 в общем объеме 80 мкл 5%-ного раствора глюкозы и спустя 10 минут вводили путем инъекции мышам через подключечную вену. Спустя 20 секунд, 1, 2, 5, 15, 30, 60, 90 и 120 минут брали пробы крови через катетер из Arteria Aorta communs. Через катетер для мочевого пузыря собирали мочу в течение 120 минут. Спустя 120 минут мышей декапитировали и извлекали органы: кору головного мозга, почки, печень, сердце, легкие, селезенку и жировую ткань. Количество полимера в образцах определяли путем измерения радиоактивности с помощью 1277 гамма-эталонированного автоматического гамма-счетчика (LKB Wallac).

Данные оценивали с помощью программы «Кинетика 1.1» и двухсекционной системы для быстрой внутривенной инъекции больших объемов жидкости. Из кривых уровня крови рассчитывали объем распределения (V_c), константу элиминирований (k_el) и AUC. В случае трех оцениваемых животных указаны среднее значение ± стандартное отклонение, в случае двух животных указаны средние величины, в случае только одного животного указано значение в скобках.

Получение комплексов и дозировки:

Полимер	N/P	Доза [мг/кг]	V_c [мл]	k_el [мин-¹]	AUC [мин. мкг. мл-¹]
PEI (25 кДа)	3,5:1	0,4	23,39	0,106	4,89
пример 1	3,5:1	0,4	(4,54)	(0,028)	(79,03)
пример 27	3,5:1	0,4	5,84±0,4	0,104±0,017	16,86±1,64
PEI (25 кДа)	6:1	0,4	5,39	0,099	19,22
PEI (25 кДа)	6:1	0,04	1,37±0,2	0,14±0,026	6,22±1,18
PEI (25 кДа)	6:1	0,008	9,57±1,78	0,063±0,009	0,34±0,1
пример 1	6:1	0,4	6,20	0,067	27,84
пример 1	6:1	0,04	3,37±0,32	0,072±0,01	4,0±0,67
пример 1	6:1	0,008	5,1±0,55	0,054±0,004	0,80±0,10
пример 27	6:1	0,4	8,12	0,0593	21,72

Результат:

- наблюдения при более низкой дозе указывают на более слабую токсичность PEI(PEG)₂₀ по сравнению с PEI (25кДа);

- уровень плазмы в случае всех полимеров может быть описан с помощью двухсекционной системы;

- сополимеры имеют более высокий AUC, а также меньший объем распределения, чем PEI (25 кДа). PEI(PEG)₂₀ (пример 1) оказывает большее воздействие, чем PEG(PEI)₈ (пример 27);

- в случае сополимеров элиминирование уменьшено;

- V_c и k_el не показывают никакой заметной зависимости от дозы;

- рассчитанное значение AUC для PEI (25 кДа) и сополимера согласно примеру 1 пропорционально дозе, наклон прямых зависимости AUC/доза больше в случае сополимера согласно примеру 1;

- основными органами распределения спустя 120 минут были печень, почки и селезенка. В случае комплексов с соотношением 6:1 сополимеры по сравнению с PEI (25 кДа) обладают уменьшенным проникновением в печень и селезенку, а также более высоким проникновением в почки.

Claims

1. Соединение формулы (I) или (II):

где

А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 100 до 10000000, содержащий такие остатки, как остаток линейного полиэтиленгликоля, многократно разветвленного полиэтиленгликоля, звездообразного полиэтиленгликоля, полисахаридов, поливинилового спирта;

В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин (PEI) с молекулярной массой от 100 до 1000000;

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=1-20;

-OC(O)NH(арил)NHC(O)-, где арил означает ароматическую структурную единицу;

-O(СН₂)_рС(O)-, где р=1-10;

-ОС(О)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-20;

n означает целое число 1-200;

С означает линейный или разветвленный полиэтиленимин с молекулярной массой от 100 до 1000000;

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

где n' означает 3-25000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток или защитную для ОН группу;

-C(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает ароматическую структурную единицу;

-(СН₂)_tC(O)O-, где t=2-10;

-CH₂CH(OH)CH₂O- или

-(СН₂)_uО-, где u=1-20;

и m означает целое число 1-200;

2. Соединение формулы (I) или (II) по п.1, в котором:

А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 1000 до 100000;

В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин (PEI) с молекулярной массой от 400 до 100000;

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=2-10;

-OC(O)NH(арил)NHC(O)-, где арил означает ароматическую структурную единицу с одним ядром;

-O(СН₂)_рС(O)-, где р=1-3;

-OCH₂CH(OH)CH₂-;

-ОС(O)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-6;

n означает целое число 1-50;

С означает линейный или разветвленный полиэтиленимин с молекулярной массой от 400 до 100000;

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

где n' означает 10-5000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток или защитную для ОН группу;

-C(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает ароматическую структурную единицу с одним ядром;

-(CH₂)_tC(O)O-, где t=2-3;

-CH₂CH(OH)CH₂O- или

-(СН₂)_uО-, где u=1-6;

и m означает целое число 1-100,

3. Соединение формулы (I) или (II) по п.1 или 2, в котором

А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 5000 до 50000;

В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин (PEI) с молекулярной массой от 400 до 50000;

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=4-6;

-OC(O)NH(арил)NHC(O)-, где арил означает толил;

-O(СН₂)_рС(O)-, где р=1;

-OCH₂CH(OH)CH₂-;

-ОС(O)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-3;

n означает целое число 1-12;

С означает линейный или разветвленный полиэтиленимин с молекулярной массой от 400 до 50000;

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

где n' означает 10-1000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток или защитную для ОН группу;

-C(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает толил;

-(СН₂)_tC(О)О-, где t=2;

-CH₂CH(OH)CH₂O- или

-(СН₂)_uО-, где u=1-3;

и m означает целое число 1-50,

4. Соединение по любому из пп.1-3, в котором Х означает мостик формулы -OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-.

5. Соединение формулы (II) по пп.1-4, применяемое для образования комплексов полинуклеиновых кислот в водных системах, в котором Y означает мостик формулы

-C(O)NH(CH₂)_sNHC(O)O-,

где s=1-10.

6. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что

а) соединение общей формулы

А-(ОН)_n, (V)

где А и n имеют значение, указанное для формулы (I), вводят во взаимодействие с диизоцианатом, и образующееся в результате этого соединение вводят во взаимодействие с полиэтиленимином; или

b) к соединению общей формулы

где А и n имеют значение, указанное для формулы (I), добавляют этиленимин и проводят полимеризацию; или

c) к соединению общей формулы

где А имеет указанное для формулы (I) значение и R⁴ означает алифатический или ароматический остаток, добавляют этиленимин и проводят полимеризацию.

7. Способ получения соединений формулы (II) по любому из пп.1-3 и 5, отличающийся тем, что соединения общей формулы

где D имеет указанное для формулы (II) значение, сначала вводят во взаимодействие с диизоцианатом и затем полученное соединение вводят во взаимодействие с линейным или разветвленным полиэтиленимином.

8. Комплексообразователь полинуклеиновых кислот формулы

где

А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 100 до 10000000;

Х означает прямую связь блоков, А и В или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина:

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=1-20;

-O(СН₂)_рС(O)-,где р=1-10;

-ОС(O)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-20;

n означает целое число 1-200;

D означает остаток связанного через О полиэтиленгликоля формулы

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

-C(O)NH(CH₂)_s,NHC(O)O-, где s означает 1-20;

-(СН₂)_tС(O)O-, где t=2-10;

-CH₂CH(OH)CH₂O- или

-(СН₂)_uО-, где u=1-20-;

и m означает целое число 1-200,

9. Комплексообразователь формулы (I) или (II) по п.8, где

В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин

(PEI) с молекулярной массой от 400 до 100000;

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=2-10;

-O(СН₂)_рС(O)-, где р=1-3;

-OCH₂CH(OH)CH₂-;

-OC(O)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-6;

n означает целое число 1-50;

D означает остаток связанного через О полиэтиленгликоля формулы: -(CH₂CH₂O)_n'-R¹, где n' означает 10-5000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток или защитную для ОН группу;

-C(O)NH(CH₂)_sNHC(O)O-, где s означает 2-10;

-(CH₂)_tC(O)O-, где t=2-3;

-CH₂CH(OH)CH₂O- или

-(СН₂)_uО-, где u=1-6;

и m означает целое число 1-100,

10. Комплексообразователь формулы (I) или (II) по п.8 или 9, где

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=4-6;

-OC(O)NH(арил)NHC(O)-, где арил означает толил;

-O(СН₂)_рС(O)-, где р=1;

-OCH₂CH(OH)CH₂-;

-ОС(O)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-3;

n означает целое число 1-12;

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

-C(O)NH(CH₂)_sNHC(O)O-, где s означает 4-6;

-C(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает толил;

-(CH₂)_tC(O)O-, где t=2;

-CH₂CH(OH)CH₂O- или

-(СН₂)_uО-, где u=1-3;

и m означает целое число 1-50,

11. Композиция для проведения трансфекции, включающая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту и одно соединение формулы (I) или (II) по любому из пп.8-10.