JP2003522948A - ウイルス融合インヒビターの検出のための分析 - Google Patents

ウイルス融合インヒビターの検出のための分析

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＩＶ−１等のエンベロープウイルスによる細胞の感染を阻害または予防する化合物の、これら細胞とのウイルス融合に必要なウイルス膜タンパク質における立体構造変化を阻止または破壊することによる同定方法、およびそのような同定方法によって発見された化合物に関する。本発明はさらに、ウイルスに感染した人においてウイルス侵入過程を阻害する抗体を検出するための診断的分析として、これら分析方法の使用を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 本発明は、ＨＩＶ−１等のエンベロープウイルスによる細胞の感染を阻害また
は予防する化合物の同定方法、およびそのような方法によって発見された化合物
に関する。本発明は、さらに、ウイルス感染した人におけるウイルスの侵入過程
を阻害する抗体を検出するための診断的分析として、これら方法を使用すること
を含む。
【０００２】 従来の技術 ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、１６０ｋＤａの糖タンパク質であり
、開裂して膜貫通（ＴＭ）サブユニットであるｇｐ４１を形成し、これは表面（
ＳＵ）サブユニットであるｇｐ１２０に非共有的に会合する（Allan J. S., et
al., Science 228 : 1091-1094 (1985) ; Veronese F. D., et al., Science 22
9 : 1402-1405 (1985)）。近年の努力によって、ＨＩＶ−１エンベロープ系の構
成要素に関する理解がより明確になった。そのような努力として、ｇｐ１２０お
よびｇｐ４１両方のクリティカルな部分の結晶構造解析が挙げられる（Kwong, P
. D., et al., Nature (London) 393 : 648-659 (1998) ; Chan, D. C., et al.
, Cell 89 : 263-273 (1997) ; Weissenhorn, W., et al., Nature 387 : 426-4
30 (1997)）。
【０００３】 表面サブユニットは、細胞受容体ＣＤ４（アミノ酸残基１〜１８１を含むＮ末
端ドメイン１および２）の可溶型に結合したＳＵタンパク質（可変ループが存在
しないｇｐ１２０コア）と、ケモカインレセプター結合をブロックする中和抗体
の抗原結合フラグメント（１７ｂモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸残基１〜
２１３および重鎖の１〜２２９）からなる複数の構成要素の複合体部分として特
徴付けられている（Kwong, P. D., et al., Nature (London) 393 : 648-659 (1
998)）。結晶構造解析により、ケモカインレセプターに対する保存的な結合部位
、ＣＤ４誘発エピトープ、および空洞を有するＣＤ４−ｇｐ１２０インターフェ
ースを含む、ｇｐ１２０の融合活性型においてのみ存在すると考えられているい
くつかのエンベロープ構成要素が明らかとなった。これは、ＣＤ４で誘発される
ｇｐ１２０の構造変化に関する、それまでの観察結果を裏付けるものである。
【０００４】 ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体は、ウイルスの接着と融合を媒介するビリオン表
面で三量体として存在する。ＨＩＶ−１複製は、細胞レセプターＣＤ４に対する
ｇｐ１２０の高い親和性の結合によって開始され、この受容体の発現は、in viv
oでのＨＩＶ−１の細胞親和性の第１の決定因子である（Dalgleish, A. G., et
al., Nature 312 : 763-767 (1984) ; Lifson, J. D., et al., Nature 323 : 7
25-728 (1986) ; Lifson, J. D., et al., Science 232 : 1123-1127 (1986) ;
McDougal, J. S., et al., Science 231 : 382-385 (1986)）。ＣＤ４のｇｐ１
２０結合部位は、この４ドメインタンパク質のＮ末端Ｖ１ドメインのＣＤＲ２領
域に位置している（Arthos, J., et al., Cell 5 : 469-481 (1989)）。ｇｐ１
２０のＣＤ４結合部位は、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４ドメインを含むｇｐ１２０の不
連続な領域に位置している（Olshevsky, U., et al., Virol 64 : 5701-5707 (1
990) ; Kwong, P. D., et al., Nature (London) 393 : 648-659 (1998)）。Ｃ
Ｄ４への接着の後、ウイルスは、融合過程を開始するために、ケモカインレセプ
ターのような「第２の」レセプターと相互作用しなければならない。最近、研究
者たちによって、ＨＩＶの侵入におけるケモカインレセプターファミリーの一員
の重要な役割が同定された（McDougal J. S., et al., Science 231 : 382-385
(1986) ; Feng Y., et al., Science 272 : 872-877 (1996) ; Alkhatib G., et
al., Science 272 : 1955-1958 (1996) ; DoranzB. J., et al., Cell 85 : 11
49-1158 (1996) ; Deng H., et al., Nature 381
: 661-666 (1996) ; Dragic T., et al., Nature 381 : 667-673 (1996) ; Cho
e H., et al., Cell 85 : 1135-1148 (1996) ; Dimitrov D. S., Nat. Med. 2 :
640-641 (1996) ; Broder, C. C. and Dimitrov, D. S., Pathobiology 64 : 1
71-179 (1996)）。ＣＣＲ５は、マクロファージ親和性で、多くのＴ細胞親和性
ＨＩＶ−１初代単離株が利用するケモカインレセプターである。大部分のＴ細胞
系に適した株はＣＸＣＲ４を利用するが、多くのＴ細胞親和性単離株はデュアル
トロピックであり、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方を利用することができる。
【０００５】 ＣＤ４およびケモカインレセプターに対するｇｐ１２０の結合によって、ＨＩ
Ｖエンベロープ系内の一連の構造変化が開始される（Eiden, L. E. and Lifson,
J. D., Immunol. Today 13 : 201-206 (1992) ; Sattentau, Q. J. and Moore
J. P., J. Exp. Med. 174 : 407-415 (1991) ; Allan J. S., et al., AIDS Res
Hum Retroviruses 8 : 2011-2020 (1992) ; Clapham, P. R., etal., J. Virol
. 66 : 3531-3537 (1992)）。これらの変化は、表面サブユニットと膜貫通サブ
ユニットの両方において起こり、ウイルス進入に必要なエンベロープ構造の形成
をもたらす。ｇｐ４１とｇｐ１２０の機能は、膜融合が促進されるようなウイル
スと細胞膜を近づける位置取りに関係しているようである（Bosch M. L., et al
., Science 244 : 694-697 (1989) ; Slepushkin, V. A. et al., AIDS Res Hum
Retroviruses 8 : 9-18 (1992) ; Freed E. O. et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87 : 4650-4654 (1990)）。
【０００６】 多くの構造の情報が、ＨＩＶ−１膜貫通糖タンパク質（ｇｐ４１）に関して入
手できる。このタンパク質は、数多くのよく特徴付けられた機能的な領域を含ん
でいる。ＦＩＧ．３を参照。例えば、Ｎ末端領域は、標的細胞膜への挿入とその
破壊によって機能すると考えられている、融合ペプチドと呼ばれる、グリシンに
富む配列からなる（Bosch, M. L., et al., Science 244 : 694-697 (1989) ; S
lepushkin, V. A., et al., AIDS Res. Hum. Retrovirus 8 : 9-18 (1992) ; Fr
eed, E. O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 4650-4654 (1990) ; M
oore, J. P., et al.,"The HIV-cell Fusion Reaction,"in Viral Fusion Mecha
nism, Bentz, J., ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL）。ジスルフィド結
合したシステイン残基の存在によって特徴付けられる別の領域は、免疫優性（im
munodominant）であることが示されており、表面（ｇｐ１２０）および膜貫通糖
タンパク質のための接触部位として示唆されている（Gnann, J. W., Jr., etal.
, J. Virol. 61 : 2639-2641 (1987) ; Norrby, E., etal., Nature 329 : 2482
50 (1987) ; Xu, J. Y., et al., J. Virol. 65 : 4832-4838 (1991)）。ｇｐ４
１外部ドメインの他の領域は、中和の回避（Klasse, P. J., et al., Virology
196 : 332-337 (1993) ; Thali, M., et al., J. Virol. 68 : 674-680 (1994)
; Stern, T. L., et al., J. Virol. 69 : 1860-1867 (1995)）、免疫抑制（Cia
nciolo, G. J., et al., Immunol. Lett. 19 : 7-13 (1988) ; Ruegg, C. L., e
t al., J. Virol. 63 : 3257-3260 (1989)）、および標的細胞の結合（Qureshi,
N. M., et al., AIDS 4 : 553-558 (1990) ; Ebenbichler, C. F., etal., AID
S 7 : 489-495 (1993) ; Henderson, L. A. and Qureshi, M. N., J. Biol. Che
m. 268 : 15291-15297 (1993)）に関係している。
【０００７】 最近の研究によって、ＨＩＶ−１膜貫通糖タンパク質の構造成分の知見は増し
たが、ｇｐ４１の免疫原性の性質については、依然としてほとんど理解されてい
ない。ＨＩＶ−１エンベロープ複合体に存在する２つの主要抗原領域のうちの１
つは、ｇｐ４１に存在することが知られている（Xu, J. Y., et al., J. Virol.
65 : 4832-4838 (1991)）。この領域（ＴＭ残基５９７〜６１３）は、多くのＨ
ＩＶ＋の人における、強力であるが中和はしない、体液性応答に関連している。
【０００８】 ｇｐ４１の外部ドメインの２つの領域が、ウイルス侵入に重要であることが示
されている。一次配列の解析から、これらの領域（Ｎ−ヘリックス（ＨＩＶLAI
配列の残基５５８〜５９５）およびＣ−ヘリックス（ＨＩＶLAI配列の残基６４
３〜６７８）と呼ばれる）は、αヘリックス型二次構造を形成すると予想された
。以前の合成ペプチド模倣体の構造研究に端を発する実験的努力によって、配列
解析による予想は一般に正確であることが確立された（Wild, C., et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10537-10541 (1992) ; Wild, C. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 9770-9774 (1994) ;
Gallaher, W. R., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 5 : 431-440 (1989)
; Delwart, E. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 6 : 703-704 (1990)
）。その後の構造解析によって、膜貫通タンパク質のこれらの領域は、三量体の
６個ヘリックス束（six-helix bundle）として特徴づけられる高次構造を形成す
る、特定の様式で相互作用することが決定付けられた（Chan, D. C., etal., Ce
ll 89 : 263-273 (1997) ; Weissenhorn, W., et al.,Nature 387 : 426-430 (1
997)）。この三量体構造は、内部の平行のコイルドコイル三量体コア（領域１、
Ｎヘリックス）からなり、そのコイルドコイル三量体の表面で疎水性の溝に逆向
きに平行して斜めに束なった３つの同一のαヘリックス（領域２、Ｃ−ヘリック
ス）と会合している。この疎水性の自己構築性ドメインは、ｇｐ４１のコア構造
を構成していると考えられている。ＦＩＧ．４Ａおよび４Ｂ参照。膜貫通タンパ
ク質のＮ−およびＣ−ヘリックス領域は、ＨＩＶ−１の侵入に重要であることが
示されている。６個ヘリックス束のコア構造を形成するこれら２つの領域の会合
は、ｇｐ４１の非フソジェニックから融合活性型への遷移する間に起きること、
そしてこのコア構造の形成は、ウイルスと標的細胞表面とを架橋して近づけるこ
とにより、膜融合を促進すると提案されている（Chan, D. C. and Kim, P. S.,
Cell 93 : 681-684 (1998) ; FIG.1）。これが正しければ、６個ヘリックス束の
形成はウイルスの進入におけるクリティカルな段階であり、その形成を妨害する
因子はその侵入事象を破壊し得る。数多くのウイルスは、ＨＩＶ膜貫通タンパク
質のＮ−およびＣ−ヘリックス領域に類似した糖タンパク質の構造を共有してい
る（Lambert et al., Proc. Nat. Acad Sci. 93 : 2186-2191 (1996)）。ＰＣＴ
出願公開ＷＯ９６／１９４９５も参照。
【０００９】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の処置のための承認されている薬物はす
べて、ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）かまたはプロテアーゼ活性を標的とするもの
である。これら薬物の特定の組合せはウイルス複製の抑制において高い効果を有
することが分かっているが、複雑な投与レジメおよび耐性ウイルス単離株に対す
る選択に関わる問題は、更なる治療法の開発の必要性が依然として存在する。組
合せ治療において、これらの効果を最大限にするために、これらの新しい薬物は
、ＲＴまたはプロテアーゼ以外の標的を利用すべきである。
【００１０】 ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対する単独（mono-）または複合
（bi-）治療は、主に、ウイルスの薬物耐性のために一次的に有効であるに過ぎ
ない。抗ウイルス治療の持続した恩恵を得るために、現在のガイドラインでは、
少なくとも３つの薬物の組合せ、またはいわゆる高活性抗レトロウイルス治療（
ＨＡＡＲＴ）が推奨されている。これらの進歩にもかかわらず、現在可能な薬物
レジメに関わる問題が依然として存在する。その薬物の多くは、重大な毒性を示
すかまたは複雑な投与スケジュールを必要とし、コンプライアンスを低下させ効
力が制限される。ＨＩＶの耐性株は、ＨＡＡＲＴレジメにあっても長期間にわた
り存在するのが通常である。
【００１１】 これらのおよびその他の理由のために、更なる抗ＨＩＶ薬の開発の必要性が依
然としてある。理想的には、これらは、（組合せ治療のための設備に加えて）ウ
イルスの生活環における異なった段階を標的とし、最小限の毒性を示し、製造コ
ストが低いものである。ＨＩＶ進入の小分子インヒビターは、これらの課題の解
決にかなり役立つであろう。
【００１２】 ＤＰ−１０７およびＤＰ−１７８ペプチドは、６個ヘリックス束の形成をネガ
ティブドミナント的に破壊することによりＨＩＶ−１複製を阻害することが提唱
されている（ＦＩＧ．２）。ウイルス進入をブロックするＨＩＶインヒビターの
新しいクラスのプロトタイプとして、これらの化合物は、単独で、またはウイル
ス複製における他の段階を標的とする薬物と組み合わせて使用するための、さら
なる治療の選択肢を提供する。しかしながら、タンパク質中心の治療に関する場
合に多いように、これらのペプチドは経口バイオアベイラビリティー、in vivo
安定性および製造コストの問題から、決して理想的な薬物候補とはいえない。
【００１３】 ｇｐ４１配列ＥＬＤＫＷＡＳを示す単離株から得られた２Ｆ５モノクローナル
抗体は、ｇｐ４１を標的とする中和抗体である（Muster, T., et al.. J. Virol
. 67 : 6642-6647 (1993), and Muster, T., et al., J. Virol. 68 : 4031-403
4 (1994)）。この抗体は、ＨＩＶ−１単離株に７２％に保存されているエピトー
プであるｇｐ４１の外部ドメインの線状アミノ酸配列Ｇlu−Ｌeu−Ａsp−Ｌys−
Ｔrp−Ａla（ＥＬＤＫＷＡ）に位置付けられる。この抗体は線状の決定因子をマ
ップしているが、競合実験では２Ｆ５エピトープは、自然状態では立体構造であ
ると示唆される。
【００１４】 モノクローナル抗体ＮＣ−１は、融合活性型ｇｐ４１の６個ヘリックス束に結
合することが示されている（Jiang, S., et al., J. Virol. 72 : 10213-10217
(1998)）。ＮＣ−１は、ｇｐ４１のＮ−およびＣ−ヘリックスドメインをモデル
化したペプチドの混合物で免疫したマウスから産生しクローニングした。ＮＣ−
１は、ｇｐ４１のαヘリックス（Ｎ−ヘリックス）コアドメインおよびオリゴマ
ー形態の両方に特異的に結合する。この立体構造依存性の反応性は、６個ヘリッ
クス束の形成を妨げるｇｐ４１のＮ−末端コイルドコイル領域内のポイントミュ
ーテーションによって劇的に減少する。ＮＣ−１は、可溶性ＣＤ４の存在下での
み、ＨＩＶ−１感染細胞の表面に結合する。
【００１５】 ホルムアルデヒド固定した、融合活性な全細胞調製物（トランスジェニックマ
ウスにおける）を用いて、様々な地域から得られた、遺伝的クレードＡ〜Ｅの初
代ＨＩＶ単離株２４のうちの２３を中和することが可能な抗血清が作製された（
LaCasse, R. A., et al., Science 283 : 357-362 (1999)）。これらの融合コン
ピテント免疫原は、ＨＩＶ結合および融合の間に生じる一過性のエンベロープ−
ＣＤ４−コレセプター構造を捕らえることができる。
【００１６】 発明の要約 数多くのウイルスは、ウイルスの融合および許容細胞への進入のメカニズムに
関与する類似したタンパク質／糖タンパク質構造を共有している。本発明は、ウ
イルス融合および／または許容細胞中への侵入を阻害する化合物をスクリーニン
グする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、試験化合物の存在下で
細胞表面で発現したウイルスエンベロープにおける１またはそれ以上のクリティ
カルな侵入中間体の形成を選択的な誘発を図ること、およびそのような中間体の
形成または形成の欠如について検証することを含む。これは、本明細書中に記載
されたように達成することができる。
【００１７】 本発明の特定の態様は、クリティカルなｇｐ４１構造およびウイルス進入に必
要な立体構造の形成を破壊して、ＨＩＶ侵入をブロックするような化合物を決定
するための方法に関する。ＣＤ４／ｇｐ１２０結合に応答して形成するｇｐ４１
の６個ヘリックス束は、そのようなクリティカルな侵入構造の１つを構成する。
６個ヘリックス束に特異的な抗体は、その形成をブロックする小分子の能力を測
定するために使用される。本発明の方法は、膜貫通タンパク質または糖タンパク
質形成がＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、呼吸器合胞体ウイルス（
ＲＳＶ）、ヒトインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス３型（Ｈ
ＰＩＶ−３）、ニューカッスル病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）お
よび麻疹ウイルスが含まれるがこれに限定されないウイルス侵入に関わる構造お
よび複合体を形成するような他のウイルスに適用することができる。
【００１８】 本発明はさらに、これらの方法によって同定された、小分子、ペプチド、タン
パク質、抗体および抗体断片またはそれらの誘導体であり得る、新規のインヒビ
ターに関する。これらのインヒビターは、ＨＩＶ−１および／または上記の他の
ウイルスを含む様々なウイルスによる感染を阻害または予防するのに適当である
。これらのインヒビターは、ＨＩＶ−１またはその他のウイルスに感染したヒト
を処置するために使用できるかまたは、ＨＩＶ−１またはその他のウイルスによ
る感染を予防するために使用することができる。本発明はさらに、適当な医薬組
成物中のインヒビターを包含する。
【００１９】 本発明の分析において阻害活性を示す化合物は、膜融合をもたらすウイルスエ
ンベロープ糖タンパク質における立体構造変化につながる、または関連する、い
くつかの段階のいずれかに作用し得る。例えば、これらは、エンベロープ糖タン
パク質の立体構造変化を引き起こす引金である、エンベロープ糖タンパク質とそ
のレセプターとの間の相互作用（例えば、ＨＩＶ−１の場合、ｇｐ１２０とＣＤ
またはＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４ケモカインレセプターとの間の相互作用）を
阻害し得る。あるいは、これらは、例えばこれらの構造の一部である膜貫通タン
パク質のαヘリックスドメインの会合を阻止することによって（例えば、ＨＩＶ
−１の場合、６個ヘリックス束の形成につながるＮ−およびＣ−ヘリックスドメ
インの会合をブロックすることによって）、融合活性型構造の形成を直接阻害し
得る。この分析はまた、まだ完全には解明されていない過程における、他の段階
のインヒビターを発見することが可能である。
【００２０】 本発明において発見された阻害化合物の作用機序をより詳細に解析するために
さらなる分析を行うことができる。これら分析のための方法は、当業者によく知
られている。例えば、ＣＤ４またはケモカインレセプターに対するＨＩＶ−１ｇ
ｐ１２０の相互作用のインヒビターを試験するための分析は、Dragic, T., et a
l., Nature 381 : 667-673 (1996) and Donzella, G. A., et al., Nature Medi
cine 4 : 72-77 (1998)に記載されている。ＨＩＶ−１ｇｐ４１の６個ヘリック
ス束のインヒビターを試験するための分析は、Jiang S. et al., J Virol. Meth
ods 8O: 85-96 (1999)に記載されている。
【００２１】 本発明はさらに、ウイルスに感染した人またはウイルスに感染した体液もしく
は組織における、１またはそれ以上のウイルスエンベロープタンパク質または糖
タンパク質の侵入に関連する立体構造変化を阻害する抗体を検出するための診断
的分析として、上記分析の使用を包含する。感染した人または試料におけるその
ような抗体の存在は、予後の上で価値あるものである。
【００２２】 好ましい態様の詳細な記載 本発明は、ウイルス侵入構造形成のインヒビターをスクリーニングする方法に
関する。本発明は、侵入関連構造およびウイルス許容細胞へのウイルス侵入に必
要な立体構造の形成を破壊する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本
スクリーニング方法は、細胞表面発現したウイルスエンベロープにおける１また
はそれ以上のクリティカルな侵入中間体の形成を選択的に誘発することおよびそ
の形成を検証することを含む。これは本明細書に記載するように達成することが
できる。
【００２３】 第１の態様では、本発明は、ウイルス侵入および／または融合の立体構造中間
体の形成に対する候補化合物の効果の測定を伴う、阻害化合物のスクリーニング
分析に関する。特に、本方法は、ウイルスエンベロープタンパク質または糖タン
パク質を誘発剤および候補化合物と接触させ、該立体構造中間体の形成に対する
候補化合物の効果を測定することを含む。
【００２４】 立体構造中間体の形成に対する候補化合物の効果は、これらの立体構造中間体
に結合する抗体によって測定することができる。これは、混合物を特異的な抗体
とインキュベーションし、ウイルス侵入および／または融合の立体構造中間体に
結合した抗体の量が、その候補化合物の存在によって増加するかまたは減少する
かを測定することによって行われる。あるいは、立体構造中間体の形成に対する
候補化合物の効果を、誘発剤と接触させる前に存在しているウイルスエンベロー
プタンパク質または糖タンパク質に結合した抗体によって測定することができる
。本分析において使用する抗体は、特許請求された発明の重要な構成要件である
。１つの態様では、１またはそれ以上の進入関連構造または立体構造（立体構造
中間体）に存在するエピトープに結合する検出抗体は、（誘発剤に接触させる前
の）非誘発状態のウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質の領域に
実質的に結合してはならない。あるいは、ウイルスエンベロープタンパク質また
は糖タンパク質に存在するエピトープに結合する検出抗体は、１またはそれ以上
の侵入関連構造または立体構造（立体構造中間体）に存在するエピトープに実質
的に結合してはならない。
【００２５】 本発明の好ましい方法は以下の工程を含む： ａ．水性緩衝液中で、 ｉ．脂質二重層に会合しているウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパ
ク質であって、インタクトなウイルスにおけるウイルス進入に必要であり且つ十
分であり、ウイルス許容細胞上の１またはそれ以上のレセプターと相互作用する
ことが可能なウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質； ｉｉ．１またはそれ以上のウイルス許容細胞、該許容細胞に由来する１またはそ
れ以上の不溶性または可溶性受容体、またはその組合せ；および ｉｉｉ．試験化合物； を混合すること、 ｂ．ウイルス許容細胞中へのウイルス侵入に必要な、１またはそれ以上の侵入関
連構造または立体構造の形成に対する試験化合物の効果を測定すること。
【００２６】 本発明の１つの態様では、工程ｂは、 ウイルス侵入の事象において立体構造的なまたは構造的な中間体に存在するエ
ピトープに優先的に結合する、場合により検出可能なように標識された１または
それ以上の抗体を加えること；および 結合した抗体の量を測定すること によって行われる。
【００２７】 本発明の別の態様では、工程ｂは、 誘発剤と接触していないウイルス膜タンパク質または糖タンパク質に存在する
エピトープに優先的に結合する、場合により検出可能なように標識された、１ま
たはそれ以上の抗体を加えること；および 結合した抗体の量を測定すること によって行われる。
【００２８】 いずれの態様においても、本方法は、場合により、さらに、以下の工程： 測定された結合した抗体の量を標準値と比較すること を含む。
【００２９】 好ましくは、工程ａは、試薬ｉと試薬ｉｉｉを約１０〜約１２０分間、より好
ましくは約４５分間〜約９０分間インキュベーションすることを含む。試験化合
物の有用な濃度範囲には、約０.１μｇ／ｍL〜約１００μg／ｍLが含まれる。ウ
イルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質の有用な濃度範囲は広い範囲
にわたり、そのウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質が以下に記
述するとおりに提供される様式に依存し得る。
【００３０】 有用なウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質は、ウイルス許容
細胞中へのウイルスの侵入事象に関わる１またはそれ以上のドメインを有する、
これらのタンパク質および／または糖タンパク質である。例えば、ＨＩＶ-１は
、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ４１を含む。エンベロープタンパ
ク質ｇｐ４１は、ＨＩＶ融合およびＨＩＶ許容細胞（例えば、リンパ球）への侵
入に必要な侵入関連中間体構造の形成に関わるＮ−ヘリックスドメインおよびＣ
−ヘリックスドメインを含む。ＲＳＶ、パラインフルエンザウイルス３型（ＨＰ
ＩＶ−３）、麻疹ウイルス、およびインフルエンザウイルスなどの他のウイルス
は、ウイルスの融合および侵入を媒介する中間体の構造および立体構造を形成す
る、機能上類似したエンベロープ糖タンパク質の一次および二次構造を含む。こ
のタンパク質または糖タンパク質は、適当な脂質二重層の系と会合する。
【００３１】 本発明の目的に関して、ウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質
は、そのタンパク質または糖タンパク質がネイティブな状態で存在する立体構造
に類似した、１またはそれ以上の立体構造でそのウイルスエンベロープタンパク
質または糖タンパク質が存在するかぎり、数多くの異なる様式で脂質二重層と会
合することができる。本発明では、このタンパク質または糖タンパク質が、その
タンパク質または糖タンパク質が、本明細書において定義された「侵入関連」構
造および立体構造を形成することが可能な状態にあることが重要である。
【００３２】 有用な脂質二重層系には、ウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク
質のいずれかを「発現する」、細胞、ビリオン、偽ビリオンまたはその他の適当
な膜小胞またはリポソ−ムが含まれる。エンベロープウイルスタンパク質または
糖タンパク質は、典型的には、１またはそれ以上の膜会合ドメインおよび１また
はそれ以上の膜貫通ドメインを有する。本発明の方法における試薬ｉの例として
は、次が挙げられる：細胞が膜会合エンベロープタンパク質または糖タンパク質
を表面で発現するようにトランスフェクトされた細胞、複製欠損ウイルス粒子で
感染した細胞および表面で発現する膜会合エンベロープタンパク質または糖タン
パク質、不活化されたウイルス粒子および偽ビリオン。
【００３３】 本発明の方法は、膜貫通タンパク質または糖タンパク質が、ＨＩＶ−１、ＨＩ
Ｖ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パ
ラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）ニューカッスル病ウイルス、ネ
コ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルスおよび麻疹ウイル
スが含まれるがこれに限定されないウイルスの侵入に関与する構造、立体構造お
よび複合体を形成するウイルスに適用することができる。
【００３４】 本発明の方法は誘発剤を必要とする。誘発剤は、脂質二重層／膜会合エンベロ
ープタンパク質または糖タンパク質の系と相互作用して、ウイルスエンベロープ
系の膜貫通または融合タンパク質における侵入関連構造または立体構造変化を誘
導する。上記方法における試薬ｉｉは、誘発剤として供する。特定のウイルスの
ウイルス融合および侵入のための誘発剤は、典型的にはウイルス許容細胞、該細
胞由来の不溶性または可溶性レセプターまたは該レセプターの機能的断片である
。本発明の目的に関して、「ウイルス許容細胞」は、典型的に、特定のウイルス
が侵入して感染することができる細胞である。
【００３５】 有用なウイルス許容細胞または該ウイルス許容細胞由来の不溶性もしくは可溶
性レセプターは、特定のウイルスおよび特定のウイルスの融合および進入に許容
性である宿主細胞によって記述される。例えば、ＨＩＶ−１に関しては、許容細
胞にはリンパ球が含まれる。リンパ球における可溶性および不溶性のＣＤ４レセ
プターもまた、誘発剤として本発明において有用であり、ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４
またはその混合物などの特定のケモカインレセプターあるいはＣＤ４を有する細
胞へのＨＩＶ−１融合を促進することが示されているその他のケモカインレセプ
ターなどの特定のケモカインレセプターも同様に有用である。いくつかのＨＩＶ
株については、ＣＤ４に対する結合は、侵入関連構造および立体構造の形成を誘
発するには十分であるが、他のＨＩＶ株については、第２のレセプター（通常Ｃ
ＣＲ５またはＣＸＣＲ４ケモカインレセプター）への結合が必要である。
【００３６】 他のウイルスに対する有用な誘発剤には、特定のウイルスに対する許容細胞系
が含まれる。ＲＳＶに対しては、ＨＥｐ２細胞が有用な許容細胞である。麻疹ウ
イルスに対しては、Ｖｅｒｏ細胞が有用な許容細胞である。ＨＩＰＶ−３に対し
ては、ＨＥｐ２が有用な許容細胞である。これら細胞由来の可溶性および不溶性
レセプターもまた利用することができる。
【００３７】 誘発剤の有用な濃度は、誘発剤が細胞として提供されるかまたは可溶性もしく
は不溶性レセプターとして提供されるかによって変わる。さらに、濃度は、特定
のウイルスおよびそれに対応するレセプターまたは誘発剤によって変わる。一般
に、試薬ｉｉについての有用な濃度範囲は、レセプタータンパク質にして約０.
１μｇ／ｍL〜約１００μｇ／ｍLであり、好ましくは約０.１μｇ／ｍL〜約１０
μｇ／ｍLである。濃度は、レセプタータンパク質に関して表現する。そのよう
な濃度は、当業者に知られている方法によって測定することができる。誘発剤は
、好ましくは、誘発剤を、試験化合物の混合物およびウイルスエンベロープタン
パク質もしくは糖タンパク質と約１０分間〜約１２０分間、好ましくは約３０〜
約９０分間インキュベーションする。
【００３８】 インヒビターの非存在下では、ウイルスエンベロープタンパク質または糖タン
パク質と誘発剤とのインキュベーションによって、ウイルスエンベロープタンパ
ク質または糖タンパク質が、ウイルス融合およびウイルス許容細胞中への侵入に
必要な１またはそれ以上の構造中間体を通じて立体構造の変化を受けるであろう
。
【００３９】 １つの態様では、工程ｂで加える抗体は、１またはそれ以上の中間体構造（構
造的または立体構造的エピトープ）に実質的に結合することが可能である。抗体
はさらに、誘発剤の非存在下での、ウイルスエンベロープタンパク質または糖タ
ンパク質上のエピトープに対する結合の実質的な減少によって特徴づけられる。
有用な抗体には、侵入関連エンベロープ決定因子を正しく形作る、ペプチド、お
よび組換えタンパク質およびタンパク質およびタンパク質断片の組合せに対して
惹起された抗体が含まれる。これら抗体を製造する方法およびそれらの結合を測
定する方法は以下に記載する。
【００４０】 別の態様では、有用な抗体は、（ａ）誘発剤と接触させる前にウイルスエンベ
ロープタンパク質または糖タンパク質上に存在し、（ｂ）ウイルスエンベロープ
タンパク質または糖タンパク質と誘発剤とを接触させた後に消失する、エピトー
プに結合する抗体である。これらの抗体を製造する方法およびこれらの結合を測
定する方法は以下に記載する。
【００４１】 本発明の方法において抗体の結合を検出するために、免疫沈降分析、フローサ
イトメトリー、蛍光顕微鏡検査法、または蛍光光度法を含む、いくつかの方法を
使用することができる。さらに、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いることができる。
【００４２】 抗体は、場合により、検出可能な標識で標識する。適当な標識は当業者に知ら
れており、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびグルコ
ースオキシダーゼ等の酵素標識、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄
（35Ｓ）、三重水素（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）およびテクネチウム（99m
Ｔｃ）等の放射性同位元素、およびフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標
識が含まれる。あるいは、抗体は、別途添加した標識によって認識される部分、
例えばビオチン、で誘導体化することができる。これら標識を用いて抗体を化学
的に修飾する技術は、当分野でよく知られている。
【００４３】 本方法は、場合により、結合した抗体の量を標準値と比較することをさらに含
む。結合した抗体は、当業者に知られている数多くの方法で測定して表示するこ
とができる。侵入関連中間体の立体構造または構造に好ましく結合する抗体を用
いたとき、侵入関連立体構造を破壊することによってウイルスの融合および侵入
を阻害する化合物によって、試薬ｉに結合する抗体の量が減少し、それによって
遊離状態の抗体の量がインヒビターなしの系と比較して増加するであろう。非誘
発状態のウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質に優先的に結合す
る抗体を用いると、侵入関連立体構造を破壊することによりウイルスの融合およ
び侵入を阻害する化合物は、試薬ｉに結合した抗体の量が、インヒビターなしの
系で試薬ｉに結合した抗体の量と同様になるであろう。
【００４４】 本発明の特定の態様は、１またはそれ以上のクリティカルなｇｐ４１侵入関連
構造または立体構造の形成を破壊し、それによってＨＩＶ侵入をブロックする化
合物を測定する方法に関する。ＣＤ４／ｇｐ１２０結合に応答して形成するｇｐ
４１の６個ヘリックス束は、１つのそのようなクリティカルな侵入構造を構成す
る。６個ヘリックス束に特異的な抗体は、その形成をブロックする小分子の能力
を測定するために使用される。
【００４５】 ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する細胞、
ビリオンまたはその他の適当な膜小胞またはリポソ−ムを、潜在的な抗ウイルス
化合物（試験化合物）とレセプター（誘発剤）の存在下または非存在下でインキ
ュベーションし、次いで、６個ヘリックス束構造を模倣したペプチドまたは組換
えタンパク質の混合物（例えばＰ１５およびＰ１６の混合物）に対して惹起され
たポリおよび／またはモノクローナル血清を用いてｇｐ４１の立体構造の変化を
分析する。６個ヘリックス束のような「侵入関連構造」の形成を阻害する試験化
合物は、これら抗体の結合の減少を引き起こすであろう。
【００４６】 これらの分析における抗体の結合を検出するために、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降分
析、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡検査法、または蛍光光度法を含む方法を
使用することができる。
【００４７】 したがって、本発明の１つの態様では、本方法は、以下の工程を含む： 少なくとも１つのＨＩＶエンベロープ糖タンパク質またはその断片を発現する
細胞を試験化合物とインキュベーションした後、得られた混合物を、少なくとも
１つの糖タンパク質またはその断片をウイルス侵入のために活性化するのに十分
な量の、その少なくとも１つの細胞表面レセプターの可溶型またはその断片とイ
ンキュベーションして、第２の混合物を得ること； ウイルス侵入事象における、１またはそれ以上の構造または立体構造中間体の
形成に対する該試験化合物の効果を測定すること。
【００４８】 測定工程は、 ウイルス侵入事象における構造的または立体構造的中間体であるエピトープに
結合する、１またはそれ以上の場合により検出可能なように標識された抗体を加
えること；および 結合した抗体の量を測定すること によって行うことができる。
【００４９】 あるいは、測定工程は、 誘発剤と接触していないウイルス膜タンパク質または糖タンパク質に存在する
エピトープに優先的に結合する、１またはそれ以上の場合により検出可能なよう
に標識された抗体を加えること；および 結合した抗体の量を測定すること によって行うことができる。
【００５０】 本方法は場合により、結合した抗体の測定された量を標準値と比較することを
さらに含む。
【００５１】 別の態様では、少なくとも１つのウイルスエンベロープタンパク質またはその
断片は、糖タンパク質またはその断片である。別の態様では、糖タンパク質また
はその断片は、脂質膜または二重層と会合した、ＨＩＶ−１ｇｐ４１／ｇｐ１２
０複合体またはその断片である。
【００５２】 本発明はさらに、以下の工程： ウイルス膜の外側に少なくとも１つの表面エンベロープ糖タンパク質またはそ
の断片を有する非感染性ウイルス粒子を試験化合物とインキュベーションするこ
と； その後、得られた混合物を、ウイルス侵入のために糖タンパク質またはその断
片を活性化するのに十分な量の、少なくとも１つの可溶型の細胞表面レセプター
またはその断片とインキュベーションして第２の混合物を得ること； ウイルス侵入事象における１またはそれ以上の構造または立体構造中間体の形
成に対する該試験化合物の効果を測定すること を含む、ウイルス融合インヒビターをスクリーニングする方法に関する。
【００５３】 測定工程は、 ウイルス侵入事象における構造または立体構造中間体であるエピトープに結合
する、１またはそれ以上の場合により検出可能なように標識された抗体を加える
こと；および 結合した抗体の量を測定すること によって行うことができる。
【００５４】 あるいは、測定工程は、 誘発剤に接触していない、ウイルス膜タンパク質または糖タンパク質に存在す
るエピトープに好ましく結合する、１またはそれ以上の場合により検出可能なよ
うに標識された抗体を加えること；および 結合した抗体の量を測定すること によって行うことができる。
【００５５】 本方法は、場合により、結合した抗体の測定された量を標準値と比較すること
をさらに含む。
【００５６】 １つの態様では、少なくとも１つの表面エンベロープ糖タンパク質またはその
断片は、ＨＩＶ−１ｇｐ４１／ｇｐ１２０複合体またはその断片である。
【００５７】 別の態様では、エンベロープ糖タンパク質またはその断片を発現する細胞は、
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を発現する組換えワクシニア
ウイルスで感染させた細胞である。別の態様では、エンベロープ糖タンパク質ま
たはその断片を発現する細胞は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその
断片を発現するベクターで形質転換された細胞である。別の態様では、エンベロ
ープ糖タンパク質またはその断片を発現する細胞は、少なくとも１つの実験室に
適したまたは初代ウイルス単離株から得られる、少なくとも１つのエンベロープ
タンパク質またはその断片を有する、複製欠損ウイルス粒子または偽ビリオンで
感染させる。
【００５８】 より具体的には、本発明に有用な試薬には、非感染性ＨＩＶ−１粒子（８Ｅ５
／ＬＡＶウイルス（Folks, T. M., et al., J. Exp. Med 164 : 280-290 (1986)
; Lightfoote, M. M., et al., J. Virol. 60 : 771-775 (1986) ; Gendelman,
H. E., et al., Virology 160 : 323-329 (1987)））または少なくとも１つの
実験室に適したまたは初代ＨＩＶ単離株に由来する、エンベロープ糖タンパク質
またはその断片を有する偽ビリオン（Haddrick, M., et al., J. Virol. Method
s 61 : 89-93 (1996) ; Yamshchikov, G. V., etal., Virology21 : 50-58 (199
5)）が含まれる。
【００５９】 ８Ｅ５／ＬＡＶ細胞系は、非複製系において機能的なエンベロープを発現する
インタクトなビリオンを産生する。初代ＨＩＶ−１レセプターＣＤ４の可溶型ま
たはその断片を加える（ｓＣＤ４）。ｓＣＤ４の添加により、ｇｐ１２０に結合
し、誘発することにより、ウイルス進入のためにエンベロープ糖タンパク質また
はその断片が活性化され、そしてこれがｇｐ４１の融合活性型形態を誘発する。
【００６０】 さらに別の態様では、少なくとも１つのウイルスエンベロープタンパク質を発
現する細胞、例えばＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を発現す
る組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞（Earl, P. L., etal., J. Virol
. 65 : 31- 41 (1991) ; Rencher, S. D., et al., Vaccine 5 : 265-272 (1997
) ; Katz, E. and Moss,B., AIDS Res. Hum. Retroviruses 13 : 1497-1500 (19
97)）を使用することができる。エンベロープを発現した細胞は誘発剤とインキ
ュベーションする。
【００６１】 別の態様として、上記の方法において、ＣＤ４およびケモカインを発現する細
胞系を、リンパ球または可溶型ＣＤ４（ｓＣＤ４）の代用とすることができる。
この方法によって、試薬ｉおよび試験化合物を、侵入関連構造および立体構造の
形成を誘発するのに供する、ＣＤ４、またはＣＲ４、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４
などの適当なケモカインレセプターを発現する細胞系とインキュベーションする
。
【００６２】 上記の方法は、そこでエンベロープタンパク質がウイルス侵入にクリティカル
な類似の複合体を形成する、他のウイルスに適合させることができ、これにはＨ
ＩＶ−２，ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、
ヒトインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス３型
（ＨＰＩＶ−３）、ニューカッスル病ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルス（Ｆ
ＩＶ）が含まれるがこれに限定されない。
【００６３】 本発明は、小分子、ペプチド、抗体および抗体断片が含まれるがこれに限定さ
れない、これら分析において検出される新規化合物を包含する。
【００６４】 本発明はさらに、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体および抗体断片または
それらの誘導体であってよい、これら方法によって同定された新規なインヒビタ
ーに関する。これらのインヒビターは、ＨＩＶ−１および／または上記の他のウ
イルスが含まれる、様々なウイルスによる感染を阻害または予防するのに適して
いる。これらのインヒビターは、ＨＩＶ−１または他のウイルスによって感染し
たヒトを処置するのに使用することができる、またはＨＩＶ−１もしくは他のウ
イルスによる感染を予防するために使用することができる。本発明はさらに、適
当な医薬組成物中のインヒビターを包含する。これらの抗ウイルス化合物は、治
療目的で使用される体液、例えば血液または血液成分、においてウイルスを不活
化するために使用することもできる。
【００６５】 本発明はさらに、１またはそれ以上のウイルスエンベロープタンパク質または
糖タンパク質における侵入関連の立体構造変化を阻害する、ウイルスに感染した
人またはウイルスに感染した体液もしくは組織における抗体を検出するための診
断的分析方法としての、上記分析方法の使用を包含する。感染した人または試料
におけるそのような抗体の存在は、予後の上で価値あるものである。
【００６６】 抗体 本発明において有用なペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは単離された
形態で提供される。「単離されたポリペプチド」は、自然の環境から取り出され
たポリペプチドを意図する。即ち、組換え宿主細胞内で産生されおよび／または
含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されていると解される。さ
らに、「単離されたポリペプチド」は、組換え宿主細胞または天然の供給源から
部分的または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、組換え的に産生
したポリペプチドは、Smith and Johnson, Gene 67. 31-40 (1988)に記載された
１工程の方法により実質的に精製することができる。あるいは、ペプチドはよく
知られたペプチド合成技術を用いて合成することができる。
【００６７】 本発明の１つの態様では、本明細書において定義されたＮ−ヘリックスドメイ
ンに存在するｇｐ４１の７残基反復領域に対応するかまたはこの領域を模倣する
安定なコイルドコイル溶液構造を形成することが可能なアミノ酸配列を含むペプ
チドまたはポリペプチドを哺乳類に投与することによって抗体を惹起する。ｇｐ
４１のＮ−ヘリックス７残基反復領域の溶液立体構造に対応するまたは模倣する
アミノ酸配列を含むペプチドまたはそのマルチマーを使用することができる。ｇ
ｐ４１のＮ−ヘリックス７残基反復領域は４つの７残基反復を含む。好ましくは
、このペプチドは、ＨＩＶｇｐ４１の細胞外ドメイン（Ｎ−ヘリックスドメイン
（配列番号１））の７残基反復領域の約２８〜５５アミノ酸、またはそのマルチ
マーを含む。ペプチドは、小ペプチドとして投与するか、またはキーホールリン
ペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、卵アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
または破傷風トキソイド等のより大きなキャリアータンパク質に担持することが
できる。ｇｐ４１の７残基反復領域に対応するまたはこの領域を模倣する安定な
コイルドコイル溶液構造を形成するペプチドは、ポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体のいずれかを形成するために利用することができる。特定のペプチド
またはマルチマーが、ｇｐ４１の７残基反復領域に対応するかまたはこの領域を
模倣する安定な三量体コイルドコイル溶液構造を有するか否かを決定するために
、ペプチドを、本明細書の一部を構成するWild, C., et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 89 : 10537-10541 (1992)に記載の方法にしたがって試験することが
できる。
【００６８】 このタンパク質のＮ−ヘリックスドメインを形成するＨＩＶ−１LAIｇｐ４１
タンパク質の残基の配列を以下に示す：
【化１】
【００６９】 有用なペプチドの２つの例として、以下のアミノ末端からカルボキシ末端への
次式を有するペプチドＰ−１７：
【化２】 および アミノ末端からカルボキシ末端への次式を有するペプチドＰ−１５：
【化３】 が挙げられる。
【００７０】 これらのペプチドは、場合により、より大きなキャリアータンパク質とカップ
リングさせるか、または場合によりＮ−および／またはＣ−末端で末端保護基を
含む。有用なペプチドは、以下に記載するように、１またはそれ以上、好ましく
は１〜１０の保存的置換を含むＰ−１７またはＰ−１５に対応するペプチドをさ
らに含む。数多くの有用なＮ−ヘリックス領域が本明細書に記載される。
【００７１】 ｇｐ４１の膜貫通の近接両親媒性αヘリックスセグメントに対応するまたはコ
のセグメントを模倣するアミノ酸配列（Ｃ−ヘリックスドメイン（配列番号４）
）またはその部分を含むペプチドまたはポリペプチドを、哺乳類に投与すること
によって抗体を惹起することもできる。有用なペプチドまたはポリペプチドとし
ては、ペプチドＰ−１７のようなｇｐ４１の７残基反復領域に対応するペプチド
と混合したときに、コア６個ヘリックス束を形成することが可能なアミノ酸配列
が挙げられる。ペプチドは、本明細書の一部を構成するChan, D. C., et al, Ce
ll 89 : 263-273 (1997) ; Lu, M., et al., Nature Struct. Biol. 2 : 1075-1
082 (1995)に記載された系と条件を用いてコア６個ヘリックス束を形成する能力
について試験することができる。
【００７２】 このタンパク質のＣ−ヘリックスドメインを形成するＨＩＶ−１LAIｇｐ４１
タンパク質の残基のアミノ酸配列を以下に示す：
【化４】
【００７３】 本発明のこの態様において用いることができる好ましいペプチドまたはそのマ
ルチマーは、ＨＩＶｇｐ４１の細胞外Ｃ−ヘリックスドメインの約６以上のアミ
ノ酸、好ましくは約２４〜５６アミノ酸を含む。このペプチドは小ペプチドとし
て投与するか、またはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、卵アルブ
ミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド等のより大きなキ
ャリアータンパク質に担持させることができる。この膜貫通の近接両親媒性αヘ
リックスセグメントは、以下に記載されるペプチドＰ−１６およびＰ−１８によ
って例示される。ｇｐ４１の膜貫通の近接両親媒性αヘリックスセグメントに対
応するまたはこのセグメントを模倣するアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリ
ペプチドは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を形成するために利用す
ることができる。
【００７４】 本発明のこの態様に有用なペプチドの例としては、ＨＩＶ−１LAI単離株に由
来する膜貫通タンパク質ｇｐ４１の一部に対応し、３６個のアミノ酸配列（アミ
ノ末端からカルボキシ末端へと読む）を有する：
【化５】 するペプチドＰ−１８および 以下のアミノ酸配列（アミノ末端からカルボキシ末端へと読む）：
【化６】 を有するペプチドＰ−１６が挙げられる。
【００７５】 これらのペプチドは、場合により、より大きなキャリアータンパク質とカップ
リングしている。有用なペプチドは、以下に記載するように、１またはそれ以上
、好ましくは１〜１０個の保存的置換を含むＰ−１８またはＰ−１６に対応する
ペプチドをさらに含む。全長Ｐ−１８、３６マーおよび全長Ｐ−１６に加えて、
本発明のこの態様のペプチドは、Ｐ−１８およびＰ−１６の先端が切り取られた
形態を含み得る。その先端が切り取られた形態が、Ｐ−１７またはＰ−１５と混
合したときに６個ヘリックス束を形成することが可能である限り。
【００７６】 ｇｐ４１コア６個ヘリックス束に対応するまたはこの束を模倣する安定な溶液
構造を形成することが可能なアミノ酸配列を含む１またはそれ以上のペプチドま
たはポリペプチドを哺乳類に投与することによって抗体を惹起することもできる
。この束は、膜貫通タンパク質の遠位領域の相互作用によりｇｐ４１において、
Ｎ−ヘリックスドメインおよびＣ−ヘリックスドメインに大まかに対応する７残
基反復領域および両親媒性αヘリックス領域セグメントを形成する。ネイティブ
なウイルスにおいて形成するこの束構造は、７残基反復領域のそれぞれの３コピ
ーと膜貫通の近接両親媒性αヘリックスセグメントとの間の三量体相互作用の結
果である。本発明において有用な組成物において、ペプチド領域は、互いに相互
作用してコア６本束を形成する。マルチマーおよびコンジュゲート構造を含め、
安定なコアヘリックス溶液構造を形成するペプチドとポリペプチドの混合物が有
用である。
【００７７】 （ａ）ｇｐ４１の安定なコイルドコイル７残基反復領域に対応するかまたはこ
の領域を模倣するアミノ酸配列を含む１またはそれ以上のペプチド；および（ｂ
）ｇｐ４１の膜貫通の近接両親媒性αヘリックスセグメントに対応するまたはコ
のセグメントを模倣する領域を含む１またはそれ以上のペプチド、の混合物を使
用し得る。これらの混合物は、溶液に安定であってもなくてもよいさらなる免疫
原性構造を提供するために、場合により化学的にまたは酸化的に架橋される。物
理的混合および慣用的な架橋に加えて、このペプチド（ａ）および（ｂ）は、適
当な連結基（好ましくは、少なくとも２、好ましくは２〜２５のアミノ酸残基を
有するペプチド残基）を介して互いに結合することができる。好ましい連結基は
、さらなる酸化的架橋が想定される場合、グリシンとセリンの組合せまたはグリ
シンとシステインの組合せから形成される。
【００７８】 例示的な態様には、Ｐ−１７とＰ−１８、Ｐ−１５とＰ−１６，Ｐ−１７とＰ
−１６またはＰ−１５とＰ−１８の物理的混合物に対して抗体を惹起する工程が
含まれる。
【００７９】 融合活性型の膜貫通タンパク質構造を模倣する１またはそれ以上の新規なペプ
チドおよびタンパク質を含む、本明細書においてコンジュゲートと称する、組成
物を哺乳類に投与することによって抗体を惹起することもできる。これらのコン
ジュゲートは、 （ａ）ｇｐ４１の７残基反復領域に対応するかまたはこの領域を模倣する、安定
なコイルドコイル溶液構造を形成することが可能な、２８またはそれ以上のアミ
ノ酸の１以上のアミノ酸配列；および （ｂ）ｇｐ４１の膜貫通の近接両親媒性αヘリックスセグメントのアミノ酸配列
に対応するまたはこのアミノ酸配列を模倣する１またはそれ以上のアミノ酸配列
、 を含み、１またはそれ以上の配列（ａ）および（ｂ）が、ペプチド結合（アミド
結合）を介して、または約２〜２５アミノ酸からなるアミノ酸連結配列によって
、互いに交互に連結している、ペプチドおよびタンパク質から形成される。 これらのペプチドおよびタンパク質は、好ましくは組換えにより製造される。
【００８０】 これらのコンジュゲートは、好ましくは、侵入関連構造に対応するまたはこれ
を模倣する構造に折り畳まれそして構築される。形成され得る新規な構築物また
はコンジュゲートの例としては、以下が挙げられる（Ｎ−末端からＣ−末端へ読
まれる）： （１）Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８からなる３直列反復ユニット （Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８−
リンカー−Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８）、 （２）Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７、 （３）Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８、 （４）Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７、 （５）Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６から構成される３直列反復ユニット（Ｐ−
１５−リンカー−Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６−リンカ
ー−Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６）、 （６）Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５、 （７）Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６、 （８）Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５、および （９）Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６ ここで、各リンカーは、同一でも異なっていてもよい、約２〜約２５アミノ酸
、好ましくは２〜約１６アミノ酸残基のアミノ酸配列である。好ましいアミノ酸
残基としては、グリシンおよびセリン、例えば（ＧＧＧＧＳ）x（配列番号７）
（ここで、ｘは、１、２、３、４または５である）が挙げられる。任意の記載さ
れた構築物において、Ｐ−１５とＰ−１７は互換可能であり、Ｐ−１６とＰ−１
８は互換可能である。そのような構築物の例（配列番号７７）を、その構築物の
組換え発現に使用される対応する核酸配列（配列番号７８）とともにＦＩＧ．７
に示す。
【００８１】 本明細書中で用いられる場合、「侵入関連」とは、ウイルス侵入の間のＨＩＶ
と細胞表面との相互作用の後に生じるまたは露出する特定の分子の分子立体構造
または分子構造、およびウイルス侵入における特定のアミノ酸配列および分子立
体構造または分子構造の役割を意味する。
【００８２】 本明細書中で用いられる場合、「ＨＩＶ」とは、ヒト免疫不全ウイルスＩ型の
すべての株と単離株を意味する。本発明の構築物は、ＨＩＶ−１ｇｐ４１に基づ
くものであり、ＨＩＶタンパク質とその断片のアミノ酸の番号付けは、ＨＩＶ−
１LAI単離株についてのものである。しかし、ＨＩＶ−１ウイルス感染とそのよ
うなＨＩＶ−１感染に対する本発明の効果が、モデル系として本明細書中で用い
られているが、標的化される侵入メカニズムは、ＨＩＶ−１のすべての株と単離
株に関連することが理解されるべきである。従って、本発明は、「包括的スクリ
ーニング」法に関する。
【００８３】 本明細書中で用いられる場合「７残基反復」または「７残基反復領域」とは、
アミノ酸、一般にはロイシンおよび／またはイソロイシン、の４−３反復を有す
る共通のタンパク質モチーフを意味し、しばしばαヘリックス二次構造に関連す
る。「７残基反復」は、以下の配列： −(ＡＡ1−ＡＡ2−ＡＡ3−ＡＡ4−ＡＡ5−ＡＡ6−ＡＡ7)− ［ここで、ＡＡ1およびＡＡ4は、それぞれロイシンまたはイソロイシンのいずれ
か１つであるが；ＡＡ2、ＡＡ3、ＡＡ5、ＡＡ6およびＡＡ7は任意のアミノ酸で
あってよい］ で示される。Wild, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10537-1054
1 (1992)を参照。
【００８４】 ペプチドは、ペプチド結合によって共有結合した２またはそれ以上のアミノ酸
を含む有機化合物として定義される。ペプチドは、構成するアミノ酸の数に関し
て言及され得る。即ち、ジペプチドは２つのアミノ酸残基を含み、トリペプチド
は、３つのアミノ酸残基を含む、など。１０またはそれ以下のアミノ酸を含むペ
プチドは、オリゴペプチドと呼ぶことができるが、１０アミノ酸残基よりも長い
ペプチドはポリペプチドである。
【００８５】 完全なｇｐ４１アミノ酸配列（ＨＩＶ−１グループＭ：サブタイプＢ単離株：
ＬＡＩ、ＮからＣ末端へ）は次の通りである：
【化７】
【００８６】 ｇｐ４１のＮ末端ヘリックス領域は、次のとおりである：
【化８】
【００８７】 以下に、タンパク質のＮ末端ヘリックスドメインにおける、ＨＩＶ−１LAIｇ
ｐ４１タンパク質の残基５５８〜５９５（配列番号７）の配列を示す。下に記し
たａおよびｄの添字は、７残基反復の４−３位を示す。
【化９】
【００８８】 ｇｐ４１のＣ末端ヘリックス領域は、次のとおりである：
【化１０】
【００８９】 以下に、タンパク質のＣヘリックスドメインにおける、ＨＩＶ−１LAIｇｐ４
１タンパク質の残基６４３〜６７８のアミノ酸配列を示す：
【化１１】
【００９０】 ＨＩＶ−１ｇｐ４１のＮおよびＣヘリックスドメインをモデル化するペプチド
は、ＨＩＶ−１の複数の株から構築することができ、単独でまたは本発明の他の
ペプチドと組み合わせて用いた場合に、侵入関連ｇｐ４１構造および立体構造に
対する抗体を惹起する得られたペプチドの能力を破壊しない、アミノ酸の欠失、
挿入および置換を含むことができる。
【００９１】 ｇｐ４１のＮヘリックスドメインをモデル化するペプチドの、所望の抗体反応
を引き出す能力に対するそのような変化の効果は、分光光度法により測定するこ
とができる。円偏光二色性（Wild, C. et al., PNAS 89 : 10537-10541 (1992)
）によって測定されたαヘリックス二次構造を形成するペプチドの能力を改変し
ないＮヘリックスペプチドの１次配列内の欠失、挿入および置換は、本発明にお
けるそれらの使用に適合すると考えられる。
【００９２】 ペプチドとしてモデル化される場合、ｇｐ４１のＣヘリックス領域は構造化さ
れない。しかし、Ｎ−ペプチドと混合する場合、このＣペプチドは、６個ヘリッ
クスコア複合体の部分としてαヘリックス二次構造をとる。この構造は、混合す
るとin vitroでＮ−およびＣ−ヘリックスペプチドを形成し、分光光度法により
特徴付けることができる（Lu, M., et al., Nat. Struct. Biol. 2 : 1075-1082
(1995)）。Ｃ−ヘリックス構造に対する一次配列の欠失、挿入および置換の効
果の最初の決定は、変異体Ｃ−ペプチドがＮ−ペプチドの構築された形態と相互
作用して６個ヘリックス束を形成する能力を解析することよって行うことができ
る。相互作用してこの構造を形成するＣ−ペプチドは、本発明におけるそれらの
使用に適合すると考えられる。これは、円偏光二色性を使用して行うことができ
る。
【００９３】 種々のＨＩＶ株に由来するＮ−ヘリックスドメインペプチド配列の例として、
以下のペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（すべてＮ末端からＣ末
端の方向に記載する）： ＨＩＶ−１グループＭ：サブタイプＢ単離株：ＬＡＩ
【化１２】
【００９４】 サブタイプＢ単離株：ＡＤＡ
【化１３】
【００９５】 サブタイプＢ単離株：ＪＲＦＬ
【化１４】
【００９６】 サブタイプＢ単離株：８９.６
【化１５】
【００９７】 サブタイプＣ単離株：ＢＵ９１０８１２
【化１６】
【００９８】 サブタイプＤ単離株：９２ＵＧ０２４Ｄ
【化１７】
【００９９】 サブタイプＦ単離株：ＢＺ１６３Ａ
【化１８】
【０１００】 サブタイプＧ単離株：ＦＩ．ＨＨ８７９３
【化１９】
【０１０１】 サブタイプＨ単離株：ＢＥ．ＶＩ９９７
【化２０】
【０１０２】 サブタイプＪ単離株：ＳＥ．ＳＥ９２８０９
【化２１】
【０１０３】 グループＮ単離株：ＣＭ．ＹＢＦ３０
【化２２】
【０１０４】 グループＯ単離株：ＣＭ．ＡＮＴ７０Ｃ
【化２３】
【０１０５】 種々のＨＩＶ株に由来するＣ−ヘリックスドメインペプチド配列の例として、
以下のペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（すべてＮ末端からＣ末
端の方向に記載する）： ＨＩＶ−１グループＭ：サブタイプＢ単離株：ＬＡＩ
【化２４】
【０１０６】 サブタイプＢ単離株：ＡＤＡ
【化２５】
【０１０７】 サブタイプＢ単離株：ＪＲＦＬ
【化２６】
【０１０８】 サブタイプＢ単離株：８９.６
【化２７】
【０１０９】 サブタイプＣ単離株：ＢＵ９１０８１２
【化２８】
【０１１０】 サブタイプＤ単離株：９２ＵＧ０２４Ｄ
【化２９】
【０１１１】 サブタイプＦ単離株：ＢＺ１６３Ａ
【化３０】
【０１１２】 サブタイプＧ単離株：ＦＩ．ＨＨ８７９３
【化３１】
【０１１３】 サブタイプＨ単離株：ＢＥ．ＶＩ９９７
【化３２】
【０１１４】 サブタイプＪ単離株：ＳＥ．ＳＥ９２８０９
【化３３】
【０１１５】 グループＮ単離株：ＣＭ．ＹＢＦ３０
【化３４】
【０１１６】 グループＯ単離株：ＣＭ．ＡＮＴ７０Ｃ
【化３５】
【０１１７】 ペプチドおよびコンジュゲートは、ＮＨ2末端でアシル化、ＣＯＯＨ末端でア
ミド化してもよい。
【０１１８】 他のウイルス由来の融合活性領域に由来する有用なペプチドとして以下のペプ
チドが挙げられる。 ＲＳＶに関して：
【化３６】 ＨＰＩＶ３に関して：
【化３７】 麻疹ウイルスに関して：
【化３８】
【０１１９】 有用な更なるペプチドは、本明細書の一部を構成する、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９
６／１９４９５、および米国特許第６,０２０,４５９号、同第６,０１７,５３６
号、同第６,０１３,２６３号、同第６,００８,０４４号および同第６,０１５,８
８１号に記載されている。ペプチドおよびコンジュゲートはＮＨ2末端でアシル
化、ＣＯＯＨ末端でアミド化してもよい。適当なＮ−ヘリックスおよびＣ−ヘリ
ックスペプチドの混合物およびコンジュゲートを用いて、侵入関連中間体立体構
造および構造に対する抗体を生じさせることができる。ペプチドは、単独で使用
して適当なウイルス膜タンパク質または糖タンパク質に対する抗体を生じさせる
ことができる。
【０１２０】 ペプチドおよびコンジュゲートは、保存的なアミノ酸の置換を含んでいてもよ
い。保存されたアミノ酸置換は、同様の電荷、大きさおよび／または疎水性の特
性を有するアミノ酸による、ペプチド配列の１またはそれ以上のアミノ酸の置換
からなる、例えば、グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）へのアミノ酸置
換。保存的な置換のみが行なわれる場合、得られるペプチドは、そのペプチドを
誘導したペプチドと機能的に等価である。
【０１２１】 本明細書に記載されたペプチド配列は、以下のとおり、アミノ酸残基について
の１文字表記で示される：
【表１】
【０１２２】 本発明において有用なペプチドおよびコンジュゲートは、単一のアミノ酸残基
または２〜１５アミノ酸の範囲の残基の鎖からなるアミノ酸挿入を含んでいても
よい。１またはそれ以上の挿入を、ペプチド、ペプチド断片、アナログおよび／
またはホモローグに導入してもよい。
【０１２３】 本発明に有用なペプチドおよびコンジュゲートは、全長ペプチド、アナログお
よび／またはホモローグのアミノ酸欠失を含んでいてもよい。そのような欠失は
、全長ペプチド配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の削除からなり、得られ
るペプチドの下限の長さは４〜６アミノ酸である。そのような欠失は、ペプチド
配列のうちの１つの連続した部分または１つより多くの分離した部分を含んでい
てもよい。 その他の有用な抗体を以下に記載する： ｇｐ４１を標的とする唯一の広範に中和する抗体である２Ｆ５モノクローナル抗
体。この抗体は、ＨＩＶ−１単離株の７２％が保存されているエピトープである
、ＡＩＤＳｇｐ４１から得られる外ドメインの線状アミノ酸配列に位置付けられ
； 融合活性型のｇｐ４１における６個ヘリックス束に結合することが示されている
モノクローナル抗体、ＮＣ−１、は、Ｎ−およびＣ−ヘリックスドメインを形作
るペプチドの混合物で免疫したマウスから産生させクローニングした。ＮＣ−１
は、αヘリックスコアドメインおよびｇｐ４１のオリゴマー形態の両方に特異的
に結合する。この立体構造に依存する反応性は、ｇｐ４１のＮ末端コイルドコイ
ル領域内での、ｇｐ４１コアの形成を阻害するポイントミューテーションにより
劇的に減少する。ＮＣ−１は、可溶性ＣＤ４の存在下でのみ、ＨＩＶ−１感染細
胞の表面に結合する。
【０１２４】 免疫原の調製 免疫原は、いくつかの異なる経路によって調製することができる。構築物は、
合成ペプチドから作製することができる。これには、各配列をペプチドモノマー
として調製した後、合成後の修飾によって適当なオリゴマー構造を作製すること
が含まれる。ペプチドは、標準的な固相法によって合成される。三量体のコイル
ドコイル構造を作製するために、Ｐ−１７ペプチドモノマーをオリゴマー形成に
資する条件下で溶解させる。これらの条件には、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４
．５）および１００μＭのペプチド濃度が含まれる（Wild, C., et al., Proc.
Natl. Acad Sci. USA 89 : 1053710541 (1992)）。これらの条件下で形成する構
造は、場合により、化学的な架橋により、例えばグルタルアルデヒドを用いて、
安定化させることができる。
【０１２５】 あるいは、この構築物の構成成分に対するかもしれない架橋過程の破壊的な作
用を回避するために、三量体のコイルドコイル構造を安定化するための分子内ジ
スルフィド結合形成を利用するプロトコルを用いることができる。この方法は、
ペプチド配列内の適当に配置させたシステイン残基の酸化を利用してオリゴマー
構造を安定化するものである。これには、Ｐ−１７ペプチドのＮ末端への短いリ
ンカー配列が必要である。この方法によって形成される三量体のコイルドコイル
構造は、システイン残基の挿入によって安定化される。この三量体は、サイズ排
除クロマトグラフィーによって、残存したモノマーとともに、高次のオリゴマー
形態から分離し、分析用超遠心によって特徴付けることができる。これらの共有
結合により安定化したコイルドコイルオリゴマーは、６個ヘリックス束の形成の
ためのコア構造として供する。
【０１２６】 ６個ヘリックス束の調製を達成するために、Ｎ−ヘリックスコイルドコイル三
量体にＰ−１８ペプチドまたはＰ−１６ペプチドの過剰量を加える。インキュベ
ーションした後、これら２つのペプチドの特異的な会合の高次構造の生成物を安
定化するために反応混合物を架橋手順に付す。所望の材料をサイズ排除クロマト
グラフィーによって単離し、分析的超遠心によって特徴付けることができる。Ｐ
−１８またはＰ−１６ペプチドのみに対応する免疫原は、特異的な合成後の修飾
を必要としない。この方法を用いて、３つの別個の標的構築物を迅速且つ大量に
作製する。
【０１２７】 標的免疫原を調製するための別の方法は、組換えｇｐ４１断片を産生する細菌
発現ベクターを使用するものである。本発明の侵入関連免疫原形成することが可
能なペプチドおよびポリペプチドを生じる発現ベクターの使用は、免疫原調製に
おいてある一定の水準の汎用性を付加する。
【０１２８】 抗原標的の新しい修飾された形態は、より理解されているＨＩＶ−１侵入の構
造的な決定因子として考えられる。組換え法は、これらの変化に迅速に順応する
。さらに、この製造方法は、様々な構築物の容易な修飾を可能にする（即ち、免
疫原性を高めるための、組換えｇｐ４１断片へのＴ細胞またはＢ細胞エピトープ
の付加）。最後に、これらの組換え構築物は、ウイルス侵入の過程においてｇｐ
４１において形成し機能するさらなる構造成分に貴重な洞察をもたらすためのツ
ールとして利用することができる。
【０１２９】 小さなタンパク質の発現のために、特に、細菌発現ベクター（デューク大学の
Terrance Oas博士より寄贈）を開発した。このプラスミド、ｐTCLE-G2Cは、ｐＡ
ＥＤ−４、Ｔ７発現ベクターに基づいている。修飾ＴｒｐＬＥ（Yansura, D. G.
, Methods Enzymol. 185 : 161-166 (1990)）融合ペプチドをＴ７プロモーター
（Studier, F. W., et al., Methods Enzymol. 185 : 60-89 (1990)）の後に挿
入した。メチオニンをコードするＴｒｉｐＬＥペプチドの末端にＮｄｅＩ部位が
インフレームで存在し、臭化シアン（ＣＮＢｒ）開裂部位を生じる。このベクタ
ーは、Ｐ−１７ペプチドの組換え形態を発現させるために初期の実験に使用され
（Calderone, T. L., et al., J. Mol. Biol. 262 : 407-412 (1996)）、Ｐ−１
８ペプチドおよびＰ１７／Ｐ１８キメラタンパク質を発現させるために修飾され
ている。
【０１３０】 ６個ヘリックス疎水性コア構造を作製するために、ｇｐ４１のいくつかの７残
基反復（例えばＰ−１７またはＰ−１５）領域および膜近位両親媒性αヘリック
ス（例えばＰ−１６またはＰ−１８）断片をアミノ酸残基のフレキシブルなリン
カーで分離した。例えば、（ＧＧＧＧＳ）x［ｘは１、２または３である］（配
列番号７）をベクター内にコードさせることができる。これは標準的なＰＣＲ法
によって行われる。（ＧＧＧＧＳ）x（配列番号７）リンカーモチーフは、発現
ベクターのＰ−１７コード領域とＰ−１８コード領域とを連結する合成オリゴヌ
クレオチドによってコードされる。
【０１３１】 すべての構築物は、複数の制限酵素消化と配列決定によって特徴付けられる。
多重成分の相互作用を達成するこの方法の成功が、最近になって実証された（Hu
ang, B., et al., J. Immunol. 158 : 216-225 (1997)）。
【０１３２】 発現後、組換えｇｐ４１断片をインクルージョンボディーとして単離し、臭化
シアンによってリーダー配列から切り離し、サイズ排除クロマトグラフィー工程
（ＳＵＰＥＲＤＥＸ７５）により、リーダー副生成物から分離する。このプロト
コルは、Ｐ−１７ペプチドの大量の修飾物の精製において成功裏に使用されてい
る（Calderone, T. L., et al., J. Mol. Biol. 262 : 407-412 (1996)）。組換
え構築物（２）および（３）を、非変性条件下で等モル量で混合して、６個ヘリ
ックス疎水性コア構造を生じさせる。構築物（１）および（４）は、分子間また
は分子内で折畳まれて、同じまたは同様の構造を生じる。所望の生成物をＳＵＰ
ＲＥＲＤＥＸ７５ＦＰＬＣカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより
精製し、ベックマンＸＬ−Ａ型分析用超遠心を用いて分子量により特徴付ける。
【０１３３】 抗体の作製とキャラクタリゼーション 新規のｇｐ４１エピトープ構築物に対する抗体の作製とキャラクタリゼーショ
ンは、本発明の第２の態様である。実験用血清およびモノクローナル抗体を生物
物理学的および生物学的評価に付する。
【０１３４】 融合関連に対する抗体の調製については、様々な宿主動物を示差的に発現した
またはパスウェイ遺伝子またはその部分で注射することにより免疫することがで
きる。そのような宿主動物として、ウサギ、マウス、およびラットといった２〜
３の例が挙げられるが、これに限定されない。免疫学的応答を高めるために、宿
主の種によって、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどの
ミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン等の表面
活性剤、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、
次にトロフェノール、およびＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）およびコリネ
バクテリウム・パルヴム等の潜在的に有用なヒトアジュバントを含む、様々なア
ジュバントを用いることができる。
【０１３５】 ポリクローナル抗体は、上記の融合関連ペプチドまたはその混合物またはコン
ジュゲートなどの、抗原で免疫された動物の血清から得られた抗体分子の異成分
から成る集合体である。ポリクローナル抗体の調製について、本明細書に記載し
たような宿主動物を、場合によりアジュバントを添加した１またはそれ以上のペ
プチドまたは組換えタンパク質で注射することにより免疫することができる。
【０１３６】 特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、培養物中
で連続継代細胞系による抗体分子の産生をもたらす任意の技術によって得ること
ができる。これらには、Kohler および Milsteinのハイブリドーマ法（Nature 2
56 : 495-497 (1975) ; and U. S. Pat. No. 4, 376, 110）、ヒトＢ細胞ハイブ
リドーマ法（Kosbor et al., Immunology Today 4 : 72 (1983）；Cole et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 2026-2030 (1983))、およびＥＢＶ−ハイブ
リドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)）が含まれるがこれに限定されない。そのよ
うな抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む免疫グロブリンク
ラスのいずれかおよびそのサブクラスである。 in vivo でのモノクローナル抗
体の高い力価での産生によって、これがやがて好ましい製造方法となる。
【０１３７】 抗体は確立されたプロトコルにしたがって作製することができる。動物に関す
る実験（免疫、採血およびハイブリドーマ産生）はすべて、標準的な方法によっ
て実施する。第１の免疫原のセットは、ペプチド構築物Ｐ−１５またはＰ−１７
（場合により化学的な架橋結合または酸化により安定化されている、三量体コイ
ルドコイルマルチマーを形成することが可能な）、Ｐ−１６またはＰ−１８、お
よびＰ−１７／Ｐ−１８混合物またはＰ−１５／Ｐ−１６混合物（ここで、ペプ
チドは場合により化学的にまたは酸化的に架橋結合している）からなる。１つの
一連の実験において、免疫原をＫＬＨ等の担体に担持させる。
【０１３８】 Ｂａｌｂ−ｃマウスは、これら構築物のそれぞれで免疫する。マウスにＫＬＨ
に担持させた抗原１００μｇで免疫する。最初の免疫後、１４日目に１００μｇ
、次いで３０および４５日目に５０μｇを動物にブーストする。最初のブースト
から２週間後にマウスを出血させる。さらに、ペプチド免疫原について概説した
のと同じ様に、組換え構築物でマウスを免疫する。
【０１３９】 免疫の別法として、一次免疫原として、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質
ｇｐ１２０／ｇｐ４１の全部または一部を発現する組換えアデノウイルスベクタ
ーを使用し、次いでｇｐ４１ペプチド、タンパク質またはその他の構築物でブー
スター免疫することが挙げられる。
【０１４０】 試料は、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングして抗体結合のキャラクタリゼーシ
ョンを行うことができる。抗原パネルは、すべての実験用免疫原を含む。１また
はそれ以上の実験用免疫原に対する結合について陽性と試験される血清試料を有
する動物は、モノクローナル抗体産生に使用するための候補である。この最初の
スクリーニングの後、モノクローナル抗体産生のために、各実験用免疫原を示す
１匹の動物を選択する。
【０１４１】 ハイブリドーマ上清を、構築されたおよび構築されていないペプチドおよび組
換え体に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。ＥＬＩＳＡが陰性あるい
は弱い陽性である試料をさらにＩｇＧについて特徴付ける。ＩｇＧが存在してい
れば、その物質を生物物理学的および生物学的分析においてスクリーニングする
。強い陽性の試料は、ウイルスを中和するおよびエンベロープを結合する能力に
ついてスクリーニングする。
【０１４２】 種々の条件下で、ＨＩＶエンベロープを結合する能力について抗体を詳細に特
徴付ける。ネイティブのエンベロープに結合する抗体の検出のために、インタク
トであるものおよび溶解したモノの両方の、Ｅｎｖ−発現細胞およびビリオンに
おける免疫沈降は、非イオン性界面活性剤を用いて行う（Furata, RA et al., N
at. Struct. Biol. 5 (4) : 276-279 (1997) ; White, J. M. and I. A. Wilson
, J. Cell Biol. 105 : 2887-2894 (1987) ; Kemble, G. W., et al., J. Virol
. 66 : 4940-4950 (1992)）。細胞リゼートおよびインタクトなビリオンに対す
る抗体結合も、ＥＬＩＳＡ法で分析する。フローサイトメトリー実験は、エンベ
ロープ発現細胞に対する結合を測定するために行う。他のマッピングされたモノ
クローナル抗体、ヒト血清およびペプチドを用いる交差競合実験も行うことがで
きる。立体構造の変化に対する「誘発因子」を特徴付けるために、抗体結合をｓ
ＣＤ４および標的細胞の存在下および非存在下で比較することができる（White,
J. M. and I. A. Wilson, J. Cell Biol. 105 : 2887-2894 (1987) ; Kemble,
G. W., et al., J Virol. 66 : 4940-4950 (1992)）。ｇｐ４１領域は高度に保
存されているので、構造における可能性のある相違を識別するために、いくつか
の異なるエンベロープを用いてエピトープの露出を、主な、実験室に適合した単
離株および遺伝的に多様化したウイルス単離株の間で比較することができる。
【０１４３】 ウイルスエンベロープに対するペプチド抗血清の結合をイムノブロットおよび
免疫沈降（ＩＰ）分析を用いて解析する。これら分析の結果は、ある特定のペプ
チドおよび組換えｇｐ４１断片が融合活性型のエンベロープ結合因子を正しく形
作ることを示している。ウェスタンブロット実験の結果は、ウイルスエンベロー
プ決定因子に対する強い結合を示す、より安定に構築された免疫原に対して惹起
された抗血清を用いたＥＬＩＳＡ分析から得られた結果と大体似ている。リゼー
ト免疫沈降分析では、ｇｐ４１ならびにＰ１５、Ｐ１７およびＰ１５／Ｐ１７混
合ペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清は、ウイルス膜貫通タンパク質
を沈降させる。これらの結果は、Ｎ−ヘリックスペプチドおよびＮ−およびＣ−
ヘリックスペプチドの混合物およびｇｐ４１がいずれも、ネイティブのウイルス
エンベロープでみられる構造に対する抗体を生じることを示している（ＦＩＧ.
６ａ）。
【０１４４】 融合活性型のｇｐ４１決定因子に対する抗体を生じるこれら免疫原の能力をさ
らに測定するために、一連の表面免疫沈降分析を行った。これらの実験は、受容
体誘発の前または後の細胞表面発現したエンベロープに対する抗体結合のキャラ
クタリゼーションを可能にする。この分析法は、非フソジェニックおよび融合活
性型のエンベロープの両方にみられるエピトープの試験が可能である。これらの
実験において可溶性のおよび細胞発現した形態の両方におけるＣＤ４を、ｇｐ４
１活性化の誘発因子として利用する。結果は、Ｎ−ヘリックスペプチド、Ｎ−お
よびＣ−ヘリックスペプチドの混合物、およびｒｇｐ４１の両方が融合活性型の
構造に対する抗体を生じることを示している（ＦＩＧ．６ｂ）。ＣＤ４誘発後の
、６個ヘリックス束に対して生じた抗血清により大きく増加した結合は、ウイル
ス侵入における、このｇｐ４１決定因子の提案された役割と一致するものである
。
【０１４５】 ＥＬＩＳＡ分析 Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレートを１μｇ／ウェルのペプチドでコ
ートする。所望の希釈率の試料約１００μＬを２個１組で加え３７℃で２時間イ
ンキュベーションする。ハイブリドーマ上清はそのまま試験し、ポリクローナル
血清は、１：１００の初濃度、次いで４倍希釈で分析する。インキュベーション
した後、試料を除去し、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄
し、１００μＬ／ウェルの希釈したホスファターゼ標識した二次抗体（Sigma）
を加える。二次抗体−コンジュゲートを、ブロッキング緩衝液中で１：１５００
の最終濃度に希釈して加える。室温でインキュベーションした後、プレートを洗
浄し、基質（Sigma ファーストｐ−ニトロフェニルホスフェート）を加える。発
色させた後、プレートを４０５ｎｍで読み取る。
【０１４６】 ウエスタンブロット分析 市販のＨＩＶ−１ウェスタンブロットストリップを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０
．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で予め湿らせる。試料を緩衝液（ＰＢＳ、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％濃縮ミルク）中で、ハイブリドーマ上清に対して１：
５、ポリクローナル血清に対して１：２００の終濃度に希釈し、ストリップに加
える。インキュベーション（浸透しながら２時間）した後、洗浄緩衝液でストリ
ップを洗浄する（３×５分間隔）。ペルオキシド標識した二次抗体（Kirkgaard
& Perry Laboratories）を、１：５０００の濃度で加えて、浸透しながら１時間
インキュベーションする。ストリップを、記述の通りに再び洗浄し、ＴＭＢ基質
を加える。水を添加することにより発色を止める。
【０１４７】 リゼート免疫沈降分析 ハイブリドーマ上清または免疫血清（immunosera）を、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ細
胞リゼート４．２μＬを含有する２００μＬのＰＢＳ中で、４℃にて一晩インキ
ュベーションする。リゼートは、Ｈ９細胞系の急性感染から調製する。タンパク
質ＡおよびＧアガロースの添加により免疫複合体を沈降させ、洗浄し、１０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＯＶＥＸ）により解析し、ニトロセルロースに転写し、抗ｇ
ｐ４１モノクローナル抗体Chessie 8（NIH AIDS Research and Reference Reage
nt Programより入手）でイムノブロッティングを行い、化学発光分析（Amersham
）およびオートラジオグラフィーによって検出する。
【０１４８】 表面免疫沈降分析 エンベロープ発現細胞は、リポフェクトアミン法（Gibco BRL）を用い、Ｒｅ
ｖ発現ベクター（カリフォルニア大学（カリフォルニア州、サン・フランシスコ
）のTris Parslow氏により提供）およびＥｎｖ発現ベクターｐＳＭ−ＷＴ（ＨＸ
Ｂ２）（ニューヨーク大学（ニューヨーク州、ニューヨーク）のDan Littman博
士により提供）により、ヒト２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクションすること
により調製することができる。ケモカインレセプターを有するおよび有しない、
ＣＤ４を発現するＵ８７細胞は、Littman博士により提供される。あるいは、実
験室に適合した細胞系または一次リンパ球細胞の急性感染により、エンベロープ
発現細胞を調製することができる。表面免疫沈降：感染後２日目に、５×１０6
Ｅｎｖ−発現２９３Ｔ細胞を、可溶性ＣＤ４（Intracell Inc.）（終濃度４μＭ
）または適当な標的細胞（培地０.５ｍL中、５×１０6細胞）の存在下および非
存在下で、０.５ｍLのDulbecco修飾Eagle培地（ＤＭＥＭ）中、所望の温度にて
１時間インキュベーションする。２μLの免疫血清またはハイブリドーマ上清を
加え、さらに１時間インキュベーションさせる。リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ
）で細胞を２回洗浄し、２００μLの溶解緩衝液（１％ Triton X-100、１５０ｍ
Ｍ ＮaＣl、５０ｍＭ Ｔris−ＨＣl、ｐＨ７. ４）で溶解する。透明化した上清
を１２.５μＭタンパク質Ａ−アガロース／１２.５μＭタンパク質Ｇ−アガロー
ス（GIBCO BRL）の混合物と、４℃にて１時間インキュベーションし、溶解緩衝
液で洗浄（３×）する。免疫沈降した複合体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＯＶ
ＥＸ）によって解析し、ニトロセルロースに転写し、抗ｇｐ４１モノクローナル
抗体Chessie 8（NIH AIDS Research and Reference Reagent Programより入手）
でイムノブロッティングを行い、化学発光分析（Amersham）およびオートラジオ
グラフィーによって検出する。
【０１４９】 免疫沈降実験 一連の抗体を表面免疫沈降分析によって、ｇｐ１２０／ｇｐ４１＋細胞とｓＣ
Ｄ４または種々の受容体およびコレセプターの組合せを発現している細胞との相
互作用の後に、ＨＸＢ２ ｇｐ４１に結合する能力について試験する。ＣＤ４の
表面発現した形態および二次レセプターは、ＣＤ４のみ、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４、
およびＣＤ４＋ＣＣＲ５を選択的に発現するように処理を施されたＵ８７細胞系
により提供される。それぞれの場合において、インキュベーションを３７℃にて
種々の時間（以下に記載するように、はじめは５分、１、４、１２時間）行い、
次いで、４℃に冷却して免疫沈降を行っている間の更なる変化を制限する。免疫
沈降は、上記のようにして行う。
【０１５０】 エンベロープ発現細胞の調製 エンベロープ発現細胞は、ＣＤ４および適当なケモカインレセプターを発現す
るＵ８７細胞を、高感染多重度（ＭＯＩ）の所望の一次ウイルス単離株で感染さ
せることによって調製する。我々は、そのパネルに含まれるＨＩＶ−１単離株の
それぞれの生育を特徴付け、Ｕ８７細胞系においてすべて十分に感染し複製され
ていると決定付けた。各ウイルス単離株について、与えられたＭＯＩでのエンベ
ロープ発現のレベルを、記述のイムノブロット法によって決定した。各ＨＩＶ単
離株について、それぞれのケースで同様のエンベロープ発現レベルを与えるよう
にＭＯＩを調整する。表面免疫沈降分析は上記のようにして行う。
【０１５１】 実施例１ 抗体の形成 ｇｐ４１の６個ヘリックス束に対するモノクローナル抗体は、標準的な方法に
よって調製する。使用した免疫原は、ウイルス侵入事象に関与するエンベロープ
タンパク質または糖タンパク質のＮ−およびＣ−ヘリックスドメインをモデル化
した合成ペプチドの物理的混合物からなる。免疫原は、Ｎ−およびＣ−ヘリック
スｇｐ４１ドメインをモデル化した合成ペプチドの物理的な混合物からなる。
【化３９】
【０１５２】 ４匹のｂａｌｂ−ｃマウスをこの混合構築物で免疫する。最初の免疫（１００
μｇ）の後、１４日目に１００μｇを、３０および４５日目に５０μｇを動物に
ブーストする。最初のブーストから２週間後に出血させる。実験動物の免疫によ
って作製したモノクローナル血清を、結合を特徴付けるＥＬＩＳＡによってスク
リーニングする。ＥＬＩＳＡにより試験の結果結合が陰性の血清試料を破棄する
。試験の結果、実験免疫原に対する結合が陽性である血清試料を有する動物は、
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）製造における使用の候補である。この最初のスク
リーニングの後で、少なくとも１匹の動物をＭＡｂ製造のために選択する。この
選択の判断基準は、同起源の免疫原に対するエンベロープ結合パターンに基づく
。ハイブリドーマ上清を混合ペプチド免疫原に対するＥＬＩＳＡによってスクリ
ーニングする。ＥＬＩＳＡ陰性である試料を破棄する。強い陽性の試料を、ウイ
ルスエンベロープを結合するそれらの能力についてスクリーニングする。この方
法を用いて、ｇｐ４１の６個ヘリックス束に対して一連のモノクローナル抗体を
作製する。
【０１５３】 実施例２ ウイルス融合インヒビターの分析 トラスフェクションから２日後、ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２エンベロープを一時的
に発現したインタクトな２９３Ｔ細胞を試験化合物の存在下でインキュベーショ
ンする。１時間後、２μｇの可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）またはＣＤ４を発現する
細胞系を加える。さらに１時間後、６個ヘリックス束構造に対するモノクローナ
ル抗体を１０μｇ／ｍLの濃度で加え、混合物を２５℃で３時間インキュベーシ
ョンする。このインキュベーション後、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、１ｍLの溶
解緩衝液（１％Triton X-100、１５０ｍＭ ＮaＣl、および５０ｍＭ Ｔris−Ｈ
Ｃl、 pＨ７.４）で溶解する。透明になった上清を、２５μLのプロテインＡ−
アガロース、１２５μLプロテインＧ−アガロース（ＧＩＣＯＢＲＬ）と、４℃
にて一晩インキュベーションし、溶解緩衝液で３回洗浄する。免疫沈降した複合
体を１０％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルで解析し、ニトロセルロースに移し、抗ｇｐ４
１モノクローナル抗体Chessie 8（NIH AIDS Research and Reference Reagent P
rogramより入手）でイムノブロッティングを行い、化学発光分析およびオートラ
ジオグラフィーによって検出する。試験化合物は、モノクローナル抗体がＨＩＶ
−１ｇｐ４１タンパク質を免疫沈降することができない、または免疫沈降する能
力を有意に減少させるならば、６個ヘリックス束の破壊について陽性であると考
えられる。
【０１５４】 実施例３ ウイルス融合インヒビターとしてジメチルサクシニルベツリン酸を使用する分析 本明細書において概説する分析は、その使用者が、試験化合物がウイルス侵入
に必要なＨＩＶ−１ｇｐ４１立体構造の変化を破壊するかどうかを測定すること
が可能な細胞ベースの系からなる。これらクリティカルな立体構造変化を破壊す
る、試験化合物の能力は、ｇｐ４１コア構造の形成を特徴付けることによって評
価する。このマルチマー構造は、ｇｐ４１のＮ−およびＣ−ヘリックスドメイン
（ＦＩＧ７ｂ）の相互作用によって形成される。この分析の１つの形態において
、検出工程はそのコア構造に特異的な抗体（モノまたはポリクローナル）を用い
る。
【０１５５】 与えられた化合物がｇｐ４１の立体構造変化を破壊する能力と、ウイルス複製
の阻害との相関関係を確立するために、以下の実験を計画した。分析は、免疫沈
降（ＩＰ）分析法の修飾であり、試験化合物と、インタクトな、ｇｐ１２０／ｇ
ｐ４１エンベロープ複合体をその表面に発現しているウイルス感染細胞とをイン
キュベーションすることを含んでいる。ウイルス侵入に必要なｇｐ４１の立体構
造変化は、標的細胞レセプターＣＤ４の可溶型か、ＣＤ４をその表面に発現して
いる非感染標的細胞の添加のいずれかによって誘発した。コア構造に特異的な抗
体（Ａｂ）を加えた。コア構造形成は、Ａｂ結合を可能にし、ゲル電気泳動を用
いて特徴づけおよび定量ができるＡｂ／コア構造複合体を免疫沈降させる。簡単
にいえば、コア構造形成の場合、（立体構造変化の破壊）をウェスタンブロット
によって免疫沈降させて可視化する。ｇｐ４１は免疫沈降されなかったか見えな
かった。これらの実験では、試験化合物の能力をコア構造形成のその効果を測定
することによって測定した。
【０１５６】 コア形成につながる段階を破壊する能力について、いくつかの化合物を、以下
のようにして測定した： この実験では、ジメチルサクシニルベツリン酸（ＤＳＢ）を２種類の異なる濃
度で分析した。ＦＩＧ８に示されるように、試験化合物の非存在下でｓＣＤ４誘
発の後に免疫沈降したｇｐ４１の量（レーン１）は、１０Ｍg／ｍLのＤＳＢ（レ
ーン２）の存在下で免疫沈降したｇｐ４１の量よりも有意に多い。試験化合物を
１００μｇ／ｍLの量で加えると（レーン３）、免疫沈降したｇｐ４１の量は、
ＣＤ４誘発の非存在下で記録されたレベル（レーン４）と同じ位までさらに減少
する。
【０１５７】 細胞表面で発現したエンベロープではなく、ＨＩＶ−１エンベロープリゼート
を用いた実験を行うことにより、ＤＳＢの結果がコア構造形成の破壊に起因する
ものであり、コア構造に結合する抗体の阻害ではないことがさらに実証された。
この系ではコア構造は、試験化合物の添加前に存在しており、試験化合物がコア
ク構造に対する抗体の結合を阻害するならば、表面免疫沈降法において観察され
るのと同様の効果が観察されるであろう（ＦＩＧ８参照）。しかし、抗体結合の
減少は観察されなかった。１０μｇ／ｍL（レーン１）および１００μｇ／ｍL（
レーン２）のＤＳＢ濃度では、化合物なしの対照（レーン６）と同等のｇｐ４１
の量が回収される（ＦＩＧ９）。
【０１５８】 実施例４ 非感染性８Ｅ５／ＬＡＶウイルス粒子の調製 ８Ｅ５／ＬＡＶウイルス粒子は、欠損（悲感染性）ＨＩＶ−１粒子の合成のた
めにコードするプロウイルスＤＮＡの１つの統合されたコピーを含むＴ細胞クロ
ーンの産物である（Folks, T. M., et al., J. Exp. Med. 164 : 280-290 (1986
)）。この細胞系８Ｅ５／ＬＡＶは、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（Ｉ
ＵｄＲ）に繰り返し暴露することによりＬＡＶ（ここではＨＩＶ−１IIIBと称す
る）で感染した、Ａ３.０１親細胞系（ＣＤ４＋ＣＥＭ誘導体）から誘導した。
このクローニングされた細胞系によって産生されたウイルスは、非機能的な逆転
写を生じる非感染性ウイルス粒子の形成をもたらす、ｐｏｌ遺伝子に１つの塩基
対の付加（第３２４１番）を含んでいる（Gendelman, H. E., et al., Virology
160 : 323-329 (1987)）。この突然変異ウイルスのキャラクタリゼーションか
ら、その他の構造遺伝子産物（ｇａｇおよびｅｎｖ）は正常に産生し、構築され
てレトロウイルス粒子を形成することが分かった。
【０１５９】 ８Ｅ５／ＬＡＶ細胞系を、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ１
６４０培地にて培養する。５×１０5細胞／ｍLの初密度で２日間培養した培養細
胞は、培養上清中で約１０8／ｍLの濃度のウイルス粒子になる（電子顕微鏡によ
り測定）。回収日に、細胞を低速（１５００ＲＰＭ）で遠心することによって取
り出し、培養細胞上清を０.４５μｍフィルターで濾過することによって透明に
する。ウイルス粒子は、超遠心（２６０００×ｇ、５時間、Sorval TFA 20.250
ローター、４℃）により小さな培養副産物から分離する。ウイルスペレットを０
.１倍の容量のＰＢＳ中で懸濁し、ＥＭ（ABI，Columbia，MD）により定量する。
使用するまでウイルス粒子を−７０℃で保存する。
【０１６０】 実施例５ ｓＣＤ４−ウイルス混合物の形成 非感染性ウイルスをＰＢＳ中に懸濁して、最終濃度約１０8粒子／ｍLにする。
可溶性ＣＤ４（分子量４６，０００）を加え（終濃度２ｍｇ／ｍL）、混合物を
３７℃で４時間インキュベーションする。終了時に、サイズ排除クロマトグラフ
ィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０）またはスクロース勾配による超
遠心のずれかによって、混合物を複合体化していないｓＣＤ４から分離する。
【０１６１】 上記で特定の好ましい態様について記述したが、本発明がそのように限定され
ないことは理解されよう。様々な修飾を開示された態様に対して行うことができ
、そのような修飾が、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である
と意図されることは当業者には想到される。
【０１６２】 本明細書において言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が
属する分野の当業者の技術レベルを示すものである。すべての刊行物、特許およ
び特許出願は、個々の刊行物または特許出願が、それぞれ、具体的におよび個別
にその全体が参考として援用されるように、同じ程度に、本明細書において参考
として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ウイルス進入の媒介におけるｇｐ４１の仮定的な役割を説明する
ものである。ネイティブな状態では、ＨＩＶ−１エンベロープ複合体は、非フソ
ジェニック（non-fusogenic）形態で存在する。ＣＤ４（ある場合にはケモカイ
ン）結合の後、プレ−ヘアピン中間体の形態をとる。この時点で、膜貫通タンパ
ク質であるｇｐ４１が伸張した立体構造をとり、Ｎ−およびＣ−ヘリックス領域
はまだ会合していない。この中間体は６個ヘリックス束（ヘアピン中間体）の形
成へと進行する。この束の形成は、ウイルスと細胞膜を互いに近づくよう引き寄
せることによってウイルス標的細胞融合の促進に寄与する。阻害ペプチドのよう
なインヒビターの存在下では、このペプチドとｇｐ４１の適当な相補領域との間
の相互作用によってプレ−ヘアピン中間体（伸張した立体構造）が安定化され、
「安定化されたプレ−ヘアピン中間体」を形成する。このプレ−ヘアピン中間体
の安定化によって、６個ヘリックス束の形成が不可能になり、ウイルス侵入の防
御として有効にはたらく。この安定化されたプレ−ヘアピン中間体は、本発明の
方法で用いられる抗体を生じさせるのに有用な融合活性型免疫原の１つの形態で
ある。
【図２】 ＦＩＧ．２Ａ−２Ｃは、ｇｐ４１の融合活性型形態を捕らえて安
定化するための、エピトープ標的化ペプチド、Ｐ−１８ＨＡの使用を説明するも
のである。ＦＩＧ.２Ａは、可溶性および細胞発現したＣＤ４への結合によるＨ
ＸＢ２エンベロープの活性化後の、Ｐ−１８ＨＡによるｇｐ４１の同時免疫沈降
を示す（＋／−は、ＣＤ４の存在または非存在を示す）。ＦＩＧ．２Ｂは、抗Ｃ
Ｄ４結合抗体（Ｑ４１２０、Sigma）による、Ｐ−１８ＨＡ結合の同時免疫沈降
の防御を示す。ＦＩＧ．２Ｃは、ＨＩＶ初代ＣＣＲ５依存性単離株のエンベロー
プに対するレセプター活性化（ＣＤ４およびケモカイン両方）の効果を示す。各
パネルにおいて、*は、ＩｇＧ重鎖によるバンドを、**は、恐らくタンパク質の
分解によって生じたｇｐ４１の短い断片によるバンドを示す。
【図３】 ＨＩＶ−１ｇｐ４１の構造および抗原領域の模式図である。この
図は、抗体がｇｐ４１に結合したときに、これらの領域に生じる立体構造変化も
示している。
【図４】 ＦＩＧ．４Ａおよび４Ｂは、６個ヘリックス束構造を形成するｇ
ｐ４１のＮ−およびＣ−ヘリックスドメインの相互作用を示す模式図である。上
面図および側面図の両方を示す。束の内部はＮ−ヘリックスコイルドコイルを示
す。外部の構造部分は、Ｃ−ヘリックスドメインを示す。
【図５】 ウイルス侵入の間に形成するｇｐ４１中間体構造の模式図である
。融合中間体Ｉは、レセプター結合の直後に形成し、伸張した形態の外部領域を
示す。融合中間体ＩＩは、コア構造の形成の後のｇｐ４１を示す。阻害ペプチド
は、ドミナントネガティブな様式で、ｇｐ４１の相補領域との相互作用によって
阻害すると考えられる。
【図６】 ＦＩＧ．６Ａおよび６Ｂは、リゼート免疫沈降実験の結果を示す
。ＦＩＧ．６Ａは、Ｎ−およびＣ−ヘリックスペプチド（個々のおよび混合した
）および組換えｇｐ４１に対して生じたポリクローナル血清に関するリゼート免
疫沈降実験の結果を示す。このアッセイでは、Ｃ−ヘリックスペプチドによって
生じた血清を除き、血清はすべてＨＸＢ２ｇｐ４１を免疫沈降する。この実験に
おいて、ｓＣＤ４の存在または非存在（＋／−）は、結果に影響がなかった。Ｆ
ＩＧ．６Ｂは、同じ一連の血清を用いた表面免疫沈降実験の結果を示す。この実
験では、４種類の血清（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ１／Ｎ１混合物およびｒｇｐ４１）が、
表面発現したエンベロープのＣＤ４活性化の後のｇｐ４１に対する増大した結合
を示した。混合ペプチドおよびｒｇｐ４１血清のバンドは非常に重く、一方、Ｎ
−ヘリックスペプチド血清のバンドが非常に軽い。各パネルにおいて、*は、Ｉg
Ｇ重鎖に起因するバンドを示す。
【図７】 ＦＩＧ．７Ａおよび７Ｂは、ＨＩＶ−１ｇｐ４１の構造および抗
原領域を示す模式図である。これらの図はまた、ｇｐ４１コア構造に特異的な抗
体の結合によってこれらの領域が典型的に受ける立体構造の変化も示す。
【図８】 ２種類の異なる濃度：１０μｇ／ｍLおよび１００μｇ／ｍLのジ
メチルサクシニルベツリン酸（ＤＳＢ）を用いた細胞表面発現したエンベロープ
に対する表面免疫沈降実験の結果を示す。
【図９】 ２種類の異なる濃度：１０μｇ／ｍLおよび１００μｇ／ｍLのジ
メチルサクシニルベツリン酸（ＤＳＢ）を用いた、細胞表面発現したエンベロー
プではなくＨＩＶ−１エンベロープリゼートに対する免疫沈降実験の結果を示す
。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月２１日（２００２．１１．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】 ｇｐ４１配列ＥＬＤＫＷＡＳ（配列番号７８）を示す単離株から得られた２Ｆ
５モノクローナル抗体は、ｇｐ４１を標的とする中和抗体である（Muster, T.,
et al.. J. Virol. 67 : 6642-6647 (1993), and Muster, T., et al., J. Viro
l. 68 : 4031-4034 (1994)）。この抗体は、ＨＩＶ−１単離株に７２％に保存さ
れているエピトープであるｇｐ４１の外部ドメインの線状アミノ酸配列Ｇlu−Ｌ
eu−Ａsp−Ｌys−Ｔrp−Ａla（ＥＬＤＫＷＡ（配列番号７９））に位置付けられ
る。この抗体は線状の決定因子をマップしているが、競合実験では２Ｆ５エピト
ープは、自然状態では立体構造であると示唆される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】 これらのコンジュゲートは、好ましくは、侵入関連構造に対応するまたはこれ
を模倣する構造に折り畳まれそして構築される。形成され得る新規な構築物また
はコンジュゲートの例としては、以下が挙げられる（Ｎ−末端からＣ−末端へ読
まれる）： （１）Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８からなる３直列反復ユニット （Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８−
リンカー−Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８）、 （２）Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７、 （３）Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７−リンカー−Ｐ−１８、 （４）Ｐ−１８−リンカー−Ｐ−１７、 （５）Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６から構成される３直列反復ユニット（Ｐ−
１５−リンカー−Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６−リンカ
ー−Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６）、 （６）Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５、 （７）Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６、 （８）Ｐ−１６−リンカー−Ｐ−１５、および （９）Ｐ−１５−リンカー−Ｐ−１６ ここで、各リンカーは、同一でも異なっていてもよい、約２〜約２５アミノ酸
、好ましくは２〜約１６アミノ酸残基のアミノ酸配列である。好ましいアミノ酸
残基としては、グリシンおよびセリン、例えば（ＧＧＧＧＳ）x（配列番号７）
（ここで、ｘは、１、２、３、４または５である）が挙げられる。任意の記載さ
れた構築物において、Ｐ−１５とＰ−１７は互換可能であり、Ｐ−１６とＰ−１
８は互換可能である。そのような構築物の例 を、その構築物の組換え発現に使
用される対応する核酸配列 とともにＦＩＧ．７に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】 他のウイルス由来の融合活性領域に由来する有用なペプチドとして以下のペプ
チドが挙げられる。 ＲＳＶに関して：
【化３６】 ＨＰＩＶ３に関して：
【化３７】 麻疹ウイルスに関して：
【化３８】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】 本発明に有用なペプチドおよびコンジュゲートは、全長ペプチド、アナログお
よび／またはホモローグのアミノ酸欠失を含んでいてもよい。そのような欠失は
、全長ペプチド配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の削除からなり、得られ
るペプチドの下限の長さは４〜６アミノ酸である。そのような欠失は、ペプチド
配列のうちの１つの連続した部分または１つより多くの分離した部分を含んでい
てもよい。 その他の有用な抗体を以下に記載する： ｇｐ４１を標的とする唯一の広範に中和する抗体である２Ｆ５モノクローナル抗
体。この抗体は、ＨＩＶ−１単離株の７２％が保存されているエピトープである
、ＡＩＤＳｇｐ４１から得られる外ドメインの線状アミノ酸配列Ｇlu−Ｌeu−Ａ sp−Ｌys−Ｔrp−Ａla（ＥＬＤＫＷＡ：配列番号７９） に位置付けられ； 融合活性型のｇｐ４１における６個ヘリックス束に結合することが示されている
モノクローナル抗体、ＮＣ−１、は、Ｎ−およびＣ−ヘリックスドメインを形作
るペプチドの混合物で免疫したマウスから産生させクローニングした。ＮＣ−１
は、αヘリックスコアドメインおよびｇｐ４１のオリゴマー形態の両方に特異的
に結合する。この立体構造に依存する反応性は、ｇｐ４１のＮ末端コイルドコイ
ル領域内での、ｇｐ４１コアの形成を阻害するポイントミューテーションにより
劇的に減少する。ＮＣ−１は、可溶性ＣＤ４の存在下でのみ、ＨＩＶ−１感染細
胞の表面に結合する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 グラハム・ピー・オーラウェイ アメリカ合衆国20878メリーランド州ダー ンズタウン、ホワイト・ウォーター・ウェ イ14205番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB21 DA44 FB03 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ10 QQ20 QQ79 QR48 QR51 QS03 QS33

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルス侵入および／または融合の立体構造中間体の形成に
    対する化合物の効果を測定するための方法であって、ウイルスエンベロープタン
    パク質または糖タンパク質を誘発剤および候補化合物と接触させて混合物を形成
    した後、該候補化合物が該立体構造中間体の形成に対して有する効果を測定する
    ことを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記立体構造中間体の形成に対して候補化合物が有する前記
    効果が、該前記立体構造中間体に対する抗体の結合によって測定される、請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記立体構造中間体の形成に対して試験化合物が有する前記
    効果を、前記混合物を特異的な抗体とインキュベーションして、ウイルス侵入の
    立体構造中間体に対して結合する抗体の量が、試験化合物の存在に起因して増加
    するかまたは減少するかを決定することにより測定される、請求項１記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 前記立体構造中間体の形成に対して有する候補化合物の前記
    効果が、誘発剤と接触させる前に存在するように、ウイルスエンベロープタンパ
    ク質または糖タンパク質に結合する抗体によって測定される、請求項１記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 ウイルス侵入および／または融合の立体構造中間体の形成に
    対する試験化合物の効果を測定するための方法であって、 ａ．水性緩衝溶液中で ｉ．脂質二重層と会合した、ウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパ
    ク質であって、該エンベロープタンパク質または糖タンパク質はインタクトなウ
    イルスにおけるウイルス侵入に必要且つ十分なものであり、該エンベロープタン
    パク質または糖タンパク質はウイルス許容細胞における１またはそれ以上のレセ
    プターと相互作用することができる； ｉｉ．１またはそれ以上のウイルス許容細胞、該ウイルス許容細胞由来の１ま
    たはそれ以上の不溶性または可溶性レセプター、またはその組合せ；および ｉｉｉ．試験化合物 を混合すること；および ｂ．ウイルス許容細胞へのウイルス侵入に必要な１またはそれ以上の侵入関連構
    造または立体構造の形成に対する試験化合物の効果を測定すること を含む方法。
  6. 【請求項６】 工程ｂが、ウイルス侵入事象における立体構造または構造中
    間体に存在するエピトープに優先的に結合する、１またはそれ以上の、場合によ
    り検出可能なように標識された抗体を加えることにより行われる、請求項５記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 工程ｂが、ウイルス膜タンパク質または糖タンパク質であっ
    て、誘発剤と接触していないウイルス膜タンパク質または糖タンパク質に存在し
    ているエピトープに優先的に結合する、１またはそれ以上の、場合により検出可
    能なように標識された抗体を加えること；および 結合した抗体の量を測定すること により行われる、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 結合した抗体の測定された量を標準値と比較することをさら
    に含む、請求項６または７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ウイルスエンベロープタンパク質または糖タンパク質が、Ｈ
    ＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、呼吸器合胞体ウイルス
    （ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ニューカッス
    ル病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルス
    または麻疹ウイルスに由来する、請求項５に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記脂質二重層が、細胞、ビリオン、偽ビリオン、膜小胞
    またはリポソ−ムの形態で提供される、請求項５に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 試薬ｉｉが１またはそれ以上のリンパ球細胞である、請求
    項５に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 試薬ｉｉが１またはそれ以上の可溶性ＣＤ４レセプター、
    不溶性ＣＤ４レセプター、ケモカインレセプターまたはその混合物である、請求
    項５に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＨＩＶ−１ウイルスおよび／または融合の立体構造中間体
    の形成に対する試験化合物の効果を測定するための方法であって、 ａ．水性緩衝液中で、 ｉ．脂質二重層と会合したＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０／
    ｇｐ４１またはその断片 ｉｉ．１またはそれ以上のリンパ球、該リンパ球由来の１またはそれ以上の不
    溶性または可溶性レセプター、またはその組合せ；および ｉｉｉ．試験化合物 を混合すること；および ｂ．ウイルス許容細胞へのウイルス侵入に必要な、１またはそれ以上の侵入関連
    構造または立体構造に対する試験化合物の効果を測定すること を含む方法。
  14. 【請求項１４】 前記脂質二重層が、細胞、ビリオン、偽ビリオン、膜小胞
    またはリポソームの形態で提供される、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 試薬ｉｉが１またはそれ以上の可溶性ＣＤ４レセプター、
    不溶性ＣＤ４レセプター、ケモカインレセプターまたはその混合物である、請求
    項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０／ｇ
    ｐ４１またはその断片が非感染性ウイルス粒子の形態で提供される、請求項１３
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記測定工程が、 ウイルス侵入事象における構造または立体構造中間体であるエピトープに結合す
    る１またはそれ以上の、場合により検出可能なように標識された抗体を加えるこ
    と；および 結合した抗体の量を測定すること によって行われる、請求項１３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記測定工程が、 ウイルス膜タンパク質または糖タンパク質であって、誘発剤と接触していないウ
    イルス膜タンパク質または糖タンパク質に存在するエピトープに優先的に結合し
    、１またはそれ以上の、場合により検出可能なように標識された抗体を加えるこ
    と；および 結合した抗体の結合を測定すること によって行われる、請求項１３に記載の方法。
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