JPWO2020171020A1 - 細胞の選抜方法、核酸の製造方法、組換え細胞の製造方法、目的物質の製造方法、医薬組成物の製造方法、及び試薬 - Google Patents
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Abstract
複数のマイクロウェル2を有する基板1を提供する。各マイクロウェル2に標的細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞3を接着させる。各々のマイクロウェル2に、目的細胞の候補である1又は2個の第二細胞5を導入し、マイクロウェル2内で第一細胞3と共存させ、第二細胞5が分泌した目的物質6を第一細胞3に接触させる。目的物質6が結合した第一細胞3を含むマイクロウェル2を特定する。特定されたマイクロウェル2から、目的細胞として第二細胞5を回収する。目的物質6として抗体が例示される。標識物質7を加えて可視化してもよい。
Description
非特許文献2には、マイクロドロップレットとマイクロ流路を応用した、特異的抗体産生細胞を同定する方法の原理が記載されている。
しかしながら、この方法では、マイクロドロップレット中で抗体と抗原タンパク質の結合の有無を可視化する過程において、洗浄工程を加えることができない。そのため、細胞膜表面上に発現する量が極めて少ない細胞膜タンパク質を標的とする場合には、バックグラウンドの蛍光シグナルに比べ、抗体と抗原タンパク質の結合による蛍光シグナルが弱いため、前記結合の有無を確認することが困難であるといった欠点が報告されている(非特許文献1)。
加えて、一般的には、陽性細胞を含むマイクロドロップレット中には複数の陰性抗体産生細胞も含まれる。そのため、モノクローナル抗体を樹立するためには、複数回、スクリーニング操作を実施する必要がある。
さらに、抗体と標的細胞膜タンパク質の結合の有無を可視化するための方法は、標的細胞膜タンパク質ごとに最適化する必要があり、汎用的に実用化されるためには改良の余地が残されている。
a)複数のマイクロウェルを有する基板を提供する工程、
b)前記細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞を、各々の前記マイクロウェルに接着させる工程、
c)工程b)に続いて、各々の前記マイクロウェルに、前記集団から単離された1又は2個の第二細胞を導入し、前記マイクロウェル内で前記第一細胞と前記第二細胞を共存させる工程、
d)工程c)に続いて、前記目的物質が結合した第一細胞を含むマイクロウェルを特定する工程、
e)工程d)で特定されたマイクロウェルから、前記目的細胞として前記第二細胞を回収する工程、
を包含する、細胞の選抜方法である。
本発明では、複数のマイクロウェルを有する基板を用いる。マイクロウェルとは、哺乳動物細胞や鳥類細胞が1〜3個程度入る微小サイズのウェル(窪み、凹部)を指す。マイクロウェルは有底の微小な穴であり、例えばその開口部の内径は10μm〜50μm程度、深さは開口部の内径と同程度である。
マイクロウェルが円筒形の場合、その開口部の直径(内径)は、マイクロウェルに格納する細胞の種類や数を考慮して適宜決定することができる。第一細胞がCHO細胞、第二細胞が非ヒト動物由来のBリンパ球又は形質細胞である場合は、直径が20μm〜40μm程度であることが好ましい。また、マイクロウェルの深さは、開口部の直径と同程度であることが好ましい。
本発明における標的細胞膜タンパク質としては特に限定はなく、複数回膜貫通型タンパク質に代表される全ての細胞膜タンパク質が対象となりうる。例えば、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、イオンチャンネル、トランスポーター、CD抗原、細胞接着分子、癌抗原、ウイルス抗原などが対象となりうる。また細胞膜タンパク質の由来動物種に特に限定はない。また本発明では、精製法が確立していない、大量精製が困難、天然に存在する構造を維持した形での単離精製が困難、等の事情を有する細胞膜タンパク質であって、その一部が脂質2重膜層から細胞外に露出しているタンパク質、が対象となりうる。
本発明では、所望の細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞を、マイクロウェルに接着させて使用する。
第一細胞としては、所望の細胞膜タンパク質が細胞表面に発現するものであれば、特に限定はない。一つの実施形態として、標的細胞膜タンパク質を発現するベクターを導入した組換え細胞が挙げられる。例えば、完全長の標的細胞膜タンパク質の遺伝子を、適当な発現ベクター(例えば、pcDNA、pEF/FRT/V5−DEST等)に挿入する。そして、このベクターをCHO細胞、COS細胞、HEK293細胞、NIH3T3細胞などの細胞に導入し、標的細胞膜タンパク質を細胞膜上に一過的又は安定的に発現する組換え細胞を取得する。この組換え細胞を第一細胞として用いることができる。この場合、標的細胞膜タンパク質の細胞膜上での発現量が、発現ベクターを有さない細胞と比較して、5倍以上に増強されていることが好ましい。
本発明では、所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、第二細胞の集団から選抜する。前記目的物質(特異的結合物質)には、特定の細胞膜タンパク質に選択的に結合する、構造が既知又は未知のポリペプチド、環状ペプチド、タンパク質が含まれる。より具体的には、ペプチドホルモン、サイトカイン、抗体、人工ポリペプチド、人工環状ペプチド、等からなる特異的結合物質が含まれる。
本発明では、マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させる。以下、第二細胞について具体的に説明する。
第二細胞としては、所望の目的物質を生産することが予想される細胞であれば、特に限定はない。例えば、非ヒト又はヒト組織由来の各種の細胞、例えば血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、免疫細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、リンパ球細胞、皮膚細胞などを、第二細胞として用いることができる。例えば、非ヒト動物の組織を分離し、コラーゲナーゼ処理等の後、30〜100μmのメッシュでろ過し、単一細胞化したものを、第二細胞として用いることができる。例えば、ヒトの血液や手術摘出臓器から単一細胞化したものを、第二細胞として用いることができる。さらに、腫瘍細胞を第二細胞として用いることができる。腫瘍細胞は、例えば、手術摘出臓器から単一細胞化したものを用いることができる。その他、腫瘍細胞は、ATCCや細胞販売会社から入手することができる。
組換え細胞を第二細胞として用いる場合は、組換え細胞には1種類の目的物質をコードする遺伝子が導入されていることが好ましい。
本発明では、上記した第一細胞をマイクロウェルに接着させる。これにより、第一細胞が、その細胞機能を損なうことなくマイクロウェル内に格納及び固定化される。マイクロウェルに接着させる第一細胞の数は、第二細胞を受け入れるスペースを確保できるものであれば限定されないが、好ましくは1〜2個である。
本発明では、第一細胞が接着したマイクロウェルに1又は2個の第二細胞を導入し、第一細胞と第二細胞を共存させる。これにより、第二細胞が生産した(分泌した)目的物質が、第一細胞の表面に接触する。マイクロウェルには1個の第二細胞を導入することが好ましい。
マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させ、必要に応じてインキュベートした後、目的物質が結合した第一細胞を含むマイクロウェル(陽性マイクロウェル)を特定する。換言すれば、各マイクロウェルにおける、第一細胞の表面に発現した標的細胞膜タンパク質と、第二細胞から分泌された物質との結合の有無を検出する。
具体的手順を例示すると、まず、上記したcDNAライブラリーを作製する際に、特異的結合物質にタグ(例えば、FLAG、V5)や抗体のFc部分が付与されるように設計する。そして、このcDNAライブラリーをCHO細胞等に導入した組換え細胞を、第二細胞として用いる。タグが付与された目的物質に対しては、当該タグに対する標識抗体(例えば、標識抗FLAG抗体、標識抗V5抗体)を用いることができる。Fc部分が付与された目的物質に対しては、標識抗Fc抗体(例えば、標識抗IgG抗体)を用いることができる。具体的操作としては、マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させた後、必要に応じて所定の条件でインキュベートし、その後、標識物質を添加する。
前記蛍光物質としては、Alexa Fluor(登録商標)、Aqua、Texas Red(登録商標)、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、Cascade Blue(登録商標)、フィコエリトリン、DyLight(登録商標)等が挙げられる。好ましくは、Alexa Fluor 488が用いられる。
蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)が挙げられる。
前記酵素としては、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、等が挙げられる。
陽性マイクロウェルを特定した後、目的細胞として第二細胞を回収する。マイクロウェルからの第二細胞の回収は、例えば、マイクロマニュピレーターを用いて行うことができる。例えば、直径が数μmから50μmのキャピラリーを陽性マイクロウェルに挿入し、第二細胞を生きたまま吸引し、回収することができる。マイクロマニュピレーターによる操作は、自動と手動とを問わない。例えば、セルピッキングシステム(アズワン社)やCellCelector (Automated Lab Solution社)を用いて回収することが出来る。
回収した第二細胞は、適切な細胞培養用の培地内、あるいはmRNAを分解させず素早く抽出するための細胞溶解液(Lysis緩衝液)内に回収することが好ましい。
本発明は、上記の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞から、目的物質をコードする核酸(遺伝子)を取得する核酸の製造方法を包含する。また本発明は、当該核酸を宿主細胞に導入し、目的物質を発現する組換え細胞を取得する組換え細胞の製造方法を包含する。さらに本発明は、当該組換え細胞を培養し、その培養物から目的物質を取得する目的物質の製造方法を包含する。好ましくは、前記目的物質は抗体である。
そして、当該組換え細胞を培養し、その培養物(例えば、培養上清)から目的物質を取得することができる。
本発明は、上記の方法によって製造された核酸に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記核酸を有効成分として含有する医薬組成物を取得する医薬組成物の製造方法を包含する。また本発明は、上記の方法によって製造された目的物質に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記目的物質を有効成分として含有する医薬組成物を取得する医薬組成物の製造方法を包含する。
さらに、抗体に他の薬剤を直接融合させて治療効果を高める技術が知られており、前記医薬組成物に適用し得る。
すなわち、前記遺伝子治療薬は、生体内において有効成分たる抗体が発現され、その作用を発揮できる限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路により十分な量が投与される。非経口経路としては、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入、又は筋肉内の経路を介した、注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法(電子銃等による)、添鼻薬等粘膜経路を介する方法、等が挙げられる。さらに、前記遺伝子治療薬は、ex vivoにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法(米国特許第4,945,050号)、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより投与してもよい。
本発明は、上記の方法によって製造された目的物質を含む、所望の細胞膜タンパク質を検出するための試薬を包含する。例えば、本発明の方法によって製造された抗体(目的物質)を含む試薬を用いて、ヒト由来又は非ヒト哺乳動物由来の血液細胞に前記抗体を接触させる。さらに、蛍光物質又は色素からなる標識物質を、直接的又は間接的に接触させる。そして、フローサイトメトリー又はプレートリーダーによって、所望の細胞膜タンパク質の発現を検出することができる。また前記試薬を用いて、ヒト由来又は非ヒト哺乳動物由来の病理組織片に前記抗体を接触させて、所望の細胞膜タンパク質の発現を検出することができる。
ジーンバンクに登録されているヒトAPLNR遺伝子配列(NM_005161.4)をマウスのアミノ酸コドンに最適化した人工合成遺伝子(配列番号1)を作製した。この人工合成遺伝子を用い、国際公開第2012/043533号(日本国特許第5315495号)に記載の方法に準じて、ヒトAPLNR遺伝子とGroEL遺伝子との融合遺伝子を含むベクターpCI-APLNR-GroELを構築した。
pEF5/FRT/V5-DESTベクター(インビトロジェン社)に上記人工合成遺伝子(配列番号1)を導入し、pEF-FRT-APLNRを構築した。pEF-FRT-APLNRから発現されるヒトAPLNRは、C末端にV5と6×HISタグが付加される。
国際公開第2012/043533号(日本国特許第5315495号)に記載の方法に準じて、8週齢のマウスICR(雌)に、ベクターpCI-APLNR-GroELを複数回に分けて注射した(DNA免疫)。
(2−1)でDNA免疫を行ったマウスから脾臓を摘出し、冷蔵HBSSを入れた6ウェルプレートに回収した。付着している結合組織や脂肪組織を除去した後、新しいHBSS内で脾臓をほぐしてリンパ球を遊離させた。細胞を回収し、10mLのHBSSで再懸濁した。セルストレーナーにて未破壊組織を分離後、2000rpmで5分間遠心分離し、細胞を回収した。回収した細胞を1mLの溶血溶液に懸濁して37℃で5分間インキュベートし、赤血球を除去した。1000rpmで5分間遠心分離し、リンパ球細胞を回収した。
EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit(STEMCELL TECHNOLOGIES社)を用いて、2.5×107個の上記リンパ球細胞から、所望の抗体産生細胞(目的細胞)の候補を含む約1.3×105個の細胞集団(第二細胞)を分離した。
細胞融合に使用するミエローマ細胞(SP2/O)は、細胞融合の5日前に起眠し、2日前に一度継代を行ってから使用した。
実施例2で取得した免疫済みマウスの凍結脾細胞を融解し、37℃のRPMI1640培地(10%FBS含有)で懸濁し、細胞数をカウントした。脾細胞とミエローマ細胞(SP2/O)を細胞数比1:1となるように混合した。なおミエローマ細胞は、細胞融合の5日前に起眠し、2日前に一度継代を行ってから使用した。細胞混合物を遠心分離した後、ECFバッファーで細胞を洗浄した。同様の洗浄をさらに2回行った。
マイクロウェルチャンバーASMC30-20P(アズワン社)を準備した。このマイクロウェルチャンバーは、約1.5cm×約2.4cmのエリアの中に直径30μmのマイクロウェル84,640個が等間隔で配置されている基板である。各マイクロウェルの深さは、マイクロウェルの直径と等しい。マイクロウェル間のピッチは、マイクロウェルの直径の2倍である。従来技術では、マイクロウェルに1個の細胞を格納して用いるのが一般的である。しかし本実施例では、マイクロチャンバーに第一細胞と第二細胞、すなわち2個以上の細胞を格納して実験を行った。以下、説明する。
実施例4で選抜したハイブリドーマの1つから、MAGrahd法(Nobuyuki Kurosawa, Megumi Yoshioka, Rika Fujimoto, Fuminori Yamagishi and Masaharu Isobe, "Rapid production of antigen-specific monoclonal antibodies from a variety of animals", BMC Biology, 10:80, 2012)にて抗体遺伝子を取得した。すなわち、実施例4で得た細胞溶解液5μLとオリゴdTマグネット5μgとを混合し、オリゴdTマグネット上に細胞由来のmRNAを捕捉した。MAGrahdリアクタートレーとネオジム磁石を使い、オリゴdTマグネットを洗浄溶液で洗浄後、逆転写反応によるcDNA合成を行った。さらにマグネットを洗浄後、5’ターミナルトランスレーショナル反応を実施した。合成した上記cDNAを用い、5’race PCR法にて、抗体重鎖可変領域(VH領域)の遺伝子と、抗体軽鎖可変領域(VL領域)の遺伝子を単離増幅した。
なお、増幅産物の特異性を高めるために、PCRは2回行った。1回目のPCRでは、VH領域とVL領域を共通して増幅させる第一フォワードプライマー(配列番号3)と、VH領域を特異的に増幅させる第一リバースプライマー(配列番号4)と、VL領域を特異的に増幅させる第二リバースプライマー(配列番号5)を混合して使用した。2回目のPCRでは、1回目の増幅産物を鋳型とし、VH領域の増幅については、第二フォワードプライマー(配列番号6)と、VH領域を特異的に増幅させる第三リバースプライマー(配列番号7)、VL領域の増幅については第二フォワードプライマー(配列番号6)とVL領域特異的に増幅させる第四リバースプライマー(配列番号8)をそれぞれプライマーとして使用した。
2回目のPCR後のサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行ったところ、750bpの位置にVH領域、550bpの位置にVL領域に、それぞれ対応する増幅産物が確認できた。
TS−jPCR法(Megumi Yoshioka, Nobuyuki Kurosawa and Masaharu Isobe, "Target-selective joint polymerase chain reaction: A robust and rapid method for high-throughput production of recombinant monoclonal antibodies from single cells", BMC Biotechnol. 2011 Jul 21;11:75)にて抗体発現ユニットを構築した。すなわち、(5−1)で増幅したVH領域の遺伝子と、抗体重鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域とをPCRを用いて融合し、完全長抗体重鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。同様に、(5−1)で増幅したVL領域の遺伝子と、抗体軽鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域とをPCRを用いて融合し、完全長抗体軽鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。これらの抗体発現ユニットを哺乳動物細胞に供導入することにより、所望の抗体(IgG)を一過的に発現する組換え細胞を得ることができる。
上記文献(Nobuyuki Kurosawa et al., BMC Biology, 10:80, 2012)に記載の方法で、HEK293FT細胞に上記2種の抗体発現ユニットを共導入した。すなわち、コラーゲンコート96ウェルプレートに、HEK293FT細胞を1.5×104細胞/100μL/ウェルとなるように播種した。リポフェクトアミン2000を用いて、(5−2)で構築した2種の抗体発現ユニットをHEK293FT細胞に共導入した。導入3日目に細胞上清を回収して、発現された抗体の結合性評価に用いた。
ヒトAPLNR安定発現CHO細胞株を、直径10cmのディッシュ内で培養した。細胞をPBSで3回洗浄後、細胞剥離用バッファーを1mL加え、37℃で15分間インキュベートした。剥離された細胞をFACSバッファーで懸濁し、1000rpmで5分間遠心した後、細胞濃度が1×107細胞/mLとなるようにFACSバッファーで再懸濁した。Fc Block(べクトン・ディッキンソン社)を細胞懸濁液の1/500量加え、4℃で30分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、2×105細胞/50μLとなるように細胞を懸濁した。96ウェルプレート内で、この細胞懸濁液を(5−3)で回収した細胞上清と混合し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベート後、100μLのFACSバッファーで2回、細胞を洗浄した。蛍光標識抗IgG抗体(2次抗体)の希釈液を各ウェルに50μLずつ加え、4℃で1時間インキュベートし、CHO細胞表面に結合した抗体に2次抗体を結合させた。100μLのFACSバッファーで細胞を2回洗浄した後、80μLのFACSバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー法にて細胞表面の蛍光強度を測定した。
一方、図5に示すように、陰性マイクロウェルから回収された目的外のハイブリドーマを用いた比較例では、組換え細胞が発現した抗体は、ヒトAPLNR安定発現CHO細胞に対する結合性を有さなかった。
以上より、本実施例によって得られた抗体が、ヒトAPLNR発現CHO細胞に対する特異的結合性を有することが示された。
実施例4の方法に準じて、実施例2で調製した不死化していないリンパ球細胞(第二細胞)の集団から、目的の抗体を産生する細胞を選抜した。以下、説明する。
実施例5と同様の操作を行い、実施例6で選抜したリンパ球の1つから抗体遺伝子を取得した。
実施例5と同様の操作を行い、(7−1)で得られた抗体遺伝子から完全長抗体重鎖と完全長抗体軽鎖を発現する2種の抗体発現ユニットを構築した。
実施例5と同様の操作を行い、(7−2)で得られた抗体発現ユニットをHEK293FT細胞に共導入した。導入48時間後に細胞上清を回収して、発現された抗体の機能性評価に用いた。
実施例5と同様の操作を行い、(7−3)で得られた組換え細胞が発現する抗体の結合性評価を行った。
一方、図9に示すように、陰性マイクロウェルから回収された目的外のリンパ球を用いた比較例では、組換え細胞が発現した抗体は、ヒトAPLNR安定発現CHO細胞に対する結合性を有さなかった。
2 マイクロウェル
3 第一細胞
5 第二細胞
6 目的物質
7 標識物質
Claims (30)
- 所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、第二細胞の集団から選抜する細胞の選抜方法であって、下記工程:
a)複数のマイクロウェルを有する基板を提供する工程、
b)前記細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞を、各々の前記マイクロウェルに接着させる工程、
c)工程b)に続いて、各々の前記マイクロウェルに、前記集団から単離された1又は2個の第二細胞を導入し、前記マイクロウェル内で前記第一細胞と前記第二細胞を共存させる工程、
d)工程c)に続いて、前記目的物質が結合した第一細胞を含むマイクロウェルを特定する工程、
e)工程d)で特定されたマイクロウェルから、前記目的細胞として前記第二細胞を回収する工程、
を包含する、細胞の選抜方法。 - 前記工程d)は、前記目的物質が前記第一細胞に結合したことを可視化する可視化工程を包含する、請求項1に記載の細胞の選抜方法。
- 前記可視化工程は、前記マイクロウェルに、前記目的物質に対して特異的に結合する標識物質を添加することを含む、請求項2に記載の細胞の選抜方法。
- 前記標識物質が前記目的物質に対する標識抗体である、請求項3に記載の細胞の選抜方法。
- 前記標識物質における標識が蛍光標識である、請求項3又は4に記載の細胞の選抜方法。
- 前記標識物質は、第一蛍光物質で標識された抗体であり、
前記工程b)は、前記マイクロウェルに接着している前記第一細胞を第二蛍光物質で標識する第一細胞標識工程を含み、
第一蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長は、第二蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長と異なる、請求項5に記載の細胞の選抜方法。 - 前記可視化工程は、前記目的物質が前記第一細胞に結合した際に起きる、前記細胞膜タンパク質の活性化に伴う細胞内情報伝達物質の変動を可視化することを含む、請求項2に記載の細胞の選抜方法。
- 前記細胞膜タンパク質が複数回膜貫通型タンパク質である、請求項1〜7のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
- 前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現するベクターを導入した細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
- 前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現する腫瘍細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
- 前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現する非腫瘍細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
- 前記目的物質が抗体である、請求項1〜11のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
- 前記第二細胞が、前記細胞膜タンパク質又はそれをコードする核酸で免疫した非ヒト動物由来の骨髄、脾臓、リンパ組織、又は血液細胞由来である、請求項12に記載の細胞の選抜方法。
- 前記第二細胞が不死化された細胞である、請求項13に記載の細胞の選抜方法。
- 前記第二細胞がハイブリドーマである、請求項14に記載の細胞の選抜方法。
- 前記第二細胞が、ヒトのリンパ組織又は血液由来である、請求項12に記載の細胞の選抜方法。
- 前記第二細胞が、エプスタイン・バール・ウイルス感染により不死化された細胞である、請求項16に記載の細胞の選抜方法。
- 前記第二細胞が、外来性の抗体遺伝子を有し、当該抗体を発現する組換え細胞である、請求項12に記載の細胞の選抜方法。
- 前記抗体が、完全抗体、機能的抗体断片、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体である、請求項18に記載の細胞の選抜方法。
- 前記抗体が、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項18又は19に記載の細胞の選抜方法。
- 前記抗体が、ネコ化抗体又はイヌ化抗体である、請求項18又は19に記載の細胞の選抜方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞から、前記目的物質をコードする核酸を取得する、核酸の製造方法。
- 前記目的物質が抗体である、請求項22に記載の核酸の製造方法。
- 請求項22又は23に記載の方法によって製造された核酸を宿主細胞に導入し、前記目的物質を発現する組換え細胞を取得する、組換え細胞の製造方法。
- 請求項24に記載の方法によって製造された組換え細胞を培養し、その培養物から前記目的物質を取得する、目的物質の製造方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞を培養し、その培養物から前記目的物質を取得する、目的物質の製造方法。
- 前記目的物質が抗体である、請求項25又は26に記載の目的物質の製造方法。
- 請求項22又は23に記載の方法によって製造された核酸に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記核酸を有効成分として含有する医薬組成物を取得する、医薬組成物の製造方法。
- 請求項25〜27のいずれかに記載の方法によって製造された目的物質に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記目的物質を有効成分として含有する医薬組成物を取得する、医薬組成物の製造方法。
- 請求項25〜27のいずれかに記載の方法によって製造された目的物質を含む、前記所望の細胞膜タンパク質を検出するための試薬。
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