TW202409079A - 對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法及篩選方法、檢查藥的製造方法及抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種抗體的新的製造方法。一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法，包括：（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
Description
本揭示是有關於一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法等。
2019年成為日本人的死因的疾病多依次為癌、心臟疾病、腦血管疾病、肺炎，特別是癌，伴隨平均壽命的延長，死亡人數逐年增加。為了減少因疾病引起的死亡人數，重視早期診斷或早期治療，但大多情況下在初期沒有特徵性的症狀，被診斷時疾病已經發展，治療變得困難。因此，血液檢查等簡便的疾病的檢查方法或治療法由於藉由適當的實施而可獲得可靠的效果，因此擔負重要的作用。
迄今為止，亦有於血液檢查中使用抗體者，特別是單克隆抗體由於靈敏度及特異度高，可半永久地使用，因此可被普遍使用。然而，現狀是幾乎沒有用於疾病的診斷或治療（特別是癌的早期診斷或早期治療）的抗體。
細胞外囊泡是由大部分細胞分泌的直徑為20 nm～1,000 nm左右的、被脂質雙層膜覆蓋的囊泡。作為細胞外囊泡的例子，已知有胞泌體或微囊泡等。於細胞外囊泡的內部高度保存有微型核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）等核酸或蛋白質等分泌源的細胞固有的資訊。已知細胞外囊泡於多個細胞種類中參與近距離或遠距離細胞間的交流，亦自參與癌等各種疾病的細胞中分泌。近年來，示出了癌細胞分泌的細胞外囊泡參與癌的生成、進展、耐藥劑性、轉移（非專利文獻1）。
[現有技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Sunami Y. Haubler J. Zourelidis A. Kleef J.：「胰臟癌微環境及轉移中的癌症相關纖維母細胞與腫瘤細胞：旁分泌調節因子、交互及胞泌體.癌.（Cancer-associated fibroblasts and tumor cells in pancreatic cancer microenvironment and metastasis：Paracrine regulators，reciprocation and exosome. Cancers.）」2022 14（3）：744.
[發明所欲解決之課題]
本揭示的課題在於提供一種抗體的新的製造方法。
[解決課題之手段]
本發明人鑒於所述課題進行了努力研究，結果發現，藉由對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法可解決所述課題，所述對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法包括：（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。本發明人基於所述見解進一步進行研究，從而完成了本發明。即，本揭示包含下述態樣。
項1. 一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法，包括：
工序（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及
工序（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
項2. 如項1所述的製造方法，其中所述工序（1）包括：
工序（1a）培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣的工序；以及
工序（1b）使所述工序（1a）的培養後的培養基來源的細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序。
項3. 如項1所述的製造方法，其中於所述工序（1）中，使固定於固相上的所述細胞外囊泡與液相中的所述被檢抗體接觸。
項4. 如項1至項3中任一項所述的製造方法，其中所述生物體試樣是所述生物體組織的酶處理物。
項5. 如項4所述的製造方法，其中所述酶包含膠原酶。
項6. 如項1至項3中任一項所述的製造方法，其中於包含生長因子的培養基中進行所述生物體試樣的培養。
項7. 如項1至項3中任一項所述的製造方法，其中所述生物體組織為人生物體組織。
項8. 如項1至項3中任一項所述的製造方法，其中所述生物體組織為腫瘤組織。
項9. 如項1至項3中任一項所述的製造方法，其中所述細胞外囊泡為胞泌體。
項10. 如項1至項3中任一項所述的製造方法，其中所述被檢抗體是選自由生物體試樣、以及細胞外囊泡所組成的群組中的至少一種經免疫的動物來源的抗體，所述生物體試樣為選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種，所述細胞外囊泡源自培養所述生物體試樣而獲得的培養基。
項11. 一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的篩選方法，包括：
工序（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及
工序（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
項12. 一種檢查藥的製造方法，所述檢查藥包含對於細胞外囊泡具有結合性的抗體，所述檢查藥的製造方法包括：
工序（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及
工序（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
項13. 一種抗體，可利用如項1至項3中任一項所述的製造方法來獲得。
[發明的效果]
藉由本揭示，可提供抗體的新的製造方法。藉由本揭示的製造方法，可簡便且有效率地製造對於生物體內的目標組織產生的細胞外囊泡具有結合性的抗體。另外，基於近年來關於細胞外囊泡的見解，亦能夠製造用於疾病的診斷或治療（特別是癌的早期診斷、早期治療、轉移抑制）等的抗體。
於本說明書中，關於「含有」及「包含」之類的表達，包括「含有」、「包含」、「實質上包含」及「僅包含」此概念。
於本說明書中，胺基酸序列由單字符表述來表示。
本揭示於其一態樣中，是有關於一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造或篩選方法（本說明書中，亦有時表示為「本揭示的方法」），包括：（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。以下，對其進行說明。
工序（1）較佳為包括：
工序（1a）培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣的工序；以及
工序（1b）使所述工序（1a）的培養後的培養基來源的細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序。
生物體組織是自生物分離的構成生物的一部分，是形態或功能相同或類似的細胞的集合體或多種集合體的組合，於此限度內並無特別限制。
作為生物，例如可列舉：人、猴子、兔子、小鼠、大鼠、狗、貓等各種哺乳類動物，較佳為可列舉人。
作為生物體組織，具體而言，例如可列舉：上皮組織、結締組織、肌肉組織、神經組織、皮膚、舌頭、食管、胃、胰腺、肝臟、肺、十二指腸、小腸、大腸、腎臟、腎上腺、膀胱、子宮、卵巢、乳房、前列腺、睾丸、陰莖、甲狀腺、腹膜、骨髓等。生物體組織可為腫瘤組織。作為腫瘤組織，具體而言例如可列舉所述組織的癌（特別是原發癌）。由於細胞外囊泡自癌細胞分泌而與癌的惡性化及轉移密切相關，因此藉由採用腫瘤組織作為生物體組織，亦能夠製造用於癌的早期診斷、早期治療、轉移抑制等的抗體。
生物體組織較佳為胰腺癌的腫瘤組織，更佳為可為初期胰腺癌的腫瘤組織。於本說明書中，所謂初期胰腺癌是階段0或階段1的胰腺癌。另外，於本說明書中，癌的階段是基於國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）的分類。
獲得生物體組織的方法並無特別限制，例如可列舉：藉由手術等（例如使用手術刀、小刀、剪刀、眼科尖刀等）取出的方法、藉由注射針或內窺鏡作為組織檢查用而能夠於體外處理來獲取的方法等。
自生物體組織分離出的細胞只要為自生物體組織的全部或一部分分離出的細胞，則並無特別限制。於該細胞中不包含細胞株。就該觀點而言，工序（1）的培養開始時刻的該細胞的培養傳代數較佳為5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、或0。細胞亦可為單個細胞，亦可為細胞塊。作為構成細胞塊的細胞數，例如可為2～1000、3～500、8～500、10～500、20～500、50～500。
作為生物體試樣，較佳為可列舉生物體組織的酶處理物。
生物體組織較佳為於酶處理之前進行細切而製成小片。細切可藉由利用小刀、剪刀、切割器（手動、自動）等分割生物體組織來進行。小片的尺寸或形狀並無特別限定，可無規進行，製成較佳為1 mm～5 mm見方、更佳為1 mm～2 mm見方的均勻尺寸。
作為酶處理中使用的酶，只要能夠自生物體組織中分離細胞，則並無特別限制，例如可列舉：膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、透明質酸酶、溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、分散酶等。作為酶，較佳為包含膠原酶。關於酶處理條件，緩衝為生理學上容許的pH，例如為約6～8、較佳為約7.2～7.6的等滲鹽溶液、例如基礎培養基（例如α MEM培養基、DMEM培養基、RPMI 1640培養基、BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、改良的MEM鋅選擇（Improved MEM Zinc Option）培養基、IMDM培養基、Medium199培養基、Eagle MEM培養基、費舍爾（Fischer's）培養基等）、PBS、漢克斯（Hanks）的平衡鹽溶液中，可為例如為約20℃～40℃、較佳為約25℃～39℃，對於用以分解結締組織而言充分的時間例如為約1分鐘～180分鐘、較佳為5分鐘～30分鐘，對於用以分解結締組織而言充分的濃度例如為約0.0001% w/v～5% w/v、較佳為約0.0005% w/v～0.005% w/v。
酶處理後，較佳為對尺寸進行分配。關於其方法，作為簡便的方法，藉由利用目視、相位差顯微鏡進行的分選、或者篩來進行，只要是本領域技術人員能夠利用的基於粒子徑的分選法，則並無特別限定。例如，可通過100 μm～500 μm、較佳為150 μm～250 μm的網格尺寸的篩，將通過者用作「生物體組織的酶處理物」。
生物體試樣是選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種。生物體試樣亦可為單獨一種，亦可為兩種以上的組合。
生物體試樣的培養於液體培養基中進行。作為構成培養基的基礎培養基，例如可列舉：αMEM培養基、DMEM培養基、RPMI 1640培養基、BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、改良的MEM鋅選擇培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、費舍爾培養基等。培養基較佳為未添加血清的無血清培養基、或添加的血清少（例如血清濃度為5 v/v%以下、2 v/v%以下、或1 v/v%以下的）減血清培養基，更佳為無血清培養基。於使用此種培養基的情況下，培養基較佳為包含生長因子。作為生長因子，例如可列舉：EGF：上皮生長因子（Epidermal growth factor）、IGF：類胰島素生長因子（Insulin-like growth factor）、TGF：轉變生長因子（Transforming growth factor）、bFGF或FGF2：鹼性纖維母細胞生長因子（basic fibroblast growth factor）、NGF：神經生長因子（英文版）（Nerve growth factor）、BDNF：大腦衍生神經滋養因子（Brain-derived neurotrophic factor）、VEGF：血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor）、G-CSF：顆粒性白血球群落刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor）、GM-CSF：顆粒性白血球巨噬細胞群落刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor）、PDGF：血小板衍生生長因子（Platelet-derived growth factor）、EPO：紅血球生成素（Erythropoietin）、TPO：血小板生成素（Thrombopoietin）、HGF：肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor）等，該些中特佳為TGF（特別是TGF-β）與bFGF的組合。於培養基包含生長因子的情況下，其濃度例如為1 ng/mL～50 ng/mL，較佳為5 ng/mL～20 ng/mL。
培養器只要一般能夠培養動物細胞，則並無特別限定，例如可列舉：燒瓶、組織培養用燒瓶、皿、陪替氏培養皿（petri dish）、組織培養用皿、多聯皿、微量培養板（microplate）、微孔板、多板、多孔板、腔室載玻片、碗、管、托盤、培養袋、轉瓶。
作為培養方法，有分離的腫瘤衍生癌細胞（Isolated tumor-derived cancer cells，iCC）法（S.富士諾等人（Fujino S. et al.）「生物化學與生物物理研究通訊（Biochem Biophys Res Commun）」513,332-339（2019））、癌組織起源球狀體（Cancer tissue-originated spheroid，CTOS）法（H.遠藤等人（Endo H. et al.）「胸部腫瘤學雜誌（J Thorac Oncol）」8,131-139（2013））或類器官（Organoid）法（上野康晴等，膽與胰 2018年4月號）等，作為本揭示的培養方法，較佳為細胞外囊泡的回收率更高的iCC法，而非使用基質凝膠或膠原等的三維培養。
培養條件可適宜設定，例如培養溫度不受限定，較佳為約30℃～40℃。最佳為37℃。CO
2濃度例如為約1%～10%，較佳為約2%～5%。
只要自生物體試樣釋放細胞外囊泡，則培養期間並無特別限制。培養期間例如可為1天～21天。
培養結束後的培養基中包含自生物體試樣釋放的細胞外囊泡。
細胞外囊泡只要來自生物體試樣的生物種類，則並無特別限定。國際細胞外囊泡學會（International Society for Extracellular Vesicles；ISEV）將「自細胞釋放的不具有核的（不可複製的）脂質雙層膜包圍的粒子」定義為細胞外囊泡。細胞外囊泡根據產生機制的不同，分類為（1）胞泌體（直徑50 nm～150 nm）、（2）微囊泡（直徑100 nm～1000 nm）、（3）凋亡囊泡（直徑5 μm）。作為細胞外囊泡的構成蛋白質成分，已知有分化簇（cluster of differentiation，CD）9、CD63、CD81的四跨膜蛋白、ALIX、Tsg101、Hsp70、Hsp90、各種整聯蛋白（integrin）、各種選滯蛋白（selectin）、CD40、膜聯蛋白（Annexin）V等。於本揭示的方法中使用的細胞外囊泡特佳為胞泌體。
於本揭示的方法中，較佳為使用自培養結束後的培養基進行了純化的細胞外囊泡。作為對細胞外囊泡進行純化的方法，例如已知有：使用超離心機的超離心法；使用針對細胞外囊泡標記物的抗體並使其沈降的抗體法；使用聚乙二醇等聚合物使細胞外囊泡沈降的沈降法或使用與存在於細胞外囊泡的細胞膜中的磷脂醯絲胺酸（phosphatidylserine，PS）特異性結合的蛋白質的PS親和法等。據推測於疾病的初期，僅分泌極少量的疾病特異性細胞外囊泡，因此於本揭示中，理想的是使用藉由PS親和法等分離的純度高的細胞外囊泡。
被檢抗體的來源並無特別限制。被檢抗體較佳為人、猴子、兔子、小鼠、大鼠、駱駝、牛、山羊、綿羊、豚鼠等脊椎動物來源的抗體。另外，被檢抗體的同型並無特別限制。作為該同型，例如可列舉：IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgA、IgD、IgE、IgM等。另外，被檢抗體中包含多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、或者Fab片段或Fab表達文庫所生成的片段等般具有抗原結合性的所述抗體的一部分。
被檢抗體的獲取方法並無特別限制。於本揭示的方法中，可使用各種來源的被檢抗體。就可包含更多的對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的觀點而言，被檢抗體較佳為選自由生物體試樣、以及細胞外囊泡所組成的群組中的至少一種經免疫的動物來源的抗體，所述生物體試樣為選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種，所述細胞外囊泡源自培養所述生物體試樣而獲得的培養基。此處所使用的免疫原較佳為來源於與被檢抗體接觸的細胞外囊泡來源的生物體組織相同的生物體組織者。
關於作為免疫對象的動物，並無特別限制，例如可列舉：人、猴子、兔子、小鼠、大鼠、駱駝、牛、山羊、綿羊、豚鼠等脊椎動物。免疫亦可僅為一次，亦可為多次。
經免疫的動物來源的抗體只要是該動物所產生的抗體或基因與該抗體相同的抗體，則並無特別限制，例如可為自經免疫的動物的體液（例如血清）獲得的抗體、經免疫的動物的淋巴細胞所產生的抗體、由經免疫的動物的淋巴細胞製備的融合瘤所產生的抗體。於本揭示的方法中，較佳為可使用經免疫的動物的淋巴細胞所產生的抗體、由經免疫的動物的淋巴細胞製備的融合瘤所產生的抗體作為被檢抗體，更佳為可使用經免疫的動物的淋巴細胞所產生的抗體作為被檢抗體。
關於淋巴細胞或血清的回收時機，只要於動物內已產生或能夠產生針對進行了免疫的抗原的抗體，則並無特別限制，例如可於初次免疫後或最終免疫後1週～12週後。
細胞外囊泡與被檢抗體的接觸的態樣並無特別限制，可根據被檢抗體與細胞外囊泡有無結合或結合量的測定方法（例如，各種免疫測定法等）的種類來選擇適當的態樣。免疫測定法無論是直接法、關節法、均勻法、不均勻法、競爭法、非競爭法等均可廣泛採用。作為免疫測定法，更具體而言，例如可列舉：ELISA（例如，直接法、間接法、夾層法、競爭法等）、放射性免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）、免疫放射測定法（immunoradiometric assay，IRMA）、酶免疫測定法（enzyme immunoassay，EIA）、夾層EIA、免疫層析（immunochromato）、西方墨點法（Western Blot）、免疫沈降、狹縫或斑點墨點分析、免疫組織染色、螢光免疫分析、使用抗生物素蛋白-生物素或鏈球菌親生物素蛋白（streptavidin）-生物素系統的免疫分析、使用表面電漿共振（surface plasmon resonance，SPR）法的免疫分析等。
作為接觸態樣，例如可列舉僅使被檢抗體及細胞外囊泡中的任一者以固定於固相的狀態接觸的態樣、使該些兩者均以不固定於固相的狀態接觸的態樣等。該些中，就效率性等觀點而言，較佳為可列舉僅使細胞外囊泡以固定於固相的狀態接觸的態樣、即，使固定於固相上的細胞外囊泡與液相中的所述被檢抗體接觸的態樣。
於僅將被檢抗體及細胞外囊泡中的任一者固定於固相的情況下，較佳為於固定後利用包含三羥基甲基胺基甲烷（Tris）及/或醚型非離子界面活性劑的溶液對固相進行清洗。
作為固相，只要能夠固定被檢抗體及細胞外囊泡，則並無特別限制。作為該固相，例如可列舉包含聚苯乙烯、玻璃、硝基纖維素等作為主要成分的板、載玻片、膜等。固相亦可為利用用於更容易地固定本揭示的抗體或其片段及生物體試樣的成分，例如易反應性化合物（例如，具有易反應性基的化合物、金膠體等）進行塗佈而成者。作為具有易反應性基的化合物，可列舉具有如下基的化合物，所述基是可與糖鏈或糖鏈衍生物形成共價鍵的基，且例如為（1H-咪唑-1-基）羰基、琥珀醯亞胺基氧基羰基、環氧基、醛基、胺基、硫醇基、羧基、疊氮基、氰基、活性酯基（1H-苯並三唑-1-基氧基羰基、五氟苯基氧基羰基、對硝基苯基氧基羰基等）、或鹵化羰基（氯化羰基、氟化羰基、溴化羰基、碘化羰基）等。
作為具有易反應性基的化合物，例如可列舉環氧矽烷、聚離胺酸等。
於使用利用易反應性化合物進行塗佈而成的固相的情況下，較佳為使用包含牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等的緩衝液將易反應性化合物封閉，封閉時間較佳為60分鐘以上。另外，較佳為於封閉液中包含三羥基甲基胺基甲烷（Tris）及/或醚型非離子界面活性劑。
於特異性地固定細胞外囊泡的情況下，可使用針對細胞外囊泡的公知的構成蛋白質成分的抗體。於細胞外囊泡為胞泌體的情況下，理想的是使用針對CD9或CD63等的四跨膜蛋白的抗體。於特異性地固定抗體的情況下，可使用針對抗體的同型的抗體（例如，抗人IgM抗體或抗兔IgG抗體）、或者蛋白A或蛋白G。
細胞外囊泡與被檢抗體的接觸較佳為使用多孔板來進行。特別是於本揭示的方法中，就效率性等觀點而言，較佳為使用孔的直徑較小（供一個細胞進入的程度的大小，例如5 μm～100 μm，較佳為10 μm～50 μm，更佳為15 μm～30 μm）的微孔板。於使用該微孔板的更具體的態樣中，較佳為向固定有細胞外囊泡的孔中添加淋巴細胞或融合瘤，使該些細胞產生的抗體與細胞外囊泡接觸。於該情況下，本揭示的方法可藉由單細胞採摘（Single Cell Picking）法來進行。
於工序（2）中，對細胞外囊泡與被檢抗體有無結合或結合量進行檢測。檢測方法並無特別限制，例如於僅將細胞外囊泡固定於固相的情況下，對經由細胞外囊泡而與固相結合的被檢抗體進行檢測。作為另一例，於僅將被檢抗體固定於固相的情況下，對經由被檢抗體而與固相結合的細胞外囊泡進行檢測。於對被檢抗體進行檢測的情況下，可使用針對被檢抗體的同型的抗體（例如，若被檢抗體為兔IgG，則為抗兔IgG抗體）進行檢測，於對細胞外囊泡進行檢測的情況下，可使用針對CD9、CD63、整聯蛋白等細胞外囊泡的表面標記物的抗體。
檢測細胞外囊泡或抗體時所使用的標識物的種類並無特別限制。作為標識，例如可列舉：螢光物質、發光物質、色素、酶、金膠體、放射性同位素等。該些中，就安全性、經濟性、檢測靈敏度等觀點而言，更佳為過氧化物酶、鹼性磷酸酶等酶標識。
基於檢測的結果、檢測訊號量，檢測出細胞外囊泡與被檢抗體的結合的情況下，或者細胞外囊泡與被檢抗體的結合量為截止值以上的情況下，將該被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體。截止值可基於陰性對照（negative control）（例如不使用被檢抗體或細胞外囊泡的情況）的檢測訊號量來適宜決定。
於本揭示的方法中，視需要決定篩選後的抗體的胺基酸序列。胺基酸序列的決定方法並無特別限制，例如可列舉從頭（De novo）抗體測序法、淋巴細胞或融合瘤的抗體基因的測序法等。基於所決定的胺基酸序列，可利用公知的轉基因技術及抗體表達純化技術大量製備重鏈CDR1～CDR3（較佳為重鏈可變區域）及輕鏈CDR1～CDR3（較佳為輕鏈可變區域）的胺基酸序列與篩選出的抗體的胺基酸序列相同的抗體。
藉由本揭示的方法獲得的抗體的利用方法並無特別限定，例如可列舉診斷疾病的檢查藥、或治療疾病的醫藥組成物等。作為檢查藥及醫藥組成物，其特徵在於包含藉由本揭示的方法獲得的抗體或其抗原結合性片段。另外，作為醫藥組成物，亦包含將藉由本揭示的方法獲得的抗體或其抗原結合性片段利用各種抗癌劑、離胺酸等毒素化合物、放射性物質放射活性金屬離子（例如，α發射體等具有放射活性的化合物）等放射性物質等進行了標識而得者。作為可使用包含藉由本揭示的方法獲得的抗體或其抗原結合性片段的醫藥組成物進行治療的疾病，可列舉高表達藉由本揭示的方法獲得的抗體或其抗原結合性片段所結合的分子的疾病（特別是癌或其轉移癌）。另外，經過本揭示的方法製造所述檢查藥或醫藥組成物的方法亦是本揭示的一態樣。
[實施例]
以下，基於實施例對本發明進行詳細說明，但本發明並不受該些實施例限定。
實施例1.與胰腺癌細胞來源的細胞外囊泡結合的兔單克隆抗體的製造 （a）淋巴細胞的製備
將冷凍人初期胰腺癌組織（Proteogenex公司製造，階段1，腫瘤佔有率85%，55歲，女性）細切，利用PBS懸浮於0.06 mg/mL中而作為免疫抗原。對JW/CSK兔（13週齡，雌）免疫混合了免疫抗原與FCA的抗原溶液，三週後回收肥大的淋巴結，將進行均質化及溶血劑處理而獲得的淋巴細胞於冷凍保護培養基（日本全藥工業製造，細胞包1）中冷凍。
（b）細胞外囊泡的製備
於大阪國際癌中心，藉由手術自患有2 cm以下的腫瘤的初期胰腺癌患者切除了腫瘤組織。利用含抗生物質的生理鹽水對腫瘤組織進行清洗後，細切成1 mm左右而製成細切小片，向其中加入包含1 mg/mL膠原酶（西格瑪奧德里奇（Sigma Aldrich）製造，目錄編號：044-29765）的DMEM培養基，進行振盪處理（200 rpm，37℃，15分鐘）後，通過200 μm的網狀物來回收腫瘤組織來源的腫瘤細胞。於包含10 ng/mL鹼性FGF、2 ng/mL TGF-β的DMEM培養基中對腫瘤細胞進行培養，每2天～4天回收培養上清液，保存為-80℃，另一方面，向腫瘤細胞中添加新鮮培養基並持續培養。
將保存為-80℃的培養上清液解凍後，利用離心分離（300 xg、4℃、5分鐘；1,200 xg、4℃、20分鐘；10,000 xg、4℃、30分鐘）回收上清液。自回收後的上清液中，使用麥格卡普夏胞泌體提取試劑盒（MagCapture Exosome Isolation Kit）PS（富士軟片和光純藥製造，目錄編號：290-84103），按照規程對細胞外囊泡進行分離。以BSA溶液為標準使用BCA蛋白質測定試劑盒（賽默飛世爾（ThermoFisher）製造，目錄編號：23225）對細胞外囊泡的蛋白質濃度進行定量。
（c）產生與細胞外囊泡結合的抗體的淋巴細胞的篩選
於1孔的直徑為20 μm且196,000孔的微室中將（b）的細胞外囊泡固相化並清洗後，加入1% BSA溶液，於室溫下封閉30分鐘。去除封閉溶液後，添加（a）的淋巴細胞（2×10
5細胞）及Cy3標識驢抗兔IgG（H+L）（傑克遜免疫研究（Jackson ImmunoResearch）製造，目錄編號：711-165-152）的混合溶液並培養45分鐘後，將微室設置於亞速旺細胞分選系統（AS ONE Cell Picking System）（亞速旺（ASONE）公司製造）而篩選產生與細胞外囊泡結合的抗體的淋巴細胞。結果，如圖1所示，獲得產生與初期胰腺癌患者的胰腺癌細胞所分泌的細胞外囊泡反應的抗體的克隆PEMb14。
（d）PEMb14抗體基因的決定
利用亞速旺細胞分選系統（AS ONE Cell Picking System）將克隆PEMb14分離後，藉由單細胞（Single cell）PCR法（英傑（Invitrogen）製造，目錄編號：12574-035）擴增淋巴細胞的抗體基因。將擴增的重鏈及輕鏈的各自的基因片段插入載體pCEC3.2兔（rabbit）（細胞工程研究所製造）中進行克隆。
利用DNA定序器決定PEMb14抗體的重鏈及輕鏈的CDR鹼基序列，鑑定表1所示的重鏈及輕鏈的CDR1～CDR3的胺基酸序列、及表2所示的重鏈及輕鏈的CDR1～CDR3的鹼基序列。另外，以下表示重鏈可變區域及輕鏈可變區域整體的胺基酸序列及鹼基序列。
[表1]
| 序列編號 | 序列名 | 胺基酸序列 |
| 1 | 重鏈CDR1 | EFSFSSSYY |
| 2 | 重鏈CDR2 | LYAGSGGVT |
| 3 | 重鏈CDR3 | AREVPADAAYGYFNL |
| 4 | 輕鏈CDR1 | QSVYNNNN |
| 輕鏈CDR2 | SAS | |
| 6 | 輕鏈CDR3 | LGDFGGGIRA |
[表2]
| 序列編號 | 序列名 | 鹼基酸序列 |
| 7 | 重鏈CDR1 | GAATTCTCCTTCAGTAGCAGCTACTAC |
| 8 | 重鏈CDR2 | CTTTATGCTGGTAGTGGTGGTGTCACT |
| 9 | 重鏈CDR3 | GCGAGAGAGGTCCCTGCTGATGCTGCTTATGGATACTTTAACTTA |
| 10 | 輕鏈CDR1 | CAGAGTGTTTATAATAACAACAAC |
| 輕鏈CDR2 | TCTGCATCC | |
| 12 | 輕鏈CDR3 | CTAGGCGATTTTGGTGGTGGTATCCGGGCT |
重鏈可變區域（胺基酸序列）
METGLRWLLLVAVLKGVQCEQLEESGGDLVKPGASLTLTCTASEFSFSSSYYMCWVRQAPGKGLEWIACLYAGSGGVTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCAREVPADAAYGYFNL（序列編號13）。
輕鏈可變區域（胺基酸序列）
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATIAQVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQSVYNNNNLAWFQQKPGQPPKQLIYSASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDFGGGIRA（序列編號14）。
重鏈可變區域（鹼基序列）
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGAATTCTCCTTCAGTAGCAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCTTGCCTTTATGCTGGTAGTGGTGGTGTCACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGAGGTCCCTGCTGATGCTGCTTATGGATACTTTAACTTA（序列編號15）。
輕鏈可變區域（鹼基序列）
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACAATTGCTCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCTGTGTCTGCCGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACAACTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTGTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTATTACTGTCTAGGCGATTTTGGTGGTGGTATCCGGGCT（序列編號16）。
（e）PEMb14抗體（兔IgG、κ）的製備
準備30張每一張100 mm培養板有1.2×10
7細胞的HEK293細胞，對於實施例1的（d）中獲得的兔抗體（IgG）表達用載體兩種（重鏈及輕鏈），於每一張板上各為8.50 μg，使用PEI（默克（Merck）製造，目錄編號：408727-100ML）進行基因導入並培養7天，回收包含PEMb14抗體的培養上清液。將所獲得的培養上清液供於Ab-Capcher（ProteNova製造，目錄編號：P-002-200），利用TBS緩衝液清洗後，利用溫和Ag/Ab洗脫緩衝液（Gentle Ag/Ab Elution buffer）（pH為6.6）（賽默飛世爾（ThermoFisher）製造，目錄編號：#21027）進行洗脫。接下來，依次透析至包含0.2 M精胺酸的TBS緩衝液、包含0.2 M精胺酸的PBS緩衝液、PBS緩衝液。利用BCA蛋白質測定試劑盒（Protein Assay Kit）（賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）製造，目錄編號：23225）測定抗體濃度。
實施例2.PEMb14抗體對初期胰腺癌患者的血液檢查
（a）PEMb14抗體的過氧化物酶標識
使用Ab-10快速過氧化物酶標記試劑盒（Rapid Peroxidase Labeling Kit）（同仁化學研究所製造，目錄編號：LK33），按照規程對大鼠抗人CD63單克隆抗體（細胞工程研究所製造，克隆名：1C8-2B11）10 μg進行過氧化物酶標識。
（b）血清檢體的製備
於大阪國際癌中心採集血清作為生物體試樣，測定CA19-9值。胰腺癌的階段依據UICC TNM分類（第8版，2017年）。關於各血清，利用PBS稀釋為10倍而製成血清檢體。
（c）健康人及胰腺癌患者的血清中的PEMb14抗體的抗原值的測定
向MaxiSorp 96孔板的各孔中加入10 μg/ml的PEMb14抗體（兔IgG）100 μl，於室溫下靜置1小時。接下來，利用清洗液（包含0.05%曲拉通（Triton）-X 100的50 mM Tris-HCl（pH為8.0）、140 mM NaCl）200 μl將各孔清洗三次，加入封閉液（包含5% BSA的清洗液）200 μl於室溫下靜置1小時。去除封閉液，添加血清檢體100 μl於室溫下振盪反應2小時後，將各孔清洗五次。接下來，將利用封閉液稀釋為1,000倍的過氧化物酶標識大鼠抗人CD63單克隆抗體各添加100 μl，於室溫下靜置1小時。將各孔洗淨五次後，將過氧化物酶底物液（SeraCare生命科學（SeraCare Life Sciences）製造，編碼編號：5120-0053）各添加100 μl，於室溫下振盪反應20分鐘。反應後，添加50 μl的2%硫酸使反應停止，利用微量培養板閱讀器測定各孔的450 nm處的吸光度。
結果，如表3所示，於胰腺癌、特別是初期胰腺癌（階段0及階段1）患者中，基於血清中的PEMb14抗體的抗原值的陽性率比CA19-9陽性率高。由此表明，根據PEMb14抗體的抗原值，能夠判定胰腺癌、特別是初期胰腺癌的患病可能性。
[表3]
| 胰腺癌階段 | 血清檢體數 | PEMb14/陽性數（陽性率） | CA19-9/陽性數（陽性率） |
| 0 | 5 | 3（60%） | 0（0%） |
| 1 | 8 | 5（63%） | 5（63%） |
| 0+1 | 13 | 8（62%） | 5（38%） |
比較例1.與胰腺癌細胞株的培養上清液來源的細胞外囊泡結合的兔單克隆抗體的製造
（a）胰腺癌細胞株的培養上清液來源的細胞外囊泡的製備
將市售的人胰腺癌細胞株（KP-3、KP-3L、BxPC3、Mia-PaCa2及SUIT-2）分別於含有10%FBS的RPMI 1640培養基中培養3天，回收培養上清液。自回收的上清液中，使用麥格卡普夏胞泌體提取試劑盒PS，按照規程對細胞外囊泡進行分離後，混合所獲得的五種細胞外囊泡。以BSA溶液為標準使用BCA蛋白質測定試劑盒對細胞外囊泡的蛋白質濃度進行定量。
（b）產生與細胞外囊泡結合的抗體的淋巴細胞的篩選
與實施例1（c）同樣地，將（a）的細胞外囊泡固相化於微室，添加實施例1（a）的淋巴細胞（2×10
5細胞），篩選產生與細胞外囊泡結合的抗體的淋巴細胞。結果，獲得了產生與胰腺癌細胞株分泌的細胞外囊泡反應的抗體的克隆六種。接下來，與實施例1（e）同樣地，由各克隆製備抗體（d5、d13、d15、d17、d19、d29）。
（c）健康人及胰腺癌患者的血清中的抗原值的測定
作為生物體試樣，利用PBS將血清（Proteogenex公司製造，13名健康人·15名胰腺癌（階段1）患者）稀釋為10倍而作為血清檢體。與實施例2（c）同樣地測定各抗原值。
結果，如表4所示，於初期胰腺癌（階段1）患者中，基於血清中的各抗原值的陽性率比PEMb14低。由此示出，相較於對於培養以人工方式加以植株化的細胞而獲得的培養基來源的細胞外囊泡具有結合性的抗體，對於培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基來源的細胞外囊泡具有結合性的抗體的有用性更高。
[表4]
| 抗體名 | 胰腺癌階段 | 血清檢體數 | 陽性數（陽性率） |
| d5 | 1 | 15 | 1（7%） |
| d13 | 1 | 15 | 1（7%） |
| d15 | 1 | 15 | 0（0%） |
| d17 | 1 | 15 | 2（13%） |
| d19 | 1 | 15 | 3（20%） |
| d29 | 1 | 15 | 0（0%） |
比較例2.與胰腺癌患者血清來源的細胞外囊泡結合的兔單克隆抗體的製造
（a）胰腺癌患者血清來源的細胞外囊泡的製備
自胰腺癌患者（階段1）10人份的血清（Proteogenex公司製造，3名男性·7名女性，40歲～65歲）各1 mL中，使用麥格卡普夏胞泌體提取試劑盒PS，按照規程對細胞外囊泡進行分離後，混合所獲得的10種細胞外囊泡。以BSA溶液為標準使用BCA蛋白質測定試劑盒對細胞外囊泡的蛋白質濃度進行定量。
（b）產生與細胞外囊泡結合的抗體的淋巴細胞的篩選
與實施例1（c）同樣地，將（a）的細胞外囊泡固相化於微室，添加實施例1（a）的淋巴細胞（2×10
5細胞），篩選產生與細胞外囊泡結合的抗體的淋巴細胞。結果，獲得了產生與初期胰腺癌（階段1）患者的血清中包含的細胞外囊泡反應的抗體的克隆五種。接下來，與實施例1（e）同樣地，由各克隆製備抗體（hs8、hs15、hs22、hs28、hs39）。
（c）健康人及胰腺癌患者的血清中的抗原值的測定
作為生物體試樣，利用PBS將血清（Proteogenex公司製造，13名健康人·15名胰腺癌（階段1）患者）稀釋為10倍而作為血清檢體。與實施例2（c）同樣地測定各抗原值。
結果，如表5所示，於初期胰腺癌（階段1）患者中，基於血清中的各抗原值的陽性率比PEMb14低。由此示出，相較於對於胰腺癌患者血清來源的細胞外囊泡具有結合性的抗體，對於培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基來源的細胞外囊泡具有結合性的抗體的有用性更高。
[表5]
| 抗體名 | 胰腺癌階段 | 血清檢體數 | 陽性數（陽性率） |
| hs8 | 1 | 15 | 2（13%） |
| hs15 | 1 | 15 | 0（0%） |
| hs22 | 1 | 15 | 0（0%） |
| hs28 | 1 | 15 | 1（7%） |
| hs39 | 1 | 15 | 0（0%） |
[序列表]
P23-140WO_PCT_對於細胞外囊泡結_20230711_135217_5.xml
無
圖1表示於實施例1中進行的、產生與細胞外囊泡反應的抗體的克隆PEMb14。左圖中藉由透射光觀察，顯示一個淋巴細胞的存在。右圖中藉由免疫螢光染色觀察，顯示淋巴細胞來源的抗體與細胞外囊泡反應。
TW202409079A_112126139_SEQL.xml
Claims (13)
- 一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的製造方法，包括： 工序（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及 工序（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
- 如請求項1所述的製造方法，其中所述工序（1）包括： 工序（1a）培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣的工序；以及 工序（1b）使所述工序（1a）的培養後的培養基來源的細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序。
- 如請求項1所述的製造方法，其中於所述工序（1）中，使固定於固相上的所述細胞外囊泡與液相中的所述被檢抗體接觸。
- 如請求項1至3中任一項所述的製造方法，其中所述生物體試樣是所述生物體組織的酶處理物。
- 如請求項4所述的製造方法，其中所述酶包含膠原酶。
- 如請求項1至3中任一項所述的製造方法，其中於包含生長因子的培養基中進行所述生物體試樣的培養。
- 如請求項1至3中任一項所述的製造方法，其中所述生物體組織為人生物體組織。
- 如請求項1至3中任一項所述的製造方法，其中所述生物體組織為腫瘤組織。
- 如請求項1至3中任一項所述的製造方法，其中所述細胞外囊泡為胞泌體。
- 如請求項1至3中任一項所述的製造方法，其中所述被檢抗體是選自由生物體試樣、以及細胞外囊泡所組成的群組中的至少一種經免疫的動物來源的抗體，所述生物體試樣為選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種，所述細胞外囊泡源自培養所述生物體試樣而獲得的培養基。
- 一種對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的篩選方法，包括： 工序（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及 工序（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
- 一種檢查藥的製造方法，所述檢查藥包含對於細胞外囊泡具有結合性的抗體，所述檢查藥的製造方法包括： 工序（1）使細胞外囊泡與被檢抗體接觸的工序，所述細胞外囊泡源自培養選自由生物體組織及自所述生物體組織分離出的細胞所組成的群組中的至少一種生物體試樣而獲得的培養基；以及 工序（2）將與所述細胞外囊泡結合的所述被檢抗體篩選為對於細胞外囊泡具有結合性的抗體的工序。
- 一種抗體，能夠利用如請求項1至3中任一項所述的製造方法來獲得。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-113672 | 2022-07-15 |
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| TW202409079A true TW202409079A (zh) | 2024-03-01 |
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