JP2003519362A - 固体相内の分析物質を電気化学的に定量分析するためのシステム - Google Patents
固体相内の分析物質を電気化学的に定量分析するためのシステムInfo
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Abstract
Description
ティクロマトグラフテスト技術と電気化学的定量技術とを組み合わせたシステム
や試験方法や試験デバイスに関するものである。より詳細には、本発明は、分析
対象をなす分析物質の濃度に相関させることができる標識物質に関連した標識の
電気化学的変化を測定することによって、固体相(例えば、試験ストリップ)内
の分析物質(例えば、タンパク質や、ホルモンまたは酵素や、小分子や、多糖類
や、抗体や、核酸や、薬剤や、毒素や、ウイルスまたはウイルス粒子や、細胞壁
の一部や、識別を可能とする特徴的なマーカーを有した他の化合物)を決定する
ための電気化学的定量分析システムに関するものである。この分析システム内に
おいて使用される試験ストリップは、固体相アフィニティクロマトグラフ媒体と
、この媒体に形成された流体通路内に配置された電気化学的検出システムと、を
備えている。詳細に後述するように、本発明は、本発明による試験デバイスの電
気化学的セル状環境下において電気的応答の変化を明らかにし得る電気活性物質
をなす電気活性種に対して濃度を相関させ得るような実質的にすべての分析物質
の定量分析に対して応用することができる。
通常、液体試料とされた分析物質と、標識物質または他の反応物質と、を互いに
相互作用させて分析を行う。従来技術の範囲内においては、『標識物質』は、(
a)インジケータによって標識化された擬似分析物質、あるいは、(b)分析対
象をなす分析物質に対して特定の相互作用を行う標識化された配位子、あるいは
、(c)(a)または(b)と、さらに他の反応構成物と、の相互作用によって
形成された錯体、とすることができるものとして理解される。標識物質および分
析物質を含有した液体は、その後、多孔性フィルムまたは膜へと移送される。多
孔性フィルムまたは膜において、液体は、膜の流体経路に沿った拡散や毛細管効
果によって抽出される。そして、1つまたは複数の付随試験キットの反応剤(反
応剤の少なくとも1つは、試験キットの規定領域内において不動化されている)
と出くわす。この標識物質および/または分析物質は、その後、試験サイトにお
いて不動化された付随試験キットの反応剤によって捕獲され、錯体を形成する。
この錯体が、十分な濃度で存在していれば、錯体は、そのようなサイトにおいて
、認識可能な変化を引き起こす。インジケータが、例えば金属(例えばコロイド
状の金)や色付きのラテックス粒子といったような染料である場合には、認識可
能な変化は、通常、裸眼によって視認することができる。
るものである。これら特許文献は、年代順に並べられており、本発明の特許性に
関する議論に際して、並び順には、何の意味もない。
Dickinson に対して付与された)には、『直接的な』または『粒状の』インジケ
ータによる分析物質の検出のための試験方法が開示されている。詳細には、この
場合のインジケータは、裸眼によって視覚的に検出し得るものである。そのため
、この試験方法は、家庭での診断という用途に適している。また、複雑な分析設
備がない医療現場に適している。選択される直接的なインジケータは、色素や同
等の発色剤を含有しているリポソーム(liposome)である。権利主張された試験
方法は、分析物質の尿分析(例えば、妊娠試験)に対して好適なものとして記載
されている。よって、高められた濃度の分析物質を検出することができる。した
がって、このような分析は、分析対象をなす分析物質の半定量的決定として認識
される。試験が単一ステップ(例えば、試験ストリップに対して試料を適用する
)であることにより、この試験は、当該技術分野において『迅速』試験として特
性づけられるようになった。
Dickinson に対して付与された)には、共通に付与された(Campbell氏他による
)米国特許明細書第4,703,017号に記載された原理に基づく免疫クロマ
トグラフ試験方法が開示されている。Rosenstein氏による試験デバイスは、試験
ストリップの『同一平面』内におけるすべての試験キット反応剤を備えており、
試験ストリップに対して試料を直接的に適用して、内部に含有される反応剤を元
の状態に戻し、これにより、所望の分析をもたらす。選択されるインジケータは
、多数の等価な発色剤の中から選択することができる。しかしながら、結合プロ
トシン(例えば、抗原や抗体)に対して吸着させたコロイド状金が、一般的には
好ましい。権利主張された試験方法は、分析物質の尿分析(例えば、妊娠試験)
に対して好適なものとして記載されている。よって、高められた濃度の分析物質
を検出することができる。すなわち、分析対象をなす分析物質の半定量的決定と
して認識される。この試験もまた単一ステップ(例えば、試験ストリップに対し
て試料を適用する)であることにより、この試験は、当該技術分野において『迅
速』試験として特性づけられるようになった。
laboratoriesに対して付与された)には、複数の試験領域を使用した免疫クロマ
トグラフ試験方法が開示されている。各試験領域は、共通の流体通路に沿って並
べられている。この流体通路に沿って試験試料と試験キット反応剤とが移動した
ときには、分析対象をなす分析物質(通常は、直接的インジケータと関連してい
る)は、各試験領域の不動化された反応剤に拘束されるようになる。各試験領域
は、標準物質を参照して予め校正されている。よって、試料中の分析物質の濃度
レベルに対応した特定の試験領域において色が発現する。したがって、試料中の
分析物質の濃度は、試験デバイスの流体経路に沿った色出現位置によって評価す
ることができる。この試験もまた単一ステップ(例えば、試験ストリップに対し
て試料を適用する)であることにより、この試験は、当該技術分野において『迅
速』試験として特性づけられるようになった。
Holdingsに対して付与された)には、上述のCampbell氏他やRosenstein氏による
特許文献に記載された試験方法に類似した免疫クロマトグラフ試験方法が開示さ
れている。May 氏他によって認識され権利主張された原理的な差異の1つは、直
接的なインジケータとともに、試料受領サイトにおける砂糖の凍結乾燥である。
砂糖の添加は、聞くところによれば、凍結乾燥させたインジケータを元に戻すた
めに必要とされる。これにより、試料中の分析物質との相互作用が可能とされる
。
においては、限られた例外を除いては、これら迅速試験は、一般的に、分析物質
濃度の正確な定量的観測には不適切であり、また、単一試験環境下での互いに異
なる複数の分析物質の定量的検出にも不適切である。
電極における電圧変化や電流変化が測定されている。典型的には、電気測定は、
第2電極を参照して行われ、多数の測定が、所定間隔でもっておよび/または所
定条件範囲でもって行われる。
ある。これら特許文献は、年代順に並べられており、本発明の特許性に関する議
論に際して、並び順には、何の意味もない。
University Technology Transfer Corp.に対して付与された)には、水銀によっ
て予めコーティングされたスクリーンプリントカーボン(動作)電極上への、流
体試料からのトレース量の金属の初期吸着によって、流体試料(例えば、飲料水
、血液、尿、等)中のトレース量の金属の分析を行うための、方法および装置が
開示されている。Wang氏による試験プラットホームにおいては、少なくとも1つ
の付加的な(参照)電極が使用されている。トレース量の金属を有した電極は、
その後、陽極ストリッピングボルタメトリ(Anodic Stripping Voltammetry,A
SV)または電位的ストリッピング分析(Potentiometric Stripping Analysis
,PSA)を受ける。Wang氏による方法および装置の利点は、使い捨ての試験デ
バイスを使用して、汚染物質が懸濁されている試料流体の現場での試験が行える
ことである。
British Columbiaに対して付与された)には、いわゆるRAMP(登録商標)技術に
従った手順による粒状ラテックスインジケータの検出のための装置を使用した定
量的免疫クロマトグラフが開示されている。Brooks氏他によれば、RAMP(登録商
標)技術は、ELISA 分析における酵素と同様にして、ラテックス粒子を使用する
。RAMP(登録商標)技術をベースとした分析においては、互いに区別された2つ
の蛍光標識インジケータを有した試験ストリップが、カートリッジ内に配置され
、流体試料が、試験ストリップに対して適用される。分析対象をなす分析物質は
、1つのインジケータと相互作用し、これにより、蛍光性錯体を形成する。この
蛍光性錯体は、試験ストリップの試験領域内において捕獲される。この場合、第
2インジケータは、試験ストリップ内において無反応のままである(そのため、
内部標準を形成する)。よって、RAMP(登録商標)技術においては、内部標準か
らの蛍光錯体を区別することができ、これにより、試料内の分析物質の量が決定
される。
、光学的検出方法(光散乱)と、電導度または抵抗率の変化の測定と、を使用す
る。提案された代替例の1つにおいては、Brooks氏他は、興味をなす分析物質に
関連した錯体からの、例えばビスマスイオンやゲルマニウムイオンやテルルイオ
ンといったような電気活性剤の放出を電気化学的に検出することによって、分析
対象をなす分析物質の定量的測定を行うことを想定している(米国特許明細書第
5,753,517号における第7コラム第7行目〜第19行目)。Brooks氏他
によれば、これら代替例の1つにおいては、分析対象をなす分析物質のためのイ
ンジケータとしてキレート剤とタンパク質との共役体を使用し、分析対象をなす
分析物質の検出においては、酸性溶液を添加して、金属標識をイオンとして放出
させ、その後、陽極ストリッピングボルタメトリ(Hays氏他による Ana. Chem.
66: 1860-1865(1994) に開示されている)によって定量化を行う。
ら文献は、年代順に並べられており、本発明の特許性に関する議論に際して、並
び順には、何の意味もない。
それは、信号が安定していて敏感であること、検出限界が低濃度であること、操
作が簡単であること、および、低コストであること、による。Henieman氏他によ
る先駆的な研究(F.H.Hays氏他による Ana. Chem. 66:1860-1865(1994))は、陽
極ストリッピングボルタメトリ(ASV)検出による不均質の免疫分析のための
金属イオン標識の使用を示している。このような免疫分析においては、金属標識
に対してのチェロン(chelon)として機能し得るよう、タンパク質に対しての電
子共有結合性キレート剤を使用する。抗体(ポリエステルチューブの表面上に不
動化されている)に対しての標識化されたタンパク質と標識化されていないタン
パク質との間の競合的平衡の後に、金属標識が放出され、水銀が懸架されたドロ
ップ電極(HMDE)とエア抜きされた溶液とによるASV検出のための電気化
学セルへと移送される。同様に、Wang氏他(J.Wang氏による Ana. Chem., 70,
1682-1685 (1998))は、抗体によってコーティングされたスクリーンプリントさ
れたセンサを使用し、使い捨てストリップの表面上において直接的に全体的分析
手順を実行し、高感度な電位的ストリッピングモードを使用して、マイクロリッ
トル溶液内の放出金属イオン標識の検出を行った。分散化した検出応用が要望さ
れていることから、そのようなチップ上での手順は、従来のASVをベースとし
た免疫分析と比較して、操作が簡単であること(例えば、分離容積や反応容積が
不要であること、毒性のある水銀の滴下が不要であること、ストリッピング検出
モードが高感度であること)も含めたいくつかの利点をもたらす。Wang氏他によ
るシステムは、(使用前に)センサの予備調整に関して比較的長いインキュベー
ション時間を必要とし、また、試料との相互作用のために比較的長い時間を必要
とし、さらに、複数の洗浄ステップを必要とする。これらが、この方法の実施を
困難なものとしまた面倒なものとしている。
気化学的分析を、分析対象をなす分析物質の定量的検出のために適用することで
ある。
可能であるような、固体相試験フォーマット内における分析物質の電気化学的定
量分析を行うためのシステムを提供することである。
能な固体相内における変化を定電圧測定または電位測定することによる標識の簡
易な検出手段を備えているような、固体相試験フォーマット内における分析物質
の電気化学的定量分析を行うためのシステムを提供することである。
を簡易に検出するための手段を備えているような、固体相試験フォーマット内に
おいて複数の分析物質を有した共通試験試料を電気化学的に同時に定量分析する
ためのシステムを提供することである。
決定するための本発明による電気化学的定量分析システムおよび方法および試験
ストリップによって得られる。初期的には、試験試料溶液と標識物質とが、固体
相試験環境内において分析環境下において最初に接触し、流体通路に沿って移動
する。分析態様(競合的分析、サンドイッチ分析、等)にかかわらず、標識物質
は、固体相の規定領域内において濃縮される(拘束される)。本発明によるシス
テムおよび分析方法の範疇においては、『標識物質』は、分析環境下において固
体相をなす規定領域内において分離することができ、または、そのような規定領
域内において電気活性要素(以下、総称して『電気活性種』と称す)を放出する
ことができ、その後、電気化学的定量分析に付随する電気化学的転移(例えば、
酸化還元)を受けるような、任意の適切な電気活性材料とすることができる。電
気活性種の観測される測定(転移)は、試験試料内の分析対象をなす分析物質の
濃度に対して、直接的に比例することができる、あるいは、反比例することがで
きる(例えば、標準曲線と比較することによって)。
的測定方法は、電位法と定電位法とである。これら分析プロトコルの各々におい
ては、2つの電極が必要とされ/使用され、これら電極と、電極に接触している
試料(電解質)溶液とが、試験ストリップ内において電気化学セル状環境を構成
する。よって、電極表面は、イオン導体(例えば、水性流体試料や試験キット反
応剤等からの電解質)と、電子導体と、の間の接合部をなす。試験ストリップの
電気化学セル状環境内において、分析対象をなす分析物質に対して(あるいは、
分析対象をなす分析物質を代理する電気活性物質に対して)応答する電極は、『
インジケータ』電極または『動作』電極と称される。一方、定電位に維持される
電極は、『参照』電極と称される(この参照電極の応答は、試料溶液には無関係
である)。
剤と接触し、規定領域内に不動化された標識物質からの標識の放出/分離を引き
起こす。例えば金属製標識の場合には、放出された/分離された金属は、放出さ
れた反応剤溶液内の物質と相互作用を起こすことができ、固体相の規定領域内に
おいて、動作電極の表面上に金属フィルム(あるいは、金属表面活性錯体)を形
成することができる。その後、アフィニティクロマトグラフ試験ストリップの規
定領域は、動作電極上の金属フィルム(あるいは、金属表面活性錯体)から、標
識の陽極ストリッピングボルタメトリによって、定電位測定を受ける。これによ
り、標識は、第2の電気化学的転移(還元状態から酸化状態への標識の変換)を
受ける。このような標識の第2の電気化学的転移(還元状態から酸化状態への転
移)は、観測可能な識別特徴を有するものであり、標準曲線と比較することによ
り、試料内の分析物質の濃度と直接的に相関させることができる。
って、分析対象をなす分析物質は、定電位電気化学的技術による試験ストリップ
の規定領域内における変化の測定によって、定量化することができる。この電気
化学的定量分析の特性においては、所定の電位範囲にわたって、規定領域に対し
て電位を印加し、各電位における電子移送速度(電流)を観測する。電圧の変化
は、波長を変更しつつ行う色付きインジケータの一連の光学測定と類似している
。電極に対して印加された電位は、目標となる電気活性種を移動させる(強制的
に移動させる)。これにより、電気活性種の濃度に応じた速度でもって電子の授
受(酸化または還元)を行う。したがって、得られる電流は、電子/溶液界面を
通って移動する電子の速度を反映するだけでなく、(標準状況と比較することに
より)試験試料内の分析物質の濃度をも反映する。このような定電位技術は、電
気活性であるすべての化学種(例えば、電気化学セルという環境内において還元
され得るまたは酸化され得るすべての化学種)を測定することができる。
つの好ましい構成においては、(a)試験ストリップによる試料の吸収量および
吸収速度を制御するために、(b)試験ストリップの規定領域内における、試料
と、不動化された結合物質を有した標識物質と、の間の制御された相互作用を行
い得るために、(c)試料内の含有要素から標識物質を分離させるために、(d
)電気化学的処理に際して、試験ストリップの規定領域内における標識物質の濃
度を確保するために、(e)電気化学的手段によって、分析対象をなす分析物質
を定量的に決定するために、複数の要素と複数の機能領域とを備えている。
、固体相アフィニティクロマトグラフ試験媒体に対して流体連通状態に維持され
る吸収剤パッド内において、組み合わせることができる。アフィニティクロマト
グラフ試験媒体への試料の搬送時に、標識物質が元の状態に戻り、元に戻った標
識物質、および/または、分析対象をなす分析物質との間で形成した錯体が、試
験媒体内に流入することとなる。この流体およびその構成要素(例えば、試料、
試験キット反応剤、反応生成物)が、アフィニティクロマトグラフ試験媒体内へ
と拡散し、標識物質が、流体経路に沿って規定領域(以降、『試験サイト』とも
称す)に対して拘束されるようになる。典型的には、この規定領域は、分析物質
や擬似分析物質や分析物質と標識化された配位子との錯体(例えば、分析物質上
のエピトープに対して結合することによる)に対して相互作用を起こし得る、不
動化された結合物質によって規定することができる。分析物質や擬似分析物質や
分析物質と標識化された配位子との錯体が、試験サイトにおいてしだいに濃度を
高めていったときには、それらを測定することができるようになり、それらの量
を、試験試料内の分析物質に対して相関させることができる。
こと、電気活性種に向けて選択的であること、線形範囲が広いこと、携行可能な
低コスト器具であること、種形成が可能なこと、である。
ス内に収容するために、すべての構成要素は、好ましくは、共通の支持体または
バッキング層(典型的には、例えば Mylar(登録商標)のような不活性プラスチ
ック)上に設置される。試験デバイスのこの基体は、試験ストリップのアフィニ
ティクロマトグラフ試験媒体と、試験ストリップの規定領域内の微小な電気的変
化を測定し得るものとされた電気化学的解析器と、の間における電気的コンタク
ト(直接的接触、または、誘導結合)をもたらし得るよう、導電性材料でもって
予めプリントすることができる。後述の図面の説明において詳述するように、こ
の支持体層には、典型的には、2つ以上の領域において、導電性材料または金属
塩が設置される。このような電極は、空間的には、固体相媒体がなす規定領域に
一致するようにして、支持層に沿って配置される。試験サイトをなす規定領域と
一致している電極は、『動作電極』と称される。電気化学的分析方法によっては
、試験ストリップは、通常、電気化学的セルのプレートを形成するために、少な
くとも1つの付加的な電極(例えば、『参照』電極)を必要とする。
化学的技術によって測定することができる。上述したように、電気化学的測定を
行う前に、まず最初に、動作電極上における『事前濃縮』によって、錯体から標
識を分離させることが望ましい。この『事前濃縮』プロセスにおいては、錯体か
ら標識を放出/分離させ、動作電極上において還元形態で標識を捕獲する(例え
ば、金属フィルム(あるいは、金属表面活性錯体))。これにより、動作電極上
においては、電気化学的プロセスが、より活性となる。この事前濃縮プロセスの
完了後には、得られた金属フィルム(あるいは、金属表面活性錯体)が、陽極ス
トリッピングボルタメトリによって定電位電気化学的定量分析を受けることがで
きる。この好ましい分析システム(例えば、陽極ストリッピングボルタメトリに
よる定電位電気化学的定量分析)の範疇においては、電気化学的定量分析環境下
において、標識が再酸化され、標識のこの電気化学的転移(還元状態から酸化状
態への転移)が、観測される。この転移時に生成される電流信号(ピークおよび
面積)は、多数のシステム変数や金属標識の特性や電極形状に依存する。しかし
ながら、いずれの場合においても、これら変数は、経験的調整によって最適化す
ることができる。分析条件は、分析濃度に対して電気信号応答を相関させるため
に使用される標準曲線に対応するように、調整される。より詳細には、図4は、
鉛の濃度を低濃度から高濃度としたときの、陽極ストリッピング分析におけるカ
ーボン電極上の鉛金属フィルムの電流信号応答を示すグラフである。同様に、図
5は、ビスマスの検出時における、(電気化学的分析に先立って)『事前濃縮』
インターバルを行う時間の関数として、(電流)信号強度の変化を示すグラフで
ある。図5に示すグラフにおいては、事前濃縮インターバルが長くなるほど、電
流信号強度が大きくなっている。分析プロセス条件における同様の相関/最適化
は、選択されたそれぞれの標識に対して行われ、また必要であれば、与えられた
分析物質に関してまた与えられた濃度範囲にわたって起こりそうな条件の動的範
囲に対して相関させるために、それぞれの場合に作成される標準曲線に対して行
われる。図6は、インジウムと鉛と銅とビスマスとを含有した単一溶液に関して
、検出ウィンドウ内における複数の標識の応答を示している。本発明において複
数の標識を使用することにより、単一試料溶液内に含有されている分析対象をな
す複数の分析物質を、同時に定量分析することができる。
は、与えられた単一試験試料内に含有されている複数の分析物質を、同時に定量
分析できるという、本発明独自の能力である。よって、与えられた試料内の分析
対象をなす複数の分析物質のそれぞれに対して互いに異なる複数の標識物質を使
用することにより、与えられた試料に関しての薬剤乱用パネル分析を行うことが
できる。したがって、以下の説明は、単一の分析物質へと、本発明の応用を限定
するものではないことを理解されたい。しかしながら、以下の説明は、理解の容
易さのためにまた例示の容易さのために、主に、単一分析物質の分析について行
われている。
ステムは、固体相試験環境の規定領域内の標識物質の初期濃度をベースとしてい
る。その後、標識の形態で電気的転移を起こし、これにより、観測可能な環境内
において測定可能な電気信号を生成する。この電気信号は、試験試料内における
分析物質の量に対して、相関させることができる。
を放出/分離させることが適切である。これにより、標識を変換させる、あるい
は、標識を他の物質と反応させ、電気化学的定量分析に際してのアクセス性を向
上させる。例えば、標識物質が金属によって標識化されている場合には(例えば
、標識化された配位子)、試験ストリップの規定領域内における分離および濃縮
には、通常、配位子構成からの放出および/または分離、さらには、変換または
反応が必要とされ、これにより、形態の転移(例えば、容易に酸化される状態ま
たは還元される状態)が引き起こされる。これは、電気化学的状態から他の状態
への利用を容易なものとする。本発明の好ましい実施形態においては、標識化さ
れた配位子は、金属標識に対してキレート状の結合を形成する機能基とされる。
しかしながら、この結合は、pHに敏感であり、そのため、金属標識は、固体相
の規定領域内における濃縮後には、単に酸性塩溶液と接触することにより、錯体
から放出/分離されることができる。
細書第4,703,017号(上述)に記載されているようなリポソーム内にカ
プセル詰めされたインジケータ(例えば、金属)である場合には、配位子に対し
て共役することとなり、リポソームカプセルの完全性は、一般的な多くの脂質溶
媒(例えば、洗浄液)によって、容易に分解することができる。よって、金属を
、標識化された配位子の構成成分から放出させることができ、定量分析に際して
、より容易にアクセスすることができる。
使用している場合には、放出された金属標識は、酸性塩溶液内の第二水銀イオン
と反応して、固体相の規定領域に隣接した動作電極上においてアマルガムを形成
することができる。その後、金属標識の電気化学的還元が、その後の電気化学的
定量分析において行われ、微小な電気的変化が、そのような転移時に観測され、
試験試料中の分析物質の存在および濃度と関係づけられる。
本発明による定量分析システムにおいては、アフィニティクロマトグラフ試験ス
トリップを使用する。この場合、試験ストリップの規定領域は、分析対象をなす
分析物質を濃縮し得るよう構成されている。図1および図2に示す試験デバイス
は、本発明による試験デバイスの好ましい実施形態を示している。
ラフ試験ストリップと、電気化学的検出器システムと、を備えている。
、好ましくは、互いに流体連通可能とされた少なくとも2個の好ましくは3個の
離散要素を有した複合体とされている。図1に示すように、試験ストリップは、
標識化された物質(14)(例えば、標識化された配位子、または、標識化され
た擬似分析物質)が隣接位置に予め配置された試料収集パッド(12)と、物質
(18)(例えば、配位子、または、擬似分析物質)が表面上に予めコーティン
グされた膜(22)と、試料溶液の移動を引き起こすために使用される吸収パッ
ド(20)と、を備えている。本発明の好ましい実施形態においては、標識化さ
れた物質は、(使用前に、この物質を安定化させるために)凍結乾燥されており
、その後、液体試料との接触時に元に戻される。
分析環境下において固体相をなす規定領域内において分離することができ、また
は、そのような規定領域内において電気活性要素(以下、総称して『電気活性種
』と称す)を放出することができ、その後、電気化学的定量分析に付随する電気
化学的転移(例えば、酸化還元)を受けるような、任意の適切な電気活性材料と
することができる。電気活性種の観測される測定(転移)は、試験試料内の分析
対象をなす分析物質の濃度に対して、直接的に比例することができる、あるいは
、反比例することができる(例えば、標準曲線と比較することによって)。
型的には、金属ラベルと関連したタンパク質または配位子である。このような配
位子が試料と接触したときには、金属によって標識化された反応剤が、試料中の
分析対象をなす分析物質と相互作用を起こし、錯体を形成する。分析対象をなす
分析物質のアフィニティクロマトグラフによる分離/濃縮において使用し得る標
識物質は、タンパク質/配位子と金属標識とを備えており、好ましくは、米国特
許明細書第4,732,974号に記載されている手順に従って、また、Gray氏
他による“Covalent Attachment of Chelating Groups to Macromolecules”,
Biochem. And Biophys. Res. Comm., Vol. 77, No. 2 (1977) pp.581-581(この
文献は、参考のため、その全体がここに組み込まれる)に記載されている手順に
従って、調製される。要約すれば、金属標識は、金属標識に対して親和性を有し
た『外来キレート基』をタンパク質/配位子に対して電子共有的に結合させるこ
とによってタンパク質/配位子を初期修飾することにより、分析物質に対して特
定のタンパク質/配位子に対して共役させることができる。分析対象をなす金属
インジケータに対して特定のキレート基は、タンパク質/配位子に対して直接的
に電子共有的に結合させることができ、また、中間介在基または連結基を介して
間接的に結合させることができる。結合サイトは、当然のことながら、分析対象
をなす分析物質に対して特定の免疫化学的活性サイトからは、離間していなけれ
ばならない。標識物質の合成において使用するのに特に好適であって、本発明に
よるシステムおよび方法において試験キット反応剤として使用することのできる
金属標識には、Mg,Al,Ca,Sc,Ti,V,Cr,Mn,Fe,Co,
Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Mo,Tc,Pd,Cd,In,S
n,Sb,Ba,Hf,W,Re,Hg,Tl,Pb,La,Ce,Rh,Pr
,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Yd,Th,U,Pu,
および、これらの同位体がある。
いて使用可能な他の標識物質には、リポソームに対して結合された擬似分析物質
がある。リポソームによって標識化された免疫反応剤の調製、および、アフィニ
ティクロマトグラフ分析におけるそれらの使用は、周知であって、Roberts 氏他
による“Investigation of Liposome-Based Immunomigration Sensors for the
Detection of Polychlorinated Biphenyl”, Anal. Chem., Vol. 57, No. 5
(February 1, 1995) pp. 482-491 という技術文献に記載されている。
から、固体相アフィニティクロマトグラフ媒体(16)の流体経路に沿って、下
流側の試験サイト(18)へと、拡散や毛細管作用によって搬送される。そして
、試験サイト(18)において、濃縮され、不動化される。これは、例えば分析
物質/金属錯体との相互作用を起こし得るような特定の不動化された結合タンパ
ク質または他の適切な物質の形態とされた付随試験キット反応剤を使用すること
によって、従来と同様にして行うことができる。よって、標識物質および/また
は錯体が、試験デバイスの流体経路に沿って移動または拡散したときには、標識
物質および/または錯体は、不動化された結合物質と出くわし、それにより捕獲
されて、試験サイトに集積する。適切な反応期間の後に、試験ストリップの規定
領域内に十分な量の分析物質/標識物質が集積されることにより、検出のために
必要な量がもたらされ、電気化学的分析によって定量化される。
商標)、プラスチック、または、比較的電気絶縁性(非導電性)の他の材料)上
に、2つの電極(2電極システムの場合)または3つの電極(3電極システムの
場合)をプリントすることにより、作製される。両面に接着剤を有している支持
体(24)を使用することにより、アフィニティクロマトグラフ試験ストリップ
と電気化学的検出器システムとが組み合わされている。支持体内の穴は、膜内に
おいて、電気化学的検出器システムと試験領域(18)との間に位置している。
引き起こされる電流または電圧の変化が還元状態から酸化状態を形成したときに
電気活性種に関する微小な電気化学的変化を測定し得るような手段を使用するこ
とによって、行われる。実用的には、これは、本発明におけるアフィニティクロ
マトグラフ試験ストリップを、適切な測定デバイス内に挿入し、これにより、こ
の測定デバイスと、試験サイト(18)における電極(26)と、を電気的に接
続することによって、行うことができる。アフィニティクロマトグラフ試験スト
リップに対しての観測器具の電気的接続は、試験デバイスの規定領域/試験サイ
トに関連した電極に対して、観測器具を直接的に結合させる(物理的接触)こと
により、または、観測器具を間接的に結合させる(誘導的)ことにより、行うこ
とができる。試験デバイスは、さらに、同時に他の位置(28)における試験ス
トリップに対して、電気的に接続することができる。これにより、試験サイトに
おける読取の比較のための参照点または内部標準が、もたらされる。その後、試
験サイトに対して電圧を印加することにより、標識を、ある形態または状態から
、他の形態または状態へと、励起/変換することができ、そのような転移を観測
することができる。この転移は、試験サイトに対して印加された電気力の性質お
よび強度に応じて、また、標識の初期濃度および本来的特性に関連したシステム
の他の変数に応じて、様々な態様で発現する。
ニティクロマトグラフ試験ストリップと電気化学的検出器システムとは、ハウジ
ング内に収容されている。このハウジングは、分離器(30)と、上部部材すな
わちカバー(32)と、底部部材すなわちベース(34)と、から構成されてい
る。ベースは、カバーと結合し得るよう構成されており、これにより、アフィニ
ティクロマトグラフ試験ストリップと電気化学的検出器システムとを内部にシー
ルして保護することができ、外部からの干渉に耐性を有した環境をもたらすこと
ができる。分離器(30)は、漏斗形状とされていて、試験サイト上の直接型試
験キット反応剤に対して適合することができ、ハウジングのカバー内の穴を通し
てハウジング内に挿入され得るようになっている。これにより、分離器は、膜の
検出領域(試験サイト)内の規定領域を穿孔することができ、これにより、イン
ジケータの初期濃度に対して、試験キット反応剤の容量に関し、膜の規定領域(
規定容積)を分離することができる。
くつかの好ましい実施形態を規定し記述し例示している。これら実験例において
説明され使用される材料の合成に関して使用される装置および技術は、特に断ら
ない限り、標準的なものである。実験例において使用されている比率は、特に断
らない限り、重量を基準とするものである。
、適度に加熱しながら、水に溶解させた。得られた溶液を凍結乾燥することによ
り、ガラス状残留物を得た。その後、そのような残留物を、適度に加熱しながら
、アセトニトリルに溶解させた。この溶液を、反応全体にわたって撹拌しつつ、
アイスバス内において、イソブチルクロロフォルメートに対して添加した。得ら
れた無水ジエチルエネトリアミンペンタアセティックアシッドを、その後、室温
において所定モル比の保護溶液内において、タンパク質と反応させた。その後、
反応混合物を、クエン酸塩バッファに対して透析した。過剰の標識溶液を、透析
した溶液に対して添加し、室温で維持した。標識化されたタンパク質を、リン酸
塩バッファ溶液に対して透析した。タンパク質(AntiHBsAg Ab,A
ntiHCG Ab,AntiMyoglobin Ab,AntiTropo
nine I Ab,G−SAG,IgG−Fc,HIV,HCV,等)は、実
験室内において上記方法により、金属イオン(例えば、ビスマス、鉛、インジウ
ム、タリウム、および、銅)によって、十分に標識化されている。標識化された
タンパク質を使用することにより、固体相のアフィニティクロマトグラフ試験ス
トリップが作製された。
)とに対応した2つの導電性成膜体または領域(2電極システムの場合)が、ポ
リエステル層上にインクジェットによりプリントされた。各プリント領域のサイ
ズは、4×4mmであり、厚さは、約0.127mm(5/1000インチ)で
あった。
ーボンインク電極システムの上方において試験サイトと位置合わせするようにし
て、バッキング層上に積層された。ファイバガラスパッド(標識/配位子共役体
を含有している)と過剰の流体吸収媒体との各々が、積層の各端部に配置され、
これにより、試験ストリップの組立が完了した。この実験例に従って作製された
試験デバイスは、図1〜図3に示されている。
固体相試験デバイスとを使用したHCGやHBsAgやミオグロビンや複数の分
析物質のための分析の性能評価に際しては、まず最初に、液体試料を、試料適用
領域に対して適用した。その後、液体試料は、毛細管作用によって、アフィニテ
ィクロマトグラフストリップに沿ってアフィニティクロマトグラフストリップの
他端に向けて移動した。液体が試料適用パッド内を移動する際には、試料適用パ
ッド内に含有されている標識化された配位子が、元の状態へと戻り、試料内の(
1つまたは複数の)分析物質は、標識化された(1つまたは複数の)配位子と反
応を起こし、(1つまたは複数の)錯体を形成する。このような錯体は、アフィ
ニティクロマトグラフ試験媒体へと移送されてアフィニティクロマトグラフ試験
媒体内へと注入される。錯体が検出領域(試験サイト)へと到達したときには、
錯体内の分析物質が、検出領域内に不動化された配位子と反応を起こし、標識化
された配位子と分析物質と配位子とからなる(1つまたは複数の)錯体を形成す
る。一方、拘束されていない要素および流体の一部は、デバイスの反対側におい
て吸収媒体内へと流入を継続する。その後、検出領域内における錯体形成が集積
し、標識金属イオンが、矩形波ストリッピングボルタメトリ(SWSV)によっ
て定量化される。上述したように、このストリッピング手順においては、予備濃
縮(あるいは、表面活性錯体の吸着集積の形成)と金属イオンの決定とを行う。
来の光学測定技術では測定が困難な混濁した溶液である場合に、特に有利である
。図7は、本発明によるシステムおよび方法および試験デバイス(図3)を使用
して、様々な濃度とされた標準的なミオグロビン抗体溶液を電気化学的に分析し
た結果を示すグラフである。この分析の検出最小限界および感度は、部分的には
、アンチミオブロビン抗原に対しての鉛イオンの標識化に関しての大きなモル比
と、動作電極上における鉛の予備濃縮のインターバル期間と、に依存する。図8
は、本発明によるシステムおよび方法および試験デバイス(図3)を使用して、
血清試料中における2.5ng/mlという濃度のHBsAgを、繰返し測定し
た場合の結果を示すグラフである。6回の繰返し測定にわたって、再現性のある
応答が得られている。また、本発明によるシステムおよび方法および試験デバイ
ス(図3)を使用すれば、分析対象をなす複数の分析物質の同時検出を行うこと
ができる。図9は、鉛イオンおよび銅イオンおよびビスマスイオンによって標識
化されたHBsAg抗体を使用した場合の、血清試料中におけるHBsAgの応
答を示すグラフである。応答曲線上において、様々なイオンを観測することがで
き、これは、複数の錯体(様々な金属イオン錯体によって標識化された、抗HB
sAg抗体−HBsAg抗原−抗HBsAg抗体−抗HBsAg抗体)が形成さ
れ、試験領域において検出されたことを示している。図10は、本発明によるシ
ステムおよび方法および試験デバイス(図3)を使用して、血清試料中において
HCG(左側)とHBsAg(右側)とを同時検出した場合の結果を示すグラフ
である。真ん中のピークは、デバイスが動作していることを示す参照試験である
。
、適度に加熱しながら、水に溶解させた。得られた溶液を凍結乾燥することによ
り、ガラス状残留物を得た。その後、そのような残留物を、適度に加熱しながら
、アセトニトリルに溶解させた。この溶液を、反応全体にわたって撹拌しつつ、
アイスバス内において、イソブチルクロロフォルメートに対して添加した。得ら
れた無水ジエチルエネトリアミンペンタアセティックアシッドを、その後、室温
において所定モル比の保護溶液内において、オリゴヌクレオチドと反応させた。
その後、反応混合物を、トリス(tris)バッファに対して透析した。過剰の標識
溶液を、透析した溶液に対して添加し、室温で維持した。標識化されたオリゴヌ
クレオチドを、トリスバッファ溶液に対して透析した。標識化されたオリゴヌク
レオチドを使用することにより、固体相のアフィニティ試験センサが作製された
。
)とに対応した2つの導電性成膜体または領域(2電極システムの場合)が、ポ
リエステル層上にインクジェットによりプリントされた。各プリント領域のサイ
ズは、約4×4mmであり、厚さは、約0.127mm(5/1000インチ)
であった。
ーボンインク電極システムの上方において試験サイトと位置合わせするようにし
て、バッキング層上に積層された。ファイバガラスパッド(標識/オリゴヌクレ
オチド共役体を含有している)と過剰の流体吸収媒体との各々が、積層の各端部
に配置され、これにより、試験ストリップの組立が完了した。この実験例に従っ
て作製された試験デバイスは、図1〜図3に示されている。
ロマトグラフ固体相試験デバイスとを使用したヒトのNPORの分析の性能評価
に際しては、まず最初に、分析対象をなすオリゴヌクレオチドを含有している液
体試料を、試料適用領域に対して適用した。その後、液体試料は、毛細管作用に
よって、アフィニティクロマトグラフストリップに沿ってアフィニティクロマト
グラフストリップの他端に向けて移動した。液体が試料適用パッド内を移動する
際には、接触パッド内に含有された標識化されたオリゴヌクレオチドが、搬送さ
れ、試料溶液中の分析対象をなすオリゴヌクレオチドに対して、試験領域にコー
ティングされた相補的オリゴヌクレオチドと競合的に相互作用し、標識化された
オリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドとの錯体と、オリゴヌクレオチ
ドと相補的オリゴヌクレオチドとの錯体と、を形成する。一方、拘束されていな
い要素および流体の一部は、デバイスの反対側において吸収媒体内へと流入を継
続する。その後、検出領域内における錯体形成が集積し、標識金属イオンが、矩
形波ストリッピングボルタメトリ(SWSV)によって定量化される。上述した
ように、このストリッピング手順においては、予備濃縮(あるいは、表面活性錯
体の吸着集積の形成)と金属イオンの決定とを行う。図11は、本発明によるシ
ステムおよび方法および試験デバイス(図3)を使用して、ヒトのNPOR(2
5merのオリゴヌクレオチド)を競合的に検出した場合の結果を示すグラフで
ある。図において、A(上側)は、ブランク溶液(ヒトのNPORが含まれてい
ない)についての信号であり、B(下側)は、ヒトのNPORを含有した溶液に
ついての信号である。このような結果は、DNAの検出およびシークエンシング
のための方法をもたらす。
トリップを示す斜視図であって、図1Aは、2電極システムを示しており、図1
Bは、3電極システムを示している。
図である。
ml〜50ng/mlとされている)に関しての、陽極ストリッピング分析にお
けるカーボン電極上のビスマス/水銀アマルガムの電流信号応答曲線を示すグラ
フである。
前濃縮』インターバルを行う時間の関数としての(電流)信号強度の変化を表し
ている電流信号応答曲線を示すグラフであり、事前濃縮インターバル(1分間〜
15分間にわたって変化している)が長くなるほど、電流信号強度が大きくなる
ことが示されている。
溶液に関して、検出ウィンドウ内における複数の標識の応答を表す電流信号応答
曲線を示すグラフである。
よび図2)を使用して、様々な濃度とされた標準的なミオグロビン抗体溶液を電
気化学的に分析した結果を表す電流信号応答曲線を示すグラフである。
よび図2)を使用して、血清試料中における2.5ng/mlという濃度のHB
sAgを、6回にわたって繰返し測定した場合の結果を表す電流信号応答曲線を
示すグラフである。
れたHBsAg抗体を使用した場合の、血清試料中におけるHBsAgの測定結
果を表す電流信号応答曲線を示すグラフである。
および図2)を使用して、血清試料中においてHCG(左側)とHBsAg(右
側)とを同時検出した場合の結果を表す電流信号応答曲線を示すグラフである。
に検出した場合の結果を表す電流信号応答曲線を示すグラフであり、A(上側)
は、ブランク溶液(ヒトのNPORが含まれていない)についての信号であり、
B(下側)は、ヒトのNPORを含有した溶液についての信号である。
Claims (13)
- 【請求項1】 固体相試験環境下において分析物質を定量分析するためのシ
ステムであって、 (a)分析対象をなす分析物質に関連した親和性物質の結合および/または捕
獲を行い得る1つまたは複数の規定領域を有したアフィニティクロマトグラフ媒
体と、 (b)分析対象をなす分析物質に対して相互作用を行い得る標識化された配位
子試験キット反応剤と、 を使用するシステムにおいて、 A.内部に流体通路が形成されている固体相アフィニティクロマトグラフ媒体
と、該アフィニティクロマトグラフ媒体に対して流体連通状態とされた試料収集
媒体と、前記アフィニティクロマトグラフ媒体の1つまたは複数の規定領域に対
しての電気接続を確立するための手段と、を備えてなる固体相試験ストリップで
あるとともに、 (1)前記アフィニティクロマトグラフ媒体が、不動化された結合物質が存在
する少なくとも1つの規定領域を有し、 前記不動化された結合物質が、インジケータによって標識化された擬似分析物
質またはインジケータによって標識化された配位子またはこれらの混合物のいず
れかとされた標識物質の要素と親和性化学相互作用を起こし得るものとされ、 (2)前記試料収集媒体が、内部に少なくとも1つの標識物質が配置されてい
るものであり、 前記標識物質の各々が、互いに異なる標識を有するとともに、分析対象をなす
1つの分析物質とだけ相互作用を起こし得るものとされている、 ような固体相試験ストリップと; B.標識を有した少なくとも1つの標識物質であるとともに、電気化学的分析
条件下において電気活性であり、さらに、標識の形態で電気化学的転移を受け、
これにより、認識可能な電気信号を引き起こすことができる標識物質であり、こ
の場合、前記電気信号が、前記標識について特徴的なものであるとともに前記試
験試料内の分析対象をなす各分析物質の存在および量を決定するために標準物質
と相関し得るものであるような、標識物質と; C.(1)電気化学的環境下において前記アフィニティクロマトグラフ媒体の
前記規定領域と電気化学的センサとの間の電気接続を確立するための手段と、(
2)電気化学的センサからの電気信号を検出するための手段と、(3)分析対象
をなす分析物質に関して、前記電気化学的センサからの前記電気信号を解釈する
および/または相関させるための手段と、を備えてなる電気化学的観測手段と;
を具備することを特徴とするシステム。 - 【請求項2】 請求項1記載のシステムにおいて、 前記アフィニティクロマトグラフ媒体が、さらに、第2規定領域と、分析環境
下において前記第2規定領域に対しての電気的な接触を確立するための手段と、
各標識に関して特徴的な前記電気化学的変化に対しての比較または参照を行うた
めの手段と、を有していることを特徴とするシステム。 - 【請求項3】 請求項1記載のシステムにおいて、 前記標識が、Mg,Al,Ca,Sc,Ti,V,Cr,Mn,Fe,Co,
Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Mo,Tc,Pd,Cd,In,S
n,Sb,Ba,Hf,W,Re,Hg,Tl,Pb,La,Ce,Rh,Pr
,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Yd,Th,U,Pu,
および、これらの同位体からなるグループの中から選択された金属であることを
特徴とするシステム。 - 【請求項4】 請求項1記載のシステムにおいて、 前記標識が、電気化学的分析状況下において電気活性であるような物質を含有
している、標識化された配位子またはリポソームであることを特徴とするシステ
ム。 - 【請求項5】 請求項1記載のシステムにおいて、 前記電気化学的分析状況が、分析対象をなす分析物質を代理する電気活性物質
の定電圧測定であることを特徴とするシステム。 - 【請求項6】 請求項1記載のシステムにおいて、 前記電気化学的分析状況が、分析対象をなす分析物質を代理する電気活性物質
の電位測定であることを特徴とするシステム。 - 【請求項7】 固体相試験環境下において分析物質を定量分析するための方
法であって、 (a)分析対象をなす分析物質に関連した親和性物質の結合および/または捕
獲を行い得る1つまたは複数の規定領域を有したアフィニティクロマトグラフ媒
体と、 (b)分析対象をなす分析物質に対して相互作用を行い得る標識化された配位
子試験キット反応剤と、 を使用する方法において、 A.(1)内部に線状通路が形成されている固体相アフィニティクロマトグラ
フ媒体と、該アフィニティクロマトグラフ媒体に対して流体連通状態とされた試
料収集媒体と、前記アフィニティクロマトグラフ媒体の1つまたは複数の規定領
域に対しての電気接続を確立するための手段と、を備えてなる固体相試験ストリ
ップであるとともに、 (a)前記アフィニティクロマトグラフ媒体が、不動化された結合物質が存
在する少なくとも1つの規定領域を有し、 前記不動化された結合物質が、前記分析物質に対して、または、前記分析物質
と前記標識化された配位子試験キット反応剤との間において形成された錯体の中
の分析物質成分に対して、免疫化学的相互作用を行い得るようなものとされ、 (b)前記試料収集媒体が、内部に少なくとも1つの標識化された配位子試
験キット反応剤が配置されているものであり、 前記標識化された配位子試験キット反応剤の各々が、互いに異なる標識を有す
るとともに、分析対象をなす1つの分析物質とだけ相互作用を起こし得るものと
されている、 ような固体相試験ストリップと; (2)標識を有した少なくとも1つの標識化された配位子試験キット反応剤で
あるとともに、前記配位子からの放出時にはまたは前記配位子からの分離時には
標識の形態で電気化学的転移を受け、これにより、認識可能な電気信号を引き起
こすことができる標識化された配位子試験キット反応剤であり、この場合、前記
電気信号が、前記標識について特徴的なものであるとともに前記試験試料内の分
析対象をなす各分析物質の存在および量を決定するために標準物質と相関し得る
ものであるような、少なくとも1つの標識化された配位子試験キット反応剤と; (3)(a)電気化学的環境下において前記アフィニティクロマトグラフ媒体
の前記規定領域と電気化学的センサとの間の電気接続を確立するための手段と、
(b)電気化学的センサからの電気信号を検出するための手段と、(c)分析対
象をなす分析物質に関して、前記電気化学的センサからの前記電気信号を解釈す
るおよび/または相関させるための手段と、を備えてなる電気化学的観測手段と
; を準備し、 B.分析環境下において前記固体相試験ストリップに対して試料を適用し、こ
れにより、試料の分析を開始し、 C.定量分析環境下において、前記試験ストリップの前記規定領域内における
電気化学的変化について前記試験ストリップを観測する、 ことを特徴とする方法。 - 【請求項8】 請求項7記載の方法において、 前記アフィニティクロマトグラフ媒体を、さらに、第2規定領域と、分析環境
下において前記第2規定領域に対しての電気的な接触を確立するための手段と、
各標識に関して特徴的な前記電気化学的変化に対しての比較または参照を行うた
めの手段と、を有したものとすることを特徴とする方法。 - 【請求項9】 請求項7記載の方法において、 前記標識を、Mg,Al,Ca,Sc,Ti,V,Cr,Mn,Fe,Co,
Ni,Cu,Zn,Ga,Sr,Y,Zr,Mo,Tc,Pd,Cd,In,S
n,Sb,Ba,Hf,W,Re,Hg,Tl,Pb,La,Ce,Rh,Pr
,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Yd,Th,U,Pu,
および、これらの同位体からなるグループの中から選択された金属とすることを
特徴とする方法。 - 【請求項10】 請求項7記載の方法において、 前記標識を、電気化学的分析状況下において電気活性であるような物質を含有
しているリポソームとすることを特徴とする方法。 - 【請求項11】 請求項7記載の方法において、 前記電気化学的分析状況を、分析対象をなす分析物質を代理する電気活性物質
の定電圧測定とすることを特徴とする方法。 - 【請求項12】 請求項7記載の方法において、 前記電気化学的分析状況を、分析対象をなす分析物質を代理する電気活性物質
の電位測定とすることを特徴とする方法。 - 【請求項13】 アフィニティクロマトグラフ試験ストリップであって、 内部に形成された流体通路と、試料溶液と標識物質との反応成分を捕獲/不動
化し得る少なくとも1つの規定領域と、を備えてなり、 前記少なくとも1つの規定領域が、前記流体通路に沿って、不動化された結合
物質を有し、 さらに、分析環境下において、各規定領域と外部の電気エネルギー源との間に
電気的な接触を確立するための第1手段と、 分析環境下において、各規定領域と他の規定領域との間に参照用電気接触を確
立するための第2手段と、 を備えていることを特徴とするアフィニティクロマトグラフ試験ストリップ。
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