JP2021096174A - 電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料溶液の流れを制御することで、反応時間が短く、感度に優れ、精度が高い定量と電気的測定ができる電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそれに用いられるセンサーを提供する。【解決手段】樹脂製シートの支持体２に、電極部５と、電極部からの電流を伝える導電部７と、この電流値を測定する電気測定器に接続する接続部１２とを配するとともに、前記支持体上に複数のパッド類を一部分積層配置して、試料溶液を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部５の位置で流れを制御して電気化学的検出を行う。流速制御パッド１５や流路部ファイバーパッド１０や、流速制御用突起部２７により流れを制御する。【選択図】図２

Description

本発明は、体液中の抗原や抗体、食品の原料／加工物中のタンパク質などを検出するための電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー検査方法およびその製造方法に関する。

近年、診療所や小規模病院において、患者を診察している間に検体検査を実施する”Point of Care Testing“が行われるようになり、ドライケミストリー試薬と小型比色計からなる血液生化学検査システムによる臓器別異常の診断や、イムノクロマトグラフィー式テストストリップを用いる咽頭や鼻からの粘膜液や血液を検体とする感染症診断用目視判定（定性）製品が流通している。

イムノクロマトグラフィー式テストストリップは、サンプル中の検出すべき被験物質を抗原抗体反応により、検出する方法である。イムノクロマトグラフィー式テストストリップは、被験物質である抗原または抗体に対する抗体または抗原を、クロマトグラフ媒体である不溶性メンブレン担体上に固定化して固定相である検出部を作製し、コンジュゲート（検出試薬）である上記被検出物質と結合可能な抗体または抗原が結合された標識体を含む移動相として用い、被験物質と移動相であるコンジュゲートとを特異的に反応させ、さらに固定相である検出部において、コンジュゲートと結合した被験物質を、検出部に固定化された抗体または抗原に特異的に反応させるものである。そして、通常、標識体として、金コロイドなどのコロイド状金属粒子やカラーラテックス粒子が用いられるので、検出部における色から、サンプル中の被験物質の存在を検出する。
イムノクロマトグラフィー式テストストリップの構成としては、特許文献１に記載されている通り、サンプルを供給するサンプルパッド、移動相であるコンジュゲートを配置させるコンジュゲーションパッド、サンプルとコンジュゲートの複合体を展開するとともに、検出のため検出部を有する不溶性メンブレン担体、及び不溶性メンブレン担体を展開してきたサンプルを吸収するための吸収パッドが配置されているのが一般的である。

本願の発明者は、特許文献２において、被検物資に特異的に結合する第１抗体が固定化された作用極と、当該被検物質に特異的に結合する抗体である第２抗体を標識体である金属粒子に結合したものを用意し、前記作用極の表面に被検物質である抗原または抗体と前記標識体に結合した抗体または抗原とを供給して抗原抗体反応させることにより、試料溶液中の被験物質に対応した量の前記金属粒子を前記作用極の表面近傍に集め、前記作用電極の電位制御を行い、前記金属粒子を電気化学的に酸化させるとともに、未反応の前記第２抗体が結合した前記金属粒子をNaCl、KClやHClの塩化物水溶液（電解液と未反応の抗体又は抗原が結合した標識体を排除するための洗浄液を兼ねる）を作用極に滴下した後、排除し、測定に用いる抗体や抗原さらに測定溶液中の夾雑物に由来するノイズの影響を抑えた状態とし、前記ノイズを抑えた状態で酸化した前記金属微粒子を電気化学的に還元させる際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被験物質の有無または濃度を調べる方法（被検物質の測定方法）を開示している。
なお、特許文献２には、「・・・印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。」と記載され、また「吸収パッド２５と、メンブレン２２の裏面側に配されたバッキングシート２６とを備えている。図４（ａ）に示すように、メンブレン２２表面の所定領域には一次抗体２が固定化され、判定部（固定化領域）２３を形成している。判定部２３の下流のメンブレン２２の表面には、金属微粒子５で標識した二次抗体４に特異的に結合する抗体が固定化され、コントロール部２４を形成している。」と記載され、さらに「メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１とを重ね合わせる。」、「メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１とを重ね合わせた後」、「図６に示すような印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。」という記載がある。しかし、この特許文献２に従って検証した結果、前記電極部の位置においては、試料溶液中の被験物質が抗原抗体を示さない割合が高く、試料溶液中の被検物質を正しく定量することがでるとは言えなかった。

国際公開２００２０３７０９９Ａ１ 特許第５１８７７５９号公報

しかしながら、従来のイムノクロマトグラフィー式テストストリップは、不溶性メンブレン担体上表面に設けた検出部に線状に塗布されたキャプチャー抗体と標識体に結合した抗体と被検液中の抗原と反応して生じる色相を目視で判定して定性または光学系を有する機器で半定量する方法であり、被験物質の量を正確かつ精密に定量することが困難であるという問題点があることから、より小型で携帯可能な測定器を用いて即座に正確に定量検査できることが望まれる。
また、上述の検証から、特許文献２については、電極部の位置で速度や流れ方と流れ量を制御しなければ、正確な測定ができないばかりか、測定器に対して簡易に接続して即座に計測ができるような構造にはなっていなかった。そして、そのような測定器（センサー）の製造方法については考えられていないものである。

そこで本発明の目的は、試料溶液の流れを制御することで、反応時間が短く、感度に優れ、精度が高い定量測定ができる電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーを提供することにある。また本発明の目的は、既存のイムノクロマト式テストストリップのパッド類を電極部が印刷された支持体上の実装を効率的に行うために、既存の製造設備を活用して量産できる安価な製造方法を提供することにある。

本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる電極部と、電極部からの電流を伝える導電性カーボンを印刷してなる導電部とこの電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上にパッド類と試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を電極部に対応した位置に集める前記流速制御パッドを配して、試料溶液をパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部の位置の流速制御パッドの位置において試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御して電気化学的検出を行うことを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法である。そして、前記流速制御パッドは、前記支持体上の電極部表面に渡って設けられるか、もしくは電極部上面まで配置させた流路部ファイバーパッドの電極部上面に設けられるとともに、流速制御パッド上流側と下流側を流速制御用突起部により、上方から適度な圧力で押さえつけることで、流速制御パッドの所定範囲において、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御することを特徴とする。
また、本発明は、樹脂製シートの支持体に、電極部と、電極部からの電流を伝える導電部と、この電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上にパッド類を複数配して、試料溶液を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部の位置で流れを制御して電気化学的検出を行うに必要最小限の反応時間確保することを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーである。
本発明によれば、樹脂製シートの支持体の電極部の位置に対応して前記流速制御パッドを設けることにより、電極部の位置での試料溶液の流れを必要最小限の反応時間を確保するための制御ができるようになり、電極部での感度が良くなり、迅速簡易に精度が高い定量測定ができる。すなわち、前記流速制御パッドを設けることにより、電極部の位置での試料溶液の流れを制御ができるようになり、パッド類に渡って流れる試料溶液の電極表面の近傍で抗原抗体反応に必要な最小限の反応時間と速度に試料溶液の流れを制御ができるので、この流速制御のためのマイクロ流路やポンプなどの必要がなくなり、携帯型の小型電流計測メーターで感度が良く、迅速簡易に精度の高い定量測定ができるようになる。このように、上記電極表面の近傍において、電極表面に資料溶液の量と速度を一定に保ちつつ電極部に密着するような流れ方を制御する。
また、本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる作用極と、対向するように配される導電性カーボンを印刷してなる対極と銀／塩化銀を印刷してなる参照極と、導電性カーボンを印刷してなるこれらの電極部から発生する各電流を伝える導電部と、これらの電極部で発生する電流を電気測定器に伝えるための接続部とを配するとともに、前記支持体の電極上にパッド類を複数配して、試料溶液を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部の位置で流れを制御して電気化学的検出を行うことを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーである。
本発明によれば、前記３種類の電極部の位置で試料溶液の流れを制御して充分な抗原抗体反応時間を確保できるようにするため、正確な電気的測定が可能である。

本発明は、被検出物質の試料溶液が流路部ファイバーパッドを通じて電極部に移動した際に、試料溶液中の被検物質が電極部上に近接して必要最小限の反応時間を得るために適度な速度で試料溶液を流し、作用極上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）を完結させるための流速制御パッドを上記各電極部上に備えることを特徴とする請求項１又は２記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーである。
本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおけるサンプルパッドとコンジュゲーションパッドと吸収パッドと支持体は、特許文献１に示された様な、一般に用いられているイムノクロトグラフィー用テストストリップに用いられているサンプルパッドとコンジュゲーションパッドおよび吸収パッドと同様な材料を用いて製造することができる。
しかし、本発明では、既成のイムノクロマトクロマトグラフィー用テストストリップとは異なり、下記する電極が印刷された支持体に、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、流路部ファイバーパッド、流速制御パッド、吸収パッドを部分積層して配置し、製造する。パッド類では、流路部ファイバーパッドの上流側上面には、コンジュゲーションパッドが一部積層して配され、流路部ファイバーパッドの下流側下面では、流速制御パッドが一部積層して配されるか、又は流路部ファイバーパッドを電極部上面まで配置し、その電極部上面に積層して配置され、流路部ファイバーパッドと流速制御パッドは一般のイムノクロマトグラフィーとは異なる材質のもので構成されている。

本発明としては、前記一般のイムノクロマトグラフィーとは異なる流路部ファイバーパッドはコンジュゲーションパッドの下流側下面の一部と接触して配置され、作用極上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）を完結させるための流速制御パッドは流路部ファイバーパッドの下流側下面に一部と接触し、上記電極部の上面に配置されていることを特徴とする。また、試料溶液中の抗原または抗体と免疫学的に反応する抗体または抗原が金などのコロイド状金属粒子に結合されたものが含侵乾燥されたコンジュゲーションパッド中で免疫学的に反応しつつ試料溶液を電極部に移動させる機能を有する流路部ファイバーパッドを備えることを特徴とする。
本発明によれば、前記流速制御パッドにより試料溶液の速度の流れを抗原抗体反応に最小必要限の反応時間に制御することにより、作用極での電気的検出が迅速かつ正確に行われるようになる。
なお、流路部ファイバーパッド上に電解／洗浄液を供給するため、上ケース２２に電解／洗浄液孔を設けることもでき、電解／洗浄液の供給は流路ファイバーパッド上からの方が効率的な未反応物の洗浄が可能である。
なお、本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおいては、電解／洗浄液をサンプル孔から供給しても、未反応物の洗浄が可能であり、大差のない測定結果が得られる。

本発明としては、本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおいて、標識体に結された被検物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原とは、別のものであることが好ましい。即ち、標識体に結合された被験物質に対して免疫化学的に反応する抗体または抗原と、作用極表面に固定化された被検物質に対して免疫化学的に反応する抗体または抗原とは、各々被験物質の別の部位を認識する抗体または抗原であることが好ましい。標識体及び作用極に別の抗体または抗原を用いることで、特異性と感度がより優れたものとなる。すなわち、研究や製品の原料として用いられる抗体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とがあり、これらは作製方法や性質が異なるため、用途にあわせて使い分けられる。モノクローナル抗体は、標的たんぱく質の被認識部位（エピトープ）の１つにしか結合できず、一方、ポリクローナル抗体は、同一のたんぱく質の複数のエピトープに結合できるので、１つのポリクローナル抗体で、たんぱく質の複数のエピトープを認識できる。

本発明としては、前記電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケースを備え、そのカセットケースに前記流速制御パッドを上方から押さえて堰き止めるように制御する流速制御用突起部を設けることを特徴とする。なお、流速制御用突起部は前記流速制御用パッド上から、２個以上の複数または１個で、部分または全面を押さえても、上記目的を達成することができる。
本発明によれば、カセットケースに設けられた前記流速制御用突起部が、前記電極部上に設置されている前記流速制御パッドを上方と下方の２カ所から堰き止め、抗原抗体反応に必要かつ最低限な流速と時間を確保して確実に試料溶液を電極部の表面に流すことができる。
また、本発明としては、前記電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケースを備え、そのカセットケースから前記接続部を外部に突出させて、その接続部を前記電極部の電流を検出する電気測定器に差し込んで、その電気回路に接続して、前記電極で発生した電流を測定することが好ましい。
本発明によれば、前記ラテラルフロー免疫センサーをカセットケースに内装したまま、その外部に出ている前記接続部を前記電極部の電流を検出する電気測定器に差し込んで、これにより電気回路を構成して、前記電極で発生した電流を即座に測定することができる。

また、本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷して作用極と参照極と対極とこれらの電流を伝える導電部と電気測定器との接続するための接続部を形成し、さらに対極上の導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面にキャプチャー抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に試料溶液の標識体に結合した抗体又は抗原を反応させながら作用極側に移動させる流路部ファイバーパッドと、試料溶液の反応物が作用極上に固定化されたキャプチャー抗体または抗原と抗原／抗体反応するようにする試料溶液の流れを制御する流速制御パッドを電極部上に配置する工程を備えることを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法である。
本発明によれば、従来のスクリーン印刷などの印刷技術を用いて、樹脂製シートの支持体に電気的配線構造と導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面に抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に複数のパッド類を従来装置で積層する工程により効率よく製造することができる。

本発明としては、前記支持体上に、滴下された試料溶液を吸収するサンプルパッドと、サンプルパッドからのサンプルを吸収しつつ含侵されている金コロイドに結合した抗体または抗原を溶解して繋ぐコンジュゲーションパッドと、サンプル中の抗原または抗体と金コロイドに結合した抗体又は抗原を反応させながら作用極側に移動させる流路部ファイバーパッドと、移動してきた反応物が作用極上に固定化されたキャプチャー抗体と抗原／抗体反応してサンドイッチを形成するようにする流速制御パッドと、試料溶液の反応残差物の液体を吸収する吸収パッドを配置する工程を備えることを特徴とする。
また、本発明としては、上流側から、サンプルパッドはコンジュゲーションパッドを積層する距離を残した部分の下面を前記支持体上の接着剤で固定し、コンジュゲーションパッドは、流路部ファイバーパッドの上流側上面の一部と積層し、残る下面を前記支持体上の接着剤子固定し、流路部ファイバーパッドは、流速制御パッドの上流側上面の一部と積層する部分を残した部分を前記電極と積層し、残る下面を支持体上の接着剤で固定し、前記流速制御パッドは作用極および対極と参照極部分に接触し（ただし、支持体上の接着剤で固定しない。）、電気絶縁部を上から印刷した導電部の最上流部の一部まで位置し、その下面を電絶縁体が上から印刷されている導電部上の接着剤で固定するか又は流路部ファイバーパッドを電極部表面まで配置し、その下面は、電極部以外は接着剤で固定し、電極部は積層し（接着剤で固定しない。）、その電極部の上面部に流速制限パッドを積層し、それを越えた下流部の下面を支持体上の接着剤で固定し、吸収パッドは流速制御パッドの下流側上面の一部に積層し、その下流部末端まで位置し、その下面を導電部に絶縁体を印刷した前記支持体上の接着剤で固定することを特徴とする。

本実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそれに用いるセンサーによれば、流速制御パッドにより、試料溶液の横流れ速度を制御して必要な抗原抗体反応時間を確保し、電極部での電流測定において、感度に優れ、定量可能な状態にして電気的測定値を得ることができる。
本発明の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造法を用いれば、既存の製造設備を用いて自動的製造が可能であり、かつ均一な性能を有する製品が得られる。
従来の印刷技術と積層技術を用いて、樹脂製シートの支持体に導電性カーボンによる電気的配線構造と導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面に抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に複数のパッド類を積層する工程により効率よく製造することができる。

本発明の一実施の形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおける電極と導電部と接続部に導電性カーボンが、さらに導電部上に電気的絶縁体が印刷されていることを示す平面図である。 上記実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーのパッド類の積層構造を説明する断面図である。上流から、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、流路部ファイバーパッド、流速制御パッド、吸収パッドの各一部が互いに積層さていることを示している。その（ａ）は電極部の上に流速制限パッドを配置した例であり、その（ｂ）は電極部の上に流路部ファイバーパッドを介して流速制限パッドを配置した例である。 上記実施形態のラテラルフロー式免疫センサーを収納する収納カセットケースの上ケースを示す平面及び立体図であり、その（ａ）はその上ケース上面図であり、その（ｂ）はその下ケースの裏面図である。２８はサンプル孔であり、２９は洗浄／電解液孔である。また、上ケース裏面図において、２７は流速制御用突起部であり、その前方側と後方側の２カ所が示されている。（ｃ）は、上ケース上面と上ケースの裏面と下ケースの上面のそれぞれ立体図である。 上記実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーがカセットに収納されている２種類の状態（（ａ）と（ｂ））を示し、その上ケースの裏面から流速制御パッド１５上に一定の圧力をかけて流速制御に寄与するための構造を示す側面図である。なお、上記突起部２７は、流速制御パッド１５上にあって、その個数は、全面を押さえるための１個から、両端を押さえる２個または２個以上の複数個でも構わず、要するに前記した流速制御が達成できればよく、その個数を限定するものではない。 上記実施形態のラテラルフロー式免疫センサーのカセット上ケース裏面の流速制御用突起部と電極部との位置関係を示す図である。 上記実施形態のラテラルフロー式免疫センサーによる使用例を説明する図であり、その（ａ）は本願発明の免疫センサーと、この接続部を携帯型小型機器差し込んで接続して還元電流の測定を示す例であり、その（ｂ）は電気回路を構成することを示す図である。 上記実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの試料溶液の検査の原理を示す一例図である。検体がサンプルパッドに滴下されるとコンジュゲーションパッド中に含侵乾燥された金コロイドの結合した抗体を溶かして検体中の抗原と抗原抗体反応しながら横流れし、電極（作用極）に固定化されたキャプチャー抗体と抗原抗体反応しサンドイッチを形成し、検体中の抗原量に対応する金コロイドが捕獲されることを図示している。

以下、本発明を適用した実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２は、図１に示すような樹脂製シートである担体３に電極が印刷された支持体２上に図２（ａ）（ｂ）に示すように、支持体上に被験物質を含有する可能性があるサンプルを横方向に展開（ラテラルフロー）させることにより被験物質を定量するセンサー２である。
樹脂製シートの担体３に、電極部５と、電極部５からの電流を伝える導電部７と、この電流値を測定する電気測定器（メーター）４に接続する接続部１２とを配するとともに、前記支持体上にパッド類８、１０，１１，１５、１６を互いに部分積層して配置して、試料溶液を複数のパッド類に渡って含浸させて行く流れを前記電極部５の位置で制御して電気化学的検出を行うセンサーであり、図２中符号２−１と２−２に示された２通りの配置がある。図２（ａ）は電極部５の上に流速制限パッド１５を配置した例であり、図２（ｂ）は電極部５の上に流路部ファイバーパッド１１を介して流速制限パッド１０を配置した例である。

本発明の電気化学法免疫センサーを用いた被験物質の測定法は、図１と図５及び図６に示すように、被検物資に特異的に結合する第１キャプチャー抗体または抗原が固定化された作用極５ａと、当該被検物質に特異的に結合する抗体である第２抗体または抗原を金属粒子（標識体）に結合したものを用意し、前記作用極５ａの表面に試験溶液と標識体とを供給して抗原抗体反応させることにより、試料溶液中の被験物質に対応した量の前記金属粒子を前記作用極５ａの表面近傍に集め、作用電極５ａに電位制御を行い、前記金属粒子を電気化学的に酸化させるとともに、未反応の前記第２抗体が結合した前記金属粒子をNaCl、KClやHClの塩化物水溶液（電解液と洗浄液を兼ねる）を作用極５ａに横流しした後、排除し、測定に用いる抗体や抗原さらに測定溶液中の夾雑物に由来するノイズの影響を抑えた状態とし、前記ノイズを抑えた状態で酸化した前記金属微粒子を電気化学的に還元させる際に生じる還元電流値を測定し、前記電流値に基づいて被験物質の有無または濃度を定量する。

本ラテラルフロー式免疫センサー２は、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドと吸収パッドと支持体は、特許文献２に示されたような、一般に用いられているイムノクロトグラフィー用テストストリップに用いられているサンプルパッドとコンジュゲーションパッドおよび吸収パッドと同様な材料を用いて製造することができる。イムノクロマトグラフィー法によるイムノアッセイでは、サンプルは毛細管力によってデバイス中を染み込みながら進み、あらかじめ含浸させておいた二次抗体と結合した結合体が、メンブレン上に判定ラインとして固定化された抗体と結合し、その場で捕捉される。サンプルと結合していない二次抗体は、そのまま判定ラインを通過し、次のコントロールラインまで流れていき、そこで捕捉される。結合の原理としてサンドイッチアッセイ法の他に阻害アッセイ法も使われる。本発明によるラテラルフローイムノアッセイでは、複数の機能が必要なため複数の異なるコンポーネントの組み合わせが必要とされ、一般的には、サンプルパッド、コンジュゲートリリースパッド、反応用メンブレン、および吸収パッドが必要になるが、この他に流路部ファイバーパッドと流速制御パッドが必要であり、一部の用途では血球分離フィルターが必要になる場合もある。

また、本実施の形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１又は２−２は、合成樹脂製のシートである担体に電極と配線が電気絶縁部を介して形成されて、電気的構造を有する支持体となり、この上に、一般に用いられているイムノクロトグラフィー用テストストリップに用いられているサンプルパッド８とコンジュゲーションパッド１１および吸収パッド１６と同様な材料を用いて製造することができる（図２）。
しかし、本発明の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１又は２−２では、既成のイムノクロマトクロマトグラフィー用テストストリップとは異なり、下記する担体３に電極部５が印刷等で被覆された支持体２上に、サンプルパッド８、コンジュゲーションパッド１１、流路部ファイバーパッド１０、流速制御パッド１５、吸収パッド１６を部分積層して配置して、製造する。なお、カーボン、銀／塩化銀を印刷或いは被覆していない前記支持体２の上にサンプルパッド８、コンジュゲーションパッド１１が配置される。
そして、対極５ｂ上の導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極５の表面に抗体または抗原を固定化する工程を備え、前記電極部５の作用極５ａは、樹脂製シートの支持体２の全幅に渡って形成されており、参照極５ｃと対極５ｂは、作用極５ａの後方側（下流側）において、支持体２の左右端側に各々配されており、各電極部５ａ，５ｂ，５ｃは、各々導電部７で引き出されて、後方下流側の接続部１２と連結されている。接続部１２は、電気測定器４に差し込まれて（カセットケース３１−１、３１−２からも接続部１２は露出する）、電気測定器４により電気的測定が行われる（図５）。

（支持体上に印刷した電極部）
図１と図２に示すように、合成樹脂シートの支持体２に導電性カーボンを黒色塗で示された形状で印刷し、作用極５ａと参照極５ｃと対極５ｂの下地および電流を伝える導電部７と電気測定器（メーター）４に接続するための接続部１２を形成し、さらに対極部５ｂでは導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷等で被覆する工程によって製造する。作用極５ａは、樹脂製シートの担体３の全幅に渡って形成されており、参照極５ｃと対極５ｂは、作用極５ａの後方側（下流側）において、電気的内部構造の担体３の左右端側に各々配されており、各電極部５ａ〜５ｃは、各々導電部７で引き出されて、後方下流側の接続部１２と連結されている。そして、電流を伝える導電部７と電気測定器４に接続するための接続部１２を形成し、さらに対極５ｂでは導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷等で被覆する工程によって支持体２を製造する。図１において、合成樹脂などを材料とする担体３に電極部５と電気測定器４への接続部１２が印刷され、また導電性カーボンを印刷することにより、電極（作用極５ａと対極５ｂ）５と導電部７とメーターへの接続部１２が形成されている。参照極５ｃは、銀／塩化銀が印刷により塗布されている。

支持体２に印刷する導電性カーボン粒子ペーストの材料としては、例えば、ケッチンブラック、グラフェン、カーボンナノチューブ、フラーレンなどが挙げられるが、コストの点ではケッチンブラックが好適である。参照極５ｃに印刷する銀／塩化銀は、塩化銀結晶の微粒子で構成されるペーストを印刷することにより、良好な塗面と密着性がある。樹脂製シートの担体３は、各種樹脂によるシートであればよく、例えば厚さ0.1〜0.5mmのポリスチレンを使用したが、電気回路とパッド類を積層できるものであれば、基板状のものであっても良い。

（担体：電気回路の担体）
本発明で用いられる電気回路が印刷された支持体２は、担体３に電極部５や配線が構成されたものであり、３種類の電極部５（５ａ，５ｂ，５ｃ）とこれらからの電流を伝える導電部７とそれら電流値を測定する電気測定器４に接続する接続部１２に導電性カーボンを印刷し、その後、参照極上に銀／塩化銀を印刷し、さらに電極部５（５ａ，５ｂ，５ｃ）から引き出される３本の導電部７上に電気的絶縁物９（ウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリエルテル樹脂、フェノール樹脂等）を印刷等で被覆してなることで、電極や配線を構成する担体３を製造することができる。

（標識体）
本発明で用いられる標識体は、電気分解可能な金属粒子（金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やコロイド粒子、量子ドット等）であれば何でもよく、その粒径は20nm〜100nmでよいが、特に、40nm〜60nmの金コロイド粒子が好ましい。この金コロイド粒子は、一般に用いられている方法、例えば、加熱したテトラクロロ金（III）酸水水溶液にクエン酸三ナトリウム水溶液を滴下して撹拌することによって製造することができる。

（流路部ファイバーパッド）
本発明で用いられる流路部ファイバーパッド１０は、繊維状の細いファイバーで形成された不織布であり、その材料としては、ガラス繊維、樹脂繊維、カーボン繊維、天然繊維などで形成された強い毛細管力を有する薄い不織布であればよく、特に厚さが0.3〜1.0mmのガラス繊維が好適である。流路部ファイバーパッド１０は、サンプル液中の抗原または抗体がコンジュゲーションパッド中の標識体の結合した抗体または抗原と反応させながら横流しして、反応領域（作用極上）５ａに導く。

（流速制御パッド）
本発明で用いられる流速制御パッド１５は、繊維状の細いファイバーで形成された不織布であり、その材料としては、ガラス繊維、樹脂繊維、カーボン繊維、天然繊維など弱い毛細管力を有する様に形成された薄い不織布である。厚さが0.3〜1.0mmのガラス繊維の流路部ファイバーパッド１０に比べ、流速制御パッド１５は0.1〜0.7mmの緻密な天然繊維の不織布がより好適である。
本実施の形態の流速制御パッド１５は、電極部（作用極と対極および銀／塩化銀を印刷してなる参照極）５の位置の上に位置して設けられている。そして、流速制御パッド１５の上方からカセットケース３１−１、３１−２の上ケース裏面２２ｂに位置する流速制御用突起部２７により２カ所またはそれ以上または全面に渡る１カ所で押圧されて、被検物質の流れを制御する。
本実施の一形態では、上流側の流速制御用突起部２７ａが作用極５ａの位置に対応して配され、下流側の流速制御用突起部２７ｂが参照極５ｃと対極５ｂの位置に対向するように配される。すなわち、電極部５の位置において、前記流速制御パッド１５の前方側（上流側）と後方側（下流側）の２か所に押圧することにより、作用極側５ａと、参照極５ｃ及び対極５ｂとがその二か所の間（Ｈ１−Ｈ２）で前記流速制御パッド１５を介して流速制御用突起部２７により押圧される（図５）。なお、カセットケース３１−１、３１−２に収納されない限り、本願の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１、２−２の流速制御パッド１５には、上記流速制御用突起部２７により押圧されることはない。

（電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法）
本発明の免疫センサー２−１の製造法は、支持体２の３種電極部分５を除いて接着剤を着け、先ず流速制御パッド１５の位置に対応する３種電極部５を除く最下流部下面を支持体２に固定し、次に流路部ファイバーパッド１０の下流側下面を流速制御パッド上面に積層し、残る下面部を支持体上の接着剤で固定し、次にコンジュゲーションパッド１１の下流側下面の一部を流路ファイバーパッド１０の上流側上面に積層し、サンプルパッド８はその下流側下面をコンジュゲーションパッド１１の上流側上面に積層し、残る下面を支持体上の接着剤で固定する。
本発明の免疫センサー２−２の製造法は、支持体２に３種電極部分除く部分に接着剤を着け、先ず、流路部ファイバーパッド１０の電極部を除く下面を支持体上の接着剤で固定し、次に流速制限パッド１５の下面を流路部ファイバーパッド１０の電極部上面に積層し、その最下流部下面を支持体２上の接着材で固定し、コンジュゲーションパッド１１の下流側下面の一部を流路ファイバーパッド１０の上流側上面に積層し、サンプルパッド８はその下流側下面をコンジュゲーションパッド１１の上流側上面に積層し、残る下面を支持体上の接着剤で固定する。
なお、支持体上の上記各電極部５の印刷は各種な方法で印刷することができる。例えばスクリーン印刷において、一度に多数（例えば５０個以上）の１測定分の電極部５が連続した形状に導電性カーボンや銀／塩化銀を印刷できる刷版を作製し、例えば５０個以上の電極が連続印刷された支持体として作製し、本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーに必要な各材料の一部分を互いに積層してなる連続体の当該センサーを製造することができる。
その量産法の一例として、例えばBioDot社から市販されているイムノクロマトクロマトグラフィーテストストリップ用自動製造装置で、長尺の各材料の貼付を行い、次にこの材料の１つであるコンジュゲーションパッド１１に標識体を塗布して乾燥した後、当該免疫センサーの１個ごとの幅に切断するにより、本特許の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１を量産し、より安価に当該製品を供給することができる。

（測定原理）
本願発明のセンサー２−１、２−２を使用した測定方法（抗原測定の一例の検査方法）を説明する。
図７に示すように、検体（測定対象の抗原を含有する）を、金コロイドに結合された抗体を含侵したサンプルパッド１３上に滴下し（図７の１）、金コロイド結合抗体と抗原（測定対象物）が流路部上を流れながら抗原＋抗体反応し（図７の２）、その先にある電極部（支持体表面）５上に固定化されたキャプチャー抗体と結合し、サンドイッチを形成し、未反応物（過剰の金コロイド結合抗体）は、吸収パッド１６に捕獲される（図７の３）。その後、電解液孔２９から流路部ファイバーパッド１０上に電解液（食塩水等）を滴下し、図７の３における「金粒子結合抗体＋抗原＋キャプチャー抗体（電極部５に固定化）」部分に到達させ、検体中の抗原量に対し、過剰に供給された未反応の金コロイドに結合された抗体を洗浄除去した後、支持体２に印刷された電極部における接続部１２部分を電気測定器（メータ）４に接続して、一定の電圧を印加し、発生する金粒子の還元電流を測定して、血液中の測定対象物の濃度を定量する。
第１の実施の形態によれば、検体中の抗原と金コロイド結合抗体が抗原抗体反応しながら流れ、電極部（作用極）上に固定化されたキャプチャー抗体に近接し、そして電極上を流れ去る間に検体中の抗原のほぼ全てがキャプチャー抗体に結合するようになる。
そして、試料溶液中の被検物質（抗原または抗体）に対応した量の金属微粒子の量を電極部５の位置の上面に配置した前記流速制御パッド１５により、作用極５ａ上に集め、金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を電極部５で検出し、その電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を測定する。
すなわち、例えば抗原抗体反応による検体中の抗原または抗体を金属微粒子量に結合された抗体又抗原と特異的に反応させ、作用電極の表面近傍に被検物質量に対応した金属微粒子を集め、金属微粒子を構成する金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際の還元電流値を測定する。ここで得られる還元電流強度は、作用電極の近傍に集められた金属量を表すことから、これに基づいて被検物質中の抗原又抗体の定量又は検出が実現される。ここで、金属微粒子の電気化学的酸化は、作用電極の表面近傍に金属微粒子を集めた状態で行うことが重要である。そのため、接着剤を使用しないで配される流速制限パッドまたは流路ファイバーパッドの電極部の下面を支持体に直接密着させるようにする。これにより、被検物質との反応に関与した金属微粒子の全てを作用電極表面との電子授受に関与させることができるため、結果として被検物質の高感度で精密な測定が実現される。

「CRPの定量用電気学法ラテラルフロー式免疫センサーの作製」
（抗CRPモノクロナル抗体溶液の調製）
以下の試験に用いたCRP抗体は、イムノ・プローブ社の2種の抗ヒトCRPモノクロナル抗体（No.8とNo.5）である。各抗体を濃度5mg/mlの濃度になるよう10mM-トリス緩衝液で希釈した溶液を作製した。

（CRP免疫センサー作製例）
１）担体３の作製には、支持体（Lohmann Precision社透明ポリスチレン）２に、導電性カーボン（ライオン・スペシャリティー・ケミカル社製ケッチンブラック）を図１と図２の様な形状の作用極５ａ、対極５ｂ、参照極５ｃ及び導電部７、接続部１２をスクリーン印刷した後、参照極５ｃに銀／塩化銀（ビー・エー・エス社製）を印刷し、更に導電部７に電気敵絶縁部（ウレタン樹脂）をスクリーン印刷した。

２）サンプルパッド８の作製には、セルロースファイバー製パッド（AHLSTROM製）をサンプルパッドとして用いた。サンプルパッド８は、サンプルを吸い上げ、コンジュゲート放出領域または分析用メンブレンへ均一かつ一定の速度で送り出す役割や、デバイスからサンプルが溢れるのを確実に防ぐ役割の他、サンプルから粒子や細胞をろ過する、サンプルを改変するために化学物質を含浸させる、など多くの機能を持たせることができる。

３）CRPモノクロナル抗体標識金コロイド粒子の作製には、蒸留水99mlに1.1%テトラクロロ金（III）酸四水和物（田中貴金属社製）水溶液1.0mlと富士フィルム和光純薬社製（品番：162-03495） K₂CO₃を10mMに希釈した水溶液2.44mlを加えて混合し、3分間50℃に加熱した後、富士フィルム和光純薬社製品番：191-01785）クエン酸ナトリウムを1.1％に希釈した水溶液1.0mlを添加し、11分間煮沸した後、蒸留水氷中に入れて冷却し、平均粒子径が40nmの金コロイドを調製した。
上記金コロイド溶液1mlに抗ヒトモノクロナル抗体（イムノ・プローブ社製No.8）を10mMのトリス緩衝液で希釈し、0.5mg/mlに調製したCRP抗体溶液を1ml添加して混合撹拌した後、室温で60分間静置し、更に10%ウシ血清アルブミン溶液を加えて超音波で分散させ、5分間室温で静置し、次に冷却した遠心分離機で遠心し、上清を除いて沈殿物を得た。これに10mlの10%ウシ血清アルブミン溶液を再度加えて超音波で分散させて、この溶液を波長520nmで吸光度（OD）を測定し、吸光度（OD）が約9になる濃度に調製し、CRPモノクロナル抗体標識金コロイド溶液を作製した。

４）コンジュゲーションパッド１１の作製
上記３）で調整したCRPモノクロナル抗体標識金コロイド粒子（コンジュゲート）溶液を、EMDMILIPORE社製GLASSFIBER DIAGNOSTICS PADに飽和するまで含侵させ、凍結乾燥機にて一晩乾燥させて、コンジュゲーションパッド１１を作製した。コンジュゲーションパッド１１は、保管期間中、コンジュゲートを保持し、検出能を維持させ、サンプルがパッド中を移動するときにこれらのコンジュゲートを効率的に放出する。

５）作用極上に抗ヒトモノクロナルCRP抗体の固定化する。
抗ヒトモノクロナルCRP抗体（イムノ・プローブ社製No.5）を10mMのトリス緩衝液で希釈し、その4μlを作用極５ａの上に載せ、一晩冷蔵庫中で静置した後、残存した当該抗体溶液をエアガンで吹き飛ばし、作用極上に抗ヒトモノクロナルCRP抗体の固定化した。

６）電極部上のブロッキング
試料溶液（サンプル）中の測定対象外の蛋白質などが３種類の電極部５に吸着しないようにブロッキングするため、2.5％カゼインホウ酸水溶液（pH8.5）を前記３種類の電極部（作用極５ａ、対極５ｂ、参照極５ｃ）に各10μlを載せ、常湿にて室温で１時間静置した後、残存する当該溶液をエアガンで吹き飛ばした。

７）電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの作製
プラスチックに製粘剤が付着した支持体２に、先ず、流路部ファイバーパッド（AHLSTROM社グラスフィアイバーパッド：品番8964）１０を配置装着し、次いで、上記４）で作製したコンジュゲーションパッド１１を配置装着し、更にサンプルパッド（AHLSTROM社グラスフィアイバーパッド：品番0238）８を配置装着し、一方、流路部ファイバーパッド１０の下流側の３種の電極部５の上端に流速制御パッド（旭化成社セルロース長繊維不織布：品番SA28G）１５を配置装着し、更に吸収パッド（AHLSTROM社製セルロースファイバーパッド：品番0270）１６を配置装着した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を印刷された電極部単位の幅で切断して電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１を作製した。この本願発明のラテラルフロー式免疫センサー１は、測定の際、プラスチック製の専用ハウジングで構成されるテストデバイス形態にした。すなわち、図３（ａ）（ｂ）に示すように、上流側に試料溶液及び洗浄液を供給する供給孔２９を有するカセットケース３０に差し込まれて使用される電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１として構成されている。
図４（ａ）（ｂ）は、カセットケース３０に内装された状態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１として構成されている。図４（ａ）は、電極部５に流速制御パッド１５を密着させるものであり、その上流側には流路部ファイバーパッド１０の下流端部の下層を流速制御パッド１５の上流端部の上層に積層し、その下流側では、吸収パッド１６の上流端部の下層を積層し、吸収パッド１６に導いている。したがって、電極部１５に流速制御パッド１５を密着させて前後（上流と下流）のパッド１１，１６で押さえつけるとともに、流速制御パッド１５での試料溶液の速度を遅くすることができる。
図４（ｂ）は、電極部５表面まで流路部ファイバーパッドを敷き、流速制御パッド１５を流路部ファイバーパッド１０における電極部の上に積層して密着させるものであり、その下流側の電極部を過ぎた上面を、吸収パッド１６の上流端部の下層を積層し、吸収パッド１６に導いている。したがって、流路部ファイバーパッド１０の電極部に位置する上層に流速制御パッド１５を積層することで試料溶液の速度を遅くすることができるとともに、流速制御パッド１５の下流側の一部を吸収パッド１６の上流部端部に積層させることで試料溶液を移動させることができる。
このように、流速制御パッド１５の上流側や下流側の一部を他のパッドと積層することで、試料溶液を上記電極５の表面に移動させ、電極部５の表面近傍において試料溶液の量と速度を一定に保ちつつ、電極部に密着するような流れ方を制御することができる。

８）ラテラルフロー式免疫センサーのカートリッジユニット
本願発明のラテラルフロー式免疫センサー１を収納するカセットケース３０は、上ケース２２と下ケース２３からなり、その材料としてはポリプロピレン、ポリエステル、ポリススチレン、アクリルなどの樹脂で成型されたもので、本願発明の免疫センサー１は下ケース２３の所定の位置において、上ケース２２を被せ、両ケースを押さえて嵌合し、かつその上ケース裏面２２ｂには、流速制御用突起部２７が内壁に成型されている。流速制御用突起部２７は、流速制御パッド１５を上方から押圧して流速を制御するものであり、２個設けられる本実施の形態に限らず、一つでも複数設けても良い。また、カセットケース３１−１、３１−２には、サンプル孔２８と洗浄／電解液孔２９が形成され（図３（ａ））、上ケース裏面２２ｂには、流速制御パッド１５の機能を制御するための流速制御用突起部２７を流速制御パッド１５の上に位置する様に流速制御用突起部２７を配置した（図３（ｂ））。サンプル孔２８に洗浄液／電解液を供給して洗浄できるが、電極部５に近い洗浄液兼電解液の孔／電解液孔２９からの供給の方が洗浄効率に優れ、また、電解液の供給にも電極部５に近い方が効率的な測定が可能である。
図５（ａ）（ｂ）は、カセット上ケース裏面２２ｂの流速制御用突起部２７と電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１、２−２の電極部５との位置関係を示す図である。図５（ａ）は、上流側の流速制御用突起部２７ａを電極部５の作用極５ａ上に配置し、下流側の流速制御用突起部２７ｂを電極部５の対極５ｂ（又は参照極５ｃ）上に配置した例を示し、流速制御パッド１５を押さえつける上流側の流速制御用突起部２７ａと下流側の流速制御用突起部２７ｂとの間の領域を反応領域Ｈ１〜Ｈ２として、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する。
図５（ｂ）は、電極部５の作用極５ａに上流側の流速制御用突起部２７ａと下流側の流速制御用突起部２７ｂとの間の領域を反応領域Ｈ１〜Ｈ２として、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する。なお、更に、電極部５の対極５ｂ（又は参照極５ｃ）上に流速制御用突起部２７ｂを配置しても良い。
このように、流速制御パッド１５の上流側や下流側を流速制御用突起部２７ａ，２７ｂにより押さえつけることで、流速制御パッド１５の所定範囲Ｈ１〜Ｈ２において、範囲電極部５の表面に試料溶液の量と速度を一定に流れるように制御することができる。

〔実施例１〕
上記作製法で作製した電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１を用いて、ＣＲＰの定量試験を行った。

（試験法）
（１）試料
CRP標準血清（関東化学製）を、生理食塩水（１％ウシ血清アルブミンを含む）希釈し、CRP濃度15ng/ml、90ng/ml、210ng/mlの試料を調製し、また希釈液をCRP濃度0mg/dlとしたものを試料とした。
（２）手順
上記（１）で調整した各試料55μlを電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１のサンプル供給孔２９に滴下して３分後に、洗浄液兼電解液（0.05%の界面活性剤Tween20を含む2M-NaCl）を洗浄液を供給する穴（電解液供給孔と兼用）２９に滴下して３分後にCRP濃度に対応して発生する電解電流（μA）の測定を、表１に示す４種の濃度の試料溶液を各１２回多重測定した。ただし、ゼロ濃度の試料溶液は１０回多重測定した。

（試験結果）
試験結果を表１に示す。CRP濃度15ng/mlにおける平均値が1.154μAであり、1μA当たりのCRP濃度は13.00ng/mlとなり、その標準偏差0.282μAに相当する濃度は3.666ng/mlであり、またCRP濃度90ng/mlにおける平均値が3.230μAであり、1μA当たりのCRP濃度は27.86ng/mlとなり、その標準偏差0.420μAに相当する濃度は11.70ng/mlとなる定量結果であった。さらにCRP濃度210ng/mlにおける平均値が3.993μAであり、1μA当たりのCRP濃度は52.59ng/ml となり、その標準偏差0.707μAに相当する濃度は37.18ng/mlである精密度を有する定量結果であった。

以上、本実施形態においては、モノクローナル抗体の例を主に説明したが、本発明はポリクローナル抗体にも適用可能である。また、製造方法においては、接着剤を使用する箇所と使用しない箇所（電極部）とを分けておき、パッド類１０，１１，１５，１６に接着剤を着けておいてから、電極や配線などの電気的内部構成を有する支持体２の上にパッド類を配置することも可能である。また、カセットケース３０を用いるタイプでは、カセットケース３０で押えることで、接着剤を使用しないでも製造可能である。

１ 担体上に印刷された電極、
２ 支持体（担体３上に電極を印刷した支持体）、
２−１、２−２ 電気化学式ラテラルフロー式免疫センサー、
３ 担体（電極や配線などの電気的内部構成を有する担体）、
４ 電気測定器（メーター）、
５ 電極部、 ５ａ 作用極、 ５ｂ 対極、 ５ｃ 参照極、
６ 電気回路、
７ 導電部、
８ サンプルパッド、
９ 電気的絶縁物、
１０ 流路部ファイバーパッド（流路メンブレン）、
１１ コンジュゲーションパッド、
１２ 接続部、
１３ サンプル孔（試料溶液の供給孔）、
１４ 制御部、
１５ 流速制御パッド、
１６ 吸収パッド、
１７ 還元電流曲線及び還元電流と濃度の関係図、
２２ 上ケース、２２ａ 上ケース上面、２２ｂ 上ケース裏面、
２３ 下ケース、２３ａ 下ケース裏面、
２７ 流速制御用突起部、
２８ サンプル孔、
２９ 洗浄液／電解液孔、
３０ カセットケース、
３１―１、３１−２ ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケース

本発明は、体液中の抗原や抗体、食品の原料／加工物中のタンパク質などを検出するための電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー検査方法およびその製造方法に関する。

近年、診療所や小規模病院において、患者を診察している間に検体検査を実施する”Point of Care Testing“が行われるようになり、ドライケミストリー試薬と小型比色計からなる血液生化学検査システムによる臓器別異常の診断や、イムノクロマトグラフィー式テストストリップを用いる咽頭や鼻からの粘膜液や血液を検体とする感染症診断用目視判定（定性）製品が流通している。

イムノクロマトグラフィー式テストストリップは、サンプル中の検出すべき被験物質を抗原抗体反応により、検出する方法である。イムノクロマトグラフィー式テストストリップは、被験物質である抗原または抗体に対する抗体または抗原を、クロマトグラフ媒体である不溶性メンブレン担体上に固定化して固定相である検出部を作製し、コンジュゲート（検出試薬）である上記被検出物質と結合可能な抗体または抗原が結合された標識体を含む移動相として用い、被験物質と移動相であるコンジュゲートとを特異的に反応させ、さらに固定相である検出部において、コンジュゲートと結合した被験物質を、検出部に固定化された抗体または抗原に特異的に反応させるものである。そして、通常、標識体として、金コロイドなどのコロイド状金属微粒子やカラーラテックス粒子が用いられるので、検出部における色から、サンプル中の被験物質の存在を検出する。
イムノクロマトグラフィー式テストストリップの構成としては、特許文献１に記載されている通り、サンプルを供給するサンプルパッド、移動相であるコンジュゲートを配置させるコンジュゲーションパッド、サンプルとコンジュゲートの複合体を展開するとともに、検出のため検出部を有する不溶性メンブレン担体、及び不溶性メンブレン担体を展開してきたサンプルを吸収するための吸収パッドが配置されているのが一般的である。

本願の発明者は、特許文献２において、被検物資に特異的に結合する第１抗体が固定化された作用極と、当該被検物質に特異的に結合する抗体である第２抗体を標識体である金属微粒子に結合したものを用意し、前記作用極の表面に被検物質である抗原または抗体と前記標識体に結合した抗体または抗原とを供給して抗原抗体反応させることにより、試料溶液中の被験物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用極の表面近傍に集め、前記作用電極の電位制御を行い、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるとともに、未反応の前記第２抗体が結合した前記金属微粒子をNaCl、KClやHClの塩化物水溶液（電解液と未反応の抗体又は抗原が結合した標識体を排除するための洗浄液を兼ねる）を作用極に滴下した後、排除し、測定に用いる抗体や抗原さらに測定溶液中の夾雑物に由来するノイズの影響を抑えた状態とし、前記ノイズを抑えた状態で酸化した前記金属微粒子を電気化学的に還元させる際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被験物質の有無または濃度を調べる方法（被検物質の測定方法）を開示している。
なお、特許文献２には、「・・・印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。」と記載され、また「吸収パッド２５と、メンブレン２２の裏面側に配されたバッキングシート２６とを備えている。図４（ａ）に示すように、メンブレン２２表面の所定領域には一次抗体２が固定化され、判定部（固定化領域）２３を形成している。判定部２３の下流のメンブレン２２の表面には、金属微粒子５で標識した二次抗体４に特異的に結合する抗体が固定化され、コントロール部２４を形成している。」と記載され、さらに「メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１とを重ね合わせる。」、「メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１とを重ね合わせた後」、「図６に示すような印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。」という記載がある。しかし、この特許文献２に従って検証した結果、前記電極部の位置においては、試料溶液中の被験物質が抗原抗体を示さない割合が高く、試料溶液中の被検物質を正しく定量することがでるとは言えなかった。

国際公開２００２０３７０９９Ａ１ 特許第５１８７７５９号公報

しかしながら、従来のイムノクロマトグラフィー式テストストリップは、不溶性メンブレン担体上表面に設けた検出部に線状に塗布されたキャプチャー抗体と標識体に結合した抗体と被検液中の抗原と反応して生じる色相を目視で判定して定性または光学系を有する機器で半定量する方法であり、被験物質の量を正確かつ精密に定量することが困難であるという問題点があることから、より小型で携帯可能な測定器を用いて即座に正確に定量検査できることが望まれる。
また、上述の検証から、特許文献２については、電極部の位置で速度や流れ方と流れ量を制御しなければ、正確な測定ができないばかりか、測定器に対して簡易に接続して即座に計測ができるような構造にはなっていなかった。そして、そのような測定器（センサー）の製造方法については考えられていないものである。

そこで本発明の目的は、試料溶液の流れを制御することで、反応時間が短く、感度に優れ、精度が高い定量測定ができる電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーを提供することにある。また本発明の目的は、既存のイムノクロマト式テストストリップのパッド類を電極部が印刷された支持体上の実装を効率的に行うために、既存の製造設備を活用して量産できる安価な製造方法を提供することにある。

本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる電極部と、電極部からの電流を伝える導電性カーボンを印刷してなる導電部とこの電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上に試料溶液中の抗原または抗体と金属微粒子である標識体に結合した抗体又は抗原を反応させながら電極側に移動させる流路部ファイバーパッドを配するとともに、前記流路部ファイバーパッドと連結するようにして、試料溶液の反応物が電極上に固定化されたキャプチャー抗体又は抗原と抗原／抗体反応するようにする試料溶液の試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する流速制御パッドを電極部上に配置し、被検物である抗原又は抗体を含む試料溶液とこれらに対する抗体または抗原が結合された金属微粒子が抗原抗体反応しつつ、前記電極部の表面に配置された前記流速制御パッドにより、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御して被検物中の抗原または抗体の対応した量の金属微粒子量を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法である。そして、前記流速制御パッドは、前記支持体上の電極部表面に渡って設けられるか、もしくは電極部上面まで配置させた流路部ファイバーパッドの電極部上面に設けられるとともに、流速制御パッド上流側と下流側を流速制御用突起部により、上方から適度な圧力で押さえつけることで、流速制御パッドの所定範囲において、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御することを特徴とする。
また、本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる作用極と対向するように配される導電性カーボンを印刷してなる対極と銀／塩化銀を印刷してなる参照極からなる電極部と、前記電極部からの電流を伝える導電性カーボンを印刷してなる導電部と、この電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上に試料溶液中の抗原または抗体と金属微粒子である標識体に結合した抗体又は抗原を反応させながら作用極側に移動させる流路部ファイバーパッドを配するとともに、前記流路部ファイバーパッドと連結するようにして、試料溶液の反応物が作用極上に固定化されたキャプチャー抗体又は抗原と抗原／抗体反応するようにする試料溶液の試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する流速制御パッドを電極部上に配置し、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を前記流速制御パッドでは、これによって前記電極部の位置で試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御して被検物中の抗原または抗体の対応した量の金属微粒子量を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーである。
本発明によれば、樹脂製シートの支持体の電極部の位置に対応して前記流速制御パッドを設けることにより、電極部の位置での試料溶液の流れを必要最小限の反応時間を確保するための制御ができるようになり、電極部での感度が良くなり、迅速簡易に精度が高い定量測定ができる。すなわち、前記流速制御パッドを設けることにより、電極部の位置での試料溶液の流れを制御ができるようになり、パッド類に渡って流れる試料溶液の電極表面の近傍で抗原抗体反応に必要な最小限の反応時間と速度に試料溶液の流れを制御ができるので、この流速制御のためのマイクロ流路やポンプなどの必要がなくなり、携帯型の小型電流計測メーターで感度が良く、迅速簡易に精度の高い定量測定ができるようになる。このように、上記電極表面の近傍において、電極表面に資料溶液の量と速度を一定に保ちつつ電極部に密着するような流れ方を制御する。
また、本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる作用極と対向するように配される導電性カーボンを印刷してなる対極と銀／塩化銀を印刷してなる参照極と、導電性カーボンを印刷してなるこれらの電極部から発生する各電流を伝える導電部と、これらの電極部で発生する電流を電気測定器に伝えるための接続部とを配するとともに、前記支持体の電極上にパッド類を複数配して、試料溶液を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部の位置で流れを制御して電気化学的検出を行うことを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーである。
本発明によれば、前記３種類の電極部の位置で試料溶液の流れを制御して充分な抗原抗体反応時間を確保できるようにするため、正確な電気的測定が可能である。

本発明は、被検出物質の試料溶液が流路部ファイバーパッドを通じて電極部に移動した際に、試料溶液中の被検物質が電極部上に近接して必要最小限の反応時間を得るために適度な速度で試料溶液を流し、作用極上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）を完結させるための流速制御パッドを上記各電極部上に備えることを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーである。
本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおけるサンプルパッドとコンジュゲーションパッドと吸収パッドと支持体は、特許文献１に示された様な、一般に用いられているイムノクロトグラフィー用テストストリップに用いられているサンプルパッドとコンジュゲーションパッドおよび吸収パッドと同様な材料を用いて製造することができる。
しかし、本発明では、既成のイムノクロマトクロマトグラフィー用テストストリップとは異なり、下記する電極が印刷された支持体に、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、流路部ファイバーパッド、流速制御パッド、吸収パッドを部分積層して配置し、製造する。パッド類では、流路部ファイバーパッドの上流側上面には、コンジュゲーションパッドが一部積層して配され、流路部ファイバーパッドの下流側下面では、流速制御パッドが一部積層して配されるか、又は流路部ファイバーパッドを電極部上面まで配置し、その電極部上面に積層して配置され、流路部ファイバーパッドと流速制御パッドは一般のイムノクロマトグラフィーとは異なる材質のもので構成されている。

本発明としては、前記一般のイムノクロマトグラフィーとは異なる流路部ファイバーパッドはコンジュゲーションパッドの下流側下面の一部と接触して配置され、作用極上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）を完結させるための流速制御パッドは流路部ファイバーパッドの下流側下面に一部と接触し、上記電極部の上面に配置されていることを特徴とする。また、試料溶液中の抗原または抗体と免疫学的に反応する抗体または抗原が金などのコロイド状金属微粒子に結合されたものが含浸乾燥されたコンジュゲーションパッド中で免疫学的に反応しつつ試料溶液を電極部に移動させる機能を有する流路部ファイバーパッドを備えることを特徴とする。
本発明によれば、前記流速制御パッドにより試料溶液の速度の流れを抗原抗体反応に最小必要限の反応時間に制御することにより、作用極での電気的検出が迅速かつ正確に行われるようになる。
なお、流路部ファイバーパッド上に電解／洗浄液を供給するため、上ケース２２に電解／洗浄液孔を設けることもでき、電解／洗浄液の供給は流路ファイバーパッド上からの方が効率的な未反応物の洗浄が可能である。
なお、本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおいては、電解／洗浄液をサンプル孔から供給しても、未反応物の洗浄が可能であり、大差のない測定結果が得られる。

本発明としては、本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおいて、金属微粒子である標識体に結合された被検物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原と、作用極上に固定化されたキャプチャー抗体または抗原は別のものであることが好ましい。即ち、標識体に結合された被験物質に対して免疫化学的に反応する抗体または抗原と、作用極表面に固定化された被検物質に対して免疫化学的に反応するキャプチャー抗体または抗原とは、各々被験物質の別の部位を認識する抗体または抗原であることが好ましい。金属微粒子である標識体及び作用極に別の抗体または抗原を用いることで、特異性と感度がより優れたものとなる。研究や製品の原料として用いられる抗体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とがあり、これらは作製方法や性質が異なるため、用途にあわせて使い分けられる。モノクローナル抗体は、標的たんぱく質の被認識部位（エピトープ）の１つにしか結合できず、一方、ポリクローナル抗体は、同一のたんぱく質の複数のエピトープに結合できるので、１つのポリクローナル抗体で、たんぱく質の複数のエピトープを認識できる。

本発明としては、前記電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケースを備え、そのカセットケースに前記流速制御パッドを上方から押さえて堰き止めるように制御する流速制御用突起部を設けることを特徴とする。なお、流速制御用突起部は前記流速制御用パッド上から、２個以上の複数または１個で、部分または全面を押さえても、上記目的を達成することができる。
本発明によれば、カセットケースに設けられた前記流速制御用突起部が、前記電極部上に設置されている前記流速制御パッドを上方と下方の２カ所から堰き止め、抗原抗体反応に必要かつ最低限な流速と時間を確保して確実に試料溶液を電極部の表面に流すことができる。
また、本発明としては、前記電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケースを備え、そのカセットケースから前記接続部を外部に突出させて、その接続部を前記電極部の電流を検出する電気測定器に差し込んで、その電気回路に接続して、前記電極で発生した電流を測定することが好ましい。
本発明によれば、前記ラテラルフロー免疫センサーをカセットケースに内装したまま、その外部に出ている前記接続部を前記電極部の電流を検出する電気測定器に差し込んで、これにより電気回路を構成して、前記電極で発生した電流を即座に測定することができる。

また、本発明は、樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷して作用極と参照極と対極とからなる電極部とこれらの電流を伝える導電部と電気測定器との接続するための接続部を形成し、さらに対極上の導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面に抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に試料溶液中の抗原又は抗体と金属微粒子である標識体に結合した抗体又は抗原を反応させながら作用極側に移動させる流路部ファイバーパッドと、試料溶液の反応物が作用極上に固定化されたキャプチャー抗体または抗原と抗原／抗体反応するようにする試料溶液の流れ量を含む流れ方を制御する流速制御パッドを前記電極部上に配置する工程を備えることを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法である。
本発明によれば、従来のスクリーン印刷などの印刷技術を用いて、樹脂製シートの支持体に電気的配線構造と導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面に抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に複数のパッド類を従来装置で積層する工程により効率よく製造することができる。

本発明としては、前記支持体上に、滴下された試料溶液を吸収するサンプルパッドと、前記サンプルパッドからのサンプルを吸収しつつ含浸乾燥されている金コロイドからなる前記標識体に結合された抗体または抗原を溶解して繋ぐコンジュゲーションパッドと、サンプル中の抗原または抗体と前記金コロイドに結合された抗体又は抗原を反応させながら前記作用極側に移動させる前記流路部ファイバーパッドと、移動してきた反応物が前記作用極上に固定化されたキャプチャー抗体と抗原／抗体反応してサンドイッチを形成するようにする前記流速制御パッドと、試料溶液の反応残渣物の液体を吸収する吸収パッドを配置する工程を備えることを特徴とする。
また、本発明としては、上流側から、サンプルパッドはコンジュゲーションパッドを積層する距離を残した部分の下面を前記支持体上の接着剤で固定し、コンジュゲーションパッドは、流路部ファイバーパッドの上流側上面の一部と積層し、残る下面を前記支持体上の接着剤で固定し、流路部ファイバーパッドは、流速制御パッドの上流側上面の一部と積層する部分を残した部分を前記電極と積層し、残る下面を支持体上の接着剤で固定し、前記流速制御パッドは作用極および対極と参照極部分に接触し（ただし、支持体上の接着剤で固定しない。）、電気絶縁部を上から印刷した導電部の最上流部の一部まで位置し、その下面を電絶縁体が上から印刷されている導電部上の接着剤で固定するか又は流路部ファイバーパッドを電極部表面まで配置し、その下面は、電極部以外は接着剤で固定し、電極部は積層し（接着剤で固定しない。）、その電極部の上面部に流速制御パッドを積層し、それを越えた下流部の下面を支持体上の接着剤で固定し、吸収パッドは流速制御パッドの下流側上面の一部に積層し、その下流部末端まで位置し、その下面を導電部に絶縁体を印刷した前記支持体上の接着剤で固定することを特徴とする。

本実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそれに用いるセンサーによれば、流速制御パッドにより、試料溶液の横流れ速度を制御して必要な抗原抗体反応時間を確保し、電極部での電流測定において、感度に優れ、定量可能な状態にして電気的測定値を得ることができる。
本発明の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法を用いれば、既存の製造設備を用いて自動的製造が可能であり、かつ均一な性能を有する製品が得られる。
従来の印刷技術と積層技術を用いて、樹脂製シートの支持体に導電性カーボンによる電気的配線構造と導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面に抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に複数のパッド類を積層する工程により効率よく製造することができる。

本発明の一実施の形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーにおける電極と導電部と接続部に導電性カーボンが、さらに導電部上に電気的絶縁体が印刷されていることを示す平面図である。 上記実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーのパッド類の積層構造を説明する断面図である。上流から、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、流路部ファイバーパッド、流速制御パッド、吸収パッドの各一部が互いに積層さていることを示している。その（ａ）は電極部の上に流速制御パッドを配置した例であり、その（ｂ）は電極部の上に流路部ファイバーパッドを介して流速制御パッドを配置した例である。 上記実施形態のラテラルフロー式免疫センサーを収納する収納カセットケースの上ケースを示す平面及び立体図であり、その（ａ）はその上ケース上面図であり、その（ｂ）はその下ケースの裏面図である。２８はサンプル孔であり、２９は洗浄／電解液孔である。また、上ケース裏面図において、２７は流速制御用突起部であり、その前方側と後方側の２カ所が示されている。（ｃ）は、上ケース上面と上ケースの裏面と下ケースの上面のそれぞれ立体図である。 上記実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーがカセットに収納されている２種類の状態（（ａ）と（ｂ））を示し、その上ケースの裏面から流速制御パッド１５上に一定の圧力をかけて流速制御に寄与するための構造を示す側面図である。なお、上記突起部２７は、流速制御パッド１５上にあって、その個数は、全面を押さえるための１個から、両端を押さえる２個または２個以上の複数個でも構わず、要するに前記した流速制御が達成できればよく、その個数を限定するものではない。 上記実施形態のラテラルフロー式免疫センサーのカセット上ケース裏面の流速制御用突起部と電極部との位置関係を示す図である。 上記実施形態のラテラルフロー式免疫センサーによる使用例を説明する図であり、その（ａ）は本願発明の免疫センサーと、この接続部を携帯型小型機器差し込んで接続して還元電流の測定を示す例であり、その（ｂ）は電気回路を構成することを示す図である。 上記実施形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの試料溶液の検査の原理を示す一例図である。検体がサンプルパッドに滴下されるとコンジュゲーションパッド中に含浸乾燥された金コロイドの結合した抗体を溶かして検体中の抗原と抗原抗体反応しながら横流れし、電極（作用極）に固定化されたキャプチャー抗体と抗原抗体反応しサンドイッチを形成し、検体中の抗原量に対応する金コロイドが捕獲されることを図示している。

以下、本発明を適用した実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーは、図１に示すような樹脂製シートである担体３に電極が印刷された支持体２上に図２（ａ）（ｂ）に示すように、支持体上に被験物質を含有する可能性があるサンプルを横方向に展開（ラテラルフロー）させることにより被験物質を定量するセンサー２である。
樹脂製シートの担体３に、電極部５と、電極部５からの電流を伝える導電部７と、この電流値を測定する電気測定器（メーター）４に接続する接続部１２とを配するとともに、前記支持体上にパッド類８、１０，１１，１５、１６を互いに部分積層して配置して、試料溶液を複数のパッド類に渡って含浸させて行く流れを前記電極部５の位置で制御して電気化学的検出を行うセンサーであり、図２中符号２−１と２−２に示された２通りの配置がある。図２（ａ）は電極部５の上に流速制御パッド１５を配置した例であり、図２（ｂ）は電極部５の上に流路部ファイバーパッド１０を介して流速制御パッド１５を配置した例である。

本発明の電気化学法免疫センサーを用いた被験物質の測定法は、図１と図５及び図６に示すように、被検物資に特異的に結合する第１キャプチャー抗体または抗原が固定化された作用極５ａと、当該被検物質に特異的に結合する抗体である第２抗体または抗原を金属微粒子（標識体）に結合したものを用意し、前記作用極５ａの表面に試験溶液と金属微粒子である標識体とを供給して抗原抗体反応させることにより、試料溶液中の被験物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用極５ａの表面近傍に集め、作用電極５ａに電位制御を行い、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるとともに、未反応の前記第２抗体が結合した前記金属微粒子をNaCl、KClやHClの塩化物水溶液（電解液と洗浄液を兼ねる）を作用極５ａに横流しした後、排除し、測定に用いる抗体や抗原さらに測定溶液中の夾雑物に由来するノイズの影響を抑えた状態とし、前記ノイズを抑えた状態で酸化した前記金属微粒子を電気化学的に還元させる際に生じる還元電流値を測定し、前記電流値に基づいて被験物質の有無または濃度を定量する。

本ラテラルフロー式免疫センサー２は、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドと吸収パッドと支持体は、特許文献２に示されたような、一般に用いられているイムノクロトグラフィー用テストストリップに用いられているサンプルパッドとコンジュゲーションパッドおよび吸収パッドと同様な材料を用いて製造することができる。イムノクロマトグラフィー法によるイムノアッセイでは、サンプルは毛細管力によってデバイス中を染み込みながら進み、あらかじめコンジュゲーションパッドに含浸させておいた一次抗体と結合した結合体が、メンブレン上に判定ラインとして固定化された二次抗体と結合し、その場で捕捉される。サンプルと結合していない一次抗体は、そのまま判定ラインを通過し、次のコントロールラインまで流れていき、そこで捕捉される。結合の原理としてサンドイッチアッセイ法の他に阻害アッセイ法も使われる。本発明によるラテラルフローイムノアッセイでは、複数の機能が必要なため複数の異なるコンポーネントの組み合わせが必要とされ、一般的には、サンプルパッド、コンジュゲートリリースパッド、反応用メンブレン、および吸収パッドが必要になるが、この他に流路部ファイバーパッドと流速制御パッドが必要であり、一部の用途では血球分離フィルターが必要になる場合もある。

また、本実施の形態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１又は２−２は、合成樹脂製のシートである担体に電極と配線が電気絶縁部を介して形成されて、電気的構造を有する支持体となり、この上に、一般に用いられているイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられているサンプルパッド８とコンジュゲーションパッド１１および吸収パッド１６と同様な材料を用いて製造することができる（図２）。
しかし、本発明の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１又は２−２では、既成のイムノクロマトクロマトグラフィー用テストストリップとは異なり、下記する担体３に電極部５が印刷等で被覆された支持体２上に、サンプルパッド８、コンジュゲーションパッド１１、流路部ファイバーパッド１０、流速制御パッド１５、吸収パッド１６を部分積層して配置して、製造する。なお、カーボン、銀／塩化銀を印刷或いは被覆していない前記支持体２の上にサンプルパッド８、コンジュゲーションパッド１１が配置される。
そして、対極５ｂ上の導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極５の表面に抗体または抗原を固定化する工程を備え、前記電極部５の作用極５ａは、樹脂製シートの支持体２の全幅に渡って形成されており、参照極５ｃと対極５ｂは、作用極５ａの後方側（下流側）において、支持体２の左右端側に各々配されており、各電極部５ａ，５ｂ，５ｃは、各々導電部７で引き出されて、後方下流側の接続部１２と連結されている。接続部１２は、電気測定器４に差し込まれて（カセットケース３１−１、３１−２からも接続部１２は露出する）、電気測定器４により電気的測定が行われる（図５）。

（支持体上に印刷した電極部）
図１と図２に示すように、合成樹脂シートの支持体２に導電性カーボンを黒色塗で示された形状で印刷し、作用極５ａと参照極５ｃと対極５ｂの下地および電流を伝える導電部７と電気測定器（メーター）４に接続するための接続部１２を形成し、さらに対極部５ｂでは導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷等で被覆する工程によって製造する。作用極５ａは、樹脂製シートの担体３の全幅に渡って形成されており、参照極５ｃと対極５ｂは、作用極５ａの後方側（下流側）において、電気的内部構造の担体３の左右端側に各々配されており、各電極部５ａ〜５ｃは、各々導電部７で引き出されて、後方下流側の接続部１２と連結されている。そして、電流を伝える導電部７と電気測定器４に接続するための接続部１２を形成し、さらに対極５ｂでは導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷等で被覆する工程によって支持体２を製造する。図１において、合成樹脂などを材料とする担体３に電極部５と電気測定器４への接続部１２が印刷され、また導電性カーボンを印刷することにより、電極（作用極５ａと対極５ｂ）５と導電部７とメーターへの接続部１２が形成されている。参照極５ｃは、銀／塩化銀が印刷により塗布されている。

支持体２に印刷する導電性カーボン粒子ペーストの材料としては、例えば、ケッチンブラック、グラフェン、カーボンナノチューブ、フラーレンなどが挙げられるが、コストの点ではケッチンブラックが好適である。参照極５ｃに印刷する銀／塩化銀は、塩化銀結晶の微粒子で構成されるペーストを印刷することにより、良好な塗面と密着性がある。樹脂製シートの担体３は、各種樹脂によるシートであればよく、例えば厚さ0.1〜0.5mmのポリスチレンを使用したが、電気回路とパッド類を積層できるものであれば、基板状のものであっても良い。

（担体：電気回路の担体）
本発明で用いられる電気回路が印刷された支持体２は、担体３に電極部５や配線が構成されたものであり、３種類の電極部５（５ａ，５ｂ，５ｃ）とこれらからの電流を伝える導電部７とそれら電流値を測定する電気測定器４に接続する接続部１２に導電性カーボンを印刷し、その後、参照極上に銀／塩化銀を印刷し、さらに電極部５（５ａ，５ｂ，５ｃ）から引き出される３本の導電部７上に電気的絶縁物９（ウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリエルテル樹脂、フェノール樹脂等）を印刷等で被覆してなることで、電極や配線を構成する担体３を製造することができる。

（標識体）
本発明で用いられる金属微粒子である標識体は、電気分解可能な金属微粒子（金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やコロイド粒子、量子ドット等）であれば何でもよく、その粒径は20nm〜100nmでよいが、特に、40nm〜60nmの金コロイド粒子が好ましい。この金コロイド粒子は、一般に用いられている方法、例えば、加熱したテトラクロロ金（III）酸水水溶液にクエン酸三ナトリウム水溶液を滴下して撹拌することによって製造することができる。

（流路部ファイバーパッド）
本発明で用いられる流路部ファイバーパッド１０は、繊維状の細いファイバーで形成された不織布であり、その材料としては、ガラス繊維、樹脂繊維、カーボン繊維、天然繊維などで形成された強い毛細管力を有する薄い不織布であればよく、特に厚さが0.3〜1.0mmのガラス繊維が好適である。流路部ファイバーパッド１０は、サンプル液中の抗原または抗体がコンジュゲーションパッド中の金属微粒子である標識体の結合した抗体または抗原と反応させながら横流しして、反応領域（作用極上）５ａに導く。

（流速制御パッド）
本発明で用いられる流速制御パッド１５は、繊維状の細いファイバーで形成された不織布であり、その材料としては、ガラス繊維、樹脂繊維、カーボン繊維、天然繊維など弱い毛細管力を有する様に形成された薄い不織布である。厚さが0.3〜1.0mmのガラス繊維の流路部ファイバーパッド１０に比べ、流速制御パッド１５は0.1〜0.7mmの緻密な天然繊維やガラス繊維の不織布がより好適である。
本実施の形態の流速制御パッド１５は、電極部（作用極と対極および銀／塩化銀を印刷してなる参照極）５の位置の上に位置して設けられている。そして、流速制御パッド１５の上方からカセットケース３１−１、３１−２の上ケース裏面２２ｂに位置する流速制御用突起部２７により２カ所またはそれ以上または全面に渡る１カ所で押圧されて、被検物質の流れを制御する。
本実施の一形態では、上流側の流速制御用突起部２７ａが作用極５ａの位置に対応して配され、下流側の流速制御用突起部２７ｂが参照極５ｃと対極５ｂの位置に対向するように配される。すなわち、電極部５の位置において、前記流速制御パッド１５の前方側（上流側）と後方側（下流側）の２か所に押圧することにより、作用極側５ａと、参照極５ｃ及び対極５ｂとがその二か所の間（Ｈ１−Ｈ２）で前記流速制御パッド１５を介して流速制御用突起部２７により押圧される（図５）。なお、カセットケース３１−１、３１−２に収納されない限り、本願の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１、２−２の流速制御パッド１５には、上記流速制御用突起部２７により押圧されることはない。

（電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法）
本発明の免疫センサー２−１の製造方法は、支持体２の３種電極部分５を除いて接着剤を着け、先ず流速制御パッド１５の位置に対応する３種電極部５を除く最下流部下面を支持体２に固定し、次に流路部ファイバーパッド１０の下流側下面を流速制御パッド上面に積層し、残る下面部を支持体上の接着剤で固定し、次にコンジュゲーションパッド１１の下流側下面の一部を流路ファイバーパッド１０の上流側上面に積層し、サンプルパッド８はその下流側下面をコンジュゲーションパッド１１の上流側上面に積層し、残る下面を支持体上の接着剤で固定する。
本発明の免疫センサー２−２の製造方法は、支持体２に３種電極部分除く部分に接着剤を着け、先ず、流路部ファイバーパッド１０の電極部を除く下面を支持体上の接着剤で固定し、次に流速制御パッド１５の下面を流路部ファイバーパッド１０の電極部上面に積層し、その最下流部下面を支持体２上の接着材で固定し、コンジュゲーションパッド１１の下流側下面の一部を流路部ファイバーパッド１０の上流側上面に積層し、サンプルパッド８はその下流側下面をコンジュゲーションパッド１１の上流側上面に積層し、残る下面を支持体上の接着剤で固定する。
なお、支持体上の上記各電極部５の印刷は各種な方法で印刷することができる。例えばスクリーン印刷において、一度に多数（例えば５０個以上）の１測定分の電極部５が連続した形状に導電性カーボンや銀／塩化銀を印刷できる刷版を作製し、例えば５０個以上の電極が連続印刷された支持体として作製し、本電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーに必要な各材料の一部分を互いに積層してなる連続体の当該センサーを製造することができる。
その量産法の一例として、例えばBioDot社から市販されているイムノクロマトクロマトグラフィーテストストリップ用自動製造装置で、長尺の各材料の貼付を行い、次にこの材料の１つであるコンジュゲーションパッド１１に金属微粒子である標識体を塗布して乾燥した後、当該免疫センサーの１個ごとの幅に切断するにより、本特許の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１を量産し、より安価に当該製品を供給することができる。

（測定原理）
本願発明のセンサー２−１、２−２を使用した測定方法（抗原測定の一例の検査方法）を説明する。
図７に示すように、検体（測定対象の抗原を含有する）を、サンプルパッド１３上に滴下し（図７の１）、検体が金コロイドに結合された抗体が含侵乾燥されたコンジュゲーションパッドに移行し、金コロイド結合抗体と抗原（測定対象物）が流路部上を流れながら抗原＋抗体反応した後（図７の２）、その先にある電極部（支持体表面）５上に移行し、電極部に固定化されたキャプチャー抗体と結合し、サンドイッチを形成し、未反応物（過剰の金コロイド結合抗体）は、吸収パッド１６に捕獲される（図７の３）。その後、洗浄液／電解液孔２９から流路部ファイバーパッド１０上に電解液（食塩水等）を滴下し、図７の３における「金粒子結合抗体＋抗原＋キャプチャー抗体（電極部５に固定化）」部分に到達させ、検体中の抗原量に対し、過剰に供給された未反応の金コロイドに結合された抗体を洗浄除去した後、支持体２に印刷された電極部における接続部１２部分を電気測定器（メータ）４に接続して、一定の電圧を印加し、発生する金粒子の還元電流を測定して、血液中の測定対象物の濃度を定量する。
第１の実施の形態によれば、検体中の抗原と金コロイド結合抗体が抗原抗体反応しながら流れ、電極部（作用極）上に固定化されたキャプチャー抗体に近接し、そして電極上を流れ去る間に検体中の抗原のほぼ全てがキャプチャー抗体に結合するようになる。
そして、試料溶液中の被検物質（抗原または抗体）に対応した量の金属微粒子の量を電極部５の位置の上面に配置した前記流速制御パッド１５により、作用極５ａ上に集め、金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を電極部５で検出し、その電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を測定する。
すなわち、例えば抗原抗体反応による検体中の抗原または抗体を金属微粒子量に結合された抗体又抗原と特異的に反応させ、作用電極の表面近傍に被検物質量に対応した金属微粒子を集め、金属微粒子を構成する金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際の還元電流値を測定する。ここで得られる還元電流強度は、作用電極の近傍に集められた金属量を表すことから、これに基づいて被検物質中の抗原又抗体の定量又は検出が実現される。ここで、金属微粒子の電気化学的酸化は、作用電極の表面近傍に金属微粒子を集めた状態で行うことが重要である。そのため、接着剤を使用しないで配される流速制御パッドまたは流路ファイバーパッドの電極部の下面を支持体に直接密着させるようにする。これにより、被検物質との反応に関与した金属微粒子の全てを作用電極表面との電子授受に関与させることができるため、結果として被検物質の高感度で精密な測定が実現される。

「CRPの定量用電気学法ラテラルフロー式免疫センサーの作製」
（抗CRPモノクロナル抗体溶液の調製）
以下の試験に用いたCRP抗体は、イムノ・プローブ社の2種の抗ヒトCRPモノクロナル抗体（No.8とNo.5）である。各抗体を濃度5mg/mlの濃度になるよう10mM-トリス緩衝液で希釈した溶液を作製した。

（CRP免疫センサー作製例）
１）担体３の作製には、支持体（Lohmann Precision社透明ポリスチレン）２に、導電性カーボン（ライオン・スペシャリティー・ケミカル社製ケッチンブラック）を図１と図２の様な形状の作用極５ａ、対極５ｂ、参照極５ｃ及び導電部７、接続部１２をスクリーン印刷した後、参照極５ｃに銀／塩化銀（ビー・エー・エス社製）を印刷し、更に導電部７に電気敵絶縁部（ウレタン樹脂）をスクリーン印刷した。

２）サンプルパッド８の作製には、セルロースファイバー製パッド（AHLSTROM製）をサンプルパッドとして用いた。サンプルパッド８は、サンプルを吸い上げ、コンジュゲート放出領域または分析用メンブレンへ均一かつ一定の速度で送り出す役割や、デバイスからサンプルが溢れるのを確実に防ぐ役割の他、サンプルから粒子や細胞をろ過する、サンプルを改変するために化学物質を含浸させる、など多くの機能を持たせることができる。

３）CRPモノクロナル抗体標識金コロイド粒子の作製には、蒸留水99mlに1.1%テトラクロロ金（III）酸四水和物（田中貴金属社製）水溶液1.0mlと富士フィルム和光純薬社製（品番：162-03495） K₂CO₃を10mMに希釈した水溶液2.44mlを加えて混合し、3分間50℃に加熱した後、富士フィルム和光純薬社製品番：191-01785）クエン酸ナトリウムを1.1％に希釈した水溶液1.0mlを添加し、11分間煮沸した後、蒸留水氷中に入れて冷却し、平均粒子径が40nmの金コロイドを調製した。
上記金コロイド溶液1mlに抗ヒトモノクロナル抗体（イムノ・プローブ社製No.8）を10mMのトリス緩衝液で希釈し、0.5mg/mlに調製したCRP抗体溶液を1ml添加して混合撹拌した後、室温で60分間静置し、更に10%ウシ血清アルブミン溶液を加えて超音波で分散させ、5分間室温で静置し、次に冷却した遠心分離機で遠心し、上清を除いて沈殿物を得た。これに10mlの10%ウシ血清アルブミン溶液を再度加えて超音波で分散させて、この溶液を波長520nmで吸光度（OD）を測定し、吸光度（OD）が約9になる濃度に調製し、CRPモノクロナル抗体標識金コロイド溶液を作製した。

４）コンジュゲーションパッド１１の作製
上記３）で調整したCRPモノクロナル抗体標識金コロイド粒子（コンジュゲート）溶液を、EMDMILIPORE社製GLASSFIBER DIAGNOSTICS PADに飽和するまで含侵させ、凍結乾燥機にて一晩乾燥させて、コンジュゲーションパッド１１を作製した。コンジュゲーションパッド１１は、保管期間中、コンジュゲートを保持し、検出能を維持させ、サンプルがパッド中を移動するときにこれらのコンジュゲートを効率的に放出する。

５）作用極上に抗ヒトモノクロナルCRP抗体の固定化する。
抗ヒトモノクロナルCRP抗体（イムノ・プローブ社製No.5）を10mMのトリス緩衝液で希釈し、その4μlを作用極５ａの上に載せ、一晩冷蔵庫中で静置した後、残存した当該抗体溶液をエアガンで吹き飛ばし、作用極上に抗ヒトモノクロナルCRP抗体の固定化した。

６）電極部上のブロッキング
試料溶液（サンプル）中の測定対象外の蛋白質などが３種類の電極部５に吸着しないようにブロッキングするため、2.5％カゼインホウ酸水溶液（pH8.5）を前記３種類の電極部（作用極５ａ、対極５ｂ、参照極５ｃ）に各10μlを載せ、常湿にて室温で１時間静置した後、残存する当該溶液をエアガンで吹き飛ばした。

７）電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの作製
プラスチックに製粘剤が付着した支持体２に、先ず、流路部ファイバーパッド（AHLSTROM社グラスフィアイバーパッド：品番8964）１０を配置装着し、次いで、上記４）で作製したコンジュゲーションパッド１１を配置装着し、更にサンプルパッド（AHLSTROM社グラスフィアイバーパッド：品番0238）８を配置装着し、一方、流路部ファイバーパッド１０の下流側の３種の電極部５の上端に流速制御パッド（旭化成社セルロース長繊維不織布：品番SA28G）１５を配置装着し、更に吸収パッド（AHLSTROM社製セルロースファイバーパッド：品番0270）１６を配置装着した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を印刷された電極部単位の幅で切断して電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１を作製した。この本願発明のラテラルフロー式免疫センサー１は、測定の際、プラスチック製の専用ハウジングで構成されるテストデバイス形態にした。すなわち、図３（ａ）（ｂ）に示すように、上流側に試料溶液及び洗浄液を供給する供給孔２９を有するカセットケース３０に差し込まれて使用される電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１として構成されている。
図４（ａ）（ｂ）は、カセットケース３０に内装された状態の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１として構成されている。図４（ａ）は、電極部５に流速制御パッド１５を密着させるものであり、その上流側には流路部ファイバーパッド１０の下流端部の下層を流速制御パッド１５の上流端部の上層に積層し、その下流側では、吸収パッド１６の上流端部の下層を積層し、吸収パッド１６に導いている。したがって、電極部５に流速制御パッド１５を密着させて前後（上流と下流）のパッド１１，１６で押さえつけるとともに、流速制御パッド１５での試料溶液の速度を遅くすることができる。
図４（ｂ）は、電極部５表面まで流路部ファイバーパッドを敷き、流速制御パッド１５を流路部ファイバーパッド１０における電極部の上に積層して密着させるものであり、その下流側の電極部を過ぎた上面を、吸収パッド１６の上流端部の下層を積層し、吸収パッド１６に導いている。したがって、流路部ファイバーパッド１０の電極部に位置する上層に流速制御パッド１５を積層することで試料溶液の速度を遅くすることができるとともに、流速制御パッド１５の下流側の一部を吸収パッド１６の上流部端部に積層させることで試料溶液を移動させることができる。
このように、流速制御パッド１５の上流側や下流側の一部を他のパッドと積層することで、試料溶液を上記電極５の表面に移動させ、電極部５の表面近傍において試料溶液の量と速度を一定に保ちつつ、電極部に密着するような流れ方を制御することができる。

８）ラテラルフロー式免疫センサーのカートリッジユニット
本願発明のラテラルフロー式免疫センサー１を収納するカセットケース３０は、上ケース２２と下ケース２３からなり、その材料としてはポリプロピレン、ポリエステル、ポリススチレン、アクリルなどの樹脂で成型されたもので、本願発明の免疫センサー１は下ケース２３の所定の位置において、上ケース２２を被せ、両ケースを押さえて嵌合し、かつその上ケース裏面２２ｂには、流速制御用突起部２７が内壁に成型されている。流速制御用突起部２７は、流速制御パッド１５を上方から押圧して流速を制御するものであり、２個設けられる本実施の形態に限らず、一つでも複数設けても良い。また、カセットケース３１−１、３１−２には、サンプル孔２８と洗浄／電解液孔２９が形成され（図３（ａ））、上ケース裏面２２ｂには、流速制御パッド１５の機能を制御するための流速制御用突起部２７を流速制御パッド１５の上に位置する様に流速制御用突起部２７を配置した（図３（ｂ））。サンプル孔２８に洗浄液／電解液を供給して洗浄できるが、電極部５に近い洗浄液兼電解液の孔／電解液孔２９からの供給の方が洗浄効率に優れ、また、電解液の供給にも電極部５に近い方が効率的な測定が可能である。
図５（ａ）（ｂ）は、カセット上ケース裏面２２ｂの流速制御用突起部２７と電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー２−１、２−２の電極部５との位置関係を示す図である。図５（ａ）は、上流側の流速制御用突起部２７ａを電極部５の作用極５ａ上に配置し、下流側の流速制御用突起部２７ｂを電極部５の対極５ｂ（又は参照極５ｃ）上に配置した例を示し、流速制御パッド１５を押さえつける上流側の流速制御用突起部２７ａと下流側の流速制御用突起部２７ｂとの間の領域を反応領域Ｈ１〜Ｈ２として、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する。
図５（ｂ）は、電極部５の作用極５ａに上流側の流速制御用突起部２７ａと下流側の流速制御用突起部２７ｂとの間の領域を反応領域Ｈ１〜Ｈ２として、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する。なお、更に、電極部５の対極５ｂ（又は参照極５ｃ）上に流速制御用突起部２７ｂを配置しても良い。
このように、流速制御パッド１５の上流側や下流側を流速制御用突起部２７ａ，２７ｂにより押さえつけることで、流速制御パッド１５の所定範囲Ｈ１〜Ｈ２において、範囲電極部５の表面に試料溶液の量と速度を一定に流れるように制御することができる。

〔実施例１〕
上記作製法で作製した電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１を用いて、ＣＲＰの定量試験を行った。

（試験法）
（１）試料
CRP標準血清（関東化学製）を、生理食塩水（１％ウシ血清アルブミンを含む）希釈し、CRP濃度15ng/ml、90ng/ml、210ng/mlの試料を調製し、また希釈液をCRP濃度0mg/dlとしたものを試料とした。
（２）手順
上記（１）で調整した各試料55μlを電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー１のサンプル供給孔２９に滴下して３分後に、洗浄液兼電解液（0.05%の界面活性剤Tween20を含む2M-NaCl）を洗浄液を供給する穴（電解液供給孔と兼用）２９に滴下して３分後にCRP濃度に対応して発生する電解電流（μA）の測定を、表１に示す４種の濃度の試料溶液を各１２回多重測定した。ただし、ゼロ濃度の試料溶液は１０回多重測定した。

（試験結果）
試験結果を表１に示す。CRP濃度15ng/mlにおける平均値が1.154μAであり、1μA当たりのCRP濃度は13.00ng/mlとなり、その標準偏差0.282μAに相当する濃度は3.666ng/mlであり、またCRP濃度90ng/mlにおける平均値が3.230μAであり、1μA当たりのCRP濃度は27.86ng/mlとなり、その標準偏差0.420μAに相当する濃度は11.70ng/mlとなる定量結果であった。さらにCRP濃度210ng/mlにおける平均値が3.993μAであり、1μA当たりのCRP濃度は52.59ng/ml となり、その標準偏差0.707μAに相当する濃度は37.18ng/mlである精密度を有する定量結果であった。

以上、本実施形態においては、モノクローナル抗体の例を主に説明したが、本発明はポリクローナル抗体にも適用可能である。また、製造方法においては、接着剤を使用する箇所と使用しない箇所（電極部）とを分けておき、パッド類１０，１１，１５，１６に接着剤を着けておいてから、電極や配線などの電気的内部構成を有する支持体２の上にパッド類を配置することも可能である。また、カセットケース３０を用いるタイプでは、カセットケース３０で押えることで、接着剤を使用しないでも製造可能である。

１ 担体上に印刷された電極、
２ 支持体（担体３上に電極を印刷した支持体）、
２−１、２−２ 電気化学式ラテラルフロー式免疫センサー、
３ 担体（電極や配線などの電気的内部構成を有する担体）、
４ 電気測定器（メーター）、
５ 電極部、 ５ａ 作用極、 ５ｂ 対極、 ５ｃ 参照極、
６ 電気回路、
７ 導電部、
８ サンプルパッド、
９ 電気的絶縁物、
１０ 流路部ファイバーパッド（流路メンブレン）、
１１ コンジュゲーションパッド、
１２ 接続部、
１３ サンプル孔（試料溶液の供給孔）、
１４ 制御部、
１５ 流速制御パッド、
１６ 吸収パッド、
１７ 還元電流曲線及び還元電流と濃度の関係図、
２２ 上ケース、２２ａ 上ケース上面、２２ｂ 上ケース裏面、
２３ 下ケース、２３ａ 下ケース裏面、
２７ 流速制御用突起部、
２８ サンプル孔、
２９ 洗浄液／電解液孔、
３０ カセットケース、
３１―１、３１−２ ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケース

Claims (13)

1. 樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる電極部と、電極部からの電流を伝える導電性カーボンを印刷してなる導電部とこの電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上に各種パッド類を配し、被検物である抗原又は抗体を含む試料溶液とこれらに対する抗体または抗原が結合された金属微粒子が抗原抗体反応しつつ、パッド類に渡って流れさせて行き、電極部の表面に配置された流速制御パッドにより、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御して被検物中の抗原または抗体の対応した量に金属微粒子の量を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法。
2. 前記流速制御パッドは、前記支持体の電極部の表面に渡って設けられるとともに、流速制御パッドの上流側及び／又は下流側を流速制御用突起部により上方から適度の圧力で押さえつけることで、流速制御パッドの所定範囲において、試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御することを特徴とする請求項１記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法。
3. 樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる作用極と対向するように配される導電性カーボンを印刷してなる対極と銀／塩化銀を印刷してなる参照極からなる電極部と、電極部からの電流を伝える導電性カーボンを印刷してなる導電部と、この電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上にパッド類を複数配置し、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記流速制御パッドでは、これによって前記電極部の位置で試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御して、より正確かつ精密に電気化学的検出を行うことを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
4. 前記複数のパッド類としてサンプルパッドとコンジュゲーションパッドを備えるとともに、コンジュゲーションパッドと連続するように流路部ファイバーパッドが配置され、流路部ファイバーパッドと積層して配置されて作用極上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）を完結させるための流速制御パッドを前記電極部上に備えることを特徴とする請求項３記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
5. 前記複数のパッド類としてサンプルパッドとコンジュゲーションパッドを備えるとともに、コンジュゲーションパッドと連続するように流路部ファイバーパッドが配置され、作用極上で抗原抗体反応（サンドイッチ法）を完結させるための流速制御パッドを前記電極部上に備え、流路部ファイバーパッド下流側下面の一部と積層し、吸水パッドの上流側下面の一部と接触して配置されていることを特徴とする請求項３記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
6. 前記流路部ファイバーパッドは、試料溶液中の抗原または抗体と免疫学的に反応する抗体または抗原が金などのコロイド状金属粒子に結合されたものが含侵乾燥されたコンジュゲーションパッド中で免疫学的に反応しつつ試料溶液を電極部に移動させる機能を有することを特徴とする請求項３ないし５のいずれか１項記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
7. 標識体に結合された被験物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原と、作用極上に固定化された被験物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原とは、各々被検物質の別の部位を認識する抗体または抗原であることを特徴とする請求項３ないし６のいずれか１項記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
8. 前記電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケースを備え、そのカセットケースに前記流速制御パッドを上方から押さえて堰き止めるように制御する流速制御用突起部を設けることを特徴とする請求項３ないし７のいずれか１項記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
9. 前記電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーを収納するカセットケースを備え、そのカセットケースから前記接続部を外部に突出させて、前記電極部の電流を検出する電気測定器の電流感知部に差し込んで接続し、これにより電気回路を構成して、前記電極で発生した電流を測定することを特徴とする請求項３ないし８のいずれか１項記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサー。
10. 樹脂製シートの支持体に、導電性カーボンを印刷してなる作用極と参照極と対極とこれらの電流を伝える導電部と電気測定器との接続するための接続部を形成し、さらに対極上の導電性カーボン上に銀／塩化銀を印刷する工程と、作用極表面に抗体または抗原を固定化する工程と、前記支持体上に試料溶液中の抗原または抗体と標識体に結合した抗体又は抗原を反応させながら作用極側に移動させる流路部ファイバーパッドと、試料溶液の反応物が作用極上に固定化されたキャプチャー抗体又は抗原と抗原／抗体反応するようにする試料溶液の試料溶液の速度及び／又は流れ量を含む流れ方を制御する速制御パッドを電極部上に配置する工程を備えることを特徴とする電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法。
11. 前記支持体上に、滴下された試料溶液を吸収するサンプルパッドと、サンプルパッドからのサンプルを吸収しつつ含侵乾燥されている金コロイドに結合された抗体又は抗原を溶解して繋ぐコンジュゲーションパッドと、サンプル中の抗原又は抗体と金コロイド結合抗体又は抗原を反応させながら作用極側に移動させる流路部ファイバーパッドと、移動してきた反応物が作用極上に固定化されたキャプチャー抗体又は抗原と抗原／抗体反応してサンドイッチの形成を完了するようにする流速制御パッドと、試料溶液の反応残差物の液体を吸収する吸収パッドを配置する工程を備えることを特徴とする請求項１０記載の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造方法。
12. サンプルパッド下流側の一部をコンジュゲーションパッドの上流側上面の一部に積層させ、その下面を支持体上の接着剤で固定し、コンジュゲーションパッドをその下流側の一部を流路部ファイバーパッド上面の一部に積層させ、その下面を支持体上の接着剤で固定し、流路部ファイバーパッドをその下流側の一部（作用極部分まで）を流速制御パッドの上流側の上面の一部に積層させ、その下面を支持体上の接着剤で固定し、流速制御パッドはその上流側の一部を流路部ファイバーパッドの下流側上面の一部と積層させ、その下面が作用極と対象極と参照極である３種の電極と密着した状態とし（ただし、接着剤で固定しない。）、吸水パッドはその上流側下面の一部と積層させ、その下面を支持体上の接着剤で固定することを特徴とする請求項１０の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造法。
13. 前記流速制御パッドは、その上流側の一部を流路部ファイバーパッドの下面の一部と積層させ、その下面が作用極と対象極と参照極である３種の電極と密着した状態とし（ただし、接着剤で固定しない。）、吸水パッドはその上流側下面の一部を流速制御パッドの下流側の上面に積層させることを特徴とする請求項１２の電気化学法ラテラルフロー式免疫センサーの製造法。
    
    
    

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