JP2003518504A - オレアユーロパエア抽出物を収得する方法及びこの抽出物の適用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は３５℃より低い温度で乾燥されたオレア ユーロパエア葉からアルカノールを用いてオレア ユーロパエア抽出物を収得し、その抽出物を精製する方法に関する。本発明はさらにＴ−リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球及び（又は）顆粒球、及びプロインフラマトリーサイトカインを活性化及び増殖させることによって、健康な体において細胞性免疫及び遅延過敏症を増加させる剤としてオレア ユーロパエア抽出物を薬理学的に適用する新規方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、３５℃より低い温度で乾燥された葉から抽出し、その抽出物を精 製し、そしてその抽出物を蒸発させることによってオレア ユーロパエアから 安定化された植物性抽出物を収得する方法を開示する。得られた抽出物は高い オレウロペイン含有量及び高い原料収率を有する。

【０００２】 本発明はＴ−リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球及び（又は）顆粒球を 活性化及び増殖させ、そしてプロインフラマトリーサイトカインを増加させる 免疫剤としてのオレア ユーロパエア抽出物の新規治療適用法を開示する。

【０００３】 従来の技術 オレウロペインはオレア ユーロパエアの果実、根、樹皮及び特に葉に見出 される苦いグリコシドである。これは抽出物に存在するフラボノイドと共にオ レア ユーロパエア抽出物の有効成分である。

【０００４】 薬理学的活性を有するオレア ユーロパエア葉から植物性抽出物を調製する 方法は、米国特許第５７１４１５０号明細書及び国際特許出願（ＷＯ）第９６ １４０６４号明細書に記載されている。

【０００５】 米国特許第５７１４１５０号明細書には、２０〜８８℃の温度で抽出剤とし てアルコール／水混合物を７５％−２５％のおおよその割合で用いて浸漬して 、３５％のオレウロペイン含有量を有する抽出物を得ることによる、オレア ユーロパエア葉からの抽出方法が記載されている。

【０００６】 国際特許出願（ＷＯ）第９６１４０６４号明細書には、乾燥された葉を用い て、２０〜１００℃の広い温度範囲で抽出剤として水及び（又は）水／アルコ ール溶液を使用して薬理学的活性を有するオレア ユーロパエア抽出物を得る ことが記載されている。

【０００７】 しかし抽出物の精製又は低温での葉の乾燥を記載した従来技術の文献はない 。

【０００８】 従来技術の文献によれば、オレア ユーロパエア及びオレウロペインから成 る植物性抽出物は、特に抗ウイルス薬品としての薬理学的特性を示した。

【０００９】 この抽出物の最初の医療適用は１８００年代初頭にさかのぼり、その時これ はマラリアを治療するために液状形で使用された。その時以来、多くの医療に 適用されてきた。最も顕著な効果のうち、この化合物に対してウイルスの存在 下でのその抗感染性活性が記載されているが、細菌、カビ及びある種の細胞内 寄生虫に対しても有効である。これらの病原菌に対するこの抗感染性活性はエ レノリン酸（elenolic acid)の直接作用に関連していた。ウイルスの場合、感 染された細胞に浸透する産生物の能力及び直ちに起こる不活性なウイルス複製 が記載されている。とりわけたとえばウイルス−クリティカル−アミノ酸を妨 げるか又はレトロウイルスの場合、逆トランスクリプターゼ又はプロテアーゼ の産生を相殺する。細菌を不活性化するためにオレウロペインによって使用さ れる多くのメカニズムは、細菌外壁への直接的溶解作用を含む。

【００１０】 従来の技術水準に含まれる文献に、健康なヒトにおいてＴ−リンパ球、ナチ ュラルキラー細胞、単球及び（又は）顆粒球の活性化及び増殖によって細胞性 免疫及び遅延過敏症を増強する、免疫システムへのオレア ユーロパエア抽出 物の効果は示されなかった。

【００１１】 タイプＩＩＩｇＧＦｃフラグメントレセプターとしても知られているＣＤ１ ６膜抗原は、ＮＫ細胞、顆粒球及びマクロファージ中で通常発現する。ほとん どの抗体依存性細胞毒性、すなわちＡＤＣＣは、ＮＫ細胞及びＣＤ１６マーカ ー、すなわちヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３複合体を主に結合するＦｃレセプター も発現する細胞毒性Ｔ−リンパ球の小集団に相当する。ＡＤＣＣは、これらの 細胞毒性細胞に、抗原- 抗体結合の特異性を利用して、これら細胞がその細胞 毒性活性を指示するか又はこれに集中することができるメカニズムを提供する 。顆粒球及びマクロファージ膜中に存在するＣＤ１６は、また食菌作用でこれ らの細胞を助ける。異なる細胞集団中でこのマーカーの発現を増加させる薬品 は、細胞毒性細胞としてのその機能を増加させながら、ＮＫ細胞及び細胞毒性 Ｔ−リンパ球の小集団をもたらすことができる。免疫系でのＮＫ細胞の作用は 、ウイルス感染細胞を除いてウイルス感染から身体を守ることになっている。

【００１２】 顆粒球及びマクロファージ中でのＣＤ１６の増加された発現は、炎症過程でこ れらの細胞の主な作用を増強することができる。これは食菌作用によって細菌 、カビ及びその他の病原菌を除去することである。

【００１３】 一方、効果的に作用する免疫系での細胞に対して、その他の細胞又は細胞外 マトリクスとの接触が要求され、その結果としてこの細胞はその状態が見分け られる。好中球の表面は、これを相互に作用させ、特定の刺激物に応答して活 性になる特異的レセプターを含有するばかりでなく、付着分子として同定され る多くの分子も発現させる。これらの好中球分子はその他の細胞中でリガンド のレセプターとして作用するか（この場合カウンターレセプターとして作用す る）又は種々の細胞外マトリックス蛋白質、たとえばコラーゲン、フィブロネ クチン、ラミニン等中に存在するアミノ酸配列中でリガンドのレセプターとし て作用する。

【００１４】 付着分子は、共同で細胞を活性化し、細胞内部に共活性化シグナルを送る。

【００１５】 その構造に基づいて、これらを３つの基本的概念に分類することができる： １．セレクチン、 ２．インテグリンのファミリーに属するもの、 ３．免疫グロブリンのスーパーファミリーに属するもの。

【００１６】 ＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂ作用に関連する抗原はＬＦＡ−１及びＭａｃ−１ インテグリンそれぞれのα鎖である。これれらの両方はβ２インテグリンのフ ァミリーに属する。これらの膜分子は炎症過程の正常な発展に対する原則であ って、根本的に白血球の血管内皮への最終付着、病巣への浸出又は移動を仲介 する。細胞膜内でのその増加した発現又は新規の発現は通常プロインフラマト リーサイトカイン、たとえばＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８等の遊離の結果 である。正常な状態で、炎症は食菌作用によって病原性媒介物を除き、損傷さ れた組織を復活させることを目的とする生理学的現象である。プロインフラマ トリーサイトカイン、たとえばＩＬ−β及びＩＬ−８の血漿レベルの増加と共 に、ＣＤ１１ａ分子上のリンパ球中の及びＣＤ１１ｂ分子上のリンパ球及び単 球中の薬剤によって得られる増加した発現は、炎症応答の増強を最終的にもた らすであろうリンパ球、単球及び顆粒球の活性化を意味する。ケモキン(Chemo kine) のファミリーに属するＩＬ−８も白血球の動き（ケモキネシス）を刺激 する能力及び特に好中球の指定された動き（化学走性）を刺激する能力を有す る。

【００１７】 更に、単球中のＣＤ２５膜マーカーの増加した発現及び薬剤によって産生さ れたリンパ球及び単球中のＣＤ６９の増加した発現はこれらの集団を活性化し 、薬剤の投与で免疫系を増強させることを意味する。

【００１８】 従来技術によればオレア ユーロパエアからの抽出方法は、高いオレウロペ イン含有量の抽出物を提供するが、この従来技術の文献には原料、オレア ユ ーロパエア葉からオレウロペイン産生について開示されていない。低温でのオ レア ユーロパエア葉の乾燥によって、より一層多くの抽出物収量が生じ、そ して有効成分を失うことなくかつ抽出物のすべての薬理学的特性を維持して高 いオレウロペイン含有量の抽出物が得られる。３５℃より低い温度でのオレア ユーロパエア葉の乾燥によって、従来技術に記載された０．３％に比べて５％ のオレウロペイン含有量を有する原料を生じる。

【００１９】 オレア抽出物を得るために水、ついで膜濾過の使用は、抽出物の薬理学的活 性のない最小の極性成分、たとえばクロロフィル、ポリフェノール、脂肪及び アルキルフェノールを除くので、抽出物中のより一層高いレベルの選択性を有 することが有利である。

【００２０】 Ｔ−リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球及び（又は）顆粒球の活性化に よって免疫系でのオレア ユーロパエア抽出物中に存在するオレウロペイン及 びフラボノイドの作用は、ウイルス及び細菌除去活性を増強させる。この作用 はウイルスの複製又は細菌壁の溶解の影響を受けない。これは遅延過敏症と共 に細菌、ウイルス及びその他の細胞成長寄生虫に対する細胞免疫性を増強させ 、プロインフラマトリーサイトカインの遊離を発生させる。

【００２１】 発明の目的 本発明は、オレウロペイン及びフラボノイドを含有するオレア ユーロパエ ア抽出物を収得する新規方法において、３５℃より低い温度で遮光して乾燥さ せ、２０℃より低い温度で低分子量のアルコールで浸漬することによって抽出 し、溶剤を蒸発させ、抽出物を水で処理し、膜濾過し、ついで凍結乾燥させる ことから成る、新規上記方法を開示する。

【００２２】 本発明は、健康な体において、Ｔ−リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球 及び（又は）顆粒球の活性化によって抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び広 い意味で細胞性免疫及び遅延過敏症を増強する免疫剤としてのオレア ユーロ パエアの薬理学的活性を開示する。

【００２３】 発明の詳細な説明 オレア ユーロパエア中の水分含有量は約６％であり、これは１０５℃で３ 時間の乾燥損失量を測定したものである。有効成分の分解を回避するために、 直射光線をさけて３５℃より低い温度で脱水を行う。オレア ユーロパエア葉 が、その有効成分含有量を変化させる温度及び直射光線に極めて敏感であるこ とを例示する。

【００２４】 種々の温度でのオレウロペイン含有量の変化を表１に示す。

【００２５】 表１：種々の乾燥条件でのオレウロペイン含有量

【００２６】

【表１】

【００２７】 この際、乾燥条件はオレウロペインの分解動力学に関して重要である。不適 当な乾燥条件はオレウロペインの分解を挑発し、したがって収率の損失を挑発 する。

【００２８】 オレウロペインの安定性はまた日光によって左右される。乾燥葉中のオレウ ロペイン含有量３．５％に対して、２０℃で太陽にさらして１２時間後、オレ ウロペイン含有量は０．８２％に低下する。したがって３５℃より低い温度で のオレア ユーロパエア葉の乾燥は、従来技術に記載された０．３% に比べて 最小含有量５％の原料を生じる。

【００２９】 この葉の抽出は９５％より大きい純度の低分子量のアルカノールによって２０ ℃より低い温度で実施され、そして最良の結果を生じるアルカノールはメタノ ール及びエタノールである。

【００３０】 葉に対してそれぞれ６リットルの溶剤を用いて２０℃より低い温度で１８時間 浸漬することによって葉を抽出する。液体抽出物をシロップコンシステンシー 、好ましくは高い減圧で、４０℃より低い温度で固体中のその含有量が約８０ ％になるまで濃縮する。

【００３１】 シロップを精製水で処理し、微生物による汚染を回避し、そして薬理学的不 活性成分、たとえばクロロフィル、ポリフェノール、アルキルフェノール、漿 剤等を抽出物から除いた滅菌プレートによって濾過する。

【００３２】 溶剤を減圧で−４０℃で凍結乾燥し、３５℃より低い温度で加熱することに よってから除去して、帯緑色粉末の形で乾燥抽出物が得られる。

【００３３】 抽出物の収率は原料に対して約２５％であり、そしてこの抽出物は１８％オ レウロペイン及び５％フラボノイドを含有する。液体クロマトグラフィー分離 によって、ヘスペリジン、ルチン及びルテオリン−７−グルコシドが同定され る。オレア抽出物は公知の方法で、たとえばクロマトグラフィー、分別結晶等 を用いて当業者によって精製され、より一層高いオレウロペイン含有量を有す る抽出物が得られる。

【００３４】 オレア ユーロパエア抽出物は薬学的に容認された賦形剤と共にオレア ユ ーロパエア抽出物（１８％オレウロペイン及び５％フラボノイド）３００ｍｇ を含有する薬剤の投与後、健康体の免疫システムにおいて薬理学的活性を示し た。臨床試験で受け入れられた薬用量は、抽出物３００ｍｇ（１錠）／６時間 及び抽出物６００ｍｇ（２錠）／６時間である。したがって６人の患者は１日 抽出物１．２ｇ及びもう６人の患者は抽出物２．４ｇを摂取した。

【００３５】 次のパラメーターをＥＤＴＡを用いて全血中で Cell Sorter Vantage and Dir ect double-marker Immunofluorescence (フルオレッセイン−ＦＩＴＣ又はフ ィコエリスリン−ＰＥ）によって分析する： −細胞系マーカー（白血球集団）：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８，ＣＤ１６、ＣＤ １９，ＣＤ５６，ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４。

【００３６】 −細胞活性化マーカー：ＣＤ６９及びＣＤ２５． −前記単クローンの組み合わせ。

【００３７】 分析の種々のポイントは、モノクロナール抗体の組み合わせに依存して、リン パ球、単球及び多形核球に対して選ぶ。モノクロナール組み合わせはつぎの通 りである：

【００３８】

【外１】

【００３９】 すべてのこれらのパラメーターを薬品（Ｄ０）を摂取する前、薬品（Ｄ１） を摂取２４時間後、薬品（Ｄ３）を摂取２７時間後及び薬品（Ｄ１１）を摂取 １１日目で分析する。したがって、合計４個の抽出物を各患者から採取する（ １０ｍｌ／抽出物）。ＥＤＴＡを有する血液のチューブと共に、２個のチュー ブを４個の抽出物それぞれで血清のために使用する。それらのうちの１つは基 本生化学分析に使用され、もう１つは後に使用するために−２０℃で凍結させ る。このチューブをＥＬＩＳＡによってサイトカインの血漿レベルの測定に使 用する。測定されたサイトカインはインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、イ ンターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン８（ＩＬ−８）及びインタ ーフェロンγ（ＩＮＦ−γ）である。

【００４０】 その試験の結果は次ぎの通りである： １．顕著な変化は産生物を摂取前又はその後、基本生化学又は血液学的分析に 何ら観察されなかった。

【００４１】 ２．１．２ｇ／日を摂取したグループと２．４ｇ／日を摂取したグループに何 ら差異はなかった。

【００４２】 ３．リンパ球及び顆粒球の両方でＣＤ１６発現を有する細胞のパーセントを増 加させる傾向がある。

【００４３】 ４．リンパ球及び単球の両方でＣＤ１１ｂ発現を有する細胞のパーセントに増 加が観察され、単球でＣＤ１１ａ発現の増加が観察され、そしてリンパ球集団 ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋の発現の動力学に顕著な変化は 観察されなかった。

【００４４】 ５．単球でＣＤ１４発現の増加が観察される。

【００４５】 ６．重要かつ顕著な増加は、リンパ球及び単球の両方で初期（ＣＤ６９）活性 化及び後期（ＣＤ２５）活性化の発現で観察される。

【００４６】 ７．特に産生物を摂取３日目に特定のプロインフラマトリーサイトカイン、た とえばＩＬ−１β及びＩＬ−８の血漿のレベルを増加させる傾向。

【００４７】 上記結果及びインフラマトリーサイトカインの血漿のレベルの増加は、Ｔリ ンパ球、ＮＫ細胞、単球及び顆粒球の活性化による細胞性免疫及び遅延過敏症 の増強を示す。

【００４８】 本発明を次の例によって説明するが、これによって本発明の範囲は限定され ない。

【００４９】 例１：オレア ユーロペア葉からの抽出を示す。

【００５０】 水分含有量６％のオレア ユーロペア葉１０６ｋｇを３５℃より低い温度で 強制空気人工ドライヤー中で乾燥させる。

【００５１】 乾燥葉を冷凍工程で粉々にする。

【００５２】 オレウロペイン含有量６．２３％の乾燥されたオレア ユーロペア葉を２０℃ で１８時間９５％メタノール６００リットルを用いて抽出する。この処理を抽 出物が枯渇するまでもう３回繰り返す。

【００５３】 濾過された液体抽出物を４０℃より低い温度で減圧で濃縮して、シロップ状 物質３２ｋｇを得る。このシロップを水に懸濁させ、滅菌濾過によって精製す る。水溶液を凍結乾燥して濃縮し、オレウロペイン含有量２１．９％及びフラ ボノイド（ヘスペリジン、ルチン、ルテオリン−７−グルコシド）５％を有 する乾燥オレア ユーロペア抽出物２５ｋｇを得る。抽出物の収率：２５％。

【００５４】 例２：オレア抽出物の取り込みによって健康体での免疫学的パラメーターの 変化を示す。

【００５５】

【表２】

【００５６】 例３：使用された薬剤を示す。

【００５７】 オレア ユーロペア抽出物 ３００ｍｇ 微晶質セルロース １５４ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ３ｍｇ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トヴァール・オリヴァ・ホセ・アントニオ スペイン国、Ｅ−03006 アリカンテ、サ キタリオ、12 (72)発明者 ディアス・アルペリ・ヨアクイン スペイン国、Ｅ−03006 アリカンテ、サ キタリオ、12 (72)発明者 ゼムペレ・オルテルス・ホセ・ミゲル スペイン国、Ｅ−03006 アリカンテ、サ キタリオ、12 (72)発明者 パルド・ツァパタ・ホセ スペイン国、Ｅ−03006 アリカンテ、サ キタリオ、12 Ｆターム(参考） 4C088 AB12 AC04 AC05 AC06 AC11 BA10 CA05 NA14 ZB09 ZC02

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抽出、精製及び溶剤の蒸発の工程から成る、２５％以上の収率 でオレアユーロパエア(Olea europaea) 抽出物を収得する方法において、オレ アユーロパエア葉を３５℃より低い温度で乾燥させることを特徴とする、上記 収得方法。
2. 【請求項２】抽出が２０℃より低い温度で９５％以上の純度のアルカノール を用いて行われる、請求項１記載のオレア ユーロパエア抽出物を収得する方 法。
3. 【請求項３】抽出剤がメタノール又はエタノールである、請求項１又は２記 載のオレア ユーロパエア抽出物を収得する方法。
4. 【請求項４】抽出を葉１部及び溶剤６部の割合で１８時間３回行う、請求項 １〜３のいずれかに記載のオレア ユーロパエア抽出物を収得する方法。
5. 【請求項５】減圧で溶剤を蒸発させ、濃縮された抽出物を精製水に溶解させ るか又は滅菌濾過することによって抽出物を精製する、請求項１記載のオレア ユーロパエア抽出物を収得する方法。
6. 【請求項６】凍結乾燥し、高い減圧で４０℃以下で凍結し、そして３５℃よ り低い温度で穏やかに加熱することによって溶剤を蒸発させる、請求項１記載 のオレア ユーロパエア抽出物を収得する方法。
7. 【請求項７】オレウロペイン(Oleuropein)含有量が１８％より多く、そして フラボノイド含有量が５％より多い、請求項１〜６のいずれかに記載のオレア ユーロパエア抽出物を収得する方法。
8. 【請求項８】健康なヒトにおいて細胞性免疫及び遅延過敏症を増強させる薬 品を製造するために、オレウロペイン及びフラボノイドを含有するオレア ユ ーロパエア抽出物を使用する方法。
9. 【請求項９】細胞性免疫及び遅延過敏症の増強が、Ｔ−リンパ球、ナチュラ ルキラー細胞、単球及び（又は）顆粒球の活性化及び増殖によって及びプロイ ンフラマトリー(pro-inflammatory)サイトカインの増加によって特徴づけられ る、請求項８記載のオレア ユーロパエア抽出物を使用する方法。
10. 【請求項１０】Ｔ−リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球及び（又は）顆 粒球の活性化及び増殖がＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ ６９、及び（又は）ＣＤ２５の発現によって特徴づけられる、請求項８又は９ 記載のオレア ユーロパエア抽出物を使用する方法。
11. 【請求項１１】 細胞性免疫及び遅延過敏症の増強が、サイトカインＩＬ− １β及び１Ｌ−８の増加によって特徴づけられる、請求項８又は９記載のオレ ア ユーロパエア抽出物を使用する方法。