JP2003518365A

JP2003518365A - 示差的遺伝子発現を使用する毒性因子の同定方法

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Publication number: JP2003518365A
Application number: JP2001508380A
Authority: JP
Inventors: ボニーイー．ゴールド−ロスバーグ，; ヴィンセントエイ．ディピッポ，; ローラミルロイ，; ケリーケイ．ダニエルス，
Original assignee: キュラジェンコーポレイション
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2003-06-10
Also published as: WO2001002609A3; WO2001002609A2; AU7133000A; EP1255857A2; CA2377768A1

Abstract

(57)【要約】示差的遺伝子発現を使用する毒性因子（例えば、肝毒性因子）の同定方法が開示される。新規の核酸配列もまた開示され、その発現は、アセトアミノフェンによって示差的に調節される。肝毒性について試験薬剤をスクリーニングする本発明の方法は、（ａ）ＡＣＥＴＡ：１〜１６９および１７０からなる群より選択される１以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程；（ｂ）試験細胞集団を、試験薬剤と接触させる工程；（ｃ）試験細胞集団における１以上の核酸配列の発現を測定する工程；（ｄ）試験細胞集団における核酸配列の発現を、参照細胞集団における核酸配列の発現と比較する工程；および（ｅ）試験細胞集団および参照細胞集団におけるＡＣＥＴＡ配列の発現レベルにおける差異を同定する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、一般に、核酸およびポリペプチドに関する。詳細には、本発明は、
示差的な遺伝子発現を用いる肝臓組織における毒性因子の同定に関する。

【０００２】（発明の背景）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、成体および小児の両方において、
疼痛および熱を制御するために一般的に使用される。ＮＳＡＩＤ薬剤の１つの型
がアセトアミノフェンである。アセトアミノフェンは、大半の個体に十分に許容
され、そして他の一般に使用される疼痛軽減剤で時折観察される副作用を誘導し
ないことが報告されている。

【０００３】しかし、高用量のアセトアミノフェンが摂取される場合には、合併症が生じ得
る。合併症の１つの型が肝臓損傷（例えば、中心周囲肝臓壊死（ｐｅｒｉｃｅｎ
ｔｒａｌｈｅｐａｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓ））である。アセトアミノフェン
摂取に関連する肝毒性は、この因子が肝臓において、Ｎ−アセチル−パラベンゾ
キノンイミンへと代謝される場合に生じると考えられ、このＮ−アセチル−パラ
ベンゾキノンイミンが毒性であり得る。大半の健康な個体では、この潜在的に毒
性の化合物は、肝臓において、ポリペプチドグルタチオンによって分解される。
しかし、アセトアミノフェンが高用量で摂取される場合、Ｎ−アセチル−パラベ
ンゾキノンイミンをプロセスするためには不十分な量のグルタチオンが存在し得
る。結果として、肝臓損傷が生じ得る。重篤な場合には、潜在的に致死的な肝臓
壊死が、引き続いて生じ得る。

【０００４】アセトアミノフェン中毒は、解毒薬を投与することによって処置され得る。解
毒薬は、好ましくは、中毒後できる限り早く投与される。しかし、解毒薬は即時
には投与されないかもしれない。なぜなら、アセトアミノフェン中毒の徴候が、
インフルエンザ様症状と混同され得るからである。アセトアミノフェン中毒の早
期の指標としては、例えば、悪心、ならびに食欲不振、下痢、腹痛、および嘔吐
が挙げられ得る。これらのインフルエンザ様症状は、通常、薬物摂取の４時間後
と１２時間後との間に存在する。アセトアミノフェン中毒の後期の指標としては
、例えば、錯乱、黄疸、または意識消失が挙げられ得る。しかし、解毒薬が投与
される時点では、解毒薬は、ほどんど効果を有さない。

【０００５】（発明の要旨）本発明は、特定の核酸が、アセトアミノフェンで処置された動物の肝臓組織に
おいて示差的に発現されるという発見に一部基づく。これらの示差的に発現され
た核酸は、新規の配列および核酸配列（これらは、以前に記載されているが、こ
れまでは、アセトアミノフェン応答性として同定されていなかった）を含む。こ
れらの示差的に発現される核酸を使用して、肝臓に損傷を与える（すなわち、肝
毒性である（例えば、中心周囲肝臓壊死））因子を同定し得る。これらの核酸は
、さらに、被験体において、ＮＳＡＩＤ（例えば、アセトアミノフェン）の摂取
に関連した中毒を同定するために使用され得る。

【０００６】種々の局面において、本発明は、毒性（例えば、肝毒性）について試験薬剤を
スクリーニングする方法を包含する。例えば、１つの局面では、本発明は、アセ
トアミノフェンに応答性の１以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む、試験細胞
集団を提供する工程、この試験細胞集団を試験薬剤と接触させる工程、およびこ
の試験細胞集団におけるこの核酸配列の発現を、参照細胞集団におけるこの核酸
配列の発現と比較する工程により、肝毒性因子を同定する方法を提供する。参照
細胞集団における遺伝子の発現と比較した、試験細胞集団における核酸配列の発
現における変化は、この試験薬剤が肝毒性であることを示す。

【０００７】さらなる局面では、本発明は、被験体における試験薬剤の肝毒性を評価する方
法を提供する。この方法は、１つ以上のアセトアミノフェン応答性遺伝子を発現
し得る細胞を含む細胞集団を被験体から提供する工程、およびこの核酸配列の発
現を、肝毒性因子に対する暴露状態が既知の被験体に由来する細胞を含む参照細
胞集団におけるこの核酸配列の発現と比較する工程を包含する。参照細胞集団に
おける核酸配列の発現と比較した、試験細胞集団における発現の変化は、この被
験体におけるこの試験薬剤の肝毒性を示す。

【０００８】別の局面では、本発明は、肝毒性への感受性を診断または決定する方法を提供
する。この方法は、１以上のＡＣＥＴＡ応答性遺伝子を発現し得る細胞を含む細
胞集団を、被験体から提供する工程、およびこの核酸配列の発現を、肝毒性を患
っていない被験体に由来する細胞を含む参照細胞集団におけるこの核酸配列の発
現と比較する工程を包含する。参照細胞集団における核酸配列の発現と比較した
、試験細胞集団における発現の変化は、被験体が、肝毒性を有するか、または肝
毒性に対して感受性であることを示す。

【０００９】新規の核酸、ならびに、これらにコードされるポリペプチド（これらの発現は
、アセトアミノフェンの影響に対して応答性である）もまた提供される。

【００１０】他に定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての専門用語および科学
用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意
味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法お
よび材料が、本発明の実施または試験において用いられるが、適切な方法および
材料は、以下に説明される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願
、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場
合には、本明細書（定義を含む）が優先する。さらに、材料、方法および実施例
は、単に例示であり、限定されることを意図しない。

【００１１】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかである。

【００１２】（発明の詳細な説明）本発明は、アセトアミノフェンへの暴露の後の、ラット肝臓細胞における複数
の核酸配列の発現パターンにおける変化の発見に一部基づく。

【００１３】示差的に発現される核酸を、雄性１０〜１４週齢ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅ
ｙラットに、ＥＤ１００用量である４３．３ｍｇ／ｋｇ／日を７２時間、または
ＬＤ１０用量である１３３．３ｍｇ／ｋｇ／日を２４時間のいずれかで、経口的
にアセトアミノフェンを投与することによって同定した。示差的な遺伝子発現を
、２つの研究において評価した。第１の研究では、コントロール動物に、カノー
ラ油を与えた。第２の研究では、コントロール動物に、１０％エタノールを与え
た。指定された時点で動物を屠殺した後、肝臓組織を切開し、この切開した組織
から総ＲＮＡを回収し、そしてｃＤＮＡを調製した。

【００１４】アセトアミノフェン処置ラットおよびコントロールラットにおいて異なるレベ
ルで発現された配列を、米国特許第５，８７１，６９７号およびＳｈｉｍｋｅｔ
ｓら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：７９８−８０３（１
９９０）に記載されるように、ＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮＧ^TM示差的発現分析にｃＤ
ＮＡを供することによって同定した。これらの特許および刊行物の内容は、本明
細書中でその全体が参考として援用される。

【００１５】第１の研究では、４００を超える遺伝子フラグメントが、アセトアミノフェン
の投与に応答して、ラット肝臓組織において示差的に発現されることが最初に見
出された。発現レベルが８倍より高く調節された遺伝子フラグメントを、さらな
る分析のために選択した。

【００１６】遺伝子フラグメントの示差的発現を、Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、ＮａｔｕｒｅＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：１９８−８０３に記載されるように非標識オ
リゴヌクレオチド競合アッセイを使用して確認した。アセトアミノフェンの存在
下において発現が少なくとも８倍調節される、４２個の確認された配列が同定さ
れた。これらの４２個の核酸配列を、本明細書中でＡＣＥＴＡ１〜４２という
。これらを、表１にまとめる。表１において小見出し（例えば、タンパク質産生
、シグナル伝達など）を付けた列は、そのタンパク質についての機能的分類を与
える。

【００１７】第１の研究において同定された１０個の配列（ＡＣＥＴＡ：１〜１０）は、新
規な遺伝子を表す。これらの１０個の遺伝子のうちの８個は、以前に記載された
配列に対して幾らかの類似性を示す。これらの８個の遺伝子のうち、３個は既知
の遺伝子に対して９５％以上の同一性を有し、４個の遺伝子は既知の遺伝子に対
して９０〜９４％の間の同一性を有し、そして１個の遺伝子は既知の遺伝子に対
して８１％同一性を有する。残りの新規な遺伝子である、ＡＣＥＴＡ６および
７は、以前に記載された配列に関連付けられないようである。残りの配列（ＡＣ
ＥＴＡ：１１〜４２）は、以前に記載されている。

【００１８】第２の研究では、アセトアミノフェンに応答して発現が調節される、１３３個
の確認された配列が同定された。これらの配列を表２にまとめる。同定された１
３３個の核酸配列のうちの６個は、第１の研究においてもまた同定された。これ
らの配列は、ＡＣＥＴＡ１５、２０、２３、３３、３６、４１である。残りの
新たに同定された１２７個の核酸配列を、本明細書中で、ＡＣＥＴＡ４３〜１
７０という。

【００１９】第２の研究において同定された８個の配列は、新規な遺伝子を表す（ＡＣＥＴ
Ａ４３〜４５、４８〜５１および５４）。４個の配列（ＡＣＥＴＡ４６、４
７、５２および５３）は、新規なＥＳＴを表す。８個のうちの７個の遺伝子は、
以前に記載された配列に対して幾らかの類似性を示す。これらの７個の遺伝子の
うち、２個は既知の配列に対して９０％以上の同一性を有し、２個の遺伝子は既
知の配列に対して８０〜８９％の間の同一性を有し、そして３個の遺伝子は既知
の配列に対して７０〜７９％の間の同一性を有する。１つの遺伝子であるＡＣＥ
ＴＡ４３は、以前に記載された配列に関連付けられないようである。残りの配列
（ＡＣＥＴＡ：５５〜１７０）は、以前に記載されている。

【００２０】新たに記載された配列を、本明細書中に示す。いくつかの新規な配列（すなわ
ち、ＡＣＥＴＡ：１〜１０およびＡＣＥＴＡ４３〜５４）については、クロー
ン化された配列を、クローン化された配列に対して実質的に同一な配列を含む、
１以上のさらなる配列フラグメント（例えば、ＥＳＴまたはコンティグ）と共に
提供する。いくつかの配列については、クローン化されたフラグメントとさらな
るフラグメントとから組み立てられた複合配列を含む、コンセンサス配列もまた
提供される。所定のＡＣＥＴＡ配列について、その発現は、本明細書中に記載さ
れる方法において任意の関連した核酸配列を用いることにより測定され得る。

【００２１】以前に記載された配列（ＡＣＥＴＡ：１１〜４２およびＡＣＥＴＡ５５〜１
７０）については、データベース登録番号が提供される。この情報は、当業者が
ＡＣＥＴＡ核酸配列の発現を検出および測定するために必要な情報を導き出すこ
とを可能にする。例えば、ＰＣＲ増幅のためのプライマーが、データベース登録
番号に対応する配列および／または本明細書中に開示された配列に基づいて作製
され得る。

【００２２】本明細書中において考察されるアセトアミノフェン応答性核酸としては、以下
が挙げられる：表１

【００２３】

【表１】

【００２４】

【表２】以下に、発現がアセトアミノフェノンの存在下で示差的に調節される新規な核
酸配列のさらなる考察が続く。

【００２５】（ＡＣＥＴＡ１）ＡＣＥＴＡ１は、新規な３７０ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する：

【００２６】

【化１】（ＡＣＥＴＡ２）ＡＣＥＴＡ２は、新規な４３６ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する８１ｂｐのクローン化フラグメントにおいて最初に同定さ
れた：

【００２７】

【化２】このクローン化配列は、以下のコンセンサス配列を生じるコンティグに構築さ
れた：

【００２８】

【化３】（ＡＣＥＴＡ３）ＡＣＥＴＡ３は、新規な４１１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する：

【００２９】

【化４】（ＡＣＥＴＡ４）ＡＣＥＴＡ４は、新規な１０８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する：

【００３０】

【化５】（ＡＣＥＴＡ５）ＡＣＥＴＡ５は、新規な３４８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する：

【００３１】

【化６】（ＡＣＥＴＡ６）ＡＣＥＴＡ６は、新規な６２２ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する：

【００３２】

【化７】（ＡＣＥＴＡ７）ＡＣＥＴＡ７は、新規な６４２ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する１４３ｂｐのクローン化フラグメントにおいて最初に同定
された：

【００３３】

【化８】このクローン化配列は、以下のコンセンサス配列を生じるコンティグに構築さ
れた：

【００３４】

【化９】（ＡＣＥＴＡ８）ＡＣＥＴＡ８は、新規な４１１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する３０８ｂｐのクローン化フラグメントにおいて最初に同定
された：

【００３５】

【化１０】このクローン化配列は、以下のコンセンサス配列を生じるコンティグに構築さ
れた：

【００３６】

【化１１】（ＡＣＥＴＡ９）ＡＣＥＴＡ９は、新規な２９０ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有する：

【００３７】

【化１２】（ＡＣＥＴＡ１０）ＡＣＥＴＡ１０は、新規な１１６ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００３８】

【化１３】（ＡＣＥＴＡ４３）ＡＣＥＴＡ４３は、新規な３９１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００３９】

【化１４】（ＡＣＥＴＡ４４）ＡＣＥＴＡ４４は、新規な５７１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する４１１ｂｐのクローン化フラグメントにおいて最初に同
定された：

【００４０】

【化１５】このクローン化配列は、以下のコンセンサス配列を生じるコンティグに構築さ
れた：

【００４１】

【化１６】（ＡＣＥＴＡ４５）ＡＣＥＴＡ４５は、新規な６１９ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する４０８ｂｐのクローン化フラグメントにおいて最初に同
定された：

【００４２】

【化１７】このクローン化配列は、以下のコンセンサス配列を生じるコンティグに構築さ
れた：

【００４３】

【化１８】（ＡＣＥＴＡ４６）ＡＣＥＴＡ４６は、新規な４９２ｂｐのＥＳＴである。この核酸は、以下の配
列を有する：

【００４４】

【化１９】（ＡＣＥＴＡ４７）ＡＣＥＴＡ４７は、新規な４１３ｂｐのＥＳＴである。この核酸は、以下の配
列を有する：

【００４５】

【化２０】（ＡＣＥＴＡ４８）ＡＣＥＴＡ４８は、新規な１３８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００４６】

【化２１】（ＡＣＥＴＡ４９）ＡＣＥＴＡ４９は、新規な４１９ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００４７】

【化２２】（ＡＣＥＴＡ５０）ＡＣＥＴＡ５０は、新規な１０９ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００４８】

【化２３】（ＡＣＥＴＡ５１）ＡＣＥＴＡ５１は、新規な２９９ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００４９】

【化２４】（ＡＣＥＴＡ５２）ＡＣＥＴＡ５２は、新規な８６ｂｐのＥＳＴである。この核酸は、以下の配列
を有する：

【００５０】

【化２５】（ＡＣＥＴＡ５３）ＡＣＥＴＡ５３は、新規な１１１ｂｐのＥＳＴである。この核酸は、以下の配
列を有する：

【００５１】

【化２６】（ＡＣＥＴＡ５４）ＡＣＥＴＡ５４は、新規な２０５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸
は、以下の配列を有する：

【００５２】

【化２７】（一般的方法）ＡＣＥＴＡ核酸およびコードされたポリペプチドは、上記に提供される情報を
使用して同定され得る。いくつかの実施形態において、このＡＣＥＴＡ核酸およ
びポリペプチドは、各ＡＣＥＴＡポリペプチドについて公開された種々の配列（
配列番号によって参照される）を含む核酸またはポリペプチドに対応する。

【００５３】この種々の局面および実施形態において、本発明は、配列ＡＣＥＴＡ１〜１
７０の１つ以上を発現し得る少なくとも１つの細胞を含む試験細胞集団を提供す
る工程を含む。「発現し得る」とは、遺伝子が細胞内にインタクトな形態で存在
し、そして発現され得ることを意味する。次いで、１つ、いくつか、またはすべ
てのＡＣＥＴＡ配列の発現が（存在する場合）検出され、そして、好ましくは測
定される。既知の配列についてのデータベースエントリ（ｅｎｔｒｙ）により提
供される配列情報、または新たに記載された配列についての配列情報を使用して
、ＡＣＥＴＡ配列の発現は、当業者に周知の技術を用いて、検出（存在する場合
）および測定され得る。例えば、ＡＣＥＴＡ配列に一致する配列データベースエ
ントリ内の配列、または本明細書中で開示される配列内の配列は、例えば、ノー
ザンブロットハイブリダイゼーション分析または、特に、そして好ましくは特定
の核酸配列を量的に増幅する方法において、ＡＣＥＴＡＲＮＡ配列を検出する
ためのプローブを構築するために使用され得る。別の例として、この配列は、例
えば、逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応のような増幅ベースの検出方法にお
いて、ＡＣＥＴＡ配列の特異的増幅のためのプライマーを構築するために使用さ
れ得る。遺伝子発現における変化が遺伝子の増幅または欠失に関連する場合、試
験集団および参照集団における配列比較は、試験細胞集団および参照細胞集団に
おける検査されたＤＮＡ配列の相対量の比較によってなされ得る。

【００５４】発現はまた、タンパク質レベルで（すなわち、本明細書中に記載の遺伝子産物
によってコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって）測定され
得る。このような方法は当該分野で周知であり、そして例えば、遺伝子によって
コードされるタンパク質に対する抗体に基づくイムノアッセイが挙げられる。

【００５５】次いで、試験細胞集団における１つ以上のＡＣＥＴＡ配列の発現レベルは、参
照細胞集団からの１つ以上の細胞における配列の発現レベルと比較される。細胞
の試験集団およびコントロール集団における配列の発現は、核酸配列の発現を比
較するための当該分野で認識される任意の方法を使用して比較され得る。例えば
、発現は、米国特許第５，８７１，６９７号およびＳｈｉｍｋｅｔｓら、Ｎａｔ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７９８−８０３に記載されるようなＧＥＮＥＣ
ＡＬＬＩＮＧ（登録商標）方法を使用して比較され得る。

【００５６】種々の実施形態において、表１に列挙されるような関連した機能の遺伝子をコ
ードする１つ以上の配列の発現が、比較される。これらの機能としては、例えば
、「ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」（例えば、ＡＣＥＴＡ１１〜１
４）、「ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ」（ＡＣＥＴＡ２
５〜２６）、「ＳｔｅｒｏｉｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、（ＡＣＥＴＡ２２
および２４）、および「Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（ＡＣＥＴＡ３３〜
３４）が挙げられる。いくつかの実施形態において、２つ以上の機能性ファミリ
ーのメンバーの発現が、比較される。

【００５７】種々の実施形態において、ＡＣＥＴＡ１〜１７０によって表される配列の、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０または全て
の発現が、測定される。所望の場合、これらの配列の発現は、その発現が本明細
書中に記載のパラメータまたは条件の１つに従って変化されることが公知である
他の配列と一緒に、測定され得る。

【００５８】参照細胞集団は、比較されるパラメータが既知の１つ以上の細胞を含む。この
比較されるパラメータは、例えば、肝毒性因子の発現状態であり得る。「肝毒性
因子の発現状態」とは、参照細胞が肝毒性因子と接触したか否かが既知であるこ
とを意味する。肝毒性因子の例は、例えばアセトアミノフェンのような非ステロ
イド性抗炎症薬である。試験細胞集団における遺伝子発現プロフィールの、参照
細胞集団に対する比較が、測定されたパラメータの存在または程度を明らかにす
るか否かは、参照細胞集団の成分に依存する。例えば、参照細胞集団が既知の肝
毒性因子で処理されていない細胞からなる場合、試験細胞集団および参照細胞集
団における同様の遺伝子の発現レベルは、試験薬剤が肝毒性因子ではないことを
示す。逆に、参照細胞集団が肝毒性因子で処理された細胞からなる場合、試験細
胞集団と参照細胞集団との間の同様の遺伝子の発現プロフィールは、試験薬剤が
肝毒性因子であることを示す。

【００５９】種々の実施形態において、試験細胞集団におけるＡＣＥＴＡ配列は、その発現
レベルが参照細胞集団におけるＡＣＥＴＡ転写物のレベルに対して２．０、１．
５または１．０倍の範囲内で変化する場合に、ＡＣＥＴＡ配列の発現レベルに対
して、発現レベルが比較可能であるとみなされる。種々の実施形態において、試
験細胞集団におけるＡＣＥＴＡ配列は、その発現レベルが、参照細胞集団におけ
る対応するＡＣＥＴＡ配列の発現レベルから１．０、１．５、２．０倍またはそ
れ以上、参照細胞集団から変化する場合に、発現レベルにおいて変化したとみな
され得る。

【００６０】所望の場合、試験細胞集団と参照細胞集団との間の配列の示差的発現の比較は
、コントロール核酸（その発現が測定されているパラメータまたは条件とは独立
している）に対してなされ得る。試験核酸および参照核酸におけるコントロール
核酸の発現レベルは、比較される集団におけるシグナルレベルを規格化（標準化
）するために使用され得る。

【００６１】いくつかの実施形態において、試験細胞集団は、複数の参照細胞集団と比較さ
れる。複数の参照集団の各々は、既知のパラメータにおいて異なり得る。従って
、試験細胞集団は、肝毒性因子に暴露されたことが既知の第１の参照細胞集団、
ならびに肝毒性因子に暴露されていないことが既知の第２の参照細胞集団と比較
され得る。

【００６２】試験肝毒性因子に暴露される（すなわち、接触される）試験細胞集団は、任意
数の細胞（すなわち、１つ以上の細胞）であり得、そしてインビトロ、インビボ
、またはエキソビボで提供され得る。

【００６３】他の実施形態では、試験細胞集団を、２以上の部分集団（小集団）（ｓｕｂ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分割し得る。部分集団は、可能な限り同一な部分集団
を作製するように第１の細胞集団を分割することによって作製され得る。これは
、例えば、インビトロまたはエキソビボでのスクリーニング方法に適切である。
いくつかの実施形態では、種々の部分集団を、コントロール薬剤、および／また
は、１もしくは複数個の試験薬剤、すなわち例えば、共にもしくは種々の組合せ
において投与される種々の投薬量の１以上の試験薬剤に曝露し得る。

【００６４】好ましくは、参照細胞集団中の細胞は、試験細胞（例えば、肝臓組織）に可能
な限り類似した組織型に由来する。いくつかの実施形態では、コントロール細胞
は、試験細胞と同じ被験体由来である（例えば、試験細胞の起源の領域に近接し
た領域由来）。他の実施形態では、参照細胞集団は、複数の細胞由来である。例
えば、参照細胞集団は、以前に試験された細胞であって、本明細書中に記載され
たパラメーターまたは条件（肝毒性因子発現パターン）の１つが既知である細胞
に由来する発現パターンのデータベースであり得る。

【００６５】試験薬剤は、以前に記載されていない化合物であり得るか、または予め公知で
あるが、肝毒性因子であることは知られていない化合物であり得る。

【００６６】被験体は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊
長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得る。

【００６７】（毒性因子についてのスクリーニング）１つの局面では、本発明は、毒性因子（例えば、肝毒性因子）を同定する方法
を提供する。肝毒性因子は、ＡＣＥＴＡ１〜１７０として表１および表２に列
挙された核酸配列に対して相同な１以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む細胞
集団を提供することによって同定され得る。この配列は、この配列が特異的なハ
イブリダイゼーションが検出され得るに十分類似している限り、ＡＣＥＴＡ１
〜１７０を含む配列に対して同一である必要はない。好ましくは、この細胞は、
表１および表２に示されるＡＣＥＴＡ核酸を同定する配列に対して同一またはほ
ぼ同一である配列を含む。

【００６８】次いで、試験細胞集団中の核酸配列の発現を、参照細胞集団（これは、試験薬
剤に曝露されていない細胞集団であるか、いくつかの実施形態では、試験薬剤に
曝露された細胞集団である）中の核酸配列の発現に対して比較する。比較は、同
時または時間的に異なる時点で測定された試験サンプルおよび参照サンプルにお
いて実施され得る。後者の例は、種々の薬剤の投与後の公知配列の発現レベルに
関する情報を集めた、編集された発現情報（例えば、配列データベース）の使用
である。例えば、試験薬剤の投与後の発現レベルの変更を、コントロール薬剤（
例えば、アセトエミノフェン）の投与後の核酸配列において観察される発現の変
化に対して比較し得る。

【００６９】試験薬剤に曝露されていない参照細胞集団中の核酸配列の発現と比較した、試
験細胞集団中の核酸配列の配列における変化は、この試験薬剤が肝毒性因子であ
ることを示す。

【００７０】本発明はまた、このスクリーニング方法によって同定された肝毒性因子を含む
。

【００７１】（被験体における薬剤の毒性の評価）本明細書中において同定された、示差的に発現されるＡＣＥＴＡ配列はまた、
毒性因子の肝毒性について測定またはモニターすることを可能にする。本方法に
おいて、被験体由来の試験細胞集団を、試験薬剤（すなわち、肝毒性因子）に曝
露する。所望される場合には、試験細胞集団を、試験薬剤への曝露の前、試験薬
剤への曝露の間、または試験薬剤への曝露の後の種々の時点で被験体から採取し
得る。次いで、細胞集団中の１以上のＡＣＥＴＡ配列（例えば、ＡＣＥＴＡ：１
〜１７０）の発現を測定し、そして肝毒性因子の発現状態が既知である細胞を含
む参照細胞集団に対して比較する。好ましくは、参照細胞は、試験薬剤に曝露さ
れていない。

【００７２】参照細胞集団が処理に曝露された細胞を含まない場合、試験細胞集団中のＡＣ
ＥＴＡ配列と参照細胞集団中のＡＣＥＴＡ配列との間の発現における類似性は、
この処理が非肝毒性であることを示す。しかし、試験細胞集団中のＡＣＥＴＡ配
列とこの参照細胞集団中のＡＣＥＴＡ配列との間の発現における差異は、この処
理が肝毒性であることを示す。

【００７３】「肝毒性」とは、この因子が、被験体に投与される場合に、肝臓に損傷を与え
るか、または肝臓に対して破壊的であることを意味する。いくつかの実施形態で
は、肝毒性は、中心周囲肝臓壊死を含む。

【００７４】（肝毒性を診断する方法）本発明は、さらに、被験体において、肝毒性を診断する方法を提供する。この
方法では、肝毒性は、肝毒性因子（例えば、非ステロイド性抗炎症薬）に曝露さ
れたことが疑われる被験体由来の細胞の試験集団からの１つ以上のＡＣＥＴＡ核
酸配列の発現を試験することによって、診断される。

【００７５】ＡＣＥＴＡ核酸配列（例えば、ＡＣＥＴＡ：１〜１７０）またはこれらの配列
の任意の組合せの１つ以上の発現を、試験細胞中で測定し、そして参照細胞集団
における配列の発現と比較する。参照細胞集団は、肝毒性状態が既知である少な
くとも１つの細胞を含む。参照細胞集団が、肝毒性因子に曝露されていない細胞
を含む場合、試験集団におけるＡＣＥＴＡ配列と参照細胞集団におけるＡＣＥＴ
Ａ配列との間の発現の類似性は、この被験体が肝性毒性を有さないことを示す。
試験集団におけるＡＣＥＴＡ配列と参照細胞集団におけるＡＣＥＴＡ配列との間
の発現の差異は、この参照細胞集団が肝毒性を有することを示す。

【００７６】逆に、参照細胞集団が、肝毒性因子に曝された細胞を含む場合、試験細胞集団
と参照細胞集団との間の発現パターンの類似性は、この試験細胞集団が肝毒性を
有することを示す。試験集団におけるＡＣＥＴＡ配列と参照細胞集団におけるＡ
ＣＥＴＡ配列との間の発現の差異は、この被験体が肝毒性を有さないことを示す
。

【００７７】（ＡＣＥＴＡ核酸）また本発明において、ＡＣＥＴＡ：１〜１０およびＡＣＥＴＡ：４３〜５４、
またはその相補体からなる群から選択される核酸配列を含む新規な核酸、ならび
にこれらの核酸を含むベクターおよび細胞が提供される。

【００７８】従って、本発明の１つの局面は、ＡＣＥＴＡタンパク質またはその生物学的に
活性な部分をコードする単離されたＡＣＥＴＡ核酸分子に関する。ＡＣＥＴＡコ
ード核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のため
に十分な核酸フラグメント（例えば、ＡＣＥＴＡｍＲＮＡ）、およびＡＣＥＴ
Ａ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマ
ーとしての使用のためのフラグメントもまた含まれる。本明細書中で使用される
場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ
）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して生成さ
れたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、
およびホモログを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好
ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【００７９】「プローブ」とは、用途に依存して、種々の長さ（好ましくは、少なくとも約
１０ヌクレオチド（ｎｔ）と、例えば、約６，０００ｎｔ程度に大きい長さとの
間）の核酸配列をいう。プローブは、同一の核酸配列、類似した核酸配列、また
は相補的核酸配列の検出のために使用される。より長い長さのプローブは、通常
、天然の供給源または組換え供給源から得られ、そしてオリゴマーよりも高度に
特異的であり、そしてより緩徐にハイブリダイズする。プローブは、一本鎖また
は二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術また
はＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように設計され得る。

【００８０】「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源内に存在する他の核酸分子から
分離された核酸分子である。単離された核酸分子の例として、ベクター内に含ま
れる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞内に維持された組換えＤＮＡ分子、部分的
または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子または合成ＲＮＡ分
子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は
、核酸が誘導体化される生物のゲノムＤＮＡ内の核酸に天然に隣接する配列（す
なわち、核酸の５’および３’末端に配置された配列）を有しない。例えば、種
々の実施形態において、単離されたＡＣＥＴＡ核酸分子は、核酸が誘導体化され
る細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に天然に隣接する、約５０ｋｂ未満、約２５
ｋｂ未満、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋ
ｂ未満、約０．５ｋｂ未満または約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得
る。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術
によって産生される場合、他の細胞物質または培養媒体を実質的に含み得ず、ま
たは化学的に合成される際に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含み
得ない。

【００８１】本発明の核酸分子（例えば、ＡＣＥＴＡ：１−１０およびＡＣＥＴＡ：４３〜
５４のいずれかのヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれ
かの相補体を有する核酸分子）は、標準の分子生物学技術および本明細書中に提
供される配列情報を使用して単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブと
してこれらの核酸配列の全てまたは一部を使用して、ＡＣＥＴＡ核酸配列は、標
準のハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離され得
る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ、１９９３に記載される）。

【００８２】本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適切なオ
リゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ
を使用して増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクロ
ーン化され得、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけされ得る。さらに、ＡＣＥＴＡ
ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準合成技術によって、例
えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用して、調製され得る。

【００８３】本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌ
クレオチド残基をいい、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応に使用される十分な数
のヌクレオチド塩基を有する。短鎖オリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列また
はｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはゲノム配列またはｃＤＮＡ配列から設計
され得、特定の細胞または組織内の同一の、同様の、または相補的なＤＮＡもし
くはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにするために使用される。オ
リゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ｎｔ、そして多くとも５０ｎｔ、好まし
くは約１５ｎｔ〜３０ｎｔを有する核酸配列の一部を含む。それらは、化学的に
合成され得、そしてプローブとして使用され得る。

【００８４】別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、ＡＣＥＴＡ：１〜１
０およびＡＣＥＴＡ：４３〜５４に示されるヌクレオチド配列の相補体である核
酸分子を含む。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、これら
の配列のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、または
これらのヌクレオチド配列のいずれかの一部を含む。ＡＣＥＴＡ：１〜１０およ
びＡＣＥＴＡ：４３〜５４に示されるヌクレオチド配列に対して相補的である核
酸分子は、示されるヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸分子であり、そ
の結果、この核酸分子は、示されるヌクレオチド配列に対してほとんどまたは全
くミスマッチすることなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を形成する
。

【００８５】本明細書中で使用される用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドユニット
間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対をいい、
そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または付随のポリペプ
チドまたは化合物またはそれらの組み合わせ間の物理的相互作用または化学的相
互作用を意味する。結合としては、イオン的相互作用、非イオン的相互作用、フ
ァンデルワールス（ＶｏｎｄｅｒＷａａｌｓ）相互作用、疎水性相互作用な
どが挙げられる。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る
。間接的結合は、別のポリペプチドまたは化合物の影響を通し得るか、または別
のポリペプチドまたは化合物の影響に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプ
チドまたは化合物の影響を通して起こらないか、または別のポリペプチドまたは
化合物の影響に起因して起こらない相互作用であるが、代わりに他の実質的な化
学的媒介物を有しない。

【００８６】さらに、本発明の核酸分子は、ＡＣＥＴＡ：１〜１０およびＡＣＥＴＡ：４３
〜５４の核酸配列の一部のみ（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用
され得るフラグメント、またはＡＣＥＴＡの生物学的に活性な部分をコードする
フラグメント）を含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、それぞれ
、核酸の場合には特異的なハイブリダイゼーションを可能にするに十分な長さで
あるか、またはアミノ酸の場合にはエピトープの特異的な認識を可能にするに十
分な長さであり、そしてせいぜい、全長配列よりいくらかの部分が短い、少なく
とも６の（連続した）核酸または少なくとも４の（連続した）アミノ酸の配列と
して規定される。フラグメントは、選択された核酸またはアミノ酸の配列の、任
意の連続した部分から誘導され得る。誘導体とは、ネイティブな化合物から、直
接的にかまたは改変もしくは部分的な置換のいずれかによって形成される、核酸
配列またはアミノ酸配列である。アナログとは、ネイティブな化合物と類似であ
るが同一はない構造を有するが、特定の成分もしくは側鎖に関して、ネイティブ
な化合物とは異なる、核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成的
であっても異なる進化学的起源由来であってもよく、そして野生型と比較して、
類似かまたは逆の代謝活性を有し得る。

【００８７】誘導体およびアナログは、以下に記載されるように、この誘導体またはアナロ
グが改変された核酸またはアミノ酸を含む場合には、全長であっても全長でなく
てもよい。本発明の核酸またはタンパク質の、誘導体またはアナログとしては、
本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同性の領域を含む（種々の実施形態
において、同じ長さの核酸もしくはアミノ酸の配列にわたって、または整列が当
該分野において公知のコンピュータ相同性プログラムによりなされた整列された
配列と比較した場合に、少なくとも約４５％、５０％、７０％、８０％、９５％
、９８％、もしくは９９％さえも同一である（８０〜９９％の同一性が好ましい
））分子、あるいはコードする核酸が、ストリンジェントか、中程度にストリン
ジェントか、または低ストリンジェントな条件下で上記タンパク質をコードする
配列の相補物とハイブリダイズし得る分子が挙げられるが、これらに限定されな
い。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、
ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、１９９３および以下を参照のこと。例示的なプログラ
ムは、デフォルト設定を使用するＧａｐプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅ
ｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８ｆｏ
ｒＵＮＩＸ（登録商標）、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ
、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
）であり、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これは、その全体が
、本明細書中に参考として援用される）を使用する。

【００８８】「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」あるいはその改変体とは、
上で議論したようなヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性により
特徴付けられる、配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＡＣＥＴＡポリペプ
チドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例え
ばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織におい
て発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によりコードされ
得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（哺乳動物が
挙げられるがこれに限定されず、従って例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ
、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物が挙げられ得る）のＡＣＥＴＡポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた
、天然に存在する対立遺伝子改変体、および本明細書中に記載のヌクレオチド配
列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチ
ド配列は、ヒトＡＣＥＴＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない
。相同な核酸配列としては、ＡＣＥＴＡポリペプチドにおける保存アミノ酸置換
（以下を参照のこと）、ならびにＡＣＥＴＡ活性を有するポリペプチドをコード
する、核酸配列が挙げられる。相同なアミノ酸配列は、ヒトＡＣＥＴＡポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードしない。

【００８９】ヒトＡＣＥＴＡ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他
の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＡＣＥＴＡホモログ、ならびに他の
哺乳動物由来のＡＣＥＴＡホモログの同定および／またはクローニングにおいて
使用するために設計される、プローブおよびプライマーの生成を可能にする。こ
のプローブ／プライマーは、代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド
を含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、
ＡＣＥＴＡ配列を含む核酸の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、
２００、２５０、３００、３５０もしくは４００の連続的なセンス鎖ヌクレオチ
ド配列、またはＡＣＥＴＡ配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、
あるいはこれらの配列の天然に存在する変異体の配列とハイブリダイズする、ヌ
クレオチド配列の領域を含む。

【００９０】ヒトＡＣＥＴＡヌクレオチド配列に基づくプローブを使用して、同じかまたは
相同なタンパク質をコードする、転写物またはゲノム配列を検出し得る。種々の
実施形態において、このプローブは、このプローブに付着した標識基をさらに含
む。例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補薬
剤であり得る。ＡＣＥＴＡタンパク質を誤発現する細胞または組織を、例えば被
験体由来の細胞のサンプル中のＡＣＥＴＡコード核酸のレベルを測定すること（
例えば、ＡＣＥＴＡｍＲＮＡレベルの検出またはゲノムＡＣＥＴＡ遺伝子が変
異されたか欠失されたかの決定）により同定するための、診断試験キットの一部
として、このようなプローブを使用し得る。

【００９１】「ＡＣＥＴＡの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、用量依存
ありまたはなしで特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、本発明のポ
リペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが同一である必要はない活性
を示すポリペプチドをいう。「ＡＣＥＴＡの生物学的に活性な部分」をコードす
る核酸フラグメントは、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４の一部（ＡＣＥ
ＴＡの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする）を単離すること、ＡＣ
ＥＴＡタンパク質のコードされた部分を発現すること（例えば、インビトロ組換
え発現による）、およびＡＣＥＴＡのコードされた部分の活性を評価することに
より調製され得る。例えば、ＡＣＥＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分を
コードする核酸フラグメントは、必要に応じて、ＡＴＰ結合ドメインを含み得る
。別の実施形態において、ＡＣＥＴＡの生物学的に活性な部分をコードする核酸
フラグメントは、１つ以上の領域を含む。

【００９２】（ＡＣＥＴＡの改変体）本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、開示されるかまたは参照され
るＡＣＥＴＡヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これら
の核酸は、例えば、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４において示されるよ
うに、ＡＣＥＴＡ核酸を含むヌクレオチド配列によりコードされるＡＣＥＴＡタ
ンパク質と同様のＡＣＥＴＡタンパク質をコードする。

【００９３】ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４に示されるラットＡＣＥＴＡヌクレオ
チド配列に加えて、ＡＣＥＴＡポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導く
ＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者に
よって理解される。ＡＣＥＴＡ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立
遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中
で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＡＣＥＴＡタン
パク質、好ましくは哺乳動物のＡＣＥＴＡタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエ
ーションは、代表的には、ＡＣＥＴＡ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５
％の変動性を生じる。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＡ
ＣＥＴＡの機能的活性を変化させない、ＡＣＥＴＡ内の任意および全てのこのよ
うなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の
範囲内であると意図される。

【００９４】さらに、他の種由来のＡＣＥＴＡタンパク質をコードし、従って、ＡＣＥＴＡ
：１〜１０および４３〜５４のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核
酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＡＣＥＴＡのＤＮ
Ａの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対する核酸分子は、本明細書中に
開示されるヒトＡＣＥＴＡ核酸に対するそれらの相同性に基づいて、ストリンジ
ェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術
に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用
いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＡＣＥＴＡＤＮＡは、ヒトの膜結合Ａ
ＣＥＴＡに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜結合ヒトＡＣ
ＥＴＡＤＮＡは、可溶性ヒトＡＣＥＴＡに対するその相同性に基づいて単離さ
れ得る。

【００９５】従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌ
クレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下でＡＣＥＴＡ：１〜１０お
よび４３〜５４のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の
実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０また
は５００ヌクレオチド長である。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分
子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「
ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションお
よび洗浄のために、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的に
は互いにハイブリダイズしたままである条件下を記載することを意図する。

【００９６】ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＡＣＥＴＡタンパク質をコードする
核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定
のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよ
びクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、ま
たは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。

【００９７】本明細書中で使用される場合、句「ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列に
ハイブリダイズするが、他の配列にはハイブダイズしない条件をいう。ストリン
ジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列
は、より短い配列より、高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリン
ジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特異的な配列についての
温度融点（Ｔｍ）よりも約５℃低い条件が選択される。Ｔｍは、標的配列に相補
的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定
されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）である。標的配列は一般に過剰で存
在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的
には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ
ナトリウムイオン未満、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（ま
たは他の塩）、そして短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例
えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について温度が少なくとも約３０℃、そしてより長
いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃
である条件である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定
化剤の添加により達成され得る。

【００９８】ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出
され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約
７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が
、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、
０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであ
る。このハイブリダイゼーションは、続いて０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳ
Ａ中の５０℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェント条件下でＡＣＥＴＡ
：１〜１０および４３〜５４の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された
核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合
、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク
質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をい
う。

【００９９】第２の実施形態では、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４あるいはそのフ
ラグメント、アナログまたは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程
度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。
中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５
５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度
のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ
およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲＡＮＤＥ
ＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。

【０１００】第３の実施形態では、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４あるいはそれら
のフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に
、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルム
アミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、
１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストランサ
ルフェート中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％Ｓ
ＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシ
ーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーショ
ンについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，
ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯ
ＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，
１９９０，ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ；
Ｓｈｉｌｏら、１９８１，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７
８：６７８９−６７９２を参照のこと。

【０１０１】（保存的変異）集団中に存在し得る、天然に存在するＡＣＥＴＡ配列の対立遺伝子改変体に加
えて、当業者はさらに、変化が、ＡＣＥＴＡタンパク質の機能的能力を変更する
ことなく、ＡＣＥＴＡ核酸に導入され得るかまたはＡＣＥＴＡポリペプチド配列
に直接導入され得ることを理解する。いくつかの実施形態において、ＡＣＥＴＡ
：１〜１０および４３〜５４のヌクレオチド配列は変更され、それによってコー
ドされたＡＣＥＴＡタンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす。例えば
、種々の「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換は
、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４の配列においてなされ得る。「非必須
」アミノ酸残基は、生物学的活性が変更されることなくＡＣＥＴＡの野生型配列
から変更され得る残基であり、しかるに、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活
性のために必要である。例えば、本発明のＡＣＥＴＡタンパク質間で保存されて
いるアミノ酸残基は、特に変更されにくいことが予測される。

【０１０２】さらに、本発明のＡＣＥＴＡタンパク質のファミリーメンバー間で保存されて
いるアミノ酸残基もまた、特に変更されにくいことが予測される。このようなも
のとして、これらの保存的ドメインは、おそらく変異されにくい。しかし、他の
アミノ酸残基（例えば、ＡＣＥＴＡタンパク質のメンバー間で保存的でないか、
または半保存的でしかない残基）は、活性に必須でないかもしれないし、従って
、おそらく変更されにくい。

【０１０３】本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含むＡＣＥＴＡ
タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＡＣＥＴＡタンパク質は
、アミノ酸配列において、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４を含む核酸に
よってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるが、なお生物学的活
性を保持している。１つの実施形態において、単離された核酸分子は、タンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、そのタンパク質は、ＡＣＥＴ
Ａ：１〜１０および４３〜５４を含む核酸によってコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列に対して、少なくとも約４５％相同、より好ましくは、６０％相同
、そしてなおより好ましくは、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、
９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列を含
む。

【０１０４】相同なＡＣＥＴＡタンパク質をコードする単離された核酸分子は、ＡＣＥＴＡ
：１〜１０および４３〜５４を含む核酸のヌクレオチド配列に、１以上のヌクレ
オチドの置換、付加、または欠失を導入することによって作製され得、その結果
、１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が、そのコードされたタンパク質に
導入され得る。

【０１０５】変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘
発）によって、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４を含む核酸に導入され得
る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基でな
される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ
酸残基で置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のフ
ァミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖
（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グ
ルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イ
ソロイシン）、および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、ト
リプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、ＡＣＥＴＡ
中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で
置き換えられる。あるいは、別の実施形態において、変異は、ＡＣＥＴＡコード
配列のすべてまたは一部に沿って無作為に導入され得（例えば、飽和変異誘発に
よって）、そして得られる変異体は、ＡＣＥＴＡ生物学的活性についてスクリー
ニングされて、活性を保持している変異体を同定し得る。核酸の変異誘発の後、
コードされたタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現さ
れ得、そしてそのタンパク質の活性が決定され得る。

【０１０６】１つの実施形態において、変異ＡＣＥＴＡタンパク質は、（１）他のＡＣＥＴ
Ａタンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはその生物学的に活性な部分とタ
ンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力について、（２）変異ＡＣＥＴＡ
タンパク質とＡＣＥＴＡリガンドとの間の複合体形成について；（３）変異ＡＣ
ＥＴＡタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分（例
えば、アビジンタンパク質）に結合する能力について；（４）ＡＴＰを結合する
能力；または（５）ＡＣＥＴＡタンパク質抗体を特異的に結合する能力について
、アッセイされ得る。

【０１０７】他の特定の実施形態において、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。

【０１０８】（アンチセンス）本発明の別の局面は、ＡＣＥＴＡ配列のヌクレオチド配列、またはそのフラグ
メント、アナログ、もしくは誘導体を含む核酸分子に対して、ハイブリダイズ可
能であるかまたは相補的な、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アン
チセンス」核酸は、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であ
るか、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的である、タンパク質をコードする「セ
ンス」核酸に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。特定の局面において、少
なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、もしくは５００ヌクレオチドま
たはＡＣＥＴＡコード鎖全体に対して、あるいはそれらの一部にのみに相補的な
配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。ＡＣＥＴＡタンパク質のフラ
グメント、ホモログ、誘導体、およびアナログをコードする核酸分子、またはＡ
ＣＥＴＡ核酸配列を含む核酸に相補的なアンチセンス核酸をコードする核酸分子
が、さらに提供される。

【０１０９】１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＡＣＥＴＡをコードする
ヌクレオチド配列のコ−ド鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用
語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配
列の領域をいう。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＡＣＥＴＡ
をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード配列」に対してアンチセ
ンスである。用語「非コード配列」とは、アミノ酸に翻訳されないコード領域に
隣接する５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも
いう）。

【０１１０】本明細書中に開示されるＡＣＥＴＡをコードするコード鎖配列が与えられると
、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎよおびＣｒｉｃｋの法則またはＨ
ｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、
ＡＣＥＴＡｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、
ＡＣＥＴＡｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアン
チセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、ＡＣＥＴＡｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり
得る。アンチセンスヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、
３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチ
センス核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学合成または酵素的連結反応
を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的
安定性を増加させるか、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成され
た二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレ
オチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド
が使用され得る）を使用して化学的に合成され得る。

【０１１１】アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセ
チルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシ
メチルアミノメチル２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラ
シル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓ
ｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチ
ルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデ
ニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−
アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキ
シアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎ
ｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−
メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル
−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン（
ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−
チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ
酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオ
ウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（
ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核
酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて
生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、
以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向であ
る）。

【０１１２】本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、または
インサイチュで生成され、その結果それらは、ＡＣＥＴＡタンパク質をコードす
る細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または
それに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば転写および／また
は翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二
重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重
鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ
（ｍａｊｏｒｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本
発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射
が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化す
るように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、ア
ンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまた
は抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセ
ンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に
連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載され
るベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度
を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩプロモーターま
たはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好
ましい。

【０１１３】なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイ
ブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに
平行になる（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ１５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−
ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ１５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナ
ログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳＬｅｔｔ２１５：３２７〜３３０
）を含み得る。

【０１１４】（リボザイムおよびＰＮＡ部分）なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。
リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ
活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補
領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａ
ｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８
５〜５９１に記載される））を使用して、ＡＣＥＴＡｍＲＮＡ転写物を触媒的
に切断し、それによってＡＣＥＴＡｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＡＣＥＴＡ
をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＡＣ
ＥＴＡＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、活性部位
のヌクレオチド配列が、ＡＣＥＴＡをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレ
オチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳＲＮＡの誘導体が
構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；および
Ｃｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＡＣＥ
ＴＡｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ
活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。

【０１１５】あるいは、ＡＣＥＴＡ遺伝子発現は、ＡＣＥＴＡ核酸の調節領域（例えば、Ａ
ＣＥＴＡのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド
配列を標的化し、標的細胞中でＡＣＥＴＡ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構
造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１
）ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ
ら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およ
びＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ１４：８０７〜１５を参照のこ
と。

【０１１６】種々の実施形態において、ＡＣＥＴＡの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン
酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは
可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、
ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ
Ｃｈｅｍ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される用語「ペプチ
ド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格に
よって置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保
持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格
は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイ
ゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記
のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮ
ＡＳ９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド
合成プロトコルを用いて行われ得る。

【０１１７】ＡＣＥＴＡのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。
例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻
害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗
遺伝子剤として使用され得る。例えば、ＡＣＥＴＡのＰＮＡはまた、例えばＰＮ
Ａ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において
；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工
制限酵素として（ＨｙｒｕｐＢ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列およ
びハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら
（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、使用さ
れ得る。

【０１１８】別の実施形態において、ＡＣＥＴＡのＰＮＡは、例えば、それらの安定性また
は細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を
結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソー
ムもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され
得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＡＣＥＴＡのＰ
ＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性
を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ
ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向を
考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ
（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）
上記およびＦｉｎｎら（１９９６）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ２４：３３
５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的
なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そし
て改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）
アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの
５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）ＮｕｃｌＡｃｉｄＲ
ｅｓ１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリ
ングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分
子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメン
トおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔｅｒ
ｓｅｎら（１９７５）ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍＬｅｔｔ５：１１１
９〜１１１２４を参照のこと。

【０１１９】他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を
含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため
）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を
参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３
４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘
発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：
９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変さ
れ得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチ
ド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発
切断剤など）に結合され得る。

【０１２０】（ＡＣＥＴＡポリペプチド）本発明の１つの局面は、単離されたＡＣＥＴＡタンパク質、およびその生物学
的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモ
ログに関する。抗ＡＣＥＴＡ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために
適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、
ネイティブなＡＣＥＴＡタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適
切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施
形態において、ＡＣＥＴＡタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される
。組換え発現に代わるものとして、ＡＣＥＴＡタンパク質またはポリペプチドは
、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。

【０１２１】「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な
部分は、ＡＣＥＴＡタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物
質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場
合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実
質的に含まない」は、タンパク質がそれが単離または組換え産生される細胞の細
胞性成分から分離されている、ＡＣＥＴＡタンパク質の調製物を含む。１つの実
施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＡＣＥＴＡタン
パク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満
（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＡＣＥＴＡタンパク質を約２０％未満、な
おより好ましくは非ＡＣＥＴＡタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましく
は非ＡＣＥＴＡタンパク質を約５％未満有する、ＡＣＥＴＡタンパク質の調製物
を含む。ＡＣＥＴＡタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生さ
れる場合、好ましくは、これはまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培
養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０
％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。

【０１２２】用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が
、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離され
ているＡＣＥＴＡタンパク質調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化
学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＡＣ
ＥＴＡの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体
または非ＡＣＥＴＡ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体ま
たは非ＡＣＥＴＡ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体ま
たは非ＡＣＥＴＡ化学物質を約５％未満有する、ＡＣＥＴＡタンパク質調製物を
含む。

【０１２３】ＡＣＥＴＡタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＡＣＥＴＡタンパク質
より少ないアミノ酸を含み、そしてＡＣＥＴＡタンパク質の少なくとも１つの活
性を示す、ＡＣＥＴＡタンパク質のアミノ酸配列（例えば、ＡＣＥＴＡ１〜１０
および４３〜５４を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列）に十分に相同
なアミノ酸配列、またはＡＣＥＴＡタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ
酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＡＣＥＴ
Ａタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。
ＡＣＥＴＡタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、
５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであり得る。

【０１２４】本発明のＡＣＥＴＡタンパク質の生物学的活性な部分は、ＡＣＥＴＡタンパク
質間で保存された、上記で同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る。Ａ
ＣＥＴＡタンパク質の別の生物学的に活性な部分は、上記で同定されたドメイン
の少なくとも２つを含み得る。ＡＣＥＴＡタンパク質の別の生物学的に活性な部
分は、上記で同定されたドメインの少なくとも３つを含み得る。本発明のＡＣＥ
ＴＡタンパク質のなお別の生物学的に活性な部分は、上記で同定されたドメイン
の少なくとも４つを含み得る。

【０１２５】さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、
組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＡＣＥＴＡタンパク質の機
能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。

【０１２６】いくつかの実施形態では、このＡＣＥＴＡタンパク質は、これらのＡＣＥＴＡ
タンパク質の１つに実質的に相同であり、そして以下に詳細に記載されるように
、天然の対立遺伝子改変または変異誘発に起因してアミノ酸配列がなお異なるが
、その機能的活性を保持する。

【０１２７】特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドの配列に８０％以上同一である
アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含み、このポリペプチドの発現は
、肝毒性因子が投与される哺乳動物において調節される。

【０１２８】（２つ以上の配列間の相同性の決定）２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント類似性を決定するために、
配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２のア
ミノ酸配列または核酸配列との至適な整列のために、第１のアミノ酸配列または
核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌク
レオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中
の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチド
で占められる場合、次いで、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書
中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸
の「同一性」と等価である）。

【０１２９】核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同
性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプロ
グラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得
る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ１９７０ＪＭｏｌＢｉｏｌ
４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（５．
０のＧＡＰ作製ペナルティー、および０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー）を用い
てＧＣＧＧＡＰソフトウェアを用いると、上記で言及される類似の核酸配列の
コード領域は、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４を含むＤＮＡ配列のＣＤ
Ｓ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なく
とも９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を示す。

【０１３０】用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用
語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域に
わたって最適に整列された２つの配列を比較する工程、両方の配列において同一
の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在す
る位置の数を決定し、一致した位置の数を導く工程、この一致した位置の数を、
比較領域における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算する工程、
そして結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導く工程。用語
「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の
特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較
して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一
性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％
の配列同一性を有する配列を含む。

【０１３１】（キメラタンパク質および融合タンパク質）本発明はまた、ＡＣＥＴＡキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する
。本明細書中で使用される場合、ＡＣＥＴＡ「キメラタンパク質」またはＡＣＥ
ＴＡ「融合タンパク質」は、非ＡＣＥＴＡポリペプチドに作動可能に連結された
、ＡＣＥＴＡポリペプチドを含む。「ＡＣＥＴＡポリペプチド」は、ＡＣＥＴＡ
に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、一方、「非ＡＣＥＴＡポ
リペプチド」は、ＡＣＥＴＡタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク
質（例えば、ＡＣＥＴＡタンパク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に
由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。Ａ
ＣＥＴＡ融合タンパク質において、このＡＣＥＴＡポリペプチドは、ＡＣＥＴＡ
タンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＡＣＥＴ
Ａ融合タンパク質は、ＡＣＥＴＡタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性
な部分を含む。別の実施形態では、ＡＣＥＴＡ融合タンパク質は、ＡＣＥＴＡタ
ンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。さらに別の実施形態
では、ＡＣＥＴＡ融合タンパク質は、ＡＣＥＴＡタンパク質の少なくとも３つの
生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結
された」は、ＡＣＥＴＡポリペプチドおよび非ＡＣＥＴＡポリペプチドが、イン
フレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＡＣＥＴＡポ
リペプチドは、ＡＣＥＴＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。

【０１３２】例えば、１つの実施形態では、ＡＣＥＴＡ融合タンパク質は、第２のタンパク
質の細胞外ドメインに作動可能に連結されたＡＣＥＴＡドメインを含む。このよ
うな融合タンパク質は、ＡＣＥＴＡ活性を調節する化合物についてのスクリーニ
ングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載
される）。

【０１３３】なお別の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＡＣＥＴＡ融合タンパク
質であり、ここではＡＣＥＴＡ配列は、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質
は組換えＡＣＥＴＡの精製を容易にし得る。

【０１３４】別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端において異種シグナル配列
を含むＡＣＥＴＡタンパク質である。例えば、ネイティブなＡＣＥＴＡシグナル
配列は除去され、そして別のタンパク質由来のシグナル配列で置換される。特定
の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＡＣＥＴＡの発現および／
または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。

【０１３５】さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のドメインを含むＡＣ
ＥＴＡ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融
合されるＡＣＥＴＡ−免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のＡＣＥＴ
Ａ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物に組み込まれ得、そして被
験体に投与され得、細胞の表面上でＡＣＥＴＡリガンドとＡＣＥＴＡタンパク質
との間の相互作用を阻害し得、これにより、インビボでのＡＣＥＴＡ媒介シグナ
ル伝達を抑制し得る。このＡＣＥＴＡ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用し
て、ＡＣＥＴＡ同族リガンドのバイオアベイラビリティーに影響し得る。ＡＣＥ
ＴＡリガンド／ＡＣＥＴＡ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の
処置ならびに細胞生存を調節する（例えば、促進または阻害する）ために治療的
に有用であり得る。さらに、本発明のＡＣＥＴＡ−免疫グロブリン融合タンパク
質は、被験体中の抗ＡＣＥＴＡ抗体を産生するための免疫原として、ＡＣＥＴＡ
リガンドを精製するために、およびＡＣＥＴＡとＡＣＥＴＡリガンドとの相互作
用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得
る。

【０１３６】本発明のＡＣＥＴＡキメラタンパク質および融合タンパク質は、標準の組換え
ＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列についてのＤ
ＮＡフラグメントコーディングは、従来技術（例えば、連結のための平滑末端ま
たはスタッガー末端を使用すること、制限酵素消化を使用して適切な末端を提供
すること、適切に突出末端を埋めること、アルカリフォスファターゼ処理を使用
して、所望でない接合を避けること、および酵素連結による）に従って、インフ
レームに、共に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成
機を含む従来技術により合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ
増幅は、引き続きアニーリングされそして再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成
し得る２つの連続する遺伝子フラグメントの間で相補的に突出を生じるアンカー
プライマーを使用して行われ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥ
ＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｈ
ｏｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、多くの発現ベ
クターが市販されており、これらは、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチ
ド）をコードしている。ＡＣＥＴＡコード核酸は、そのような発現ベクターへク
ローン化され得、その結果、融合部分は、ＡＣＥＴＡタンパク質にインフレーム
で連結される。

【０１３７】（ＡＣＥＴＡアゴニストおよびＡＣＥＴＡアンタゴニスト）本発明はまた、ＡＣＥＴＡアゴニスト（模倣物）またはＡＣＥＴＡアンタゴニ
ストのいずれかとして機能する種々のＡＣＥＴＡタンパク質に関する。ＡＣＥＴ
Ａタンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、個別の点変異またはＡＣＥＴＡタ
ンパク質の切断）により生成され得る。ＡＣＥＴＡタンパク質のアゴニストは、
ＡＣＥＴＡタンパク質の天然に存在する形態の生物学的な活性と実質的に同じ活
性を保持するかまたは生物学的に活性なサブセットを保持する。ＡＣＥＴＡタン
パク質のアンタゴニストは、例えば、ＡＣＥＴＡタンパク質を含む細胞シグナル
伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することにより、Ａ
ＣＥＴＡタンパク質の天然に存在する形態の１つ以上の活性を阻害し得る。従っ
て、特定の生物学的効果は、制限された機能の改変体で処理することにより誘発
され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学
的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、ＡＣＥＴＡタンパク質
の天然に存在する形態での処置と比較して被験体におけるより少ない副作用を有
する。

【０１３８】ＡＣＥＴＡアゴニスト（模倣物）またはＡＣＥＴＡアンタゴニストのいずれか
として機能するＡＣＥＴＡタンパク質改変体は、ＡＣＥＴＡタンパク質の変異体
（例えば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーをＡＣＥＴＡタンパク
質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによっ
て、同定され得る。１つの実施形態において、ＡＣＥＴＡ改変体の多様化（ｖａ
ｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリーが、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発に
より生成され、そして多様化遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＡＣＥＴ
Ａ改変体の多様化ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を
酵素により連結して遺伝子配列にすることにより生成され得、可能なＡＣＥＴＡ
配列の縮重セットが個々のポリペプチドとしてかまたはその中にＡＣＥＴＡ配列
のセットを含むもっと大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージ
ディスプレイのため）発現可能であるようにする。縮重オリゴヌクレオチド配列
から可能なＡＣＥＴＡ改変体のライブラリーを生成するために使用され得る、種
々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機にて実施
され得、次いで、その合成遺伝子が適切な発現ベクター中に連結され得る。遺伝
子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、可能なＡＣＥＴＡ配列の所望
のセットをコードする配列すべての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチド
を合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９
８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎ
ｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）
Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）ＮｕｃｌＡｃｉｄ
Ｒｅｓ１１：４７７を参照のこと）。

【０１３９】（ポリペプチドライブラリー）さらに、ＡＣＥＴＡタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーが、
ＡＣＥＴＡタンパク質の改変体のスクリーニングおよびその後の選択のために、
ＡＣＥＴＡフラグメントの多様化集団を生成するために使用され得る。１つの実
施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーが、ニック形成が１分
子につき約１回のみしか生じない条件下でヌクレアーゼを用いてＡＣＥＴＡコー
ド配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを処理すること、その二本鎖ＤＮＡを変性さ
せること、そのＤＮＡを再生させて異なるニック形成産物由来のセンス／アンチ
センス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させること、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理
によって再形成した二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および生じたフラグ
メントライブラリーを発現ベクター中に連結することより生成され得る。この方
法により、そのＡＣＥＴＡタンパク質の種々のサイズのＮ末端フラグメントおよ
び内部フラグメントをコードする、発現ライブラリーが誘導され得る。

【０１４０】点変異または短縮により生成されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物につい
てｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技術が当該分
野で公知である。このような技術は、ＡＣＥＴＡタンパク質のコンビナトリアル
変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可
能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に使
用される技術（これは、高スループット分析に従う）としては、代表的には、こ
の遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、生
じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および産物が検
出された遺伝子をコードするベクターの単離が所望の活性の検出により容易にな
る条件下でそのコンビナトリアル遺伝子を発現させることが、挙げられる。反復
アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）（ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を
増大する新規な技術）が、ＡＣＥＴＡ改変体を同定するためにスクリーニングア
ッセイと組合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２
）ＰＮＡＳ８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６：３２７〜３３１）。

【０１４１】（抗ＡＣＥＴＡ抗体）単離されたＡＣＥＴＡタンパク質、あるいはその部分またはフラグメントが、
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的技術を使用
して、ＡＣＥＴＡを結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。
全長ＡＣＥＴＡタンパク質が使用され得るし、あるいは本発明が、免疫原として
の使用のためのＡＣＥＴＡの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＡＣＥＴ
Ａの抗原性ペプチドは、ＡＣＥＴＡ：１〜１０および４３〜５４に示される核酸
配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列のうちの少なくとも８アミノ酸
残基を含み、そしてそのペプチドに対して惹起された抗体がＡＣＥＴＡと特異的
免疫複合体を形成するように、ＡＣＥＴＡのエピトープを含む。好ましくは、そ
の抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも
１５アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、そして最
も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。その抗原性ペプチドにより含
まれる好ましいエピトープは、そのタンパク質の表面上に位置するＡＣＥＴＡの
領域（例えば、親水性領域）である。抗体産生を標的とするための手段として、
親水性および疎水性の領域を示すハイドロパシープロットが、当該分野で周知の
任意の方法（例えば、ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐＷｏｏ
ｄｓ法）が、Ｆｏｕｒｉｅｒ変換を伴ってかまたは伴わずにかのいずれかで、生
成され得る。例えば、ＨｏｏｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：３８２４〜３８２８；ＫｙｔｅおよびＤ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１４２
（各々が、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。

【０１４２】ＡＣＥＴＡポリペプチド、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログまた
はホモログが、これらのタンパク質成分を免疫特異的に結合する抗体の産生にお
いて、免疫原として利用され得る。用語「抗体」とは、本明細書中で使用される
場合、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分
（すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含
む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆ_abフラグメントおよびＦ_(ab)2フラグメント
、ならびにＦ_ab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。当該
分野で公知の種々の手順が、ＡＣＥＴＡタンパク質配列、あるいはその誘導体、
フラグメント、アナログまたはホモログに対する、ポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体の産生のために使用され得る。これらのタンパク質のいくつか
が、下記にて議論される。

【０１４３】ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたは他の動物）が、ネイティブのタンパク質、またはその合成
改変体、あるいは上記の誘導体での注射により免疫され得る。適切な免疫原性調
製物は、例えば、組換え発現されたＡＣＥＴＡタンパク質または化学合成された
ＡＣＥＴＡポリペプチドを含み得る。その調製物はさらに、アジュバントを含み
得る。免疫学的応答を増加するために使用される種々のアジュバントとしては、
フロイント（完全および不完全）アジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アル
ミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、多官能ポリオール、ポリア
ニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバ
ント（例えば、カルメット−ゲラン杆菌およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍ、または類似の免疫刺激因子）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。所望の場合、ＡＣＥＴＡに対する抗体分子が、哺乳動物から（例えば、
血液から）単離され得、そしてさらに、周知技術（例えば、プロテインＡクロマ
トグラフィー）によって精製されて、ＩｇＧ画分が得られ得る。

【０１４４】本願明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」または「モ
ノクローナル抗体組成物」とは、ＡＣＥＴＡの特定のエピトープと免疫反応し得
る抗原結合部位の１つの種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクロ
ーナル抗体組成物は、代表的には、それが免疫反応する特定のＡＣＥＴＡタンパ
ク質に対して、単一の結合親和性を示す。特定のＡＣＥＴＡタンパク質、または
その誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル
抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により抗体分子の生成を提供する任意
の技術が利用され得る。このような技術としては以下が挙げられるがこれらに限
定されない：ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９
７５Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７を参照のこと）；トリオーマ技術
；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３Ｉｍｍｕｎｏｌ
Ｔｏｄａｙ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を生産す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５ＭＯＮＯＣＬＯＮ
ＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡＮＤＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａ
ｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナ
ル抗体は、本発明の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマを用い
ることによって（Ｃｏｔｅら、１９８３．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃ
ｉＵＳＡ８０：２０２６〜２０３０を参照のこと）、またはエプスタインバ
ーウイルスを用いるインビトロでのヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８
５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡＮＤＣＡＮＣＥＲＴ
ＨＥＲＡＰＹ、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁を参照のこと
）によって生成され得る。

【０１４５】本発明に従って、ＡＣＥＴＡタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために、
技術が適応され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）
。さらに、方法は、Ｆ_ab発現ライブラリーの構築に適応され（例えば、Ｈｕｓｅ
ら、１９８９Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）、
ＡＣＥＴＡタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくは
ホモログに対して所望の特性を有するモノクローナルＦ_abフラグメントの迅速か
つ効果的同定を可能にする。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術により「ヒト
化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＡＣＥ
ＴＡタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下を含む
がこれに限定されない当該分野で公知の技術により産生され得る：（ｉ）抗体分
子のペプシン消化によって生成されるＦ_(ab')2フラグメント；（ｉｉ）Ｆ_(ab')2 フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦ_abフラグメン
ト；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理によって生じるＦ_abフ
ラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆ_vフラグメント。

【０１４６】さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクロ
ーナル抗体のような、組換え抗ＡＣＥＴＡ抗体（これらは、標準組換えＤＮＡ技
術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体お
よびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により生
成され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：ＰＣＴ国際出願番
号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特
許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開
番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願
番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：
１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ８４：３４３９〜３４４
３；Ｌｉｕら（１９８７）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；
Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら
（１９８７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１
９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ
ＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１
９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；米国特許第５，２２５，５
３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５５２〜５２５；Ｖ
ｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４；ならびに
Ｂｅｉｄｌｅｒら（１９８８）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１４１：４０５３〜４０６
０。

【０１４７】１つの実施形態において、所望の特異性を有する抗体のスクリーニングのため
の方法は、当該分野で公知の酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および他
の免疫学的に媒介される技術を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態
において、ＡＣＥＴＡタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の
選抜は、このようなドメインを有するＡＣＥＴＡタンパク質のフラグメントに結
合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＡＣＥＴＡタンパク質内の１
以上のドメインに特異的な抗体（例えば、ＡＣＥＴＡファミリータンパク質の上
記で同定された保存された領域、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナロ
グもしくはホモログにわたるドメイン）もまた、本明細書中に提供される。

【０１４８】抗ＡＣＥＴＡ抗体は、ＡＣＥＴＡタンパク質の局在化および／または定量に関
する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサ
ンプル内のＡＣＥＴＡタンパク質のレベルを測定する際の使用のために、診断的
方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）
。所定の実施形態において、ＡＣＥＴＡタンパク質、またはその誘導体、フラグ
メント、アナログもしくはホモログに対する抗体（これらは、抗体由来の結合ド
メインを含む）は、薬理学的に活性な化合物［本明細書中、以降において「治療
剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」］として利用される。

【０１４９】抗ＡＣＥＴＡ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えば、ア
フィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＡＣＥＴＡを単離す
るために用いられ得る。抗ＡＣＥＴＡ抗体は、細胞からの天然ＡＣＥＴＡの精製
、そして宿主細胞において発現された組換え産生されたＡＣＥＴＡの精製を容易
にし得る。さらに、抗ＡＣＥＴＡ抗体を使用して、ＡＣＥＴＡタンパク質の発現
の量およびパターンを評価するために、ＡＣＥＴＡタンパク質を検出し得る（例
えば、細胞溶解物または細胞上清における）。抗ＡＣＥＴＡ抗体は、例えば、所
定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織
におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は
、抗体を検出可能な物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより
容易になり得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光
物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例
としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族
複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン
が挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイ
ン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルア
ミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダン
シルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ル
ミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェ
リンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては¹² ⁵ Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓまたは³Ｈが挙げられる。

【０１５０】（ＡＣＥＴＡ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）本発明の別の局面は、ＡＣＥＴＡタンパク質、またはその誘導体、フラグメン
ト、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは
、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は
、それに連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクター
は、「プラスミド」である。これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る
直鎖状または環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。他の型のベクターは、ウイルス
ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結さ
れ得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自己複製し得る
（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動
物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、
宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿
主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に
連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書におい
て「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用な発現
ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本願明細書において、「プラス
ミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベク
ターであるので、互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果
たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、お
よびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含む
ことを意図する。

【０１５１】本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の
本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列
に作動可能に連結されている、発現に用いられるべき宿主細胞に基づいて選択さ
れる、１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「
作動可能に連結される」とは、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、
またはベクターが宿主細胞に導入される場合には、宿主細胞において）目的のヌ
クレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結
されているという意味を意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハ
ンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含
むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮ
ＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主
細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主
細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的
調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、
所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に
理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本
明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（
融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＡＣＥＴＡタンパク質、ＡＣ
ＥＴＡの変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。

【０１５２】本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＡＣＥＴＡの発現のために設計され得る。例えば、ＡＣＥＴＡは、細菌細胞（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、
酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ、ＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨ
ＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察されてい
る。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列お
よびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。

【０１５３】原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベ
クターは、その中でコードされるタンパク質に（通常、組換えタンパク質のアミ
ノ末端に）多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には
、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させ
ること；（２）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（３）親和
性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の
際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断
部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入され、そして融合タンパ
ク質の精製の後に、組換えタンパク質が融合部分から分離されることを可能にす
る。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、
およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、または
プロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ；ＳｍｉｔｈａｎｄＪｏｈｎｓｏ
ｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。

【０１５４】適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍ
ｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１
ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が
挙げられる。

【０１５５】Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラ
テジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿
主細菌中でタンパク質を発現させることである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮ
ＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジー
は、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用
されるコドンであるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更する
ことである（Ｗａｄａら（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２
０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤ
ＮＡ合成技術によって実行され得る。

【０１５６】別の実施形態において、ＡＣＥＴＡ発現ベクターは、酵母発現ベクターである
。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、
ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：２２９
−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２
）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１
９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐ
ｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ
．）が挙げられる。

【０１５７】あるいは、ＡＣＥＴＡは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細
胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発
現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓ
ｍｉｔｈら（１９８３）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ３：２１５６−２１６５
）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）が挙げられる。

【０１５８】なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤ
Ｍ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２Ｐ
Ｃ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：１８７−１９５）が挙げ
られる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばし
ば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用される
プロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およ
びシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方の
ための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ．第２版
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を
参照のこと。

【０１５９】別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優
先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して
核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切
な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（
肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）ＧｅｎｅｓＤｅｖ１：２６８−
２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８
８）ＡｄｖＩｍｍｕｎｏｌ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター
のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ
Ｊ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８
３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（
１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター
（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ
（１９８９）ＰＮＡＳ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター
（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：９１２−９１６）、お
よび乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４
，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発
生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕ
ｒｉｎｅｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモ
ーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）ＧｅｎｅｓＤｅｖ
３：５３７−５４６）。

【０１６０】本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分
子は、ＡＣＥＴＡｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（
ＤＮＡ分子の転写によって）可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される
。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結されて、種々の
細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、調節配列が
選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、ま
たは細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエン
ハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換
えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、こ
こではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、
ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用
する遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅＲＮＡａｓａｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｏｏｌｆｏｒｇｅｎ
ｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−−ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。

【０１６１】本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのよ
うな細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境
的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、
このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細
書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。

【０１６２】宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ａ
ＣＥＴＡタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母ま
たは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または
ＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。

【０１６３】ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して
原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合
、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例え
ば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技術をい
うことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、
ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエ
レクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクシ
ョンするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬ
ＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ．第２版、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得
る。

【０１６４】哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベク
ターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来
ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定お
よび選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）を
コードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。
種々の選択可能なマーカーには、薬物に対する耐性を付与するもの（例えば、Ｇ
４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）が含まれる。選択可能な
マーカーをコードする核酸は、ＡＣＥＴＡをコードするベクターと同じベクター
上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導
入された核酸で安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定さ
れ得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残り、一方
、他の細胞は死滅する）。

【０１６５】本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細
胞）は、ＡＣＥＴＡタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得
る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＡＣＥＴＡタンパ
ク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、
ＡＣＥＴＡタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（
ここに、ＡＣＥＴＡをコードする組換え発現ベクターが導入された）を培養する
工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細
胞からＡＣＥＴＡを単離する工程を包含する。

【０１６６】（薬学的組成物）本発明のＡＣＥＴＡ核酸分子、ＡＣＥＴＡタンパク質、および抗ＡＣＥＴＡ抗
体（これはまた、本明細書中で「活性化合物」として参照される）、ならびにそ
れらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学
的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパ
ク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用
される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任
意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張
剤および吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｄｅｌａｙｉｎｇａｇｅｎｔ）
などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野の標準的な参考本で
あるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ｓの最新版（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リン
ガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液および
５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームお
よび不揮発性油のような非水性ビヒクルがまた、使用され得る。薬学的に活性な
物質に対する、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任
意の従来の媒体または薬剤が、この活性化合物と不適合である限りを除いて、こ
の組成物におけるそれらの使用が意図される。補助活性化合物もまた、組成物へ
組み込まれ得る。

【０１６７】本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方され
る。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口
（例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａ
ｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために
使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水
溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコー
ルまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパ
ラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸
化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレートまた
はホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど
の張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸また
は塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジあるいは
ガラスまたはプラスチックから作製される多用量のバイアル中に入れられ得る。

【０１６８】注入使用に適した薬学的組成物は、無菌の水溶液（ここで、水溶性）または水
性分散液、および無菌の注入可能な溶液または分散液の即座調製のための無菌粉
末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌性
水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ^TM（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．
）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合におい
て、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂ
ｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保
存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚
染作用から保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶
媒または分散媒体であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロ
ール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならび
にそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティン
グの使用によって、分散液の場合、要求される粒子サイズを維持することによっ
て、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防
止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、
フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多く
の場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソ
ルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注
入可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸
アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る
。

【０１６９】必要な場合、上記に列挙した成分の１つまたはその組み合わせとともに、必要
な量の適切な溶媒中に、活性化合物（例えば、ＡＣＥＴＡタンパク質、または抗
ＡＣＥＴＡ抗体）を組み込むこと、次いで濾過滅菌することにより、滅菌注射可
能溶液を、調製し得る。一般に、活性化合物を、基礎的分散媒体および上記に列
挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより、
分散液を調製する。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方
法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、その事前に濾過滅菌した溶
液から活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末を生成する。

【０１７０】経口組成物は、一般に不活性希釈液または食用キャリアを含む。それらは、ゼ
ラチンカプセルに封入されるか、または錠剤中に圧縮され得る。経口治療投与の
目的のため、活性化合物を、賦形剤とともに組み込み得、そして錠剤、トローチ
剤、またはカプセル剤の形態で用い得る。経口組成物はまた、うがい薬としての
使用のための流体キャリアを用いて調製され得る。ここで流体キャリア中の化合
物は、経口適用され、そして振り落とされ、そして吐き出されるかまたは飲み込
まれる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の
一部として含まれ得る。この錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下
の成分のうちのいずれかまたは類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロ
ース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクト
ースのような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチの
ような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢
剤；コロイド二酸化ケイ素のようなグリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロース
またはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、も
しくはオレンジ香料のような香料。

【０１７１】吸入による投与のために、この化合物は、適切なプロペラント（例えば、二酸
化炭素のようなガス）を含む、加圧容器またはディスペンサーから、またはネブ
ライザーから、エアーゾルスプレーの形態で送達される。

【０１７２】全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により投与され得る。経粘膜投与
または経皮投与のために、透過されるべき関門に適切な浸透剤が処方物中に用い
られる。このような浸透剤は、当該分野で一般に公知であり、そして例えば、経
粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。
経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与
のためには、活性化合物が、当該分野で通常公知のように、軟膏剤（ｏｉｎｔｍ
ｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。

【０１７３】化合物はまた、（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の
坐剤基剤を伴う）坐剤または直腸送達のための滞留浣腸剤の形態で調製され得る
。

【０１７４】１つの実施形態において、活性な化合物を、身体からの迅速な排泄に対してこ
の化合物を保護するキャリアと共に調製する（例えば、徐放性処方物（ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄｒｅｌｅａｓｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））。これには、イン
プラントおよびマイクロカプセル化送達系が挙げられる。生分解性、生体適合性
ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコ
ール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。
このような処方物の調製の方法は、当業者に明白である。この物質はまた、Ａｌ
ｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ，Ｉｎｃ．から購入され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノ
クローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬
学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば、米国特許第
４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従って調製され得
る。

【０１７５】投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口組成物または非経口組成物
を投与量単位形態に処方することが特に有利である。本明細書において用いられ
る場合、投薬量単位形態とは、処置されるべき被験体のための単位投与量として
適合した物理的に別々の単位をいう。ここで各単位は、必要な薬学的キャリアと
関連して所望の治療的効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含
む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の特有の特徴、および
達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のための活性化合物のよう
な合成の分野で固有の制限により示され、そしてこれに依存する。

【０１７６】本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、そして遺伝子治療ベクターとして
用いられ得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特
許第５，３２８，４７０号を参照のこと）により、または定位注射（例えば、Ｃ
ｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４〜３０５７を参照のこと）によ
り、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な
希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または徐放性マトリックス（この
中に遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている）を含み得る。あるいは、完全な遺
伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで生成され得る場合（例えば、
レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じる１つ以上の
細胞を含み得る。

【０１７７】薬学的組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パックまたはディスペ
ンサーに含まれ得る。

【０１７８】（ＡＣＥＴＡ核酸を同定するためのキットおよび核酸収集物）別の局面において、本発明は、薬剤の肝毒性を試験するのに有用なキットを提
供する。このキットは、２つ以上のＡＣＥＴＡ配列を検出する核酸を含み得る。
好ましい実施形態において、このキットは、ＡＣＥＴＡ核酸配列の３，４、５、
６、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００または全てを検出する試
薬を含む。

【０１７９】本発明はまた、１つ以上のＡＣＥＴＡ応答性核酸配列を同定し得る単離された
複数の配列を含む。

【０１８０】このキットまたは複数の配列は、例えば、ＡＣＥＴＡ核酸配列に相同な配列、
または１つ以上のＡＣＥＴＡ核酸配列を特異的に同定し得る配列を含み得る。

【０１８１】（他の実施形態）本発明は、その詳細な記載と組み合わせて記載されているが、前述の記載は、
前述の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を例示することを意図して
いるが、限定するものではないことが理解されるべきである。他の局面、利点お
よび改変は、前述の特許請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 ＭＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 15/00 Ｆ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ミルロイ，ローラアメリカ合衆国コネチカット 06405，ブランフォード，ブルシャイプレインロード 175，ビルディング３アパートメントビー３ (72)発明者ダニエルス，ケリーケイ．アメリカ合衆国コネチカット 06405，ブランフォード，メノーウッドドライブ 15 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 FB02 4B024 AA11 BA80 CA04 GA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA05 QA18 QA19 QQ08 QQ13 QQ53 QR32 QR56 QR59 QR77 QR80 QR82 QS34 QS38 4B065 AA26X AA80X AA90X AA91Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 DA75 EA31 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】肝毒性について試験薬剤をスクリーニングする方法であって
、該方法は、以下；（ａ）ＡＣＥＴＡ：１〜１６９および１７０からなる群より選択される１以上
の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程；（ｂ）該試験細胞集団を、試験薬剤と接触させる工程；（ｃ）該試験細胞集団における１以上の該核酸配列の発現を測定する工程；（ｄ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、参照細胞集団における該
核酸配列の発現と比較する工程であって、該参照細胞集団は、肝毒性因子への曝
露状態が既知である少なくとも１つの細胞を含む、工程；および（ｅ）該試験細胞集団および該参照細胞集団における該ＡＣＥＴＡ配列の発現
レベルにおける差異が存在する場合、該差異を同定する工程、を包含し、それによって肝毒性について該試験薬剤をスクリーニングする、方法
。
【請求項２】１５以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記試験細胞集団における前記核酸配列の発現が、前記参照
細胞集団と比較して減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記試験細胞集団における前記核酸配列の発現が、前記参照
細胞集団と比較して増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記試験細胞集団がインビトロで提供される、請求項１に記
載の方法。
【請求項６】前記試験細胞集団が、哺乳動物被験体からエキソビボで提供
される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記試験細胞集団が、哺乳動物被験体においてインビボで提
供される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記試験細胞集団が、ヒト被験体またはげっ歯類被験体由来
である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記試験細胞集団が肝細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記試験薬剤が非ステロイド性抗炎症薬である、請求項１
に記載の方法。
【請求項１１】前記非ステロイド性抗炎症薬がアセトアミノフェンである
、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】被験体における試験薬剤の肝毒性を評価する方法であって
、該方法は、以下：（ａ）ＡＣＥＴＡ：１〜１６９および１７０からなる群より選択される１以上
の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を、該被験体から提供する工程
；（ｂ）該試験細胞集団を、試験薬剤と接触させる工程；（ｃ）該試験細胞集団における１以上の該核酸配列の発現を測定する工程；お
よび（ｄ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、参照細胞集団における該
核酸配列の発現と比較する工程であって、該参照細胞集団は、肝毒性因子に対す
る曝露状態が既知である少なくとも１つの細胞を含む、工程；（ｅ）該試験細胞集団および該参照細胞集団における該核酸配列の発現レベル
における差異が存在する場合、該差異を同定する工程、を包含し、それによって該被験体における該試験薬剤の肝毒性を評価する、方法
。
【請求項１３】前記試験細胞集団における前記核酸配列の発現が、前記参
照細胞集団と比較して減少する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記試験細胞集団における前記核酸配列の発現が、前記参
照細胞集団と比較して増加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】前記被験体が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項１２に
記載の方法。
【請求項１６】前記試験細胞集団が、前記被験体からエキソビボで提供さ
れる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】前記試験細胞集団が、前記被験体からインビボで提供され
る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】被験体における肝毒性への感受性を診断または決定する方
法であって、該方法は、以下：（ａ）ＨＥＰＡＴＯ：１〜１６９および１７０からなる群より選択される１以
上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を、該被験体から提供する工
程；（ｂ）該試験細胞集団における１以上の該核酸配列の発現を測定する工程；な
らびに（ｃ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、参照細胞集団における該
核酸配列の発現と比較する工程であって、該参照細胞集団は、肝毒性を患ってい
ない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む、工程；ならびに（ｄ）該試験細胞集団および該参照細胞集団における該核酸配列の発現レベル
における差異が存在する場合、該差異を同定する工程、を包含し、それによって該被験体における肝毒性への感受性を診断または決定す
る、方法。
【請求項１９】前記肝毒性が、前記被験体において中心周囲肝臓壊死を生
じる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】ＡＣＥＴＡ１〜１０、４３〜５３、および５４の核酸ま
たはそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列を含む、単離された核酸
。
【請求項２１】請求項２０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２２】請求項２１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２３】請求項２０に記載の核酸によってコードされる、ポリペプ
チド。
【請求項２４】請求項２３に記載のポリペプチドに対して特異的に結合す
る、抗体。
【請求項２５】ＡＣＥＴＡ：１〜１６９および１７０からなる群より選択
される、２以上の核酸配列を検出する、キット。
【請求項２６】ＡＣＥＴＡ：１〜１６９および１７０からなる群より選択
される、１以上の核酸を検出する、アレイ。
【請求項２７】ＡＣＥＴＡ：１〜１６９および１７０からなる群より選択
される、１以上の核酸を含む、複数の核酸。