JP2003514957A - 共有結合性カップリングの方法 - Google Patents

共有結合性カップリングの方法

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JP2003514957A
JP2003514957A JP2001539506A JP2001539506A JP2003514957A JP 2003514957 A JP2003514957 A JP 2003514957A JP 2001539506 A JP2001539506 A JP 2001539506A JP 2001539506 A JP2001539506 A JP 2001539506A JP 2003514957 A JP2003514957 A JP 2003514957A
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alditol
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オーレ・ラールム
イブラヒーム・ガウダ
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メディカーブ・アクチエボラーグ
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Abstract

(57)【要約】 ヘパリン、ヘパリン誘導体、少なくとも部分的に脱アセチル化されたデルマタン硫酸及びデキストラン硫酸から選ばれた多糖類と第一級アミノ基を含む固形物質との共有結合性カップリングによる複合体の製造方法であって、ａ）糖類の末端単糖単位がアルジトールに転化されるように糖類を還元する工程；ｂ）工程ａ）で形成されたアルジトールを過ヨウ素酸酸化して、ヒドロキシル及びアミノ基から選ばれる２つの隣接基の間の単糖単位を切断して末端アルデヒド基を形成する工程；及びｃ） アルデヒド基を通して前記アルジトールを固形基体のアミノ基へ還元カップリングする工程：を特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、オリゴ糖類又は多糖類とアミノ化された基体（substrate）との複
合体の製造に関する。また、本発明は、これによって得られた生成物を包含する
。
【０００２】
【発明の背景】
基体への糖類の共有結合性カップリングは、主として２つの異なる方法、一つ
は、いわゆる「終点付加（end−point attachment）」（ＥＰＡ）により、もう
一つは、いわゆる「多点付加（multipoint attachment）」（ＭＰＡ）により実
施することができる。第１の場合は、糖末端の還元単糖単位を通して糖類をカッ
プリングする。第２の場合は、多糖類に関するのもので、多糖内のいくつかの単
糖単位を通してカップリングする。自然界に存在するほとんどの高分子炭水化物
は、他のいくつかの高分子化合物とカップリングして、それらの還元単糖単位を
通して固定されており、このような天然の複合体は、例えば糖タンパク質、糖脂
質、プロテオグリシン及びリポ多糖類である。
【０００３】 「終点付加」によるカップリングでは、「多点付加」とは対照的に、高度に固
定された状態の分子がその本来のコンフォメーションを保っており、これによっ
て特に他の分子、例えば血漿タンパク、増殖因子、抗体、レクチン及び酵素と相
互作用する能力が維持されている。
【０００４】 アミノ化された基体への多糖類の還元カップリングについて、末端の還元単糖
単位にアルデヒド官能基を使用する試みが行われてきた。しかし、これらのアル
デヒド官能基は、セミアセタールとして存在し、アルデヒド官能基の反応性が極
めて低く、ほとんどの場合、許容できないほど低いカップリング収率になる。
【０００５】 アミノ化された表面への多糖類の「終点付加」についての有用な方法は、米国
特許第4,613,665号中に記載されている。
【０００６】 この知られている方法は、Ｄ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミン単位含む
多糖、例えばヘパリンを酸の環境中で亜硝酸ナトリウムを用いて部分的に分解す
ることによって簡潔に構成されている。これにより、還元末端単位として２,５
−アンヒドロ−Ｄ−マンノース単位が形成される。この還元末端単位は、セミア
セタール形成に関与しない反応性アルデヒド官能基を有しており、このため、そ
のアルデヒド基は、還元アミノ化により高収率で第一級アミノ基を含む基体にカ
ップリングすることができる。
【０００７】 この知られている方法は、以下に記載するある種の欠点を伴う。 その方法では、多糖類は、誘導体化されてないジアゾ化できる第一級アミノ基
を有するＤ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミン単位を含む必要がある。
【０００８】 活性化の際、分子は分解し、ある種の用途では生物活性が失われるか又は実質
的に減少する。 また、その方法では、分解で形成された分子の半分でしかカップリング可能な
還元末端を得られない。
【０００９】
【発明の開示】
本発明の主な目的は、先行技術の欠点が取り除かれるか又は少なくとも本質的
に緩和される新たな方法を提供することである。 本発明のさらにもう一つの目的は、アミノ化された基体へカップリングする物
質が、カップリング法に伴って分解又は損傷を受けず、基体へのカップリングが
起こった後、物質の性質が実質的に変化しない方法を提供することである。
【００１０】 本発明のさらにもう一つの目的は、全ての分子がカップリングにより製造され
、これによってカップリング反応における収率が先行技術と比較して実質的に改
善された方法を提供することである。 本発明のもうひとつの目的は、アミノ化された基体への「終点カップリング」
を含む方法を提供することである。
【００１１】 これらの目的と以下の開示から明らかになる別の目的のため、本発明により、
ヘパリン、ヘパリン誘導体、少なくとも部分的に脱アセチル化されたデルマタン
硫酸及びデキストラン硫酸から選ばれた多糖と第一級アミノ基を含む固形物質と
の共有結合性カップリングによって複合体を製造する方法が提供される。従って
、本発明に係る方法は、 ａ）末端の単糖単位がアルジトールに転化されるように糖を還元する工程； ｂ）工程ａ）で形成されたアルジトールを過ヨウ素酸酸化してヒドロキシル基
及びアミノ基から選ばれる２つの隣接基の間の単糖単位を切断して末端アルデヒ
ド基を形成する工程；及び ｃ）アルデヒド基を通して前記アルジトールを固形基体のアミノ基へ還元カッ
プリングする工程： を特徴とする異種の反応特性からなる方法である。
【００１２】 上の工程ａ）における還元は、水素化ホウ素、触媒還元剤及びラネーニッケル
から選ばれる還元剤で適切に実施される。特に工程ａ）の還元は、水素化ホウ素
、特に水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ホウ素カリウムを用いて実施するのが
好ましい。
【００１３】 上の工程ｂ）における酸化については、過ヨウ素酸又はそのナトリウム塩もし
くはカリウム塩を用いて適切に実施される。
【００１４】 上の工程ｃ）における還元カップリングは、シアノボロハイドライド、例えば
ナトリウムシアノボロハイドライド又はカリウムシアノボロハイドライドを用い
て適切に実施される。
【００１５】 従って、本発明に係る方法の好ましい実施態様とは、工程ａ）の還元は、水素
化ホウ素ナトリウムを用いて実施し、工程ｂ）の酸化は、過ヨウ素酸ナトリウム
を用いて実施し、そして工程ｃ）の還元カップリングは、ナトリウムシアノボロ
ハイドライドを用いて実施することである。
【００１６】 本発明に係る方法は、生物活性を有する多糖類と共に用いることに特に適して
いる。したがって、多糖はヘパリン、ヘパリン誘導体、少なくとも部分的に脱ア
セチル化されたデルマタン硫酸及びデキストラン硫酸から選ぶことができる。 特に好ましい多糖類は、ヘパリン及びヘパラン硫酸である。
【００１７】 基体の特性に関して、基体の例として例えばポリエチレンイミン又はキトサン
の表面コーティングを有するアミノ化されたプラスチック物体を挙げることがで
きる。好ましい表面コーティングは、キトサンであり、これは脱アセチル化され
たキチン質としてその中に、本発明に関連するカップリング技術に適した第一級
アミノ基を含んでいる。
【００１８】 また、本発明は、上で定義された方法によって製造された複合体を包含する。 本発明に係る方法に包含される反応の、反応機構のよりよい解釈については、
これからさらに明らかにされるであろう。
【００１９】 上の工程ｂ）の過ヨウ素酸酸化には、環状エステルの形成が含まれ、次にこれ
が切断され、とりわけ下の式Ｉ
【化１】 に従って２つのアルデヒド官能基が生じる。
【００２０】 過ヨウ素酸酸化による隣接ジオールの切断は、以前から知られているが、知ら
れている限り、以前に本発明の糖類に固定化に適用されたことはない。反応にお
いて、立体因子は、どの異なる隣接ジオールが過ヨウ素酸により切断されるかに
よって速度における決定的な影響を有する。
【００２１】 したがって、フラノシド及びピラノシド中のシス配向を有する隣接ＯＨ−基は
、トランス配向を有するものよりもより速やかに切断される。堅牢な系中のある
種のトランス−ジオールは、過ヨウ素酸酸化に対して抵抗性がある。非環式ジオ
ールは、一般に環式化合物より速やかに酸化され、そしてスレオ配置のものは、
エリスロ配置のものよりも速やかに酸化される。
【００２２】 ヘパリンに関して本発明を以下に説明するが、本発明がそれに制限されるわけ
ではない。下の式II
【化２】 は、ヘパリン分子内部の代表的な部分を記載している。Ｒがアセチルである左側
のＤ−グルコサミン単位は、過ヨウ素酸塩で酸化することができない。他の単位
のうち、グルクロン酸単位だけしか酸化できないが、しかしトランス−ジエクア
トリアル配向したジオールを含んでおり、酸化するのが困難である。
【００２３】 約７０００〜約２５０００の分子量を有する天然ヘパリン中の分子の主要部分
には、末端に以下： −−4）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＲ−（1−−４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ （式中、Ｒは、アセチル又は−ＳＯ3Ｈである）の配列が含まれる。
【００２４】 末端基は、下の式IIIのアルジトールに還元することができ、ｐＨ値は高く適
切に維持されているので酸がラクトン化されることはない。慎重な過ヨウ素酸酸
化により、好ましくはスレオ−グリコール基が酸化され、末端アルデヒド基を含
む式VIの化合物が得られる。
【化３】
【００２５】 反応をさらに進めると、おそらくＣ−原子５のアルデヒド官能基を形成するこ
とができる。
【００２６】 次に、関連した多糖類を、下の式Ｖ
【化４】 に従って還元アミノ化することによって第一級アミノ基を含む固形基体にカップ
リングする。
【００２７】 類似の方法で、例えばキトサンを、下の式VI
【化５】 による「終点」カップリングにより固定することができる。
【００２８】 ここで、隣接して配向しているアミノ基とヒドロキシル基は、下の式VII
【化６】 に従って過ヨウ素酸塩により酸化される。
【００２９】 本発明に含まれる反応は、添付のスキームに示される式による。環内のＰは、
ポリマー又は多糖を示しているが、末端単位の構造しか記載されていない。６位
のＣＯＯＨは、末端グルクロン酸単位を有する多糖類に相当するが、６位のＣＨ 2 ＯＨは、末端位にグリコサミン単位を有する多糖類に相当する。
【００３０】 本発明によるカップリング技術は、本質的に、糖類の本来の性質、例えば生物
活性を維持しながらアミノ化された固形基体に多糖類を固定する可能性に基づい
て構成されている。
【００３１】 本発明を、以下において、非限定的な実施例によってさらに説明するが、その
際、特記しない限り、部及びパーセンテージは、重量による。
【００３２】 実施例１ 天然ヘパリンの還元−酸化による活性化 水素化ホウ素ナトリウム（２２５mg）を、蒸留水（１５０mL）に溶解した。天
然ヘパリンのナトリウム塩（ブタ粘膜、Kabi Vitrum、３ｇ）を加え、反応混合
物を撹拌下で１８時間放置した。１０Ｌの蒸留水に対して１８時間透折した後、
還元されたヘパリンを凍結乾燥したところ、収量は２.９ｇであった。
【００３３】 還元されたヘパリン（２.９ｇ）を、２５０mLのイミダゾール緩衝液、４０mm
、ｐＨ ６.５中に溶解した。また、過ヨウ素酸ナトリウム（６４０mg）を２５０
mLイミダゾール緩衝液、４０mm、ｐＨ６.５中に溶解した。２つの溶液を混合し
、氷上０℃でホイルに取り囲まれたフラスコ中に撹拌下で５分間放置した。次に
、過剰の過ヨウ素酸塩を破壊するため、１mLグリセロールを加え、溶液を撹拌下
で１時間放置した。次に、反応混合物を１０Ｌの蒸留水に対して１８時間透析し
、最終的にヘパリンを凍結乾燥した。活性化ヘパリン（ＲＯ−ヘパリン）の収率
は、２.４ｇであった。
【００３４】 実施例２ 亜硝酸を用いたヘパリンの分解 ヘパリン（ブタ粘膜、Kabi Vitrum）を水（３００mL）中に溶解した。溶液を
冷やして氷−水中で０℃に維持した。そして、最初に亜硝酸ナトリウム（ＮａＮ
Ｏ2、１０mg）及び次に酢酸（２mL）を、撹拌下の溶液に加えた。反応混合物を
２時間０℃に維持し、透析して凍結乾燥した。分解したヘパリンの収率は、０.
７ｇであった。
【００３５】 実施例３ 天然のヘパリンの過ヨウ素酸酸化 典型的な例では、ヘパリン中の１０％の単糖単位を酸化する場合、天然ヘパリ
ン（ブタ粘膜、Kabi Vitrum、５ｇ）を水（１００mL）中に溶解し、過ヨウ素酸
ナトリウム（Ｃ、５ｇ）を加えた。溶液を暗所にて室温で２４時間保持した。反
応混合物を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥してジアルデヒド官能基を含むヘパ
リン誘導体４.２ｇを形成した。
【００３６】 実施例４ ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたポリエチレン表面のアミノ化 ポリエチレン表面（ポリエチレン膜）を濃硫酸中の過マンガン酸ナトリウム２
％（ｗ／ｖ）溶液を用いて室温で２分間処理し、次に蒸留水で注意深くすすいだ
。ポリエチレンイミンＳｎ（ＰＥＩ、ボレート緩衝液中０.０５%、ｐＨ９.０）
と共にクロトンアルデヒド（ボレート緩衝液中０.０３４%、ｐＨ９.０）を用い
てポリマー表面を室温で処理した。
【００３７】 ポリマー表面を大量の蒸留水で注意深くすすぎ、デキストラン硫酸（Pharmaci
a）、０.１５Ｍ ＮａＣｌ中０.１ｇ／Ｌ、ｐＨ３.０の溶液を用いて５５℃で１
０分間処理した。ポリマー表面を再び大量の蒸留水で注意深くすすぎ、ポリエチ
レンイミンＳｎ（ＰＥＩ、ボレート緩衝液中０.０５%、ｐＨ９.０）と共にクロ
トンアルデヒド（ボレート緩衝液中０.０３４%、ｐＨ９.０）を用いてポリマー
表面を室温で処理した。次に上記に従ってデキストラン硫酸を用いた処理を繰り
返し、表面を注意深く蒸留水ですすぎ、ｐＨ９.０（１Ｍ ＮａＯＨで調節した）
で０.０５％ＰＥＩ溶液を用いて室温で１０分間処理してから再び洗浄した。ア
ミノ基の存在は、指示薬（poinceau S, Sigma）で確認した。
【００３８】 実施例５ キトサンを用いたポリエチレン表面のアミノ化 ＰＥＩの代わりに水中の１５％（０.２５ｗ／ｖ）のＮ−アセチル化度を有す
るキトサン溶液を用い、この溶液で処理した後の表面を水の代わりにエタノール
（８０％ｖ／ｖ）ですすいだことを除いて、ポリエチレン表面を実施例４と同様
に処理した。アミノ基の存在は、実施例４と同様にして確認した。
【００３９】 実施例６ 軟質ポリエチレン管へのＲＯ−ヘパリンのカップリング ポリエチレン管（１ｍ、内径１.８mm）を実施例４に記載された方法でアミノ
化した。次に、実施例１に従って製造したＲＯ−ヘパリン（５００mL、０.０２
５％ｗ／ｖ）及びナトリウムシアノボロハイドライド（０.１５Ｍ ＮａＣｌ中０
.００３％ｗ／ｖ、ｐＨ３.９）を用いて管を５０℃で２時間処理し、蒸留水及び
最終的にボレート緩衝液（ｐＨ９.０）で洗浄した。ポリエチレン管上のヘパリ
ンの存在は、指示薬、トルイジンブルーを用いて視覚化し、硫酸化された多糖類
の存在下ではライラック色を示す。
【００４０】 実施例７ 軟質ポリエチレン管への亜硝酸分解されたヘパリンのカップリング このカップリングは、上の実施例６に従って実施したが、変更したのは実施例
２に従って製造した亜硝酸分解されたヘパリンをカップリングに用いたことであ
る。このカップリング技術を関する詳細に関しては、米国特許第4,613,665号を
参照のこと。
【００４１】 実施例８ 過ヨウ素酸酸化されたヘパリンの軟質ポリエチレン管へのカップリング このカップリングは、上記を実施例６に従って実施したが、変更したのは、実
施例３に従って製造した過ヨウ素酸酸化されたヘパリンをカップリング法に用い
たことである。
【００４２】 実施例９ ＡＴ−取込みの比較研究 アンチトロンビン（ＡＴ）を結合するヘパリン表面の能力は、変化を受けてな
いＡＴ−結合配列を有するヘパリン分子の密度を反映しており、表面の非トロン
ボゲン形成性の基準となる。アンチトロンビンを結合する能力が大きいほど、ヘ
パリンの生物活性に関して表面がより良好となる。
【００４３】
【表１】 表 対照* 実施例６ 実施例７ 実施例８ ＡＴ(pmol／cm2) 0.02 2.8 2.6 0.9 ＊ 未処置の管を用いた対照。
【００４４】 実施例１０ 還元−酸化により活性化されたデキストラン硫酸のポリエチレン膜へのカップリ
ング 水素化ホウ素ナトリウム（２２５mg）を、蒸留水（１５０mL）中に溶解した。
デキストラン硫酸のナトリウム塩（４ｇ、Pharmacia）を加え、反応混合物を１
８時間、撹拌下で放置した。１０Ｌの蒸留水に対して１８時間透折した後、還元
されたデキストラン硫酸（ヘパリノイド）を凍結乾燥したところ、収率は３.５
ｇであった。還元されたデキストラン硫酸（３.０ｇ）を、２５０mLイミダゾー
ル緩衝液、４０mm、ｐＨ６.５中に溶解した。また、過ヨウ素酸ナトリウム（６
４０mg）を、２５０mLイミダゾール緩衝液、４０mm、ｐＨ６.５中に溶解した。
２つの溶液を混合し、氷上０℃でホイル中に包んだフラスコ中に撹拌しながら５
分間放置した。次に、過剰の過ヨウ素酸塩を破壊するため１mLのグリセロールを
加え、溶液を撹拌下で１時間放置した。
【００４５】 反応混合物を１０Ｌの蒸留水に対して１８時間透析し、生成物を最終的に凍結
乾燥した。ＲＯ−ヘパリノイドの収率は、２.５ｇであった。
【００４６】 ＲＯ−ヘパリノイドを、実施例４に従って製造したアミノ化されたポリエチレ
ン膜にカップリングさせ、カップリングは、実施例６の説明と同様にして実施し
た。ポリエチレン膜上のデキストラン硫酸の存在は、指示薬、トルイジンブルー
を用いて視覚化し、硫酸化された多糖類の存在下ではライラック色を示した。カ
ップリング収率は、約５mg／cm2（ＦＴＩＲを用いて測定した）であった。
【００４７】 本発明は、上記実施態様及び実施例に制限されない。その理由は、方法が、末
端還元単糖単位を有する全てのタイプのオリゴ糖類及び多糖類を全ての形態の第
一級アミノ基を含む基体へ共有結合性カップリングするのに適用できるからであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C090 AA05 BA66 BA68 BB17 BB33 BB36 BB53 BB54 CA31 4H039 CA10 CB40 4J031 AA02 AA57 AB06 AC09 BA22 BB03 BC11 BD03

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヘパリン、ヘパリン誘導体、少なくとも部分的に脱アセチル
    化されたデルマタン硫酸及びデキストラン硫酸から選ばれた多糖類と第一級アミ
    ノ基を含む固形物質との共有結合性カップリングによる複合体の製造方法であっ
    て、 ａ）糖類の末端単糖単位がアルジトールに転化されるように糖類を還元する工
    程； ｂ）工程ａ）で形成されたアルジトールを過ヨウ素酸酸化して、ヒドロキシル
    及びアミノ基から選ばれる２つの隣接基の間の単糖単位を切断して末端アルデヒ
    ド基を形成する工程；及び ｃ）アルデヒド基を通して前記アルジトールを固形基体のアミノ基へ還元カッ
    プリングする工程 を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 工程ａ）の還元を、水素化ホウ素、触媒還元剤及びラネーニ
    ッケルから選ばれる還元剤を用いて実施することを特徴とする請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 工程ａ）の還元を、ホウ化水素、例えば水素化ホウ素ナトリ
    ウム又はカリウムを用いて実施することを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程ｂ）の酸化を、過ヨウ素酸又はそのナトリウム塩もしく
    はカリウム塩を用いて実施することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 工程ｃ）の還元カップリングを、シアノボロハイドライドを
    用いて実施されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
  6. 【請求項６】 工程ａ）の還元を、水素化ホウ素ナトリウムを用いて実施し
    、工程ｂ）の酸化を、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて実施し、そして工程ｃ）の
    還元カップリングを、ナトリウムシアノボロハイドライドを用いて実施すること
    を特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 糖類が生物学的に活性な多糖類であることを特徴とする請求
    項１〜６のいずれか一項記載の方法。
  8. 【請求項８】 多糖類がヘパリン又はヘパラン硫酸であることを特徴とする
    請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 基体は、その表面がアミノ化されたポリマー物体から選ばれ
    ることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 基体は、ポリエチレンイミン又はキトサンのコーティング
    が施されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法によって製造さ
    れた複合体。
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