JP2002518586A - 精製したアルテロモナス・マクレオディイのポリサッカライドとその使用 - Google Patents
精製したアルテロモナス・マクレオディイのポリサッカライドとその使用Info
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Abstract
Description
。
omonas macleodii subsp. fijiensis)が海底の熱水源から単離された。これをグ
ルコースリッチの培地中実験条件下で培養すると、このバクテリアは大量のエキ
ソポリサッカライドを分泌する。アルテロモナス・マクレオディイ亜種フィジエ
ンシスの形態学的、生理学的および系統発生学的特徴は、RAGUENESらの刊行物[A
pplied and Environmental Microbiology, 62(1), pp. 67-73, (1996) ]に報告
されている。 この刊行物はまた、ST716として示されたアルテロモナス・マクレオディイ亜
種フィジエンシス株によりグルコース豊富化培地での培養でつくられ、この培地
からエタノール次澱で回収されるポリサッカライド混合物の全体組成の情報を提
供している。
ガラクトース、4.4%のマンノース、5%のピルベート置換マンノース、12.2%の
グルクロン酸と6.3%のガラクツロン酸を含み、グルコース、ガラクトース、マ
ンノース、グルクロン酸及びガラクツロン酸それぞれのモル比は1.0/1.1/0.6
/1.1/0.6/に相当する。スルフェートの含量は5%である。 この発見者らは、この混合物の成分を同定する研究をし、それから新規なポリ
サッカライドを精製した。
グルクロン酸、ガラクツロン酸とピルベート置換マンノースから構成されている
。 これらの異なる成分は、それぞれ1/1/1/2/1のモル比で存在し、1つの反復
ヘキササッカライド単位に組合わさっていることを特徴とする。この単位におい
て、3つのグリコシド残基は分枝点がガラクツロン酸残基からなる主鎖を形成し
ている。4位と6位のピルベートで置換されているマンノース残基を末端とする側
鎖が、この後のガラクツロン酸残基にグラフト化されている。
からなる。 この発明のポリサッカライドは、例えば、ST716株から生産されるエキソポリ
サックライドから精製できる。この株は、1995年10月17日にIFREMERにより、CNCM
(National Collection of Microorganism Cultures)にブタペスト条約に従い寄
託され、パスツール研究所(25 rue du Docteur Roux, Paris)により番号I-1627で
保持されている。 この発明の好ましい具体例によれば、アルテロモナス・マクレオディイ亜種フ
ィジエンシスから分泌されたエキソポリサッカライド混合物をアニオン交換クロ
マトグラフィーで精製した式(I)のポリサッカライドは、106Daのオーダーの
平均分子量(Mw)、すなわち800のオーダーの平均変合度DPnを有する。
の流動持性が示される。 - 106Daのオーダーの平均分子量(Mw)に対し、2600ml.g-1のオーダーの固有粘
度ηを有する、 - Ca2+イオンの存在下で粘度が増加するが、Mg2+とK+のイオンの存在下では粘
度が安定なままである、 - 増粘力と流動化(rheofluidifying)挙動を有し、これらの増粘特性がpH 4.5
〜9で安定である。
ポリサッカライドの使用にも関する。 親水性と溶解度とを併ったこれらの流動持性により、種々の産業、特に農産物
産業におけるテクスチャー剤、安定剤および/または増粘剤としてのこの発明に
よるポリサッカライドの使用は、かなり関心がもたれる。 この理由のため、この発明はまた、農産物産業でのテクスチャー剤、特に安定
剤および/または増粘剤としてのこの発明によるポリサッカライドの使用に関す
る。
造へのこの発明によるポリサッカライドの使用に関する。 この発明によるポリサッカライドは、液状、クリーム状、ペースト状、ゼラチ
ン状または半固形状の製品に所望の稠度を与え、一方、同時にそのテクスチャー
を改良および/または安定化するのに用いることができる。 特に、ポリサッカライドは、ポリサッカライドが氷結晶の生成を防止する際に
、温度の実質的変動(例えば調理中またはUHT処理中、または冷凍中)に付され
る製品を安定化する。 ポリサッカライドは、また、固形製品の湿気を保持するのに使用でき、これら
の製品に柔らかなテクスチャーを与え、その柔らかなテクスチャーが確実に保持
されるようにする。
も非常に容易かつ均等に導入できる。そのため、それらは産業工程での使用が非
常に簡単で、加えて、最終消費者による再生の「用時調製」製品をつくるのに特
に適している。 この発明によるポリサッカライドは、ワインやビネガーのような食品としての
使用を意図した液体製品を清澄にするのにも用いることができる。 また、この発明は、ヒトまたは動物に与えることを意図し、この発明によるポ
リサッカライドを少なくとも1つ含む製品を包含する。 この発明によるポリサッカライドは、成分の全重量に対して0.01〜10重量%、
好ましくは0.05〜5重量%の割合で問題の製品に存在するのが有利である。 この発明は、本発明のポリサッカライドの精製と特徴及びその特性と用途を例
示する以下の非限定的な実施例を述べる残りの記載から、より十分に理解される
であろう。
泌されるエキソポリサッカライドは、RAGUENESら [Applied and environmental
Microbiology, 62(1), pp.67-73 (1996)]に記載されているように、このバクテ
リア培養物からエタノール沈澱によって得られる。 トリス緩衡液(50mM, pH 7.5)に溶解した後、エキソポリソサッカライド混合
物をアニオン交換カラム(セファロースCL-6Bゲル)に負荷する。このカラムを
同じ緩衡液中0.1〜1M NaCl勾配で溶出する。 溶出プロフィルを図1に示す。450mMのNaCl濃度に対応する主ピークの区分を
集め、透析し、凍結乾燥する。 これらの区分で行った分析からタンパク質が存在しないことが分かり、ウロン
酸とヘキソースの含量が、それぞれ38%及び37%であることが計算できる。
付し、MONTREUILら (Carbohydrate analysis: a practical approach, Chaplin
M.F 及びKennedy J.K. (編集), I.R.L. Press Oxford, Washington D.C., Glyco
proteins pp. 143-204 (1986) の方法にしたがってメチルグリコシドを対応する
トリメチルシリル化誘導体に転化し、その後マススペクトロメーターと組み合わ
せたガスクロマトグラフィーで分析する。 また、中性のモノサッカライドは、BLAKENEY ら [Carbohydr. Res., 113, pp.
291-299 (1983)]の方法によりポリサックライドを加水分解し、還元してアセル
チル化を行った後、アルジトールアセテートの形で分析する。 ピルビン酸含量は、2,4-ジニトロフェニルヒドラゾンを用いる比色定量アッセ
イ法[SLONEKER ら, Nature, 194, pp. 478-479, (1962)]により算出する。
., 62, pp. 349-357, (1978)] の方法によって決定した。ポリサッカライドの加
水分解に由来したグリコシド残基は、トリフルオロ酢酸の存在下で(+)2-ブタノ
ールと反応する。得られるキラル誘導体をトリメチルシリル化し、次いでガスク
ロマトグラフィーで分析する。 アルジトールアセテートとトリメチルシリル化メチルグリコシドの形の残基の
分析により、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸とガラクツ
ロン酸は相対割合1:1:1:2:1(粗製高分子のとき1:1.1:0.6:1.1:0.6)で
存在することが分かる。残基の各々はD立体配置を有することが確認された。比
色定量アッセイで、ピルビン酸含量は7重量%であることが算出される。この値
は、全マンノース残基が置換されていることを示す。 トリメチル化シリル化メチルグリコシドの、マススペクトルと組合わせたガス
クロマトグラフィー分析の結果を図2に示す。この分析から、ピルベート基がマ
ンノース残基の4位と6位に結合していることが分かる。
の環状型(ピラノースまたはフラノース)とグリコシド結合の性質を測定するこ
とが可能となる。D'AMBRA ら [Carbohydr. Res., 177, pp. 111-116, (1988)]が
修正した HAKOMORI [J. Biochem, 55(2), pp. 205-208, 1964]] の方法を用いて
、ジメチルスルホキシド中、メチルスルフィニル リチウム カルボアニオンと
メチルヨーダイドを作用させてポリサッカライドの遊離ヒドロキシル官能基をメ
チル化する。次いで、結合に関与したヒドロキシル官能基を加水分解で遊離させ
る。部分的にメチル化した残基について、還元とその後のアセチル化で誘導した
アルジトールアセテートを、ガスクロマトグラフィーとマススペクトロメトリー
を組み合わせて分析する。メチル基の位置で特徴づけられた性質から、対応する
残基の環状型とグリコシド結合の位置が明らかになる。 この分析は、4位で置換されているグルコースとガラクトース、4位と6位でジ
置換されているマンノース(ピルベート基の置換部位を確認)、3位で置換され
るグルクロン酸、4位で置換されているグルクロン酸、及び3位と4位でジ置換さ
れているガラクツロン酸の存在を示す。したがって、この後者は、その側鎖末端
がピルベート置換マンノース残基である、分枝した反復ヘキササッカライド単位
の分枝点を構成している。すべての残基は、ピラノース環状型である。
s. 57, pp. C23-C26, (1977)]の方法に従って、先にメチル化したポリサッカラ
イドをアルカリ媒体中で処理する。 この分析で、O-エチル基を有する単一化合物、すなわちガラクトース残基のア
ルジトールアセテート誘導体の存在が示される。したがって、反復単位は、3つ
のウロン酸残基の配列からなり、その配列はガラクトース残基の4位に結合して
いる。
を添加した重水中に溶解した後、BRUKER AMX-500と AMX600装置で320KでNMRスペ
クトルを記録した。「TOCSY」(全体的に認められた相関分光)と「COSY」(認めら
れた相関分光)の高磁場でホモヌクレアモードでの分析と「HSQC」(Heteronuclea
n Single Quantum Coherence)ヘテロヌクレアモードで高磁場で得られたスペク
トルにより、各残基のプロトンと炭素に基づくシグナルを得る。 グリコシド結合のα/β立体配置は、アノマー炭素とプロトンに対応するシグ
ナルの化学シフト値で示される。ホモヌクレアモードでの「NOESY」 (核のオー
バーハウザー増強分光)分析で、反復単位中の残基の並びを決定する。
。これは、メチル化の結果と一致した。グリコシド結合の立体配置は、アノマー
のプロトンと炭素の化学シフト値から決定する。TOCSY及びCOSYスペクトルの分
析によれば、シグナルの大部分が異なる残基のプロトンによっている。β-脱離
の結果を考慮してNOESYスペクトルを解釈すると、残基の並びを決定することが
できる:
リマー濃度1g/L( )と2g/L(◆)(つまり0.1%と0.2%)の半希釈系で検討した
。研究結果は、剪断速度の増加と減少の連続サイクルの付加中、 断速度の関数
として見掛け粘度の変動を描く流動カーブを書いて示す。図3は、ポリサッカラ
イド溶液における増粘特徴をポリマー濃度に依存した粘度で示している。さらに
、流動曲線は、剪断速度値の低い領域でのいわゆる「ニュートン」プラトーの存
在と、高い剪断値の場合には剪断速度の関数として見かけ粘度の減少を伴った流
動化挙動の外観を示す。 ポリサッカライドの濃度が0.02〜0.2g/L(0.002%〜0.02%)のような希釈系
流動曲線をプロットすることで、NaClの0.1M溶液中の固有粘度[η](所定の溶媒
中1gのポリマーで占められる流体力学的容量)を測定することができた。このよ
うにして、固有粘度は2600ml/gと計算された。
20℃で行った。 この発明による精製ポリサッカライドについてのアニオン強度0.1Mの水性溶媒
中での2g/L溶液の流動曲線を、各種イオンの存在下でプロットした。図4 で描いたこれらの曲線は、ポリサッカライドの粘度はCa2+イオンの存在下で顕著
に増大するが、一方K+またはMg2+イオンの存在下では粘度は影響されないことを
示している。 図5は、この発明のポリサッカライドの0.1M NaCl中、異なるpH値の2g/L濃度
溶液で得た流動曲線 を示している。これらの曲線から、この発明によるポリサッカライドの増粘特性
がpH値4.5〜9の間で安定であることを結論付けることができる。
例を集め たもので、これらの食品各々に一般に好ましいとされる成分の全重量当たりの重
量割合を示す。
Claims (8)
- 【請求項1】 グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、ガラクツロン
酸とピルベート置換マンノースから構成され、それらの残基が式(I) 【化1】 の反復へキササッカライド単位で結合し、そのサッカライドが式(I)のnサッカ
ライド単位(nは1に等しいかそれより大きい)からなることを特徴とする精製され
たポリサッカライド。 - 【請求項2】 106 Daオーダーの平均分子量(Mw)、つまり800オーダーの
平均重合度(DPn)を有し、約2600ml.g-1の固有粘度(η)を有することを特徴とす
る請求項1にクレームしたポリサッカライド。 - 【請求項3】 請求項1または2にクレームしたポリサッカライドの増粘
剤としての使用。 - 【請求項4】 請求項1または2にクレームしたポリサッカライドの流動
化剤としての使用。 - 【請求項5】 請求項1または2にクレームしたポリサッカライドのテク
スチャー剤、ことに農産物産業における安定剤および/または増粘剤としての使
用。 - 【請求項6】 請求項1または2にクレームしたポリサッカライドのヒト
または動物に与えることを意図した製品の製造への使用。 - 【請求項7】 請求項1または2にクレームしたポリサッカライドの少な
くとも1つからなることを特徴とするヒトまたは動物に与えることを意図する製
品。 - 【請求項8】 請求項1または2にクレームしたポリサッカライドの0.01
〜10重量% 好ましくは0.05〜5重量%(構成する成分の全重量当り)からなるこ
とを特徴とする請求項7にクレームした製品。
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