JP2003502063A

JP2003502063A - 殺菌剤の効力評価用モデルバイオフィルム

Info

Publication number: JP2003502063A
Application number: JP2001503998A
Authority: JP
Inventors: アーサラ、ケー．チャラフ、
Original assignee: エス．シー．ジョンソンアンドサン、インコーポレイテッド
Priority date: 1999-06-10
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2003-01-21
Also published as: CA2376372A1; WO2000077162A1; AU5470200A; AR024565A1; EP1185614A1; BR0011416A

Abstract

(57)【要約】モデルバイオフィルムの培養方法が開示される。１実施形態では、接種された増殖培地（増殖培地は栄養源に接触する）の上に、上部及び底部を有する複数の面を配置する工程、複数の面の底部にモデルバイオフィルムを培養する工程、及び前記増殖培地から前記面を除去する工程を含む。モデルバイオフィルムは、前記面の底部を被覆する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願のクロスリファレンス本願は、１９９９年６月１０日に出願した米国仮出願番号第60/138,354号に対
して優先権を主張する。

【０００２】連邦委託研究又は開発に関する陳述適用しない

【０００３】家庭、製造プラント、土壌、水又は人体中の微生物は、バイオフィルムとして
増殖する傾向がある（Raloff, 1996; Blackman and Frank, 1996; Olson, 1997;
Potera, 1999)。バイオフィルム細胞は、プランクトン様細胞とは表現型が異な
る（Characklis, 1999; Gilbert, 1990; Costerton, et al., 1995)。この相違
の最も重要な現れの１つは、バイオフィルム細胞の殺菌剤に対する感受性が著し
く低いことである（Costerton, et al., 1995; Das, et al., 1997)。

【０００４】殺菌剤の登録プロトコルは、実験用培養液に懸濁して増殖する微生物が環境に
おいて見られる微生物を一般的に代表していると認められていることに基づく。
しかしながら、実験室で殺菌剤の効力を測定するために使用するターゲット生物
が問題の原因となる生物と常に同一であるとは限らない。殺菌剤の効力を試験す
る際にバイオフィルムとして増殖する微生物を考慮に入れないため、現行の試験
プロトコルは殺菌剤の全ての態様を適切に測定しているとは言えないかもしれな
い。

【０００５】殺菌剤の試験制度にバイオフィルムによる試験を含めるための１つの簡単な方
法は、公認分析化学者協会(Association of Official Analytical Chemists (AO
AC))によって認可された現行の試験で使用するプランクトン様細胞で覆われた担
体に代わって、バイオフィルムで覆われた担体を用いることである。殺菌剤試験
に適したバイオフィルム被覆切片は、種々のバイオフィルム培養器で培養するこ
とができる。しかしながら、これらの方法には専門的知識や高価な装置を要し、
限られた枚数の試験切片しか調製できない。

【０００６】殺菌剤の感受性試験を簡単にするために、実験室で培養するバイオフィルムの
複雑さを軽減するための試みがなされてきた。細胞をアルギン酸（Stewart, et al ., 1997; Xu, et al., 1996)、他のポリマー材料(Harkonen, et al., 1998)
などの人工マトリックスに埋め込んだり、アルギン酸ビーズに吸着させたりする
ことができる(Cochran, 1997)。これらの埋め込まれた細胞が、アルギン酸マト
リックスによる輸送制限に左右されない殺菌剤に対して高い抵抗を示すことが分
かっている(Cochran, 1997)。しかしながら、細胞が自己の細胞外ポリマー物質
（ＥＰＳ）に埋め込まれていない点において、このシステムは幾分人工的である
。さらに、これらの人工バイオフィルムは、殺菌剤試験の現行の方法で利用する
試験用表面とは本質的に異なり、現行の試験プロトコルに代わるのは難しい。

【０００７】信頼性があり、調製しやすく、高価な装置に依らないモデルバイオフィルムを
開発した。簡単に言うと、このモデルバイオフィルムは、寒天などの栄養支持体
の上にある、濾紙などの接種された増殖培地の上に配置された切片又は他の平面
上で培養される。これらのバイオフィルム被覆切片は、従来の殺菌剤試験で使用
するプランクトン様細胞で覆われた担体の代わりに用いることができる。モデル
バイオフィルムは自然に成長したバイオフィルムで、細胞は人工的な環境に置か
れない。モデルバイオフィルムは、大部分の試験用バイオフィルムのように、「
培養器で培養」されるわけでもないし、固体と液体の界面で培養されるわけでも
ない。本発明のバイオフィルムは制御された条件下で培養され、再現性がある。

【０００８】本発明の１実施形態は、接種された増殖培地（増殖培地は栄養源に接触する）
の上に複数の面を配置する工程、前記複数の面の底部にモデルバイオフィルムを
増殖させる工程、及び前記増殖培地から前記面を取り除く工程を含む。この面が
、本発明のモデルバイオフィルムで被覆される。

【０００９】本発明の目的は、試験プロトコルで使用するモデルバイオフィルムで被覆され
た、複数の再現性のある試験用表面を提供することである。

【００１０】本発明の別の目的は、モデルバイオフィルムの試験用表面を形成するための、
迅速、再現性があり、且つ低コストの方法を提供することである。

【００１１】本発明の他の目的、利点及び特徴は、明細書、特許請求の範囲及び要約を検討
することによって明らかとなるであろう。

【００１２】発明者は、比較的現実的、単純且つ信頼性のある殺菌剤効力試験のニーズに応
じて、モデルバイオフィルムの培養方法を開発した。この方法は、実験室の基本
的な装置を利用し、高速（４８時間）且つ単純、さらに再現性がある。さらに、
この方法はその有用性や試験切片の数を限定しない。比較的最小の努力で数百枚
の切片を簡単に手に入れられる。

【００１３】本発明のバイオフィルムの細胞はＥＰＳに埋め込まれ、そこで細胞が産生され
る。当該細胞が真のバイオフィルムに必須の表現型変化の全てを経ているかどう
か分からないため、このバイオフィルムを「モデル」と分類することにする。

【００１４】モデルバイオフィルムは、野生型のバイオフィルムの特徴のうち幾つかを有す
る。例えば、その細胞がスライドガラス又は他の試験用表面に付着し、スライム
を産生し、殺菌剤に対する抵抗が著しく高いといったことである。目に見えるく
らいのスライムを産生する付着した細胞は、好ましくは１０³〜１０¹²セル／ｃ
ｍ²の範囲にある。好ましい範囲は１０⁷〜１０⁸である。固体切片が固体の非多
孔性面に直接接触しないのが好ましい。同様に処理した天然又は培養器で培養し
たバイオフィルムサンプルから得たデータに対して、このようなモデルバイオフ
ィルムを用いて得たデータは有効である。

【００１５】モデルバイオフィルムの調製方法図１に開示した一実施形態では、本発明の方法は、例えばトリプティカーゼソ
イアガー(Trypticase Soy Agar)などの好ましくは寒天である栄養源６の上に配
置した、好ましくは濾紙(ワットマン純正＃２)である接種された増殖培地４で、
バイオフィルム２を培養する。プレート当たり４０ｍｌの寒天を含む１０×１０
ｃｍの正方形のシャーレを用いた。

【００１６】適切な栄養源とは、多孔性シートを支持できる栄養源である。これは、培地で
飽和された濾紙又はスポンジ状シートを支持するフレーム又は他の支持構造を有
する液体培地であり得る（即ち、多孔性支持体は、その下の寒天が不必要な程度
に十分厚い）。したがって、栄養源及び接種された増殖培地は同じ物理的構造を
有することができる。

【００１７】所望のバイオフィルム形成生物からなる一晩培養した培養液を希釈した（１／
１０〜１／１００）培養液、通常１ｍｌを、紙面全体が均等に湿潤するように、
濾紙の上にピペットで滴下する。濾紙は多孔性であり、その目的は、切片の下側
で無酸素状態が起こる可能性を低減するためである。

【００１８】上述のように、多くの他の多孔性増殖培地が適切である。この適切な増殖培地
が試験生物を増殖できるようにすることだけが必須である。

【００１９】図１を参照すると、平面８のセット、好ましくは無菌平坦切片（例えば、ガラ
ス又はステンレススチール）を接種された濾紙４の上に置き、軽く押し付ける。
バイオフィルム２が濾紙４の上で培養されると、バイオフィルム２は面８の下側
も覆う。好ましくは、２４時間後に濾紙を希釈した（１／１００）トリプティカ
ーゼソイブロス(Trypticase Soy Broth)又はリン酸緩衝化生理食塩水で再度湿潤
させるのが有用である。バイオフィルムが成熟すると、好ましくは４８時間後に
は、バイオフィルムで被覆された切片は採取できるようになる。

【００２０】典型的には、切片を採取したとき、切片間の濾紙上にスライム状の膜成長を明
確に観察できた。１日後に切片を観察したところ、バイオフィルムの存在を発見
した。しかしながら、バイオフィルムの成熟、即ち付着した細胞のバイオフィル
ムへの物理的且つ生理学的転換を確実なものにするために、モデルバイオフィル
ムを２日間培養するほうがよい。１日後と４日後のサンプルでは反応や細胞の数
に殆ど差は無かった。細胞には、付着し、バイオフィルムを形成するために適当
な時間が必要であり、それは２週間までである。好ましい時間は２〜３日である
。本発明の他の実施の形態では、キレート化支持体の上にバイオフィルムをある
時間培養し、完成したバイオフィルムの上に切片を置く。細胞は、数分程度の短
時間で切片に付着する。しかし、この場合は再現性が低いかもしれない。

【００２１】モデルバイオフィルムの接種のため、各生物をその好ましい増殖条件に応じて
、即ち、緑膿菌(Pseudomanas aeruginosa)（環境菌株ＰＡＯ１）であれば室温で
、また、臨床菌株の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureaus)（ＡＴＴＣ６５３
８）であれば３５±２℃で培養する。しかしながら、モデルバイオフィルムに関
しては、使用する細胞の種類に関わりなく室温で培養するのがよい。

【００２２】好ましくは、切片を濾紙の表面からピンセットで無菌的に取り除き、直ぐに又
は３５±２℃で４０分間乾燥させた後用いる。乾燥工程は、従来技術のプランク
トン様細胞からなる担体の調製に対応している。

【００２３】次いで、好ましくはＡＯＡＣの公定分析法に概略が示される殺菌剤試験を切片
に施す。

【００２４】実施例Ａ．モデルバイオフィルムの評価方法２０枚を越える未処理の切片から細胞をこすり落とし数を測定することによっ
て、モデルバイオフィルム培養の再現性を評価した。一貫して、１ログ以内のば
らつきで約１０⁸セル／切片を得た（図２参照）。採取直後の切片を使用した場
合と（３５±２℃で４０分間）乾燥させた切片を使用した場合に差はなかった。
中和培地は細胞に悪影響を及ぼさなかった。

【００２５】細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）と細胞をよりよく区別するために、細胞とＥＰ
Ｓを、１９８４年にAllisonとSutherlandによって開発された手順及び１９９９
年にD. G. Daviesによって開発された手順にしたがって異なる色に染めた。ＥＰ
Ｓをブルーに染めるためにアリシアンブルーを使用し、細胞を対照色の赤に染め
るために石炭酸フクシンを使用した。

【００２６】Ｂ．殺菌剤試験１．プランクトン様細胞の定性的試験最初に、ＡＯＡＣの殺菌剤噴霧試験に概略が示されている手順にしたがって、
各活性成分をプランクトン様細胞に対して試験した。細胞の懸濁液を６．４４ｃ
ｍ²の平坦なガラスの切片に与えた。切片を３５±２℃で４０分間乾燥させ、殺
菌剤を噴霧した。１０分間殺菌剤にさらした後、切片を中和培地に移し、４８時
間培養し、増殖を観察した。ＡＯＡＣの公定方法によると、６０本のチューブう
ち１本しか生き残った細胞による増殖を呈しなかったならば、活性成分又はその
製品は殺菌試験に合格したことになる。

【００２７】２．バイオフィルムの定性的試験プランクトン様細胞からなる担体の代わりに、上述の方法で調製した同じサイ
ズのモデルバイオフィルム切片を用いて上述のＡＯＡＣ方法で試験した。

【００２８】３．バイオフィルムの定量的試験５枚以上のバイオフィルム切片をそれぞれ、使用する殺菌剤の使用法及び種類
に応じて、１０分又はそれよりも短いか長い適切な時間殺菌剤に接触させて殺菌
剤による処理を行った。次いで、中和培地から直接こすり落とすことによって、
バイオフィルムを担体から取り除いた。（これが第１の希釈工程である。）次い
で、２４〜４８時間後に、細胞を最大速度の１／２で１分間均質化することによ
って、分散させた。細胞の懸濁液を連続して希釈し、Ｒ２Ａ又は他の適切な寒天
に接種した。Ｒ２Ａ培地は、微生物培地ハンドブック(Handbook of Microbiolog
ical Media) (Ronald M. Atlas, CRC Press, 1993, ed. Lawrence C. Parks)に
記載されるＢＢＬ又はＤｉｆｃｏ（ＤＦ１８２６−１７−１）から供給される。
２４〜４８時間の培養後に、処理に対して生き残った細胞をコロニー形成単位と
して数えた。同数の未処理の切片を中和培地からこすり落とし、上記の処理と同
様に処理した。これらは、モンタナ州立大学のバイオフィルム工学研究所(Cente
r for Biofilm Engineering) で開発された方法（Hamilton and Herigstad, 199
8)によって対数減少を計算するために使用するコントロールの役目を果たした。

【００２９】Ｃ．結果／考察このモデルバイオフィルムの利点は、調製が簡単でありサンプル間で再現性が
ある点である。４８時間後のモデルバイオフィルムの細胞密度は、一様に、１ロ
グ以内のばらつきで約１０⁸セル／切片に到達している（図２）。モデルバイオ
フィルムは、切片の下側に付着するスライム状の物質として、裸眼で簡単に観察
することができる。明視野顕微鏡による顕微鏡試験によると、ＥＰＳに関連する
細胞クラスターがあった。実際、本発明のモデルバイオフィルムは、培養器で培
養した染色したバイオフィルムと区別がつかなかったが、共焦点顕微鏡では、バ
イオフィルム構造の差が明らかとなるであろう。

【００３０】殺菌剤効力試験によって、殺菌剤製品の評価及びランク付けができる。ＡＯＡ
Ｃの殺菌剤噴霧試験及び他の標準的な殺菌剤試験で使用するプランクトン様細胞
の試料に代えて、バイオフィルム切片を使用し、バイオフィルムに対する製品の
殺菌剤の効力の定性的評価を得ることができた。比較を簡単にするために、バイ
オフィルムの初期の細胞数及びプランクトン様細胞の試験切片の初期の細胞数を
比較できるものにした。即ち１０⁸〜１０⁹セル／切片（１０⁶〜１０⁷セル／ｃｍ ² の切片面）とした。このようにして得た結果は、人工バイオフィルム(Chen and
Stewart, 1996)の文献及び環境的なバイオフィルム又は培養器で培養したバイ
オフィルム(Samrakandi, et al., 1997)の文献で記述されている結果の範囲内に
あるものと思われる。

【００３１】表１は、緑膿菌ＰＡＯ１と黄色ブドウ球菌６５３８のプランクトン様細胞及び
バイオフィルムに対する定性的なＡＯＡＣ殺菌剤噴霧試験の結果を示す。プラン
クトン様細胞に関わる全ての試料がＡＯＡＣ殺菌剤噴霧試験に合格した。即ち、
処理した６０枚の切片のうちどの切片にも生き残った細胞はなかった。対照的に
、同様に処理したバイオフィルムサンプルはどれも試験に合格しなかった。

【００３２】

【表１】

【００３３】６０枚以上の切片を定性的試験のために調製するのは困難ではなく、この試験
において殺菌剤での処理工程が最も手間がかかる。しかしながら、より少ない切
片を使用して計数プロセスに力を注ぐことによって、統計的に評価できる結果を
得ることができる。定量的評価によって、バイオフィルムに対する殺菌剤の効力
をランク付けすることができる。モデルバイオフィルムを１０００ｐｐｍの次亜
塩素酸で処理することによって、バイオフィルム細胞が約２ログ減少した。次亜
塩素酸試験製剤１は基準の次亜塩素酸に比べてあまり効力がないことが証明され
、特許製剤２が試験した全ての活性成分及び製品のなかで最も効力があることが
証明された（図３）。予想した通り、試験した４つの消費者製品は、プランクト
ン様細胞に基づいた標準的な試験方法で示されたよりもバイオフィルムに対して
あまり効力がなかった（図４）。

【００３４】２つの標準的な試験用殺菌剤に対して黄色ブドウ球菌、肺炎杆菌(Klebsiella
pneumoniae)及びエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)（
ＡＴＣＣ６５３８）も試験した。黄色ブドウ球菌は緑膿菌よりも両殺菌剤に対し
てやや高い割合で死滅したが、肺炎杆菌及びエンテロバクター・アエロゲネス（
グラフには含まない）は約１ログ以下の細胞の減少しか示さなかった。試験の実
施の際、各環境で見られる優占種に応じたバイオフィルムの組成を最終的に調節
するのが有効である。殺菌剤に対する、混合されたバイオフィルムの相乗効果又
は拮抗作用についてはあまり知られておらず、本発明の方法はこの評価に適した
ツールとなり得る。

【００３５】Ｄ．モデルバイオフィルムの培養における細胞接種物及び栄養濃度の効果モデルバイオフィルムの培養において、細胞の希釈の割合と栄養素の濃度を変
えた接種物を調査した。４２〜４８時間の培養の後、モデルバイオフィルムを採
取した。表２及び表３は、特定の細胞の希釈の割合と栄養素濃度から得た切片当
たりの細胞を表にしている。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】図６は、黄色ブドウ球菌をモデルに結果を説明する棒グラフである。黄色ブド
ウ球菌の場合、多孔性培地に置かれた時細胞の数は減少したが、その４８時間後
に採取したバイオフィルムの細胞の数に変化はなかった。寒天の栄養素濃度の減
少がバイオフィルムの細胞数に影響したのは、元の栄養素濃度の５％より低い（
即ち１％）の時だけだった。肺炎杆菌の場合も類似した傾向が観察された。（空
欄は、得られたデータから傾向を確立することができるため、実験を行わなかっ
たことを意味する。）

【００３９】Ｅ．モデルバイオフィルムにおける多糖類の存在上述のモデルバイオフィルムを２色に染色した：多糖類はアリシアンブルーで
染色し、細胞は石炭酸フクシンで染色した。全種類の細胞、即ち緑膿菌、黄色ブ
ドウ球菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・アエロゲネスを染色した。全ての試料
がＥＰＳに関連する細胞を示した。微小コロニーを迅速に形成する性質がある黄
色ブドウ球菌では、クラスター化効果が最も強かった。このようにして、多糖類
を青く染め、細胞を赤く染めた。多糖類が存在し、これが細胞に密接に関連して
いることが明確に分かった。特に、バイオフィルムの細胞について文献で記述さ
れているように、黄色ブドウ球菌のモデルバイオフィルム細胞が微小コロニーに
クラスター化したのが観察された。

【００４０】Ｆ．モデルバイオフィルムと培養器で培養したバイオフィルムの比較環状培養器で培養したバイオフィルムは、文献で広く記述されている。環状培
養器(ロトトルク:ＲｏｔｏＴｏｒｑｕｅ)は、モンタナ州BozemenのBiosurface T
echnologies, Inc.で製造されている(Biofilms, John Wilely & Sons, William
G. Chakaraklis and Kevin C. Mashall, pp. 59-62, 1990)。バイオフィルムを
培養する長いステンレススチールの切片を、それぞれ４枚のガラス切片を受ける
ホルダーに代えて、ロトトルクを改変した。これらのガラス切片は、モデルバイ
オフィルムに使用する切片と同じサイズである。モデルバイオフィルムから回収
した細胞の数と改変したロトトルクから回収した細胞の数を比較する。

【００４１】表４及び図７は、モデルバイオフィルムと培養器で培養したバイオフィルムの
比較について説明している。この処理に関するデータから、標準的な処理、即ち
１０００ｐｐｍのＮａＯＣｌ及び１０００ｐｐｍのＱｕａｔ＋２００ｐｐｍのＥ
ＤＴＡでの処理に関して、モデルバイオフィルムが、培養器で培養されたバイオ
フィルムと同様の反応をすることが示されている。

【００４２】

【表４】

【００４３】産業上の利用可能性本発明のモデルバイオフィルムは、試験プロトコルで使用するための多数の再
現性のある試験用表面を提供する。殺菌剤用モデルバイオフィルムの調製には比
較的安価な装置や材料を要し、試験切片の枚数を制限することもない。本発明の
方法は高速（４８時間）、単純且つ再現性のあるものである。

【００４４】参考文献 Allison D.G. and Sutherland, I. W., "A staining technique for atta
ched bacteria and its correlation to extracellular carbohydrate producti
on", J. Microbiol. Meth. 2:93-99, 1984. Blackman I.C. and Frank, J.F., "Growth of Listeria monocytogenes a
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7-831, 1996. Characklis, W.G., "Microbial Biofouling Conrol", in Biofilms, Edit
ed by Characklis, W.G. & Marshall, K.C., New York, John Wiley & Sons, pp
. 585-633, 1990. Chen, X. and Stewart, P.S., "Chlorine Penetration into Model Biofi
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Biotech. Bioeng. 49: 93-100, 1996.

【図面の簡単な説明】

【図１】モデルバイオフィルム設置の１実施形態の概略図である。

【図２】種々のコントロールの実行から得られた細胞の数を記録する棒グラフである。

【図３】本発明のモデルバイオフィルムに対する次亜塩素酸の効果を説明する棒グラフ
である。

【図４】バイオフィルムに対する試験製品の効果を説明する棒グラフである。

【図５】３種類の微生物、即ち、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎杆菌に対する２つの
試験用殺菌剤の効力を示す棒グラフである。

【図６】黄色ブドウ球菌のモデルバイオフィルムにおける、接種物と栄養素の有効性の
変化を比較した棒グラフである。

【図７】本発明のモデルバイオフィルムから得られた細胞の数と培養器で培養したバイ
オフィルムの細胞の数を比較した棒グラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月２２日（２００１．５．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】削除

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】削除

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４４】参考文献 Allison D.G. and Sutherland, I. W., "A staining technique for att
ached bacteria and its correlation to extracellular carbohydrate product
ion", J. Microbiol. Meth. 2:93-99, 1984. Blackman I.C. and Frank, J.F., "Growth of Listeria monocytogenes
as a Biofilm on Various Food-Processing Surfaces", J. Food Prot. 59(8):8
27-831, 1996. Characklis, W.G., "Microbial Biofouling Conrol", in Biofilms, Edi
ted by Characklis, W.G. & Marshall, K.C., New York, John Wiley & Sons, p
p. 585-633, 1990. Chen, X. and Stewart, P.S., "Chlorine Penetration into Model Biof
ilm is Limited by a Reaction-Diffusion Interaction", Environ. Sci. Tech. 30(6):2078-83, 1996. Cochran, W.L., "Physiological Basis of Biofilm Resistance to Anti
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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】モデルバイオフィルムの培養方法であって、ａ増殖培地が栄養源に接触し、モデルバイオフィルムが増殖培地上で増殖でき
るように、接種された増殖培地上に、上部及び底部を含む複数の面を配置する工
程と、ｂ前記モデルバイオフィルムを前記複数の面の底部に付着させる工程と、ｃ前記モデルバイオフィルムで前記面の底部を被覆した状態で、前記面を前記
増殖培地から除去する工程と、を含む、モデルバイオフィルムの培養方法。
【請求項２】前記増殖培地が濾紙である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記栄養源が寒天である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記面が切片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記切片がガラス又はステンレススチールを含む、請求項４
に記載の方法。
【請求項６】前記面の数が２より多い、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記除去後前記面を乾燥する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記除去工程（ｃ）の後、前記面に対して殺菌剤試験を行う
、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記モデルバイオフィルムが、微生物又は複数生物種の混合
物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記面の数が１０より多い、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】少なくとも１つの面がモデルバイオフィルムで被覆された
複数の面。
【請求項１２】接種された増殖培地及び栄養源が組み合わせられる、請求
項１に記載の方法。
【請求項１３】前記面を前記増殖培地に配置する前に前記バイオフィルム
を増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記面を前記増殖培地に配置した後に前記バイオフィルム
を増殖させる、請求項１に記載の方法。