CN117247985A - 银离子洗手液抗菌性能的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其包括洗手液样品稀释，洗手液样品抗菌性检测，设置空白对照组与抗菌率计算三个步骤，通过使用标准菌片替代传统的标准菌液，进行洗手液抗菌性检测，与现有技术的国标检测方法对比，更符合洗手液产品的特性和使用方法，能够更客观的评价产品的抗菌性能，具有检测时间短，灵敏度高，准确度高，操作简单，便于推广实施的优点。
Description
技术领域
本发明属于洗手液抗菌性能检测领域，具体涉及一种银离子洗手液抗菌性能的检测方法。
背景技术
现有技术中，银离子消毒剂是一种广谱的微生物杀灭剂，银离子洗手液因其极强的杀灭能力以及较持久的作用时间，已逐渐在消毒洗手液产品市场中占有越来越多的份额，电解银离子溶液作为稳定性高的材料，有望推广应用到各种消毒卫生场景当中，但是在实际生产过程中，产品质量参差不齐，银离子具有强氧化性，及其不稳定，如生产过程中投入非电解法银离子溶液作为原料，产品成品中的银离子在短时间内则容易被还原，并失去其消毒作用，现有技术中，常用标准菌液进行抗菌性能检测，使得洗手液样品于标准菌液充分混合，评价洗手液的抗菌性能，不符合洗手液清洗取出手部表面细菌的使用场景，检测可参考性低，时间长，灵敏性低，因此，现在急需作出改进，科学、有效测定银离子洗手液中的杀灭性能及其杀灭性能稳定性变得极其重要。
发明内容
本发明为了解决现有技术中银离子洗手液抗菌性评价方法不符合洗手液日常使用场景，检测可参考性低，检测时间长，灵敏性低，的技术问题，提出一种银离子洗手液抗菌性能的检测方法。
本申请采用如下方案：
银离子洗手液抗菌性能的检测方法，包括以下步骤：
步骤101.样品稀释：
将10g银离子抗菌洗手液样品与10mL无菌PBS缓冲溶液混合分散后，即得样品稀释液；
步骤102.样品抗菌性检测：
将5mL所述步骤101中制备得到的样品稀释液加入无菌培养皿A1中，在20-25℃的条件下，静置20min后，将含有标准菌的菌片放入无菌培养皿A1中，使得样品稀释液充分浸没菌片；作用1min后，加入中和剂去除其中有效消毒成分后，并使用振荡器振荡20s并作用10min后，从无菌培养皿A1中取1mL培养液S，接种至两个无菌培养皿A2中，并倾注入保温至45℃的琼脂培养基20mL，进行活菌计数后，得到活菌计数值CS，若标准菌为真菌，则倾注SDA琼脂培养基；
步骤103.设置空白对照与抗菌率计算：
将5mL无菌标准硬水无菌培养皿B1中，在20-25℃的条件下，静置20min后，作用一定时间后，放入含有标准菌的菌片，，使得样品稀释液充分浸没菌片；作用1min后，加入中和剂去除其中有效消毒成分后，并使用振荡器振荡20s并作用10min后，从无菌培养皿B1中取1mL的培养液P，接种至两个无菌培养皿B2中，进行活菌计后，得到活菌计数值CP，并通过以下公式计算抗菌率A，A＝CP-CS/CP。
优选的，所述步骤102中菌片的制备方法包括以下步骤：
步骤201.标准菌活化：
将标准菌投入含90mL无菌NB/SDB培养基的锥形瓶中，在24-37℃的条件下，培养22-52h后得到标准菌株，其中细菌标准菌在无菌NB培养基中，在36±1℃的条件下，培养22-26h；真菌标准菌在无菌SDB培养基中，在25±1℃的条件下，培养44-52h后即得标准菌菌株；将该标准菌株分离至无菌琼脂平板或脂斜面上，在24-36℃的条件下，培养22-52h后，收集从无菌琼脂平板或脂斜面上刮下菌苔，即得活化标准菌；
步骤202.标准菌液制备：
将所述步骤201中得到的活化标准菌接种于含有10mL生理盐水的无菌试管中，盖上试管盖于旋涡振荡器中振荡60s使细胞分散，得到标准菌悬液，向标准悬菌液内加入300μl牛血清蛋白分散均匀后，即得标准菌液；
步骤203.菌片制备：
将10μl所述步骤202中制备得到的标准菌液，染点于10mm×10mm高压灭菌无菌玻片表面后，将无菌玻片置于无菌培养皿内培养10-20min，并将无菌培养皿置于培养箱中，在36℃的条件下，干燥后，即得菌片。
优选的，所述步骤202中标准菌悬液浓度测试方法为使用光电麦氏浊度计，在波长为960nm的条件下，测量标准菌悬浊度McF后，通过以下公式计算标准菌悬液浓度Cm,Cm＝McF×3×108。
优选的，所述步骤202中通过光电麦氏浊度计测量方法测得的标准菌悬浊液浓度的对数值与实际活菌计数值的对数值的最大偏差＜0.5。
优选的，所述步骤202中准菌悬液浓度为107-1010CFU/mL，其中细菌标准菌悬液浓度为108-109CFU/mL，真菌标准菌悬液浓度为107-108CFU/mL，制作铜绿假单细胞菌时，标准菌悬液浓度为109-1010。
优选的，所述步骤203中所得的菌片含菌量为105-106CFU/片。
优选的，所述步骤203中所得的菌片的含菌量与所述步骤202中所得的标准菌悬液含菌量满足以下关系：(标准菌悬液含菌量-菌片的含菌量)/标准菌悬液含菌量≤15％。
优选的，所述标准菌为革兰氏阴性代表菌株、大肠埃希氏菌、革兰氏阳性代表菌株、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及铜绿假单胞菌中的任一种。
优选的，所述步骤102中，中和剂的为PBS缓冲液，卵磷脂以及吐温-80的混合物。
优选的，所述步骤102中，中和剂为1000mL PBS缓冲液，3g卵磷脂，以及20g吐温-80的混合物。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本申请提供银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其包括洗手液样品稀释，洗手液样品抗菌性检测，设置空白对照组与抗菌率计算三个步骤，通过使用标准菌片替代传统的标准菌液，进行洗手液抗菌性检测，与现有技术的国标检测方法对比，更符合洗手液产品的特性和使用方法，能够更客观的评价产品的抗菌性能，具有检测时间短，灵敏度高，准确度高，操作简单，便于推广实施的优点。
具体实施方式
下面结合一下具体实施情况，对本发明做进一步描述：
(1)银离子洗手液抗菌性能的检测方法，包括以下步骤：
步骤101.样品稀释：
将10g银离子抗菌洗手液样品与10mL无菌PBS缓冲溶液混合分散后，即得样品稀释液；
步骤102.样品抗菌性检测：
将5mL所述步骤101中制备得到的样品稀释液加入无菌培养皿A1中，在20-25℃的条件下，静置20min后，将含有标准菌的菌片放入无菌培养皿A1中，使得样品稀释液充分浸没菌片；作用1min后，加入中和剂去除其中有效消毒成分后，并使用振荡器振荡20s并作用10min后，从无菌培养皿A1中取1mL培养液S，接种至两个无菌培养皿A2中，并倾注入保温至45℃的琼脂培养基20mL，进行活菌计数后，得到活菌计数值CS，若标准菌为真菌，则倾注SDA琼脂培养基；
步骤103.设置空白对照与抗菌率计算：
将5mL无菌标准硬水无菌培养皿B1中，在20-25℃的条件下，静置20min后，作用一定时间后，放入含有标准菌的菌片，，使得样品稀释液充分浸没菌片；作用1min后，加入中和剂去除其中有效消毒成分后，并使用振荡器振荡20s并作用10min后，从无菌培养皿B1中取1mL的培养液P，接种至两个无菌培养皿B2中，进行活菌计数后，得到活菌计数值CP，并通过以下公式计算抗菌率A，A＝CP-CS/CP。
将抗菌率A与QB/T 2957-2008、QB/T 2850-2007、GB
19877.1-2005抗菌率标准A标准对比，若测得抗菌率A大于抗菌率标准A标准即该洗手液抗菌率符合使用标准。
(2)步骤102中菌片的制备方法包括以下步骤：
步骤201.标准菌活化：
将标准菌投入含90mL无菌NB/SDB培养基的锥形瓶中，在24-37℃的条件下，培养22-52h后得到标准菌株，其中细菌标准菌在无菌NB培养基中，在36±1℃的条件下，培养22-26h；真菌标准菌在无菌SDB培养基中，在25±1℃的条件下，培养44-52h后即得标准菌菌株；将该标准菌株分离至无菌琼脂平板或脂斜面上，在24-36℃的条件下，培养22-52h后，收集从无菌琼脂平板或脂斜面上刮下菌苔，即得活化标准菌；
步骤202.标准菌液制备：
将所述步骤201中得到的活化标准菌接种于含有10mL生理盐水的无菌试管中，盖上试管盖于旋涡振荡器中振荡60s使细胞分散，得到标准菌悬液，向标准悬菌液内加入300μl牛血清蛋白分散均匀后，即得标准菌液；
步骤203.菌片制备：
将10μl所述步骤202中制备得到的标准菌液，染点于10mm×10mm高压灭菌无菌玻片表面后，将无菌玻片置于无菌培养皿内培养10-20min，并将无菌培养皿置于培养箱中，在36℃的条件下，干燥后，即得菌片。
其中，所述步骤202中标准菌悬液浓度测试方法为使用光电麦氏浊度计，在波长为960nm的条件下，测量标准菌悬浊度McF后，通过以下公式计算标准菌悬液浓度Cm,Cm＝McF×3×108。
优选的，所述步骤202中准菌悬液浓度为107-1010CFU/mL，其中细菌标准菌悬液浓度为108-109CFU/mL，真菌标准菌悬液浓度为107-108CFU/mL，制作铜绿假单细胞菌时，标准菌悬液浓度为109-1010。
其中，所述步骤203中所得的菌片含菌量为105-106CFU/片。
如下表1所示为在波长为960nm的光电麦氏浊度计测试下，McF与菌悬液浓度的关系表：
表1麦氏浊度McF与细菌(真菌)悬液浓度关系表
2.1麦氏浊度法配制菌株悬液的浓度分析
通过多次配制不同菌株的菌株悬液，要求细菌菌株孵育在琼脂培养基上的孵育时间在24-48h内，测定麦氏浊度0.5的菌悬液试剂活菌浓度值的对数值，具体数据如下表2所示：
表2McF＝0.5的细菌的悬液的实际活菌计数值和对数值
由上表2可知，McF＝0.5的细菌的菌株悬液浓度均值接近1.50×108CFU/mL，且活菌对数值最大偏差＜0.5。
2.2菌片的实际含菌量分析
按照步骤201-步骤203的操作，滴加菌液到无菌玻片上，再通过恒温箱干燥，制得的菌片振荡液实际菌浓度与初始菌悬液浓度对比会有所损失，通过多次试验分析菌片的实际菌含量以及损失率。
试验结果如下表3所示：
表3金黄色葡萄球菌悬液初始含量菌片的实际菌含量以及下降的幅度
续表3金黄色葡萄球菌悬液初始含量菌片的实际菌含量以及下降的幅度
由上表3可知，恒温干燥后的菌片，通过振荡器把菌苔充分振荡到稀释液中制得的菌悬液，对比初始悬液，损失率在15％以内，菌含量仍然满足后续实验要求。
(3)抗菌性有效性能的检测：
步骤301.样品老化：
将银离子洗手液样品，于37℃的恒温箱中放置90天，或于54℃的恒温箱中放置14天后，按银离子洗手液包装规定有效期进行室温放置后，即得老化样品；
步骤302.老化样品抗菌性检测：
将步骤301中得到的老化样品与PBS缓冲溶液按质量比1.1:1，分散混合后，制备得到老化样品稀释液，将老化样品稀释液按步骤102进行抗菌性能检测；
步骤303抗.抗菌有效性的评估
若于37℃的恒温箱中放置90天的加速老化后，洗手液样品测定的抗菌性能仍复合要求(即符合QB/T 2957-2008、QB/T 2850-2007、GB 19877.1-2005等标准的要求)，则确定该洗手液样品的有效贮存期为2年；
若于54℃的恒温箱中放置14天的加速老化后，洗手液样品测定的抗菌性能仍复合要求，则确定该洗手液样品的有效贮存期为1年；
若于室温放置老化后，洗手液样品测定的抗菌性能仍复合要求，则确定该洗手液样品的有效贮存期符合其声明期限。
(4)中和剂的适用性测定试验
步骤401.取样品稀释液1mL，加入到含9mL无菌中和剂的试管中，具塞，用振荡器振荡20s，然后在室温条件下放置30min，制得“测试管”；
步骤402.取无菌PBS缓冲溶液1mL，加入到含9mL无菌中和剂的试管中，具塞，用振荡器振荡20s，然后在室温条件下放置30min，制得“对照管”；
步骤403.取标准菌株悬液1mL，分别加入“测试管”和“对照管”中，具塞，用振荡器振荡20s，然后在室温条件下放置5min后，进行活菌计数；
步骤404.分别取“测试管”和“对照管”与标准菌株悬液的混合体系，进行10倍系列稀释，取10倍稀释后的稀释液各1mL，接种至2个或以上无菌培养皿中，然后倾注琼脂培养基，细菌测试项目倾注营养琼脂，于36℃培养48h，真菌测试项目则倾注SDA琼脂培养基，于25℃培养72h；
步骤405.分别计算步骤404中“测试管”和“对照管”混合体系中的活菌数，“测试管”的活菌数定义为CT，“对照管”的活菌数定义为CR，如CT≥0.5CR且接近CR，则表示中和剂达到对该样品的适用性达到要求。
(5)样品微生物增殖风险测定
通过在样品或样品稀释液中加入一定量的标准菌株悬浮液，并在室温条件下放置一段时间，在放置过程中多次取样进行活菌计数，通过与初始悬液比对，评估样品内微生物增值风险；
步骤501.取20mL的样品稀释液和20mL无菌PBS溶液分配到不同无菌容器中，将20mL的样品稀释液定义为“测定组”，20mL无菌PBS溶液定义为“对照组”；
步骤502.将测定组和对照组两组的容器接种0.2mL的标准菌株悬液，具塞，用振荡器振荡20s，混合确保接种物均匀分布。然后取“对照组”混合液，参照步骤404进行活菌计数；
步骤503.将已接种的样品稀释液室温放置28天，其中，放置时间到第7天、第14天以及第28天时，参照步骤404取样液进行活菌计数；
步骤504.取培养后的已接种样液1mL，接种至9mL步骤401中已验证的中和剂稀释液中，具塞，用振荡器振荡20s，彻底混合以确保接种物均匀分布，然后分别取1mL混合物接种至无菌培养皿中，并参照步骤404方法进行活菌计数，并按照如下公式计算微生物的减少量：
计算方法：DX＝LogC0-LogCX
式中：DX：样品中微生物的减少值；CX：“测定组”的活菌计数值(X为已接种样品稀释液的室温放置天数)；C0：“对照组”的活菌计数值。
(6)样品综合稳定性评价数据分析
通过如上对多个银离子洗手液样品进行微生物增长风险评估试验和贮存稳定性试验，可分析样品短期常温存放条件下的稳定性和模拟长期存放环境条件下的稳定性。贮存稳定性试验用于评价样品的贮存有效期，而微生物增长风险评估试验，因其放置时期的样液为稀释100倍的体系，稀释后的体系中有效成分更容易失效，因此可以更容易观测出样品的有效抗(抑)菌成分的稳定性，检测结果具体见下表4：
表4样品综合稳定性评价数据分析
| 样品编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| LogC0 | 6.15 | 6.12 | 6.09 | 6.14 | 6.11 |
| D7＝LogC0-LogC7 | 6.15 | 6.12 | 6.09 | 6.14 | 6.11 |
| D14＝LogC0-LogC14 | 6.15 | 6.09 | 6.09 | 6.14 | 6.11 |
| D28＝LogC0-LogC28 | 6.15 | 5.62 | 6.09 | 6.14 | 6.11 |
由表4可知，1,、3、4、5号样品，在28天后仍然保持着最低的微生物增长风险，编号2的样品，在放置28天后，虽仍然保持着较低微生物增长风险，但是仍可以观测出微生物增长风险有一定程度的增长。
本申请提供银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其包括洗手液样品稀释，洗手液样品抗菌性检测，设置空白对照组与抗菌率计算三个步骤，通过使用标准菌片替代传统的标准菌液，进行洗手液抗菌性检测，与现有技术的国标检测方法对比，利用麦氏浊度法预估标准菌株悬液浓度，大幅降低因悬液配制浓度与设计的浓度偏差大所造成的重复试验风险，提出基于“载体定量浸泡法”的银离子抗(抑)菌洗手液测试的抗菌性能方法；更符合洗手液的产品特性与使用方法，更客观地评价产品的抗(抑)菌性能；能通过评估样品的微生物增殖风险和贮存有效期限，更全面地评价样品的综合稳定性，对微生物增长风险测定具有较高的试验灵敏度，更符合洗手液产品的特性和使用方法，能够更客观的评价产品的抗菌性能，具有检测时间短，灵敏度高，准确度高，操作简单，便于推广实施的优点。
Claims (9)
1.银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤101.样品稀释：
将银离子洗手液样品与无菌PBS缓冲溶液混合分散后，即得样品稀释液；
步骤102.样品抗菌性检测：
将所述步骤101中制备得到的样品稀释液以及含菌量为105-106CFU/片的标准菌菌片放入无菌培养皿A1中，作用一定时间后，从无菌培养皿A1中取适量的培养液S，并使用中和剂去除其中有效消毒成分后，接种至无菌培养皿A2中，进行活菌计数后，得到活菌计数值CS；
步骤103.设置空白对照与抗菌率计算：
将无菌标准硬水以及含有标准菌的菌片放入无菌培养皿B1中，作用一定时间后，从无菌培养皿B1中取适量的培养液P，接种至无菌培养皿B2中，进行活菌计后，得到活菌计数值CP，并通过以下公式计算抗菌率A，A＝CP-CS/CP。
2.根据权利要求1所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤102中菌片的制备方法包括以下步骤：
步骤201.标准菌活化：
将标准菌投入无菌培养基中，在24-37℃的条件下，培养22-52h后得到标准菌株，将该标准菌株分离至无菌琼脂平板或脂斜面上，在24-36℃的条件下，培养22-52h后，收集从无菌琼脂平板或脂斜面上刮下菌苔，即得活化标准菌；
步骤202.标准菌液制备：
将所述步骤201中得到的活化标准菌接种于含有生理盐水的无菌试管中旋涡振荡至一定浓度后，得到标准菌悬液，向标准悬菌液内加入牛血清蛋白分散均匀后，即得标准菌液；
步骤203.菌片制备：
将所述步骤202中制备得到的标准菌液染点于无菌玻片表面后，将无菌玻片置于无菌培养皿内培养一定时间，并将无菌培养皿干燥后，即得菌片。
3.根据权利要求2所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤202中标准菌悬液浓度测试方法为使用光电麦氏浊度计测量标准菌悬浊度McF后，通过以下公式计算标准菌悬液浓度Cm,Cm＝McF×3×108。
4.根据权利要求2所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤202中通过光电麦氏浊度计测量方法测得的标准菌悬浊液浓度的对数值与实际活菌计数值的对数值的最大偏差＜0.5。
5.根据权利要求2所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤202中准菌悬液浓度为107-1010CFU/mL。
6.根据权利要求2所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤203中所得的菌片的含菌量与所述步骤202中所得的标准菌悬液含菌量满足以下关系：(标准菌悬液含菌量-菌片的含菌量)/标准菌悬液含菌量≤15％。
7.根据权利要求1所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述标准菌为革兰氏阴性代表菌株、大肠埃希氏菌、革兰氏阳性代表菌株、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及铜绿假单胞菌中的任一种。
8.根据权利要求1所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤102中，中和剂的为PBS缓冲液，卵磷脂以及吐温-80的混合物。
9.根据权利要求1所述的银离子洗手液抗菌性能的检测方法，其特征在于，所述步骤102中，中和剂为1000mL PBS缓冲液，3g卵磷脂，以及20g吐温-80的混合物。
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| CN202311210481.4A CN117247985A (zh) | 2023-09-19 | 2023-09-19 | 银离子洗手液抗菌性能的检测方法 |
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