JP2003501092A - 標的化新脈管形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、末梢脈管疾患または心臓血管疾患における処置において、新脈管形成を促進または阻害するための組成物、方法、および遺伝子療法試薬に関し、脈管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結された脈管形成因子を含むキメラ分子を使用する。本発明はまた、脈管形成因子が、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、またはＶＥＧＦ−Ｒ３の少なくとも１つに特異的に結合するキメラ分子に関する。本発明はさらに、脈管形成因子が、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、またはＶＥＧＦ−Ｒ３の少なくとも１つに特異的に結合するキメラ分子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、末梢血管または心臓血管の疾患の処置のためにインビボにおいて新
脈管形成を促進または阻害するための組成物、方法および遺伝子治療試薬に関す
る。詳細には、本発明は、新脈管形成を誘導するために血管内皮に特異的に結合
する標的化分子に連結されている新脈管形成因子の使用に関する。

【０００２】 （発明の背景） 新脈管形成は、既存の血管からの毛細血管内皮細胞の増殖、移動および組織浸
潤を含む、新しい血管を発生するプロセスである。新脈管形成は、正常な生理学
的プロセス（胚発生、濾胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）増殖および創傷治癒を含む
）ならびに病理学的状態（腫瘍増殖および異常な新生血管形成に関連する非腫瘍
性疾患（血管新生緑内障を含む）を含む）に重要である（例えば、Ｆｏｌｋｍａ
ｎ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３５：４４２−４４７を参照のこと
）。

【０００３】 組織虚血を生じるかまたは組織虚血に関与する疾患および状態は、主要な健康
上の問題である。虚血は、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢血管疾患
（ＰＶＤ）において見られる。米国において約６０００万人の成人が心臓血管疾
患を有し、うち１１００万人の成人が冠状動脈性心臓病を有することが、米国心
臓学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって報
告されている。アンギナ（心臓虚血の症状）は、米国において１５０万人の成人
（毎年約３５０，０００例の新患を含む）が罹患している。ＰＶＤは、成人人口
の約３０％が罹患していると推定されている。ＰＶＤ、アテローム性硬化症性血
管疾患、冠状動脈性心臓疾患（ＣＨＤ）および脳血管性疾患の主な原因は、糖尿
病である。

【０００４】 虚血は、組織が血液供給を十分に受けない場合に生じる。例えば、心筋虚血は
、心筋が十分な血液供給を受けない場合に生じる。これは、血管の閉塞または狭
小化（例えば、冠状動脈アテローム性硬化症に見られるような）に起因し得る。
処置としては、外科的アプローチおよび薬学的アプローチが挙げられる。外科的
介入は、狭小化した管腔を広げるため（例えば、バルーン血管形成）または心臓
血管数を増加するため（例えば、移植片を使用するバイパス手術）に使用される
。より外傷性が低い薬学的処置は、酸素および栄養分の心筋の要求量を減少する
ように、または血液供給を増加するように作用する。酸素要求量は、血流力学的
負荷に対する心臓の収縮応答を減少することによって低下され得る（例えば、β
−アドレナリン作用性ブロッカーを使用して）。心臓の血液供給は、平滑筋の壁
を有する冠状動脈血管管腔の直径を増加することによって増大され得る（例えば
、ニトログリセリンまたはカルシウムチャネルブロッカーを用いて）。しかし、
これらの薬学的処置は、不正確であり、一過的に活性であり、そして薬物相互作
用および副作用への高い傾向がある。

【０００５】 虚血組織への血液供給を増加するための別の手段は、新脈管形成を介してその
組織への血管の増殖を誘導することであるか、またはその組織を浴する血液の量
を増加させること（血液灌流の増加とも言われる）である。これは、新脈管形成
因子の投与によって達成される。いくつかの因子は、インビボでの新脈管形成の
潜在的なレギュレーターとして関係付けられている。これらには、トランスフォ
ーミング増殖因子（ＴＧＦβ）、酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽細
胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、な
らびに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．ら、
Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）５３：２１７−２３９を
参照のこと）。内皮細胞特異的マイトジェンである、ＶＥＧＦは、内皮細胞の増
殖を特異的に促進することによって、新脈管形成のインデューサーとして作用す
るという点で、これらの因子の間で区別される。

【０００６】 ＶＥＧＦは、新脈管形成の重要なメディエーターである。なぜなら、ＶＥＧＦ
は、直接的かつ特異的に内皮細胞に対して作用するからである。例えば、Ｇｒａ
ｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．（１９９８）３６：３７９−３８
３を参照のこと。インビボにおいて、ＶＥＧＦは、発生、創傷修復（新脈管形成
は、組織損傷によって誘発される修復機構の重要な要素である）、癌ならびに他
の疾患および状態における血管の増殖に関連する。

【０００７】 新脈管形成効果を達成するために、ポリペプチド新脈管形成因子（例えば、Ｖ
ＥＧＦ）の繰返しのおよび／または長期間の投与が必要とされる。しかし、この
アプローチは、注射による繰返しの投与を通常必要とするので、代表的には、非
常に費用がかかりかつ不便である。

【０００８】 あるいは、ポリペプチド新脈管形成因子は、そのポリペプチド自体ではなく、
そのポリペプチドをコードする核酸を投与することによって、インビボで投与さ
れ得る。新脈管形成遺伝子は、静脈内でインビボ投与されている。例えば、Ｌａ
ｉｔｅｉｎｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９８）９：１４８１−
１４８６；Ｉｓｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ（１
９９７）３０：１８５−１９７；Ｇｉｏｒｄａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．
（１９９６）２：５３４−５３９；Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．（１９９６）７５：４８７−５０１；ＭｃＤｏｎａｌｄら、米国特許第５，
８３７，２８３号（「２８３」特許）を参照のこと。

【０００９】 ポリペプチドコード遺伝子は、筋肉内注射されている（裸のプラスミドＤＮＡ
またはウイルス発現ベクターとして）。Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．ら、Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９８）９７：１１１４−１１２３：Ｔｓｕｒｕｍｉ
Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９７）９６（補遺９）：ＩＩ−３８２−
８；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（１９９６）７５：４
８７−５０１；Ｈａｍｍｏｎｄ、米国特許第５，７９２，４５３号；およびＭｃ
Ｄｏｎａｌｄら、「２８３」特許（前出）を参照のこと。Ｍａｊｅｓｋｙ，Ｍ．
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９６）９４：３０６２−４もまた参照のこと。

【００１０】 新脈管形成に関与するリガンドおよびレセプターをコードする遺伝子の同定に
おける近年の進歩にかかわらず、現在の方法が、末梢性または心筋の虚血を克服
するために必要とされる新脈管形成のレベルを促進するという指摘は全く存在し
ない。例えば、既存の治療においては、新脈管形成効果を達成するために新脈管
形成タンパク質の繰返しまたは長期間の送達の必要性が存在する。これは、臨床
設定において新脈管形成を刺激するためのこれらのタンパク質の使用の有用性を
制限し得る。言い換えると、ヒトにおける首尾よい治療は、１以上のこれらの新
脈管形成ペプチドまたは新脈管形成タンパク質の持続性かつ長期間の注入を必要
とする。この注入は、それ自体で非常に高費用であり、そして冠状動脈に配置さ
れたカテーテルによって送達される必要性があり、これが、さらに処置の費用お
よび困難性を増大する。

【００１１】 虚血組織に関連する疾患および状態に罹患している高齢集団の個体数の増加を
考慮すると、投与するためにより安全で、より予測的でかつより容易である、虚
血のための新たな処置が必要とされる。本発明は、これらの必要性および関連す
る利点を提供する。

【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、血管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結されている新脈管形
成因子を含む、キメラ分子を提供する。いくつかのこのようなキメラ分子は融合
タンパク質であり、ここで、この融合タンパク質は、血管内皮に特異的に結合す
る標的化分子に連結されている新脈管形成因子を含む。

【００１３】 本発明はまた、新脈管形成を誘導する方法を提供する。この方法は、細胞にキ
メラ分子を接触させる工程を包含し、このキメラ分子は、血管内皮に特異的に結
合する標的化分子に結合されている新脈管形成因子を含む。

【００１４】 本発明はさらに、心筋新生血管形成を増加するための方法を提供する。この方
法は、心臓血管の内皮細胞にキメラ分子を接触させる工程を包含し、このキメラ
分子はさらに、血管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結されている新脈管
形成因子を含む。

【００１５】 本発明はさらに、末梢血管系における虚血組織において新生血管形成を増加す
るための方法を提供する。

【００１６】 本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチ
ドを提供する。この融合タンパク質はさらに、新脈管形成因子および標的化分子
を含み、この標的化分子は、血管内皮に結合する。

【００１７】 本発明はさらに、組織において新脈管形成を誘導する方法を提供する。この方
法は、内皮細胞を核酸分子でトランスフェクトする工程を包含し、これによって
、この細胞は、この核酸によってコードされる融合タンパク質を発現し、ここで
、融合タンパク質は、新脈管形成因子および標的化分子を含む。

【００１８】 本発明はさらに、薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物はキメラ分
子および薬学的受容可能なキャリアを含み、このキメラ分子は、血管内皮に特異
的に結合する標的化分子に連結されている新脈管形成因子を含む。他の薬学的組
成物は、融合タンパク質を含む。これらの融合タンパク質は、新脈管形成因子お
よび標的化分子を含み、この標的化分子は、血管内皮に特異的に結合する。

【００１９】 （詳細な説明） （定義） 用語「新脈管形成」とは、新しい血管が既存の血管系（例えば、毛細血管）か
ら発生するプロセスをいう。例えば、Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
．（１９９２）１：２７−２１を参照のこと。新脈管形成は、複雑なプロセスで
あり（Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１０
９３１−４およびＦａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．（１
９９５）１６：５７−６６；これらの参考文献および本明細書中に引用される参
考文献は、本明細書中に参考として援用される）、これは、以下を含み得る：内
皮細胞および周皮細胞の活性化；基底膜の分解；内皮細胞および周皮細胞の移動
および増殖（すなわち、細胞分裂）；新しい毛細血管管腔の形成；その新しい管
の周辺での周皮細胞の出現；新しい基底膜の発生；毛細血管わなの形成；新しい
管の退縮、分化の維持；ならびに毛細血管網の形成および最終的なより大きい微
小血管への組織化。例えば、Ｓａｆｉ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉ
ｏｌ．（１９９７）２９：２３１１−２３２５を参照のこと。組成物は、インビ
トロまたはインビボにおいて新脈管形成活性についてスクリーニングされ得る。
例示的なインビトロ毛細血管形成評価は、例えば、Ｄｅｒａｍａｕｄｔら、Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６８：１２１−１２７に記載のように
、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリクス（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に埋め込まれた内皮細胞を使用する。インビボ動物
モデルを、以下に議論する。用語「血管内皮」とは、例えば、漿液管腔、リンパ
管および血管を裏打ちする平坦な内皮細胞の薄層を意味する。血管内皮は、血管
の緊張、ホメオスタシス、免疫応答および炎症応答の調節において重要な役割を
果たす（例えば、Ｖａｎｅ Ｊ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ（１９９０
）３２３：２７−３１を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引用
される参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。これらの生物学的反
応は、循環細胞と血管内皮との間の密接な相互作用に関連し得る。白血球の血管
内皮への接着は、全ての形態の損傷に対する反応において最も重要な事象の１つ
であり得る（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，（１
９９４）３０７：３７８−３８９；Ａｌｂｅｌｄａ，Ｓ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．
（１９９４）８：５０４−５１２；Ｗｅｓｔｌｉｎ，Ｗ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔ
ｈｏｌ，（１９９３）１４２：１５９８−１６０９を参照のこと；これらの参考
文献および本明細書中に引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用さ
れる）。内皮細胞の活性化白血球との相互作用は、欠損性の内皮依存性血管拡張
、血管浸透性および凝固カスケードの活性化の増加に関連し得る。反応性酸素種
、スーパーオキシドおよび炎症性サイトカインを含む、多くの白血球産物は、内
皮機能を損ない、そして炎症と凝固との間の正のフィードバックループについて
可能性を生じ得る。これらの分子は、以下を含むがそれらに限定されない、多く
の病理学的プロセスにおいて役割を果たし得る：アテローム性動脈硬化症、移植
片拒絶、敗血性ショック、後期過敏性反応および再灌流障害（Ｃａｒｏｌｓ，Ｔ
．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４：２０６８−２１０１；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．
ら、前出を参照のこと）。

【００２０】 新脈管形成は、通常、創傷治癒、胎児および胚の発生、ならびに黄体、子宮内
膜および胎盤の形成において観察される。持続性の調節されない新脈管形成は、
癌における腫瘍転移および内皮細胞による異常増殖を含むがこれらに限定されな
い、多くの疾患状態を生じ、そしてこれらの状態に見られる病理学的損傷を支持
する。調節されない新脈管形成が存在し得る多様な病理学的疾患状態は、まとめ
て、「新脈管形成依存性」または「新脈管形成関連疾患」とグループ化されてい
る。新脈管形成によって媒介される疾患およびプロセスとしては、以下が挙げら
れるが、これらに限定されない：血管腫、固形腫瘍、血管媒介腫瘍（ｂｌｏｏｄ
ｂｏｒｎｅ ｔｕｍｏｒ）、白血病、転移、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫（ｐ
ｈｙｇｅｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａ）、心筋血管形成、クローン病、プラーク
新生血管形成、冠状側副枝形成（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）
、脳側副枝形成（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、動静脈奇形、
虚血性肢血管形成、角膜疾患、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、関節炎、糖尿
病性新生血管形成、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ関連疾患、および脈管形成。

【００２１】 用語「新脈管形成活性」、「新脈管形成因子活性」、「血管内皮増殖因子活性
」および「新生血管形成」は、例えば、以下を含む、組織への血流量を増大する
広範な生理学的活性を含む：血管透過性の増大、血管密度の増加、内皮細胞（Ｅ
Ｃ）活性化、ＥＣ移動、ＥＣ増殖、毛細血管形成（新脈管形成）、脈管形成（血
管構造へのＥＣの新生組織化）；例えば、Ｆｏｌｋｍａｎら（１９９２）前出を
参照のこと）。新脈管形成活性としては、新脈管形成を誘導する新脈管形成因子
、または新脈管形成を阻害する新脈管形成因子、あるいは内皮増殖因子の発現を
誘導する新脈管形成因子（例えば、遺伝子アクチベーターまたは転写レギュレー
ター）が挙げられる。新脈管形成因子としては、血管増殖を誘導または阻害する
ように作用する、任意のタンパク質、ペプチド、化学分子または他の分子が挙げ
られるが、これらに限定されない。新脈管形成因子は、天然に存在し得るか、ま
たは天然に存在していなくともよい。種々の方法が、生物学的活性アッセイ（例
えば、ウシ毛細血管内皮細胞増殖アッセイ）を使用して所定の因子の新脈管形成
活性を測定するために使用され得る。他のバイオアッセイとしては、ニワトリＣ
ＡＭアッセイ、マウス角膜アッセイ、ならびに移植した腫瘍に対する単離された
タンパク質または合成タンパク質の投与効果が挙げられる。ニワトリＣＡＭアッ
セイは、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ，（１９９４）７９：３１５−３２８に
よって記載される。多くの系が、新脈管形成を評価するために利用可能である。
例えば、新脈管形成は固形腫瘍増殖に必要とされるので、動物モデルにおける腫
瘍増殖の阻害は、新脈管形成の阻害の指標として使用され得る。新脈管形成はま
た、創傷治癒（皮膚または器官の創傷修復における）；および慢性炎症（例えば
、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症および特発性肺線維症（ＩＰＲ）
のような疾患における）のモデルという点から評価され得る。新脈管形成因子活
性はまた、例えば、マーカー分子（例えば、ＣＤ３Ｈ、第ＶＩＩＩ因子またはＰ
ＥＣＡＭ−１）について染色した後、組織切片中の血管を計数することによって
評価され得る。新脈管形成因子活性を評価するために使用され得る他の系として
は、内皮細胞走化性アッセイが挙げられる。新脈管形成因子または新脈管形成薬
剤は、例えば、内皮細胞走化性をコントロール値を超えるよう促進する能力によ
るアッセイにおいて同定され得る。内皮細胞走化性の阻害は、抗新脈管形成活性
の証拠を提供し得る。抗新脈管形成因子または抗新脈管形成薬剤は、内皮細胞走
化性を、新脈管形成薬剤によって刺激されるレベルよりも下に一貫して減少する
ことによって同定され得る。

【００２２】 用語「血管内皮細胞増殖因子」または「ＶＥＧＦ」は、単独または他の増殖因
子（例えば、線維芽細胞増殖因子（以下で議論される））と共に、血管発生、新
脈管形成および他の新脈管形成活性を惹起し得る、増殖因子のファミリーを含む
（例えば、Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２３７巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９９９）を参照のこと；これらの参考文献および本明細
書中に引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。Ｖ
ＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａと呼ばれる；例えば、Ｌｅｕｎｇ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１３０６−１３０９を参照のこと）を
含む。このＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、７つのイントロンで分けられた、８つのエキ
ソンで組織される。単一のＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の選択的エキソンスプライシング
は、４つの分子の生成を生じ、これらは、１２１アミノ酸、１６５アミノ酸、１
８９アミノ酸および２０６アミノ酸のヒトタンパク質（ＶＥＧＦ−Ａ₁₂₁、ＶＥ
ＧＦ−Ａ₁₆₅、ＶＥＧＦ−Ａ₁₈₉、ＶＥＧＦ−Ａ₂₀₆：マウスＶＥＧＦ−Ａアイソ
フォームは、ヒトアイソフォームより１アミノ酸少ない）をコードする；例えば
、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）２７
３（５、パート２）：Ｈ２０９１−１０４；米国特許第５，１９４，５９６号；
同第５，２４０，８４８号；および同第５，３３２，６７１号を参照のこと。他
のファミリメンバーとしては、以下が挙げられる：ＶＥＧＦ−Ｂ（例えば、Ｏｌ
ｏｆｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）
９３：２５７６−２５８１を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に
引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される；これは、「
ＶＲＦ」とも称される；例えば、Ｇｒｉｍｍｏｎｄ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒ
ｅｓ．（１９９６）６：１２４−１３１を参照のこと）；ＶＥＧＦ−Ｃ（例えば
、Ｊｏｕｋｏｖ，Ｖ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９６）１５：２９０−２９８お
よびＷＯ９６／３９５１５を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に
引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される；これは、Ｖ
ＥＧＦ関連タンパク質または「ＶＲＰ」とも称される；Ｌｅｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１９８８−１９９
２を参照のこと）；ＶＥＧＦ−Ｄ（「ＦＩＧＦ」と称される、Ｏｒｌａｎｄｉｎ
ｉ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３
：１１６７５−１１６８０およびＹａｍａｄａ，Ｙ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（
１９９７）４２：４８３−４８８を参照のこと）；および胎盤増殖因子（ＰＩＧ
Ｆ）（例えば、Ｍａｇｌｉｏｎｅ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：９２６７−９２７１を参照のこと）。近年、Ｖ
ＥＧＦ−Ｅ（第５のＶＥＧＦファミリーメンバー）が、単離および特徴付けられ
ている（例えば、Ｏｇａｗａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）
２７３（４７）：３１２７３−３１２８２およびＭｅｙｅｒ，Ｍ．ら、ＥＭＢＯ
Ｊ．（１９９９）１８（２）：３６３−３７４を参照のこと）。

【００２３】 ヒト胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）は、ＶＥＧＦとタンパク質レベルで４６％の相
同性を共有する、グリコシル化されたホモダイマーである。ヒトＰＩＧＦ ｍＲ
ＮＡの示差的スプライシングは、１７０アミノ酸または１４９アミノ酸のいずれ
かの前駆体を導き得、これらの前駆体は、それぞれ、１５２アミノ酸長または１
３１アミノ酸長の成熟形態にタンパク質分解的にプロセシングされる。例えば、
ＢａｙｎｅおよびＴｈｏｍａｓ ＥＰ０５０６４７７；Ｍａｇｌｉｏｎｅ，Ｄ．
ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：９２５−９３１；Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．お
よびＷｅｉｃｈ，Ｈ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（１９９３）９：２５９−
２６８を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引用される参考文献
は、本明細書中に参考として援用される。

【００２４】 用語「線維芽細胞増殖因子」または「ＦＧＦ」は、単独または他の増殖因子（
例えば、ＶＥＧＦファミリーの増殖因子）と共に、血管発生、新脈管形成および
他の新脈管形成活性を惹起し得る、増殖因子のファミリーを含む。ＦＧＦファミ
リーとしては、少なくとも２０個のポリペプチドが挙げられる（例えば、Ｇｏｎ
ｃａｌｖｅｓ，Ｌ．，Ｒｅｖ Ｐｏｒｔ Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９８）１７、補
遺２：ＩＩ１１−２０を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引用
される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。酸性ＦＧＦ（
ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）
は、このファミリーのうちで最も広範に特徴付けられているメンバーである。例
えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ，Ｐｒｏｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅ
ｓ（１９８９）１：２０７−３５；Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ａｎｎ ＮＹ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（１９９１）６３８：４６７−９；およびＳｌａｖｉｎ，
Ｊ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ（１９９５）１９：４３１−４４を参照のこ
と；これらの参考文献および本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細
書中に参考として援用される。

【００２５】 新脈管形成を誘導する他の新脈管形成因子としては、アンギオポイエチンタン
パク質ファミリーが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｄａｖｉｓ
，Ｓ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９
）２３７：１７３−８５；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ Ａ．ら、Ｌａｂ
Ｉｎｖｅｓｔ（１９９９）７９：２１３−２３；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．，
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：１９０４−
９；Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１１７１−１１８０；Ｔａｋｅｈ
ａｒａら、Ｃｅｌｌ（１９８７）４９：４１５−４２２；Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ
（１９９６）８７：１１７１−１１８０を参照のこと；これらの参考文献および
本明細書中に引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。用
語「アンギオポイエチン−１」または「Ａｎｇ１」とは、Ｔｉｅ−２レセプター
に対するリガンドであるタンパク質をいう（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：８１６−８１９を参照のこと）。Ａｎｇ１は、
（アゴニストとして）Ｔｉｅ−２レセプターを刺激し得る。用語「アンギオポイ
エチン−２」または「Ａｎｇ２」とは、ＴｉｅレセプターのＡｎｇ１刺激性活性
化を（アンタゴニストとして）ブロックし得るタンパク質をいう（例えば、Ｍａ
ｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：５５−６
０を参照のこと）。Ａｎｇ１刺激性活性化のブロックは、インビボで新脈管形成
を破壊し得る。

【００２６】 用語「ＶＥＧＦのホモログ」としては、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧ
Ｆ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−ＥおよびＰＩＧＦのホモダイマー、ならびに
ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅとの
間で形成される任意の機能的ヘテロダイマー（ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｂへテ
ロダイマーを含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

【００２７】 脈管発生および新脈管形成の間の細胞間の伝達は、少なくとも５つの内皮細胞
特異的チロシンキナーゼレセプターに関係し得る（例えば、Ｃｌａｅｓｓｏｎ−
Ｗｅｌｓｈ，Ｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２３７巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９９９）お
よびＭｕｓｔｏｎｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）１２９：
８９５−８９８を参照のこと；これらの参考文献およびそれらに引用される全て
の参考文献は、本明細書中において参考として援用される）。これは、少なくと
も２つの異なるサブクラスに属する：Ｔｉｅファミリーの二つのレセプター（例
えば、Ｐａｒｔａｎｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ（１９９９）２３７：１５８−１７１を参照のこと）および３つのＶＥＧ
Ｆレセプター：ＶＥＧＦＲ−１、−２、および−３。これら３つのＶＥＧＦレセ
プターは、それぞれ、もともとＦｌｔ１（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ；例えば、
Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ、Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：９８９−９９
１を参照のこと）、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（キナーゼ挿入−ドメイン含有レセプタ
ーまたは胎児肝臓キナーゼ−１；Ｔｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９２）１８７：１５７９−１５８６を参照
のこと）およびＦｌｔ４（例えば、Ｐａｊｕｓｏｌａ，Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ（１９９２）５２：５７３８−５７４３およびＧａｌｌａｎｄ、Ｆ．ら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：１２３３−１２４０を参照のこと）と呼ばれて
いた。ＶＥＧＦの生物学的な応答は、これらの高い親和性ＶＥＧＦレセプターを
介して媒介される。

【００２８】 ＦＧＦレセプターもまた特徴付けられており、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＧ−２、
ＦＧＦＲ−３およびＦＧＦＲ−４を含む（例えば、Ｋｌｉｎｔ，Ｐ．ら、Ｆｒｏ
ｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９１）１５：Ｄ１６５−７７およびＧａｌｚｉｅ，
Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９７）７５：６９９−８
５；これらの参考文献およびそこに引用される全ての参考文献は、本明細書中に
おいて参考として援用される）。

【００２９】 種々のインビボ動物モデルが、（上記インビトロ試験に加えて（上記Ｆｏｌｋ
ｍａｎ（１９９２）を参照のこと））本発明のキメラ分子が脈管形成活性を有す
る能力を評価するために使用され得る。例えば、虚血性筋肉の新脈管形成は、外
因的に投与される本発明のキメラ分子が、実験的に誘導されたマウスまたはラビ
ットの後肢虚血において側副肢血流を増加する実験によって示され得る。例えば
、Ｐｕ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．（１９９４）７：４９−６０；
Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２
：１６６７−１６７９；Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．
Ｐａｔｈ．（１９９８）１５３：３８１−３８４）；およびＢａｕｔｅｒｓ，Ｃ
．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９５）９１：２８０２−２８０９）を参照
のこと；これらの参考文献およびそれらに引用される全ての参考文献は、本明細
書中において参考として援用される。ＶＥＧＦの筋肉内遺伝子移動の後に側副肢
微小血管の内皮依存性弛緩は、実験的に誘導されたラットの後肢虚血において示
されている。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（
１９９８）９８：１２６１−６３を参照のこと；これらの参考文献およびそれら
に引用される全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用される。浸
透圧ポンプからの制御されたＶＥＧＦの局所的送達は、部分的虚血性後肢ラビッ
トモデルにおいて新脈管形成、肢灌流、および機能的改善を促進することが実験
的に示された。例えば、Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．（
１９９８）２７：８８６−８９４を参照のこと；これらの参考文献およびそれら
に引用される全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用される。慢
性ブタ心筋虚血モデルにおけるＶＥＧＦ投与に関する実験もまた、使用されてい
る。例えば、Ｈａｒａｄａ，Ｋ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）
２７０：８８６−９４を参照のこと；これらの参考文献およびそれらに引用され
る全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用される。

【００３０】 用語「虚血」「末梢血管疾患」、「アテローム性動脈硬化症」および「冠動脈
疾患」は、本明細書中で使用される場合、それらの一般的な使用法を含む。これ
らの疾患、障害、または病気（ａｉｌｍｅｎｔ）は、ＶＥＧＦまたはＦＧＦによ
って、単独で、または組み合わせて、他の脈管形成因子に加えて調節され得る。
虚血は、例えば、不適切な灌流に起因する器官および四肢の組織における酸素供
給の不足によって特徴付けられる状態である。このような不適切な灌流は、少し
挙げると、アテローム性動脈硬化症損傷、再狭窄損傷、貧血、または発作を含む
多くの自然な原因を有し得る。例えば、バイパス手術の間の血流の中断のような
多くの医学的処置もまた、虚血を導く。疾患状態の心臓血管組織によって時々引
き起こされることに加えて、虚血は、時々、虚血性心臓疾患のような心臓血管組
織に影響し得る。しかし、虚血は、任意の器官または四肢において生じ得、これ
らは酸素供給の不足を被っている。

【００３１】 心臓における虚血の最も一般的な原因は、心外膜冠状動脈のアテローム性動脈
硬化症疾患である。これらの血管の管腔を減少させることによって、アテローム
性動脈硬化症は、基底状態における心筋灌流の絶対的な減少を引き起こすか、ま
たは流れに対する要求が増加する場合に灌流の適切な増加を制限する。冠状血流
はまた、動脈血栓、痙攣、およびまれに冠状塞栓によって、ならびに梅毒大動脈
炎に起因して狭くなる小孔によって制限され得る。肺動脈から左前室間冠状動脈
の異常な起点のような先天的な異常は、新生児期の心筋虚血および梗塞を引き起
こし得るが、これは成人においては非常に稀であり得る。心筋虚血はまた、高血
圧または大動脈狭窄に起因する重篤な心室肥大のような、心筋酸素要求が異常に
増加した場合、生じ得る。後者は、アテローム性冠状動脈硬化症によって引き起
こされる識別不能なアンギナとともに存在し得る。非常に重篤な貧血または一酸
化炭素ヘモグロビン血症の存在のような、血液の酸素運搬能の減少は、心筋虚血
の稀な原因であり得る。虚血の２つ以上の原因は同時に存在し得る（例えば、左
心室肥大に起因する酸素要求の増加およびアテローム性冠状動脈硬化症の次の酸
素供給の減少）。

【００３２】 心臓血管疾患は、心臓の血管の疾患をいう。例えば、Ｋａｐｌａｎ，Ｒ．Ｍ．
ら、「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、ＨＥＡＬＴＨ Ａ
ＮＤ ＨＵＭＡＮ ＢＥＨＡＶＩＯＲ，２０６〜２４２頁、（ＭｃＧｒａｗ−Ｈ
ｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３）を参照のこと；これらの参考文献および
それらに引用される全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用され
る。心臓血管疾患は、一般的に、例えば、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｉｏｎ）（
高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）とも呼ばれる）、冠状心臓
疾患、発作、およびリウマチ様心臓疾患を含むいくつかの形態の１つであり得る
。末梢血管疾患は、心臓以外の任意の血管の疾患をいう。それは、しばしば、脚
および腕の筋肉に血液を運搬する血管の狭まりであり得る。

【００３３】 用語「アテローム性動脈硬化症」は、医学の関連する分野における医師によっ
て認識され理解される血管の疾患および状態を包含する。アテローム性動脈硬化
症心臓血管疾患、冠状心臓疾患（冠状動脈疾患または虚血性心臓疾患としても公
知）、脳血管疾患および末梢血管疾患はすべて、アテローム性動脈硬化症の臨床
的な徴候であり、従って、用語「アテローム性動脈硬化症」および「アテローム
性動脈硬化症疾患」によって包含される。

【００３４】 用語「再狭窄」は、新脈管形成術およびステント挿入のような血管中断に続い
て血管管腔が再び狭まることをいう。初期管腔直径増加の損失として臨床的に規
定され得る。血管形成術前の血管直径を回復する期待において、身体は、血管壁
を再構築するか、空間を占め、管腔を再び閉塞する新たな組織増殖を刺激するか
、または組織収縮を刺激することを試みる。例えば、手術後に血管を治癒する間
、平滑筋細胞は、血管の管腔を狭め、そして再びアテローム性動脈硬化症プロセ
スを開始する内皮細胞よりも速く増殖する。

【００３５】 用語「調節する」は、抑制、増強、あるいは機能または状態の誘導をいう。例
えば、本発明のキメラ化合物は、虚血性心臓組織において新脈管形成を増加する
ことによって新脈管形成を調節し得、それによって虚血を軽減する。

【００３６】 用語「処置」は、疾患、状態、または障害と戦う目的のためのヒト被験体の管
理および看護を意味し、症状または合併症の発症を妨げるためか、症状または合
併症を軽減するためか、または疾患、状態または障害を除去するための、本発明
のキメラ分子の投与を包含する。

【００３７】 用語「誘導する」または「誘導」は、本明細書中で使用される場合、本明細書
中に記載されるような任意の組織の形成、修復プロセスまたは発生に必要な細胞
機構または細胞プロセスの活性化、刺激、増強、開始および／または維持をいう
。

【００３８】 用語「ライブラリー」は、分子の収集物を意味する。ライブラリーは、数個ま
たは多数の異なる分子（約１０個の分子から数十億個以上の分子で変動する）を
含み得る。所望であれば、分子は、タグに連結され得、これは、分子の回収また
は同定を促進し得る。

【００３９】 用語「分子」は、薬物；ペプチド（ペプチド模倣物またはペプトイドのような
改変体または改変ペプチドまたはペプチド様分子を含む）；あるいはタンパク質
例えば、抗体または増殖因子レセプターまたはそれらのフラグメント（例えば、
結合ドメインを含む抗体のＦ_v、Ｆ_cまたはＦ_ab）のような、有機化合物を意味す
るように広く使用される。分子は、非天然の分子（天然には存在しないが、イン
ビトロ法の結果として産生される）であり得るか、またはｃＤＮＡライブラリー
から発現されるタンパク質またはそれらのフラグメントのような天然に存在する
分子であり得る。

【００４０】 「キメラ分子」、「キメラタンパク質」、「脈管形成キメラ分子」、または「
脈管形成キメラタンパク質」は、天然の細胞表面脈管形成レセプター、他のチロ
シンキナーゼレセプター、または標的細胞または組織上の他のレセプターを認識
する少なくとも１つの結合部位、ならびに正常な標的細胞もしくは組織または異
常な標的細胞もしくは組織のいずれかに特異的に結合する少なくとも１つの第２
結合部位を有し得る分子である。

【００４１】 「融合タンパク質」は、第２のドメインに会合する少なくとも１つのポリペプ
チドまたはペプチドドメインを含む組成物をいう。第２のドメインは、ポリペプ
チド、ペプチド、多糖類などであり得る。「融合」は、ペプチド結合、化学連結
、電荷相互作用（例えば、塩架橋（ｓａｌｔ ｂｒｉｄｇｅ）、Ｈ結合のような
静電的引力）、非共有結合相互作用などによって生成される会合であり得る。ポ
リペプチドが組換えである場合、「融合タンパク質」は、通常のメッセージから
翻訳され得る。あるいは、ドメインの組成物は、任意の化学的または静電的手段
によって連結され得る。本発明の融合タンパク質はまた、リンカー、エピトープ
タグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含み得る。

【００４２】 用語「単離された」は、本発明のキメラ分子または標的分子のような分子また
は組成物を参照する場合、キメラ分子または標的ペプチドが、少なくとも１つの
他の化合物（例えば、タンパク質、他の核酸（例えば、ＲＮＡ）、あるいはイン
ビボまたはその天然に存在する状態で付随する他の混入物）から分離されること
を意味する。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離
された組成物は、均質な状態であり得、乾燥または水溶液であり得る。純度およ
び均質性は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定
され得る。従って、単離された標的分子は、そのインサイチュの環境で通常付随
する物質を含まない。タンパク質が均質または優勢なバンドに単離された場合で
さえ、所望のタンパク質と同時精製される微量の混入物が存在する。

【００４３】 発現ベクター、核酸、脈管形成因子、または送達ビヒクルを細胞に「投与」す
ることは、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スロケーション、融合、食作用、シューティング（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）またはバ
リスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）方法（すなわち、タンパク質または核酸が
細胞膜を横切って、好ましくは細胞の核に輸送され得る任意の手段）を包含する
。

【００４４】 「送達ビヒクル」は、例えば、リポソーム、毒素、または膜トランスロケーシ
ョンポリペプチドのような化合物をいい、これは、本発明のキメラ分子を送達す
るために使用される。送達ビヒクルはまた、脈管形成因子（例えば、脂質：核酸
複合体）をコードする核酸、発現ベクター、ウイルスなどを投与するために使用
され得る。

【００４５】 用語「異種」は、相対的な用語であり、これは、核酸の部分を参照して使用さ
れる場合、核酸が互いに天然には同じ関係で見出されない２つ以上の下位配列（
ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことを示す。例えば、組換え的に産生された核
酸は、典型的には、新規な機能の核酸を作製するために合成的に配置された無関
係の遺伝子由来の２つ以上の配列（例えば、１つの供給源からのプロモーターお
よび別の供給源からのコード領域）を有する。従って、２つの核酸は、この状況
において互いに異種である。細胞に加えられる場合、組換え核酸はまた、細胞の
内因性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸は、染色
体に組み込まれた非ネイティブな（非天然の）核酸、または非ネイティブ（非天
然）染色体外核酸を含む。対照的に、天然にトランスロケートされた染色体の片
は、本特許出願の状況において異種であると考えない。なぜなら、これは、変異
細胞にネイティブな内因性核酸配列を含むからである。

【００４６】 同様に、異種タンパク質は、このタンパク質が天然では互いに同じ関係では見
出されない２つ以上の下位配列を含むことを示す（例えば、「融合タンパク質」
、ここでは、２つの下位配列が単一の核酸配列によってコードされる）。例えば
、組換え技術の導入として、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）１９９７；これら
の参考文献およびそれらに引用される全ての参考文献は、本明細書中において参
考として援用される）を参照のこと。

【００４７】 用語「組換え」は、例えば、細胞、あるいは核酸、タンパク質、またはベクタ
ーを参照して使用される場合、異種核酸またはタンパク質の導入、あるいはネイ
ティブな核酸またはタンパク質の改変、あるいは細胞がそのように改変された細
胞から誘導されることによって、改変されたことを示す。従って、例えば、組換
え細胞が、細胞のネイティブ（天然）の形態で見出されない遺伝子を発現するか
、あるいは、そうではなく正常に発現されるか、異常に発現されるか、少なく発
現されるか、または全く発現されないネイティブな遺伝子の２代目のコピーを発
現する。

【００４８】 用語「プロモーター」は、転写を指向する核酸制御配列のアレイとして規定さ
れる。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、典型的に、例えば、特定
のＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡエレメント、エンハンサー
、ＣＣＡＡＴボックス、ＳＰ−１部位などの場合、転写の開始部位近くの必要な
核酸配列を含む。本明細書中で使用される場合、プロモーターはまた、必要に応
じて遠位エンハンサーまたはレプレッサエレメントを含み、これは、転写の開始
部位から数千塩基対離れて配置され得る。プロモーターは、しばしば、ポリペプ
チド（例えば、核酸レセプター、Ｇａｌ４、ｌａｃレプレッサなど）のようなＤ
ＮＡ結合部分によってトランスアクティベーションに応答性のエレメントを有す
る。

【００４９】 用語「構成」プロモーターは、大部分の環境条件および発生条件下で活性なプ
ロモーターである。「誘導」プロモーターは、特定の環境条件または発生条件下
で活性なプロモーターである。

【００５０】 用語「弱いプロモーター」は、野生型の単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）
チミジンキナーゼ（「ｔｋ」）プロモーターまたは変異ＨＳＶ ｔｋプロモータ
ー（ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．（１９８５）５：１９４０−１９４７に記載される）とおよそ同じ活性を有す
るプロモーターをいう。

【００５１】 用語「作動可能に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター
、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸との間の機能的連結をいい、
ここで、この発現制御配列が、第２の配列に対応する核酸の転写に指向する。

【００５２】 「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の核酸の転写、ならびに必要に応
じて、宿主細胞における発現ベクターの組込みまたは複製を可能にする、一連の
特定の核酸エレメントを用いて組換え的または合成的に生成される核酸構築物で
ある。発現ベクターは、ウイルスまたは非ウイルス由来のプラスミド、ウイルス
、または核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、「
発現カセット」を含み、この発現カセットは、転写される核酸を含み、プロモー
ターに作動可能に連結される。用語発現ベクターはまた、プロモーターに作動可
能に連結される裸のＤＮＡを含む。

【００５３】 「宿主細胞」は、本発明のキメラ分子あるいは本発明のキメラ分子をコードす
る発現ベクターまたは核酸を含む細胞を意味する。宿主細胞は、典型的に、発現
ベクターの複製または発現を支持する。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ．のような原
核生物細胞、あるいは酵母細胞、真菌細胞、原生動物細胞、高等植物細胞、昆虫
細胞、または両生類細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９
３、ＣＯＳ−１など）のような真核生物細胞（例えば、培養細胞（インビトロ）
、外植片および一次培養物（インビトロおよびエキソビボ）、ならびにインビボ
細胞）であり得る。

【００５４】 用語「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体をいう。この用語は、
公知のヌクレオチドアナログあるいは改変骨格残基または連結を含む核酸を含み
、これらは、合成、天然および非天然であり、これらは、参照核酸に類似した結
合性質を有し、そして参照したヌクレオチドに類似した様式で代謝される。この
ようなアナログの例としては、限定しないが、ホスホロチオエート、ホスホラミ
デード、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチル
リボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。

【００５５】 他に示さない限り、特定の核酸配列はまた、暗にそれらの保存的に改変された
改変体（例えば、コドン置換を変性する）および相補的配列、ならびに暗に示さ
れた配列を含む。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。核酸配列は、従来の５’
−３’方向で本明細書中において示される。

【００５６】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基
の重合体をいうために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１つ以
上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸のアナログまたは模倣物であるア
ミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体に適用される。ポリペプ
チドは、例えば、糖タンパク質を形成するために、炭水化物残基の付加によって
改変され得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、
糖タンパク質、ならびに非糖タンパク質を含む。ポリペプチド配列は、従来のＮ
末端からＣ末端の方向で本明細書中に示される。

【００５７】 用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似
の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然のアミノ
酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならび後に改変されるアミ
ノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、およびＯ−ホス
ホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然のアミノ酸と同じ基礎化学構造（
すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されるα炭素）を
有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、
メチオニン、およびメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、改変
されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが
、天然に存在するアミノ酸と同じ基礎化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、
アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ
酸と類似の様式で機能する化合物をいう。

【００５８】 「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適
用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一また
は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、あるいはその核酸が
アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列をいう。詳細には、縮
重コドン置換が、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位
置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製
することによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．（１９９１）１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６０５〜２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ（１９９４）８：９１〜９８）。遺伝コードの縮
重に起因して、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコード
する。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸
アラニンをコードする。従って、アラニンが本明細書中のアミノ酸におけるコド
ンにより特定されるすべての位置において、そのコドンは、コードされるポリペ
プチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかへと変更され
得る。このような核酸の変化は、「サイレントな変化」であり、これは、保存的
に改変された変化の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核
酸配列も、その核酸の可能なすべてのサイレントな変化もまた記載する。核酸中
の各コドン（通常はメチオニンのみのコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプ
トファンのみのコドンであるＴＧＧは除く）は、機能的な同一な分子を生じるよ
うに改変され得ることを、当業者は認識する。従って、ポリペプチドをコードす
る核酸のサイレントな変化各々が、記載される配列各々に含まれる。

【００５９】 アミノ酸配列および核酸配列に関して、その配列における単一のアミノ酸もし
くはヌクレオチド、または小さい割合のアミノ酸またはヌクレオチドを、変更、
付加または欠失する個々の置換、欠失または付加が、その変更が化学的に類似の
アミノ酸によるアミノ酸置換をもたらしている「保存的に改変された改変体」を
作製する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知
である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性改変体および
対立遺伝子に加わり、そしてこれらの多型性改変体および対立遺伝子を排除しな
い。

【００６０】 以下の群は、各々が、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン
（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；３）アスパラ
ギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；４）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ
）；５）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；６）アルギニン（Ｒ）、リジン
（Ｋ），ヒスチジン（Ｈ）；７）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン
（Ｖ）；および８）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン
（Ｗ）（例えば、アミノ酸特性の考察について、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。

【００６１】 用語「ポリヌクレオチド」とは、１つより多くのヌクレオチドの核酸である。
ポリヌクレオチドは、その単位の記載により言及される、複数のポリヌクレオチ
ド単位から構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コード配列を有するポ
リヌクレオチド、調節領域であるポリヌクレオチドおよび／または当該分野で一
般的に使用される他のポリペプチド単位を含み得る。

【００６２】 用語、野生型脈管形成タンパク質の「生物学的に活性なフラグメント」、「生
物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な等価物」および「機能的誘導体」は
、その野生型脈管形成タンパク質の生物学的活性と少なくとも実質的に等しい生
物学的活性を保有する。上記の用語は、その野生型脈管形成タンパク質の「フラ
グメント」、「変異体」、または「改変体」を含むことが意図される。用語「フ
ラグメント」とは、その野生型脈管形成タンパク質の任意のポリペプチドサブセ
ッの部分集合をいうことが意味される。用語「変異体」とは、野生型と実質的に
類似し得るが異なる生物学的特徴を保有する分子をいうことが意味される。この
ような変化した特徴としては、その脈管規制タンパク質またはヒト脈管形成機能
的誘導体の生物学的活性に影響する化学化合物に対する、変化した基質結合、変
化した基質親和性および変化した感受性（これらは、各変異体を本明細書中に開
示されるような標的化された脈管形成について魅力的にし得る）が挙げられるが
、これらに限定されない。上記のような用語「改変体」とは、野生型タンパク質
全体またはそのフラグメントのいずれかに、構造および機能において実質的に類
似する分子をいう。

【００６３】 用語「遺伝子」とは、染色体（例えば、ヒト染色体）にて見出される遺伝する
遺伝物質の単位をいう。各遺伝子は、鎖を形成するヌクレオチドの配列により言
及され得る、デオキシリボヌクレオチドの線状鎖から構成される。従って「配列
」とは、鎖を形成するヌクレオチドの順序付けられた列挙、およびそのヌクレオ
チド配列を有する鎖の両方を示すために使用される。用語「配列」とは、ＲＮＡ
鎖（リボヌクレオチドから作製された線状鎖）に関して同じ様式で使用される。
その遺伝子は、調節配列および制御配列、ＲＮＡ分子へと転写され得る配列を含
み、そして未知の機能を有する配列を含み得る。そのＲＮＡ産物（ＤＮＡからの
転写の産物）のいくつかは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、これは
、ポリペプチドへと翻訳されるリボヌクレオチド配列（複数または単数）および
翻訳されないリボヌクレオチド配列を最初に含む。翻訳されない配列としては、
制御配列、イントロンおよび未知の機能を有する配列が、挙げられる。同じ遺伝
子についてのヌクレオチド配列における小さい差異が、異なるヒト間、または正
常な細胞と癌性細胞との間、または正常な細胞と疾患細胞との間にて、その遺伝
子の同一性を変更することなく存在し得ることが、認識され得る。

【００６４】 用語「特異的結合」（および等価な句）は、タンパク質および他の生物学物質
の不均一な集団の存在下で、特定の標的分子（例えば、リガンドまたは抗原）に
結合部分（例えば、レセプター、抗体、またはアンチリガンド）が優先的に（す
なわち、試験サンプル中に存在する他の成分への有意な結合を伴わずに）結合す
る能力をいう。代表的には、２つの実体（例えば、リガンドとレセプター）間の
特異的結合は、少なくとも約１０⁶Ｍ^-1、そして好ましくは少なくとも約１０⁷Ｍ ^-1 、１０⁸Ｍ^-1、１０⁹Ｍ^-1または１０¹⁰Ｍ^-1の結合親和性を意味する。いくつか
の実施形態において、特異的結合は、米国特許第５，６２２，２６９号（この参
考文献およびその中に引用されるすべての参考文献は、本明細書中に参考として
援用される）の方法に従ってアッセイされ（そして特異的結合分子が同定される
）。代表的には、このアッセイによる特異的反応または選択的反応は、バックグ
ラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも約２倍であり、そしてより代表的に
は、バックグラウンドの少なくとも約５倍または少なくとも１００倍、あるいは
それ以上である。

【００６５】 結合部分が抗体である場合、種々のイムノアッセイ形態が、特定のタンパク質
と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相
ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、抗原と特異的に免疫反応性であるモノクローナル
抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために
使用され得るイムノアッセイ形態および条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗお
よびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（この参考文献およびその中に引用される参考文献は、
本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【００６６】 「特異的ハイブリダイゼーション」とは、その配列が複合混合物（例えば、総
細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合の、ストリンジェントな条件下で特
定のヌクレオチド配列にのみへの、分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイ
ゼーションをいう。ストリンジェントな条件は、プローブがその標的部分配列に
ハイブリダイズし得るが他の配列にハイブリダイズしない条件である。ストリン
ジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境にて異なる。長い配列
ほどより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントな
条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融解温度（Ｔ_m
）より約５℃低いように選択される。このＴ_mは、標的配列と相補的なプローブ
のうちの５０％が平衡して標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強
度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。（標的配列が一般的に過剰に存在する場
合、Ｔ_mにおいて、そのプローブの５０％が平衡状態で存在する）。代表的には
、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度少なくとも約０．
０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）を含み、かつ温度が、短いプ
ローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃である
。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドまたはテトラアルキルアンモニ
ウム塩のような変性剤の添加により達成され得る。例えば、条件５×ＳＳＰＥ（
７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．４）および温度２５〜３０℃が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼ
ーションに適切である。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ １９８９を参照のこと；この参考文献およびその中に引用されるすべて
の参考文献が、本明細書中に参考として援用される）。

【００６７】 用語「薬学的に受容可能な」、「生理学的に許容可能な」およびそれらの文法
的変化は、それらが組成物、キャリア、希釈剤および試薬をいう場合、交換可能
に使用され、そしてその物質が、その組成物の投与を妨げる程度まで望ましくな
い生理学的効果（例えば、悪心、めまい、胃の不調など）の生成を伴わずにヒト
に投与され得ることを示す。

【００６８】 用語「ポリサッカライド」または「オリゴサッカライド」とは、その一般的語
法を組み込み、そして例えば、下記ような、デキストロース、グルコース、ラク
トース、マンノース、マンナンなどを含む。

【００６９】 （１．標的化された新脈管形成） （Ａ．血管内皮の標的化） 本発明は、血管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結した脈管形成因子を
含むキメラ分子を提供する。

【００７０】 脈管構造における表面発現の変化は、虚血−再灌流障害において広範に研究さ
れている。例えば、Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｅ．、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．（１９９６）２７補遺１：Ｓ２６〜３０；Ｌｅｆｅｒ，Ａ．およ
びＬｅｆｅｒ，Ｄ．、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ（１９９６）３２：７４３
〜５１；Ｈａｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｄｒｕｇｓ（１９９７）５３補遺１：１〜１０；
Ｋｉｎｌａｙ，Ｓ．およびＧａｎｚ，Ｐ、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９７
）８０（９Ａ）１１Ｉ〜１６Ｉ、ならびにＬｕｓｃｈｅｒ，Ｔ．ら、Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ Ｍｅｄ（１９９３）４４：３９５〜４１８（これらの参考文献およびその
中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援用される）を参照
のこと。いくつかの器官系（心臓、腎臓、脳および骨格筋を含む）において、以
前に虚血性であった領域への流れの修復は、種々の応答を誘導する。種々の内皮
細胞マーカーが公知であり、それらとしては、内皮−白血球接着分子（ＥＬＡＭ
−１；Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８７）８４：９２３８〜９２４２）；血管細胞接着分子−
１（ＶＣＡＭ−１；Ｄｕｓｔｉｎ，Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１
３７：２４５〜２５４）および細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１；Ｏｓｂｏｒ
ｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：１２０３〜１２１１）（これらの参考
文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援用
される）が挙げられる。これらのいくつかの細胞接着分子の発現は、時間依存性
様式で増加し、そして白血球接着を増強する。最終結果は、再灌流が炎症応答お
よび好中球の補充を引き起こし、このことがその虚血障害と関連し得る細胞死を
促進し得るということであり得る。免疫グロブリン（「Ｉｇ」）スーパー遺伝子
ファミリーレセプター（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１）は、
可変数の反復する免疫グロブリン様ドメインから構成される（例えば、Ｗｉｌｌ
ａｍｓ，Ａ．ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）６：３８１〜
３８７を参照のこと）。

【００７１】 虚血−再灌流障害後の冠状血管内皮における表面発現のこれらの変化は、種々
の選択技術を使用して、例えば、心臓血管内皮に特異的に結合する分子を単離す
るために、使用され得る。

【００７２】 （Ｂ．アテローム性動脈硬化症および再狭窄を標的化するための治療因子） 損傷に対する血管応答は、少なくとも３つの基本的細胞プロセス（細胞増殖、
細胞移動および細胞外マトリックス産生）における変化を含み得る。損傷に対す
るこの血管応答は、以下を含むがこれらに限定されない、種々の血管疾患の病因
を特徴とし得る：アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、静脈バイパ
ス移植狭窄、人工器官移植狭窄、新脈管形成および高血圧。例えば、アテローム
性動脈硬化症損傷は、内膜下空間への血管平滑筋の移動、豊富な細胞外マトリッ
クスの増殖および産生の結果として、発展する。同様に、血管形成術後の再狭窄
、静脈バイパス移植狭窄、人工器官移植狭窄、新脈管形成および高血圧は、血管
細胞の増殖、移動およびマトリックス組成における異常を伴う。一般的に、Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｄ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９５）７４：５
４１〜５１を参照のこと。

【００７３】 アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の内側部分の局所的肥厚により特徴付けら
れており、このことは、個体を心筋梗塞（心臓発作）、脳梗塞（発作）、高血圧
（高い血圧）および四肢の壊疽にかかりやすくする。アテローム性動脈硬化症損
傷の形成の原因である一般的基礎事象は、内皮細胞損傷に応答しての増殖する平
滑筋細胞の内膜肥厚である。「内膜（または新内膜）の肥厚または形成」とは、
動脈の内皮露出に応答しての内膜における動脈平滑筋細胞の増殖を意味する。血
管形成術またはバイパス手術により物理的に処置される冠状動脈における平滑筋
細胞の蓄積もまた、再狭窄の顕著な特徴である。主に増殖した平滑筋細胞からな
ることに加えて、アテローム性動脈硬化症の損傷は、脂質を抱えた大量のマクロ
ファージ、種々の数のリンパ球および大量の結合組織により囲まれる。ＰＤＧＦ
が、平滑筋細胞増殖の原因である主な増殖調節分子であると考えられている（例
えば、Ｄｒｉｋｓ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏ Ｒｅｐ（１９９５）２２：１〜２
４（この参考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参
考として援用される）を参照のこと）。従って、ＰＤＧＦは、アテローム性動脈
硬化症の疾患プロセスにおいて重要な役割を果たし得る（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ
，Ａ．、Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）２７：１０７９〜８９（こ
の参考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考とし
て援用される）を参照のこと）。他の多数の因子が、アテローム性動脈硬化症お
よび再狭窄の病態生理に寄与する。これらの因子としては、アンギオテンシンＩ
Ｉ、ＦＧＦ、およびトランスホーミング増殖因子β１が挙げられるがこれらに限
定されない（例えば、Ｐｒａｔｔ，Ｒ．、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ（
１９９９）補遺１１：Ｓ１２０〜８；Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．、Ａｍ Ｊ Ｈｙｐ
ｅｒｔｅｎｓ（１９９８）１１：１７７Ｓ〜１８１Ｓ；Ｃｉｎｅｓ，Ｄ．ら、Ｂ
ｌｏｏｄ（１９９８）９１：３５２７〜６１；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、ＲＥＧＵＬ
ＡＴＩＯＮ ＯＦ ＡＮＧＩＯＧＥＮＥＳＩＳ、ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓ
ｅｎ編（Ｂｉｒｋｈｏｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ １９９７）第２７
３〜２９４頁；Ｓａｌｔｉｓ，Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９６）２３：１９３〜２００（これらの参考文献および
その中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援用される）を
参照のこと）。

【００７４】 平滑筋細胞増殖、内皮細胞増殖および新脈管形成を阻害する治療因子は、本発
明のキメラ分子、方法、および遺伝子治療試薬とともに使用され得る。例えば、
アンジオスタチンと呼ばれる１つの治療因子（プラスミノゲンの天然に存在する
内部切断産物）は、内皮細胞増殖を阻害し、そして米国特許第５，７３３，８７
６号（この参考文献は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている
。別の内皮細胞増殖阻害剤としては、エンドスタチンが挙げられ、これは、米国
特許第５，８５４，２０５号（この参考文献は、本明細書中に参考として援用さ
れる）に記載される。例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９７
）８８：２７７〜８５を参照のこと。アテローム性動脈硬化症および再狭窄なら
びに他の新脈管形成依存性（または脈管形成関連性）疾患の脈管形成プロセスの
制御に関する、アンジオスタチンおよびエンドスタチンのような治療因子は、こ
れらの疾患の排除または緩和をもたらし得る。例えば、Ｃａｏ，Ｙ、Ｐｒｏｇ
Ｍｏｌ Ｓｕｂｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９８）２０：１６１〜７６（この参
考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと。従って、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の脈管
形成プロセスを制御する治療因子は、本発明のキメラ分子において使用され得る
。

【００７５】 （（２．）キメラ分子の標的化成分の選択および調製） （（Ａ）標的化分子の同定） 種々の方法が、血管内皮（例えば、心臓血管内皮）のような特定の細胞および
組織に特異的に結合する分子を同定および単離するために利用可能である。いつ
かの例示的方法が、以下に記載される。

【００７６】 （（１）インビボパニングを利用するファージディスプレイ） この方法において、１つまたはいくつかの選択された器官に特異的に結合する
分子が、インビボパニングを使用してライブラリーをスクリーニングすることに
よって、同定され得る。この方法は、米国特許第５，６２２，６９９号に詳細に
記載され、そして本明細書中で参考として援用される。また、Ｐａｓｑｕａｌｉ
ｎｉ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：３６４〜３６６を参照のこと
。被験体に投与するための例示的ライブラリーは、ファージディスプレイペプチ
ドライブラリーである。ファージディスプレイとは、ペプチドまたはタンパク質
が、複製可能な遺伝的パッケージ（下記）のコートタンパク質に遺伝的に融合さ
れており、一般的にはその複製可能な遺伝的パッケージの外側にその融合ペプチ
ドまたはタンパク質の提示をもたらすと同時に、その融合物をコードするＤＮＡ
が一般的にはその複製可能な遺伝的パッケージ内に存在する、インビトロまたは
インビボでの選択技術を述べる。提示されるタンパク質とそれをコードするＤＮ
Ａとの間のこの物理的結合は、各々が対応するＤＮＡ配列に連結している多数の
ペプチドまたはペプチドの改変体のスクリーニングを可能にする。

【００７７】 種々の型の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質
フラグメント、ペプトイド、またはペプチド模倣物）の多様な集団を含むライブ
ラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、そして市販されている
。例えば、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ，ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍ
ｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．（１９９７）２６：４０１〜２４；Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．
ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）７（６）：６１
６〜２１；ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｄ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９
９６）６（２）：１５５〜６２；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：３５１〜３６０ならびにＢｌｏｎｄｅｌｌｅ
ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）１４：８３〜９２（これ
らの参考文献およびその中で引用される参考文献すべては、その各々が本明細書
中に参考として援用される）を参照のこと。また、ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、
Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、ＢＵＲＧ
ＥＲ’Ｓ ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＩ
ＳＣＯＶＥＲＹ、第１巻（Ｗｏｌｆｆ，Ｍ．Ｅ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ １９９５）ならびにＧｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９４
）３７：１３８５〜１４０１（その各々が参考として援用される）も参照のこと
。

【００７８】 ファージディスプレイ技術は、ランダムなペプチドまたは選択的にランダムに
されたペプチドの多岐の集団を発現するための手段を提供し得る。ファージディ
スプレイの種々の方法およびペプチドの多岐の集団を生成するための方法は、公
知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号（この参
考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。

【００７９】 複製可能な遺伝的パッケージは、細胞、胞子またはウイルスを意味する。この
複製可能な遺伝的パッケージは、真核生物性であってもまたは原核生物性であっ
てもよい。ポリペプチドディスプレイライブラリーは、提示される外因性ポリペ
プチドをコードする核酸をその複製可能な遺伝的パッケージのゲノム中に導入し
て、その複製可能な遺伝的パッケージの外側表面から通常は発現される内因性タ
ンパク質との融合タンパク質を形成することによって、形成される。その融合タ
ンパク質の発現、外側表面への輸送およびアセンブリは、その遺伝的パッケージ
の外側表面からの外因性ポリペプチドの提示をもたらす。

【００８０】 ディスプレイライブラリーに最も頻繁に使用される遺伝的パッケージは、バク
テリオファージ、特に糸状ファージ、そしてとりわけファージＭ１３、Ｆｄおよ
びＦ１である。ほとんどの作業は、提示されるポリペプチドをコードするライブ
ラリーを、融合タンパク質を形成するこれらのファージのｇＩＩＩまたはｇＶＩ
ＩＩのいずれかに挿入している（例えば、ＷＯ ９１／１９８１８；ＷＯ ９１
／１８９８９；ＷＯ ９２／０１０４７（遺伝子ＩＩＩ）；ＷＯ ９２／０６２
０４；およびＷＯ９２／１８６１９（遺伝子ＶＩＩＩ）を参照のこと）。このよ
うな融合タンパク質は、シグナル配列（通常は、ファージコートタンパク質以外
の分泌タンパク質由来）、提示されるポリペプチド、および遺伝子ＩＩＩタンパ
ク質もしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質またはそれらのフラグメントのいずれか
を含む。外因性コード配列は、しばしば、遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩの
Ｎ末端にかまたはその付近に挿入されるが、他の挿入部位が可能である。いくつ
かの糸状ファージベクターが、遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかの
第２のコピーを生成するように操作されている。このようなベクターにおいて、
外因性配列は、その２つのコピーのうちのただ１つのみに挿入される。もう１つ
のコピーの発現は、ファージ粒子中に取り込まれる融合タンパク質の比率を効果
的に落とし、そしてファージ増殖に有害なポリペプチドに対する選択を減少する
際に有利であり得る。

【００８１】 別の改変において、外因性ポリペプチド配列は、ファージコートタンパク質お
よびファージパッケージング配列をコードするが複製不可能な、ファージミドベ
クターにクローニングされる。ファージミドは、細胞にトランスフェクトされ、
そしてヘルパーファージでの感染によってパッケージされる。ファージミド系の
使用はまた、コートタンパク質とディスプレイされたポリペプチドとから形成さ
れる融合タンパク質を、ヘルパーファージから発現されたコートタンパク質の野
生型コピーで希釈する効果を有する（例えば、ＷＯ９２／０９６９０を参照のこ
と）。

【００８２】 真核生物ウイルスを使用して、ポリペプチドを類似の様式でディスプレイし得
る。例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスのｇｐ７０に融合したヒトヒ
レグリンのディスプレイは、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ（１９９５）９２：９７４７−９７５１により報告された。胞子をまた
、複製可能な遺伝パッケージとして使用し得る。この場合には、ポリペプチドは
、この胞子の外側表面からディスプレイされる。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
由来の胞子は、適切であることが報告されている。これらの胞子のコートタンパ
ク質の配列は、Ｄｏｎｏｖａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６
：１−１０により提供されている。細胞をまた、複製可能な遺伝パッケージとし
て使用し得る。ディスプレイされるポリペプチドは、細胞表面で発現される細胞
タンパク質をコードする遺伝子に挿入される。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎ
ｏｄｏｓｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｉｓ、および特に、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む細菌細胞が、好ましい。外側表面のタンパク質の詳細
は、米国特許第５，５７１，６９８号、ならびにＧｅｏｒｇｉｏｕら、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：２９−３４およびそこに
引用される参考文献により、議論されている。

【００８３】 ポリペプチドディスプレイライブラリーによりディスプレイされるポリペプチ
ドをコードする核酸は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、複製可能な遺伝パ
ッケージのゲノムに挿入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１
９８９）を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）。核酸は、最終的
に、複製可能なパッケージの外側表面タンパク質のすべてまたは一部に融合した
ポリペプチドとして（スペーサー残基またはフレームワーク残基を伴うかまたは
伴わずに）発現される。ライブラリーは、しばしば、約１０³、１０⁴、１０⁶、
１０⁷、１０⁸以上のメンバーの大きさを有する。

【００８４】 これらおよび他の周知の方法を使用して、ファージディスプレイライブラリー
を生成し得、１つまたは少数の選択した器官および組織に特異的に結合するペプ
チドを同定するために、米国特許第５，６２２，６９９号に記載されるインビボ
パニング法に、このライブラリーを供し得る。例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，
Ｒ．およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：３６２
−３６６；Ａｒａｐ，Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：３７７−３
８０；Ｒａｊｏｔｔｅ，Ｄ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９９８）１０
２：４３０−７；およびＲａｊｏｔｔｅ，Ｄ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（
１９９９）２７４：１１５９３−８を参照のこと；これらの参考文献は、本明細
書中に参考として援用される。例えば、インビボでの選択またはパニングを使用
して、正常な心臓内皮または心筋虚血−再灌流障害により変化した心臓内皮を選
択的に結合するペプチドを同定および単離し得る。同様に、正常な脳組織または
変化した脳組織をまた使用して、これらの組織に特異的に結合するペプチドを同
定および単離し得る。

【００８５】 一般に、目的の無作為な分子または選択的に無作為化された分子の様々な集団
を含む分子のライブラリーが調製され得、次いで２．５×１０⁸形質導入単位（
ＴＵ）のファージライブラリーが、被験体に投与され得る（例えば、頸静脈を通
して静脈内で）。インビボでのファージ循環を可能にする、所定の時間の後に、
高カリウム血（３０ｍＭ ＫＣｌ）の低体温ＤＭＥＭ溶液の心室内注射によって
心臓を停止させ得、そして５〜１０ｍＬの高カリウム血ＤＭＥＭで左心室カニュ
ーレを通して潅流することによって、脈管構造から血液を除去し得る。次いで、
心臓および脳を採取し、均一化し、秤量し、そして標準的な技術によって、ファ
ージをレスキューし得る。選択の２回目および３回目については、クローンを、
先の回から採取し得、そして飽和するまで個々に増殖し得る。次いで、この培養
物をプールし、ファージ粒子を精製し、次いでこのプールの１０¹⁰ＴＵを、同様
に処置した被験体に再注入し得る。次いで、３回目以上からの個々のクローンの
ファージｓｓＤＮＡを調製し得、そして標準的な技術によって、インサートを配
列決定し得る（例えば、Ｒｏｊｏｔｔｅら、前出を参照のこと）。次いで、複数
回現れる配列を有するファージを、同様に処置した被験体へのさらなる注射によ
って、さらに特徴付け得る。スクリーニングの引き続く回を実施して、目的の器
官に特異的に結合する分子を濃縮し得る。

【００８６】 インビボでのパニングをまた使用して、変化した脈管内皮（すなわち、心臓内
皮）を選択的に標的化するファージを同定し得る。脈管内皮は、心筋虚血−再灌
流障害によって変化し得る。例えば、標準的な手順による３０分間の虚血の誘導
および引き続く３０分間の再潅流（いくらかの変化が内皮において起こることを
可能にするため）を使用して、脈管内皮を変化させ得る。次いで、再潅流障害を
受けた動物由来の心臓組織に、ファージを注射し得る。次いで、インビボでのパ
ニング手順を、上記のように実施し得る。

【００８７】 （（２）プラスミド上のペプチド） 別の方法は、プラスミド上のペプチド（「ＰＯＰＳ」）と呼ばれる。Ｓｃｈａ
ｔｚ，Ｐ．ら、米国特許第５，７３３，７３１号を参照のこと；これらの参考文
献およびこれらに引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用さ
れる。ファージディスプレイ法と同様に、ＰＯＰＳは、様々な集団のペプチドを
コードする、プールされたオリゴヌクレオチドのコレクション、大きなライブラ
リーを生成するためのエレクトロポレーション、ならびにペプチドおよびこれら
をコードするオリゴヌクレオチドの遺伝子連結を使用する。しかし、ＰＯＰＳは
、遺伝子連結が、ファージ粒子によって提供されるのではなく、融合タンパク質
をコードするベクター上の部位に結合する融合タンパク質としてＤＮＡ結合ドメ
インを有する発現ペプチドによって提供される点で、ファージディスプレイ法と
は異なる。

【００８８】 （（３）コードされた合成ライブラリー法） さらなる方法は、コードされた合成ライブラリー法（「ＥＳＬ」）と呼ばれる
。米国特許第５，６３９，６０３号；ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９３／０６１
２１、ＷＯ９４／０８０５１、ＷＯ９５／３５５０３およびＷＯ９５／３０６４
２（これらの各々が、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される）
を参照のこと。この方法において、ライブラリーにおける異なる化合物が、これ
らの化合物の種々の成分をカップリングのいくつかの回において段階的に添加す
ることによって、別の支持体（例えば、ビーズ）に付着して合成される。カップ
リングの回は、異なる反応容器間で支持体を割り当て、そして異なる成分を、異
なる反応容器内の支持体に添加することによって、実施され得る。反応容器に添
加される特定の成分が、この支持体に第二の部位でタグ化合物を添加することに
より、記録される。タグ成分は、オリゴヌクレオチドまたは他の標識であり得る
。オリゴヌクレオチドが使用される場合には、対応するタグおよび化合物は、代
表的に、遺伝子コード以外の対応レジメンにより関連付けられる。合成の各回の
後に、同じ反応容器からの支持体を、異なる反応容器間に割り当て得、そして／
または合成の次の回において、別の反応容器からの支持体でプールされ得る。合
成のいずれかの回において、そして通常は全ての回において、支持体に添加され
る成分は、支持体の第二の部位においてさらなるタグ成分を添加することによっ
て、記録され得る。合成のいくつかの回の後に、異なる化合物の大きなライブラ
リーが生成し、ここで、化合物の識別は、その化合物を保有するそれぞれの支持
体に付着したタグにコードされる。このライブラリーを、標的に対する結合に関
してスクリーニングし得る。ＥＳＬ法を使用して、成分ごとの様式で合成され得
るペプチドを含む、任意の化合物のライブラリーを生成し得る。

【００８９】 上記選択技術を使用して、例えば、心臓脈管内皮、虚血性の心臓脈管内皮、末
梢脈管内皮、および虚血性の抹消脈管内皮を、標的化し得る。末梢脈管内皮は、
心臓および肢の外側の器官において、見出される。

【００９０】 （（Ｂ）好ましい標的化分子） 本発明の好ましい標的化分子は、上に記載されそして以下で参照される、イン
ビボでのパニング手順を使用して、ＧＧＧＶＦＷＱ、ＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶ
ＴＳＳ、ＣＬＨＲＧＮＳＣ、およびＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣからなる群から選
択される、アミノ酸配列を構成する。ＧＧＧＶＦＷＱ、ＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬ
ＶＴＳＳ、およびＣＬＨＲＧＮＳＣのペプチドは、正常な心臓内皮に選択的に結
合する。より具体的には、ＧＧＧＶＦＷＱペプチドは、正常な心臓脈管に対して
５倍の濃縮を示し、一方でＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶＴＳＳ、ＣＬＨＲＧＮＳＣ
のペプチドは、正常な心臓血管に対して２倍の濃縮を示した。ＣＲＳＷＮＫＡＤ
ＮＲＳＣペプチドは、虚血性心筋層に対して５倍の濃縮を示した。これらのペプ
チドが同定された方法、およびこれらの特性の詳細は、本願と同日に出願された
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ［Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆ Ｆｌｏｒｅｓ ＬＬＰ代理人文
書番号Ｐ−ＬＪ３５１２］に記載され、この出願は、特に本明細書中に参考とし
て援用される。

【００９１】 （（Ｃ）脈管形成因子成分の選択／調製） 脈管形成因子は、前出に記載される。例示的な脈管形成因子としては、ＶＥＧ
Ｆポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。例示的なＶＥＧＦポリペ
プチドである、ＶＥＧＦ−Ｂは、単離され、クローニングされ、そして配列決定
された。Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、米国特許第５，８４９，６９３号を参照のこと；
この参考文献およびこれに引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用
される。現在、ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生成するＶＥＧＦ−Ｂの
２つのアイソフォームが、区別されている（Ｇｒｉｍｍｏｎｄら、１９９６；Ｏ
ｌｆｓｓｏｎら、１９９６ｂ；Ｔｏｗｎｓｏｎら、１９９６；これらの参考文献
およびこれらに引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用され
る）。これら２つの分泌形態のＶＥＧＦ−Ｂは、それぞれ１６７（ＶＥＧＦ−Ｂ ₁₆₇ ）および１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆）のアミノ酸残基を有する。

【００９２】 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアイソフォームは、それぞれ見かけ
の分子量２１ｋＤおよび３２ｋＤの、ジスルフィド連結したホモダイマーとして
生成する（Ｏｌｏｆｓｓｏｎら、１９９６）。

【００９３】 一旦、ＶＥＧＦポリペプチドが選択されるか、設計されるか、または他の様式
で提供されると、ＶＥＧＦポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡが合成さ
れる。ＶＥＧＦタンパク質をコードするＤＮＡの合成および発現の例示的な方法
は、以下および実施例に記載される。次いで、ＶＥＧＦキメラポリペプチドまた
はそれをコードするポリヌクレオチドを使用して、脈管増殖を誘導し得る。

【００９４】 ＶＥＧＦタンパク質およびこのようなＶＥＧＦタンパク質をコードする核酸を
、組換え遺伝学の分野において慣用的な技術を使用して、作製し得る。本発明に
おける使用の一般的な方法を開示する、基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）が挙げられる；これ
らの参考文献およびこれらにおいて引用される全ての参考文献は、本明細書中に
参考として援用される。さらに、本質的にあらゆる核酸を、任意の種々の市販の
供給源からあつらえて注文し得る。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種々
の市販の供給源からあつらえて注文し得る。

【００９５】 選択した脈管形成タンパク質をコードする核酸は、代表的に、例えばＫ_dを決
定するために、複製および／または発現のために、原核生物細胞または真核生物
細胞内への形質転換のために、中間体ベクターにクローニングされ得る。中間体
ベクターは、代表的に、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）、またはシャ
トルベクターであるか、あるいは脈管形成タンパク質もしくはタンパク質の産物
をコードする核酸の貯蔵もしくは操作のため、またはタンパク質の産生のために
は、昆虫ベクターである。脈管形成タンパク質をコードする核酸はまた、植物細
胞、動物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞）、真菌細胞、細菌
細胞、または原生動物細胞への投与のために、代表的に、発現ベクターにクロー
ニングされ得る。

【００９６】 クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、キメラ脈管形成タ
ンパク質は、代表的に、転写を指向するためのプロモーターを含む発現ベクター
にサブクローニングされ得る。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモー
ターは、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎ
ｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９
０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）に記載される；これらの参考文献
およびこれらにおいて引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援
用される。脈管形成タンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａ
ら、Ｇｅｎｅ Ｉ（１９８３）２２：２２９−２３５）において利用可能である
。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、
および昆虫細胞のための、真核生物発現系は、当該分野において周知であり、そ
してまた市販されている。

【００９７】 キメラ脈管形成タンパク質核酸の発現を指向するために使用されるプロモータ
ーは、特定の応用に依存する。例えば、強力な構成的プロモーターは、代表的に
、脈管形成タンパク質の発現および精製のために、使用され得る。対照的に、脈
管形成タンパク質が遺伝子調節のためにインビボで投与される場合には、その脈
管形成タンパク質の特定の使用に依存して、構成的プロモーターまたは誘導的プ
ロモーターのいずれかが使用され得る。プロモーターはまた、代表的に、トラン
ス作用性を担うエレメント（例えば、低酸素症応答エレメント、Ｇａｌ４応答エ
レメント、ｌａｃ抑制応答エレメント、および小分子コントロール系（例えば、
ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系））を含み得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎおよ
びＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９
９２）８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９８）
５：４９１−４９６；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９７）４：４３
２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８８：１１４７−１１
５５；ならびにＲｅｎｄａｈｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：
７５７−７６１を参照のこと）。

【００９８】 プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、原核生物または真核生物
のいずれかの宿主細胞において、核酸の発現のために必要とされる全てのさらな
るエレメントを含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。従って、代表的
な発現カセットは、例えば、脈管形成タンパク質をコードする核酸配列に作動可
能に連結されたプロモーター、および例えば、転写、転写終止、リボソーム結合
部位、または翻訳終止の効率的なポリアデニル化のために必要とされるシグナル
を含む。カセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、およ
び異種のスプライシングされたイントロンシグナルが挙げられ得る。

【００９９】 遺伝情報を細胞内に移送するために使用される特定の発現ベクターは、脈管形
成タンパク質の意図された使用（例えば、植物、動物、細菌、真菌、および原生
動物における発現）に関して、選択され得る。標準的な細菌発現ベクターとして
は、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドのようなプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２
３Ｄ、および市販の融合発現系（例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺ）が挙げられる
。これらの融合タンパク質を、脈管形成タンパク質の精製のために使用し得る。
エピトープタグもまた、組換えタンパク質に添加されて、発現をモニタリングす
るため、ならびに細胞および非細胞の局在化をモニタリングするために、好都合
な単離方法を提供し得る。

【０１００】 真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば、真
核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター
、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他
の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ⁺、ｐＭＴ
Ｏ１０／Ａ⁺、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ
４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、
ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために効果的で
あることが示された他のプロモーターの指向のもとでの、タンパク質の発現を可
能にする、他の任意のベクターが挙げられる。

【０１０１】 いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされる細胞株（例えば、チミジ
ンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロフ
ォレートレダクターゼ）を選択するために、マーキングされた。高収率の発現系
（例えば、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモ
ーターの指向の元で、脈管形成タンパク質コード配列を有するバキュロウイルス
ベクターを昆虫細胞において使用すること）もまた、適切である。

【０１０２】 発現ベクターに代表的に含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機
能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能するための、抗
生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするための、
プラスミドの本質的でない領域における独自の制限部位を含む。

【０１０３】 標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する
細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を生成し、次いでこ
れらを、標準的な技術を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４；１７６１９−１７６２２；Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照のこ
と）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換を、標準的な技術に従って実
施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９７７）１３２：３４
９−３５１；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８
３）を参照のこと）。

【０１０４】 （（Ｄ）脈管形成因子成分への標的化成分のカップリング） 本発明のキメラ分子は、少なくとも２つの成分を含む：機能的脈管形成因子お
よび標的化分子。この機能的脈管形成因子は、例えば、内皮細胞上の脈管形成因
子レセプターを結合するか、または特定の様式で標的組織に影響を与える配列を
含む、アミノ酸配列またはポリペプチド配列を含み得る。この標的化分子は、１
つ以上の型の脈管内皮細胞に結合する、アミノ酸配列またはポリペプチド配列を
含み得る。機能的脈管形成因子であるアミノ酸配列は、脈管形成因子レセプター
のリガンド結合ドメインであり得る；標的化分子であるアミノ酸配列は、細胞表
面レセプターに結合し得、従って細胞表面レセプターリガンドであり得る。

【０１０５】 選択された物質が、血液、リンパ、または細胞外流体の通常存在する成分であ
る場合には、脈管形成因子レセプターを結合するリガンド結合ドメインは、通常
は脈管形成因子レセプターを結合する（すなわち、ヒトにおいて選択された脈管
形成因子レセプターを結合する）アミノ酸配列である。このような配列の、変更
された結合特性で改変された形態、または通常はヒトにおいて見出されないアミ
ノ酸配列であって、合成的操作もしくは遺伝子操作の方法によって生成され、そ
して選択された脈管形成因子レセプターを結合し得る、アミノ酸配列。例えば、
脈管形成因子および／または標的化分子は、コンビナトリアルペプチドライブラ
リーまたはファージディスプレイライブラリーから選択された、アミノ酸配列で
あり得る。脈管形成因子および／または標的化分子はまた、免疫グロブリンまた
は一本鎖抗体の抗原結合ドメインを含み得、ここで、この免疫グロブリンまたは
一本鎖抗体の抗原結合ドメインは、所望の選択された物質または細胞表面レセプ
ターを認識する。選択された物質が外来の成分である場合には、選択された物質
を結合するアミノ酸配列は、天然に存在するリガンド結合ドメインから選択され
たものであり得、これは、外来の成分、または外来の成分を結合するよう設計さ
れたアミノ酸配列を、結合する。

【０１０６】 このキメラタンパク質のドメインは、得られるキメラタンパク質が脈管内皮増
殖因子レセプターと標的化分子レセプターとの両方を結合し得る限り、種々の構
造で連結し得る。１つの構造は、融合タンパク質の形態であり得る。「融合タン
パク質」とは、第二のドメインに関連する少なくとも１つのポリペプチドまたは
ペプチドドメインを含む、組成物をいう。第二のドメインは、ポリペプチド、ペ
プチド、多糖類などであり得る。「融合」は、ペプチド結合、化学結合、電荷相
互作用（例えば、塩橋、水素結合のような静電引力）、非共有結合相互作用など
により発生する会合であり得る。ポリペプチドが組替えられる場合には、「融合
タンパク質」は、共通のメッセージから翻訳され得る。あるいは、ドメインの組
成は、任意の化学的または静電的手段により、連結され得る。本発明の融合タン
パク質はまた、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナルシーク
エンサー、分泌シグナルなどを含み得る。

【０１０７】 代表的に、これら２つのドメインは、組換えＤＮＡ分子内の単一のリーディン
グフレームによりコードされ、そしてこれら２つのドメインは、ペプチド結合に
より連結される。これら２つのドメインは、同様にオープンリーディングフレー
ムによりコードされ得る、１つ以上のアミノ酸により分離され得る。あるいは、
これら２つのドメインは、別のＤＮＡ分子から発現され得、そして非共有結合（
例えば、疎水性またはイオン性相互作用）あるいは共有結合（例えば、ジスルフ
ィド）のいずれかを介してインビトロまたはインビボで連結される。さらに、生
物学的に活性なペプチドダイマーを生成するための方法が記載された。例えば、
ＥＰ ０７２１９８３ Ａ１を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援
用される）。

【０１０８】 （３．）キメラ分子の処方および投与：薬学的組成物 （Ａ）タンパク質を基礎にした治療 本発明の新脈管形成因子キメラ分子は、代表的には、薬学的に受容可能なキャ
リア（賦形剤）と組み合わせて薬理学的組成物を形成し得る。薬学的に受容可能
なキャリアは、例えば、本発明の薬学的組成物を安定化するか、またはその吸着
またはクリアランス速度を増加または減少するために作用する生理学的に受容可
能な化合物を含み得る。生理学的に受容可能な化合物は、例えば、グルコース、
スクロース、またはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグル
タチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチドまたは
ポリペプチド複合体のクリアランスまたは加水分解を減少する組成物、または賦
形剤もしくはその他の安定化剤および／または緩衝剤を含み得る。界面活性剤も
また、薬学的組成物を安定化するため、またはその吸着を増加または減少するた
めに用いられ得る。例示の界面活性剤はリポソームキャリアを含み、後述を参照
のこと。ペプチドおよびポリペプチドのための薬学的に受容可能なキャリアおよ
び処方物は当業者に公知であり、そして科学的および特許文献中に詳細に記載さ
れている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、前述、およびＢａｎｇａ、Ａ．Ｋ
．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｍｓ（１９９６）（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ
、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照のこと；これらの参考文献およ
びこれらの中で引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される。

【０１０９】 その他の生理学的に受容可能な化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤または微生
物の増殖または作用を防ぐために特に有用である保存剤を含む。種々の保存剤が
周知であり、そして例えば、フェノールおよびアスコルビン酸を含む。当業者は
、生理学的に受容可能な化合物を含む薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例
えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドの投与の経路およびその特定の生
理化学的特徴に依存することを認識する。

【０１１０】 （１）腸、非経口または経粘膜投与のための水性溶液 投与のための組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリア、組成物が水溶
性である場合、好ましくは水性キャリア中に溶解された、本発明のペプチドまた
はポリペプチドの溶液を含む。腸、非経口または経粘膜薬物送達のための処方物
で用いられ得る水性溶液の例は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食
塩水、ハンクス溶液、リンゲル溶液、デキストロース／生理食塩水、グルコース
溶液などを含む。これら処方物は、ほぼ生理学的条件に必要な、緩衝化薬剤、浸
透圧調節剤、湿潤剤、界面活性剤などのような、薬学的に受容可能な補助物質を
含み得る。添加物はまた、静菌剤、または安定化剤のような付加的な活性成分を
含み得る。例えば、溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム
、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートまたはトリエタノ
ールアミンオレアートを含み得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法に
より滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られる水性溶液は、そのまま
で使用のためにパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された
調製物は、投与の前に滅菌水性溶液と組み合わせられる。これらの処方物中のキ
メラ分子の濃度は広く変化し得、そして選択された投与の特定の様式および患者
の必要に従って、主に流体容積、粘度、体重などに基いて選択される。

【０１１１】 （２）腸送達のための固形処方物 固形処方物が腸（経口）投与のために用いられ得る。これらは、例えば、ピル
、タブレット、粉末またはカプセルとして処方され得る。固形組成物には、従来
の非毒性固形キャリアが用いられ得、これには、例えば、薬学的グレードのマン
ニトール、乳糖、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含
まれる。経口投与には、薬学的に受容可能な非毒性組成物が、先に列挙したキャ
リアのような任意の通常採用される賦形剤、およびほぼ１０％〜９５％の活性成
分（キメラ分子）を取り込むことにより形成される。非固形処方物もまた腸投与
のために用いられ得る。キャリアは、石油、動物、植物または合成起源の、例え
ば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む種々の油から選択され得る
。適切な薬学的賦形剤は、例えば、スターチ、セルロース、タルク、グルコース
、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、
ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステア
レート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコ
ール、水、エタノールなどを含む。

【０１１２】 本発明のキメラ分子が、経口投与されるとき、消化から保護されなければなら
ないことが認識される。これは、代表的には、ペプチドまたはポリペプチド複合
体を、それを酸性かつ酵素的加水分解に耐性にするために、組成物と複合体化す
ることによるか、またはリポソームのような適切に耐性であるキャリア中にペプ
チドまたは複合体をパッケージングすることのいずれかにより達成され得る。化
合物を消化から保護する手段は当該分野で周知である。例えば、Ｆｉｘ Ｐｈａ
ｒｍ Ｒｅｓ．（１９９６）１３：１７６０−１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ Ｊ．
Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）４８：１１９−１３５；治療剤
の経口送達のための脂質組成物を記載する米国特許第５，３９１，３７７号（リ
ポソーム送達は後述にさらに詳細に論議される）を参照のこと。

【０１１３】 （３）経皮／経粘膜送達のための局所処方物 全身投与もまた、経粘膜または経皮手段によってであり得る。経粘膜または経
皮投与のために、透過されるバリアに適切な浸透剤が処方剤中に用いられ得る。
このような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与
のために、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、界面活性剤を
用いて透過を促進し得る。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐薬を用いることによ
ってであり得る。例えば、Ｂａｎｇａ、第１０章；Ｓａｙａｎｉ「吸収性粘膜を
横切るペプチドおよびタンパク質の全身送達」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９９６）１３：８５−１８４を参照の
こと。局所的、経皮投与には、薬剤は、軟膏剤、クリーム、軟膏、粉末およびゲ
ル中に処方され得る。経皮送達システムはまた、例えば、パッチを含み得る。例
えば、Ｂａｎｇａ、第９章を参照のこと。

【０１１４】 ペプチドおよびポリペプチド複合体また、持続送達または持続放出機構で投与
され得、これは、処方物を内部的に送達し得る。例えば、組成物（例えばキメラ
分子）を持続送達し得る、生分解性マイクロスフェアまたはカプセルまたはその
他の生分解性ポリマー形態が本発明の処方物中に含められ得る（例えば、Ｐｕｔ
ｎｅｙ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：１５３−１５７を
参照のこと）。

【０１１５】 （４）吸入送達のための処方物 吸入には、ペプチドまたはポリペプチドは、当該分野で公知の任意のシステム
を用いて送達され得、これには、乾燥粉末エアロゾル、液体送達システム、エア
ージェット噴霧器、噴霧剤システムなどが含まれる。例えば、Ｐａｔｔｏｎら、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）１６：１４１−１４３；例えば、Ｄｕ
ｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｒａ
ｄｉｇｍ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、Ａｅｒｏｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ
、ＣＡ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ
Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）などによるポリペプチド高分子のための産物および吸入送
達システムを参照のこと。

【０１１６】 例えば、薬学的処方物は、エアロゾルまたはミストの形態で投与され得る。エ
アロゾル投与のためには、処方物は、界面活性剤および噴霧剤とともに微細に分
割された形態で供給され得る。好ましくは、界面活性剤は噴霧剤に可溶性である
。このような薬剤の代表は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステアリン酸およびオレイン
酸のような６〜２２炭素原子を含む脂肪酸の、脂肪族多水酸基アルコールまたは
その環状無水物（例えば、エチレングリコール、グリセロール、エリスリトール
、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトール由来のヘキシトー
ル無水物）とのエステルまたは部分エステル、およびこれらエステルのポリオキ
シエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体である。混合または天然グリセリ
ドのような混合エステルが採用され得る。界面活性剤は、組成物の０．１重量％
〜２０重量％、好ましくは０．２５重量％〜５重量％を構成し得る。処方物の残
りは通常噴霧剤である。代表的には、液化性噴霧剤は、周囲温度でガスであり、
そして圧力下で濃縮されている。適切な液化性噴霧剤は、ブタンおよびプロパン
のような５つまでの炭素を含む低級アルカン；および好ましくはフッ化アルカン
またはフルオロ塩素化アルカンである。上記の混合物もまた採用され得る。エア
ロゾルを生成することにおいて、適切なバルブを装着した容器に、微細に分割さ
れた化合物および界面活性剤を含む適切な噴霧剤で充填する。従って、成分は、
バルブの作用により放出されるまで高圧に維持される。例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：１８６８−１８７１を参照のこと。

【０１１７】 別の実施形態では、呼吸組織に処方物を送達するためのデバイスは、処方物が
気化する吸入器である。その他の液体送達システムは、例えば、空気ジェット噴
霧器を含む。

【０１１８】 （５）その他の処方物 本発明の医薬を調製することで、種々の処方物の改変を用い得、そして薬物動
態学および生体内分布を改変するために操作され得る。薬物動態学および生体内
分布を改変するための多くの方法が当業者に公知である。このような方法の例は
、タンパク質、脂質（リポソーム、以下を参照のこと）、炭水化物、または合成
ポリマー（上記で論議）のような物質から構成されるベシクル中の複合体の保護
を含む。薬物動態学の一般的な論議については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ、第３７−３９章、またはＢａｎｇａ、第６章を参照のこと。またＬｅｅ、Ｐ
．Ｉ．Ｄ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ １９９６）を参照のこと。

【０１１９】 （６）送達の経路 本発明の方法で用いられるペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で公知の
任意の手段、例えば全身的、領域的、または局所的に；動脈内、くも膜下腔内（
ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、筋肉内注射、非経口的、胸腔内、局所、経口、または
局所投与により、皮下、気管内（例えばエアロゾルにより）または経粘膜（例え
ば、頬、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）として、単独または薬学的組成物とし
て送達され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公
知または明らかであり、そして科学的文献および特許文献に詳細に記載されてい
る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓまたはＢａｎｇａを参照のこと。投与の特
に好適な様式は、特に例えば、特定器官（例えば、脳およびＣＮＳ（例えば、Ｇ
ｕｒｕｎ Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ．（１９９７）８５：３１７−３２３を参
照のこと）および心臓）に焦点をあてるために、「領域効果」を有することが所
望されるとき、動脈内、筋肉内注射またはくも膜下腔内（ＩＴ）注射を含む。例
えば、本発明のペプチドまたはポリペプチドを脳に直接送達することが所望され
る場合、頸動脈内注射が好適である。高い全身用量が必要である場合、非経口的
投与が送達の好適な経路である。経口耐性を誘導するペプチドの投与が治療目的
である場合、腸投与が好適な方法である。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．（１９９７）１５９：１０３６−１０４４；Ｋｅｎｔ Ａｎｎ．ＮＹ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９７）８１５：４１２−４２２を参照のこと。非経
口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明
らかであり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、Ｂａｎｇａ第７章に詳
細に記載されている。また、Ｂａｉ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９
７）８０：６５−７５；Ｗａｒｒｅｎ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．（１９９７
）１５２：３１−３８；Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９９７）１
８６：５０７−５１５もまた参照のこと。

【０１２０】 （７）治療養生法：薬物動態学 薬学的組成物は、投与の方法に依存して種々の単位投与量形態で投与され得る
。代表的なペプチドおよびポリペプチド薬学的組成物の投与量は、当業者に周知
である。代表的には、このような投与量は、事実上熟慮され、そして特定の治療
内容、患者耐性などに依存して調節される。これを達成するために適切なキメラ
分子の量は、「治療的に有効な用量」として規定される。投与量スケジュールお
よびこの使用に有効な量、すなわち「用量養生法」は、種々の因子に依存し、こ
れには、疾患または症状の段階、疾患または症状の重篤度、患者の健康の一般的
状態、患者の肉体的状態、年令、活性薬剤の薬学的処方物および濃度などが含ま
れる。患者のための投与量養生法を算出するには、投与の様式もまた考慮される
。投与量養生法はまた、薬物動態学、すなわち、薬学的組成物の吸収速度、生物
学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮しなければならない。例えば、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｅｇｌｅｔｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（１９９７）１８：１
４３１−１４３９；Ｌａｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２
７−１５３３を参照のこと。

【０１２１】 治療適用には、組成物は、虚血疾患を患う患者に、疾患および／またはその合
併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するに十分な量で投与される。これを
達成するに適切な量は、「治療的に有効な用量」として規定される。この使用の
ために有効な量は、疾患の重篤度、患者の健康の一般的状態，投与の頻度および
経路、臨床医の判断などに依存する。

【０１２２】 投与量は、症状の寛解または軽減を評価することによるか、または血液または
組織病理学的標本の分析のような客観的基準によって、経験的に決定され得る。
従って、本発明の組成物は、疾患の進行を阻止するため、およびこれらまたはそ
の他の症状の発症、頻度または重篤度を低減するために投与される。

【０１２３】 本発明のペプチドおよび複合体を含む薬学的組成物は、単独またはその他の治
療処置と組み合わせて投与され得る。組成物の単回または複数投与は、患者に必
要であって、かつ患者が耐える投与量および頻度に依存して投与され得る。

【０１２４】 （８）リポソーム処方物 本発明は、キメラ分子が脂質単層または二重層中に取り込まれている処方物の
ための医薬品を提供する。本発明はまた、水可溶性ペプチドまたは複合体が単層
または二重層の表面に付着した処方物を提供する。例えば、ペプチドは、ヒドラ
ジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソ
ーム（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９５
）６：７０５−７０８を参照のこと）に付着され得る。リポソームまたはインタ
クト細胞（例えば、赤血球細胞）の平面状脂質膜または細胞膜のような任意の形
態の脂質膜が用いられ得る。リポソーム処方物は、任意の手段によってであり得
、これには、静脈内、経皮的（例えば、Ｖｕｔｌａ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．
（１９９６）８５：５−８）、経粘膜的、または経口投与が含まれる。本発明は
また、本発明のペプチドおよび／または複合体がミセルおよび／またはリポソー
ム内に取り込まれる薬学的調製物を提供する（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９４）４６：２３−２８；Ｗｏｏｄｌｅ
Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９２）９：２６０−２６５を参照のこと）。

【０１２５】 リポソームおよびリポソーム処方物は、標準的方法に従って調製され得、そし
て当該分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ
Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（１９９５）１：１９７−２１０；Ａ
ｌｖｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９５）１４５：５−３１；Ｓｚｏ
ｋａ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８０）９：４６
７、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８
３７，０２８号；これらの参考文献およびこれらの中で引用されるすべての参考
文献は参考として本明細書中に援用される、を参照のこと。１つの実施形態では
、代表的には、本発明のリポソームは、リポソームの表面上に位置するキメラ分
子複合体を、この複合体が内皮細胞上のレセプターとの相互作用に利用可能であ
るような様式で含む。米国特許第５，８７６，７４７号は、優先的に心臓および
骨格筋までたどるリポソームを記載し、そして参考として本明細書中に援用され
る。

【０１２６】 リポソーム荷電は、血液からのリポソームクリアランスにおける重要な決定因
子であり、負に荷電したリポソームは、網膜内皮系によってより迅速に摂取され
（Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
（１９７５）６３：６５１）、そしてそれ故、血流中でより短い半減期を有する
。ホスファチジルエタノールアミン誘導体を取り込むことは、リポソーム凝集を
防ぐことによって循環時間を増大する。例えば、Ｎ−（オメガ−カルボキシ）ア
シルアミド−ホスファチジルエタノールアミンを、Ｌ−α−ジステアロイルホス
ファチジルコリンの大きな単層のベシクル中への取り込みは、インビボリポソー
ム循環寿命を劇的に増大する（例えば、Ａｈｌ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３２９：３７０−３８２を参照のこと）。延長した
循環半減期を有するリポソームは、代表的には、治療および診断使用に所望され
る。例えば、血流中で、８、１２時間から、または２４時間まで維持され得るリ
ポソームは、本発明の特に好適な実施形態である。

【０１２７】 代表的には、リポソームは、約５〜１５モル％の負に荷電した、ホスファチジ
ルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールのよ
うなホスホリピドを用いて調製される。ホスファチジルグリセロールのような、
付加された負に荷電したホスホリピドはまた、自発的なリポソーム凝集を防ぐた
めに供され、そしてそれ故小型のリポソーム凝集物形成のリスクを最小にする。
スフィンゴミエリンまたは飽和中性ホスホリピドのような膜剛直化剤は、少なく
とも約５０モルパーセント、および５〜１５モルパーセントのモノシアリルガン
グリオシドの濃度で、米国特許第４，８３７，０２８号に一般に記載されるよう
に、血流中のリポソーム調製物の増大した循環を提供し得る。

【０１２８】 さらに、リポソーム懸濁液は、貯蔵に際しフリーラジカルおよび脂質過酸化損
傷に対して脂質を保護する脂質保護薬剤を含み得る。αトコフェロールおよびフ
ェリオキシアニンのような水溶性鉄特異的キレート剤のような親油性フリーラジ
カル失活剤が好適である。

【０１２９】 本発明の処方物は、異質サイズの多層ベシクルを含み得る。この方法では、ベ
シクル形成性脂質は、適切な有機溶媒または溶媒系中に溶解され、そして真空下
または不活性ガス下で乾燥され、薄い脂質膜を形成する。所望であれば、この膜
は、第三級ブタノールのような適切な溶媒中に再溶解され得、次いで凍結乾燥さ
れてより容易に水和された粉末様形態にあるより均質な脂質混合物を形成する。
この膜は、ペプチドまたはポリペプチド複合体の水性溶液でカバーされ、そして
代表的には、１５〜６０分間に亘る攪拌により水和される。得られる多層ベシク
ルのサイズ分布は、より激しい攪拌条件下で脂質を水和することによるか、また
はデオキシコレートのような可溶化界面活性剤を添加することによって、より小
さいサイズに向かってシフトされ得る。この水和媒体は、最終リポソーム懸濁液
中のリポソームの内部容量において所望される濃度で、ペプチドまたは複合体を
含む。代表的には、この薬物溶液は、緩衝化生理食塩水溶液中に、１０〜１００
ｍｇ／ｍｌの本発明のペプチドまたは複合体を含む。

【０１３０】 リポソーム調製に続いて、リポソームは、所望のサイズ範囲および比較的狭い
リポソームサイズの分布を達成するようにサイズ決めされる。１つの好ましいサ
イズ範囲は、約０．２〜０．４ミクロンであり、これは、従来のフィルター（典
型的には、０．２２ミクロンフィルター）を通して濾過することにより、リポソ
ーム懸濁液の滅菌を可能にする。このフィルター滅菌法は、リポソームが、約０
．２〜０．４ミクロンまでサイズダウンされる場合、高出量基準に基づいて実施
される。いくつかの技術は、所望のサイズにリポソームをサイズ決めするために
利用可能である（例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと）。バ
ス式またはプローブ式超音波処理手順のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音
波処理は、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さな単層ベシクルまでの漸減性
サイズ調節を生じる。ホモジナイゼーションは、大きなリポソームをより小さな
リポソームに分画するための剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的
なホモジナイゼーション手順において、多層状ベシクルが、選択されたリポソー
ムサイズ（典型的には、約０．１と０．５ミクロンとの間）が観察されるまで、
標準の乳濁ホモジナイザーを介して再循環される。両方の方法において、粒子サ
イズ分布は、従来のレーザービーム粒子サイズ分解によりモニターされ得る。小
孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通すリポソームの押し出しは
また、リポソームサイズを比較的良好に規定されたサイズ分布に減縮するための
有効な方法である。典型的に、懸濁液は、所望のリポソームサイズ分布が達成さ
れるまで、１回以上、その膜を通して循環される。このリポソームは、より小さ
な孔の膜を連続的に通して押し出され得、リポソームサイズの漸進的減少を達成
する。

【０１３１】 最も効率的な封入方法の下でさえも、初めにサイズ決めされたリポソーム懸濁
液は、遊離（カプセル化されてない）形態の５０％以上までの複合体を含み得る
。いくつかの方法は、特定の処方が所望される場合、リポソーム懸濁液から補足
されていない化合物を除去するために利用可能である。１つの方法では、懸濁液
中のリポソームは、高速遠心により叩きつけられ、懸濁液中の遊離化合物および
非常に小さいリポソームを残す。別の方法は、限外濾過、次いで濃縮したリポソ
ームを置換媒体中に再懸濁することにより懸濁液を濃縮する工程を包含する。あ
るいは、ゲル濾過は、大きなリポソーム粒子を溶質分子から分離するために使用
され得る。この処理に続いて、リポソーム懸濁液は、例えば、静脈内投与、腹腔
内（ＩＰ）投与、経皮的投与、または経粘膜投与における使用のための所望の濃
度にされ得る。この方法は、リポソームが、例えば、遠心もしくは超遠心により
濃縮されている場合、適切な容積の適切な媒体中にリポソームを再懸濁すること
を含み、または薬物除去工程が、総懸濁液容積を増加する場合、懸濁液の濃縮を
含む。次いで、この懸濁液は、上記のように濾過により滅菌される。ペプチドま
たはキメラ分子を含むこれらのリポソームは、例えは、投与の様式、送達されて
いる薬物、処置されている特定の疾患に従って変化する容量で非経口的にかまた
は局所的に投与され得る。

【０１３２】 ミセルは、非極性領域を有する分子の溶解性を増加するために、当該分野にお
いて通常使用される。従って、当業者は、ミセルが、本発明の組成物において有
用であることを認識する。本発明の複合体を含むミセルは、当該分野において周
知である方法に従って調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ第２０章を
参照のこと）。本発明のペプチドおよび／または複合体を含むミセルは、典型的
に標準的な界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）または界面活性剤（ｄｅｔｅｒ
ｇｅｎｔ）を使用して調製される。ミセルは、水溶液中で、界面活性剤（疎水性
部分および１つ以上のイオン性さもなくば強力な親水性基を含む分子）により形
成される。固体界面活性剤の濃度が増加するにつれて、空気／水またはガラス／
水の界面に吸着されるその単分子膜は、密にパッキングされるようになるので、
さらなる占有率は、既に２つの単分子膜である界面活性剤分子の過剰の圧力を必
要とする。その濃度を超える溶解した界面活性剤の量のさらなる増加は、新たな
分子をミセルに凝集するに等しい量を引き起こす。適切な界面活性剤としては、
ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オク
タオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクトキシノール９および
ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７（登録商標）（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。好ましい界面活性剤は、静脈内（ＩＶ）
注射と両立し得る非イオン性ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン界
面活性剤（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７（登録商標）、ｎ−オクチル
−α−Ｄ−グルコピラノシドなど）である。リン脂質（例えば、リポソームの作
製における使用について記載されるリン脂質）はまた、ミセル形成のために使用
され得る。混合ミセルは、共通の界面活性剤またはリン脂質およびサブユニット
の存在下で形成され得る。本発明の混合ミセルは、サブユニット、リン脂質およ
び／または界面活性剤の任意の組み合わせを含み得る。従って、ミセルは、サブ
ユニットおよび界面活性剤、リン脂質および界面活性剤の両方と組み合わされた
サブユニット、またはサブユニットおよびリン脂質を含み得る。

【０１３３】 （（Ｂ）核酸ベースの治療法） 概して述べると、遺伝子治療ベクターは、それが移入された哺乳動物細胞に対
する医学的に有用な表現型効果を生じる外来性ポリヌクレオチドである。ベクタ
ーは、複製起点を有してもよいし有さなくてもよい。例えば、ベクター中に複製
起点を含むことは、患者への投与の前のベクターの増殖のために有用である。し
かし、複製起点は、そのベクターが宿主染色体ＤＮＡに組み込まれるか、または
宿主ｍＲＮＡまたはＤＮＡと結合するように設計されている場合、しばしば投与
の前に除去され得る。遺伝子治療において使用されるベクターは、ウイルス性ま
たは非ウイルス性であり得る。ウイスルベクターは、通常、患者にウイルスの構
成要素として導入される。非ウイルス性ベクター（典型的には、ｄｓＤＮＡ）は
、裸のＤＮＡとしてまたは移入増強ビヒクル（例えば、レセプター認識タンパク
質、リポアミン、またはカチオン性脂質）に付随して移入され得る。

【０１３４】 （（１）ウイスルベースの方法） ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウ
イルスおよびヘルペスウイルス）は、しばしば２つの構成要素（修飾ウイルスゲ
ノムおよびそれを取り囲むコート構造）から作製される（一般的には、Ｓｍｉｔ
ｈら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）４９，８０７−８３
８を参照のこと；この参考文献およびそこに引用される全ての参考文献は、本明
細書中で参考として引用される。）が、ウイルスベクターは時々、裸の形態また
はウイルスタンパク質ではないタンパク質でコートされて導入される。最も最近
のベクターは、野生型ウイルスと同様のコート構造を有する。この構造は、ウイ
ルス核酸をパッケージおよび保護し、そして標的細胞に結合しそして侵入する手
段を提供する。しかし、遺伝子治療のために設計されたベクター中のこのウイル
ス核酸は、多くの方法で変化される。これらの変化の目的は、利用可能なパッケ
ージング細胞またはヘルパー細胞においてベクター形態を増殖するその能力を維
持している間、標的細胞中でウイルスを増殖不能にすること、外来性ＤＮＡ配列
の挿入のための空間をウイルスゲノム内に提供すること、および目的の遺伝子を
コードする新たな配列を組み込みそしてその適切な発現を可能にすることである
。従って、ベクターの核酸は、一般に、以下の２つの構成要素を含む：ヘルパー
系統中に複製しそしてパッケージングするために必須のシス作動性ウイルス配列
および外来性遺伝子のための転写ユニット。他のウイルス機能は、特異的なパッ
ケージング細胞系統またはヘルパー細胞系統中にトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ
）発現される。

【０１３５】 （（ａ）レトロウイルス） レトロウイルスは、ウイルスゲノムとして一本鎖ＲＮＡを含む大きなクラスの
エンベロープウイルスを含む。正常なウイルスのライフサイクルの間、ウイルス
ＲＮＡは、逆転写され、宿主ゲノム中に組み込まれそして長期間発現される二本
鎖ＤＮＡを生じる。結果として、感染された細胞は、宿主細胞への明確な傷害を
伴わずに連続してウイルスを減少する。ウイルスゲノムは、小さく（およそ１０
ｋｂ）、そしてそのプロトタイプの組織は、極度に単純であり、ｇａｇ（抗原ま
たはコアタンパク質に特異的な群）；ｐｏｌ（逆転写トランスクリプターゼ）；
およびｅｎｖ（ウイルスエンベロープタンパク質）をコードする３つの遺伝子を
含む。ＲＮＡゲノムの末端は、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれ、そしてプロモ
ーターおよびエンハンサーの活性および組み込みに関与する配列を含む。このゲ
ノムはまた、ウイルスＲＮＡをパッケージングするために必要とされる配列およ
び別々のエンベロープｍＲＮＡの生成のためのスプライスのアクセプター部位お
よびドナー部位を含む。ほとんどのレトロウイルスは、複製している細胞中にの
み組み込まれ得るが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、除外されるようであ
る。この特性は、レトロウイルスの遺伝子治療のためのベクターとしての使用を
制限する。

【０１３６】 レトロウイルスベクターは、比較的単純であり、５’および３’ＬＴＲ、パッ
ケージング配列、および目的の遺伝子からなる転写ユニットを含み、これは、典
型的には、発現カセットである。このようなベクターを増殖するために、いわゆ
るパッケージング細胞系統を使用して、失ったウイルス機能をトランスで提供し
なければならない。このような細胞は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの組み込ま
れたコピーを含むがパッケージングシグナルを欠くように操作され、その結果、
ヘルパーウイルス配列は、キャプシド形成されなくなる。ベクターおよびパッケ
ージング細胞系統に付加されるかそれらから除去されるさらなる特質は、ヘルパ
ーウイルスによる混入のより有効なまたは減少した可能性をベクターに与えるた
めの試みを反映する。

【０１３７】 レトロウイルスベクターの主な利点は、それらが組み込まれ、それゆえ潜在的
に長期発現が可能であることである。それらは、比較的大量に増殖され得るが、
ヘルパースウイルスの非存在を確実にするためには注意が必要とされる。

【０１３８】 （（ｂ）アデノウイルス） アデノウイルスは、直線二本鎖ＤＮＡを含む、大きなクラスの非エンベロープ
化ウイルスを含む。ウイルスの正常なライフサイクルは、分裂細胞を必要とせず
、そして大量のウイルス蓄積の間の許容細胞における生産的感染を含む。生産的
感染サイクルは、細胞培養物において約３２〜３６時間かかり、そして２つの相
（初期相（ウイスルＤＮＡ合成の前）および後期相（構造タンパク質およびウイ
ルスＤＮＡが合成され、そしてウイルス粒子に組み込まれる間））を含む。一般
に、アデノウイルス感染は、ヒトにおける軽度な疾患に関連する。

【０１３９】 アデノウイルスベクターは、いくらか大きく、そしてレトロウイルスまたはＡ
ＡＶベクターよりも複雑である。これは、ウイルスゲノムの小画分がほとんどの
現在のベクターから取り除かれることに、部分的に起因する。さらなる遺伝子が
除去される場合、この困難性が証明されるかぎり、これらは、トランスで提供さ
れ、ベクターを産生する。実際、アデノウイルスベースのベクターの一般的なタ
イプは、研究されてきた（Ｅ３−欠失ベクターおよびＥ１−欠失ベクター）。研
究室のストック中の野生型のくつかのウイルスは、Ｅ３領域を欠失しており、そ
してヘルパーの非存在下で増殖し得る。この能力は、Ｅ３遺伝子産物が野生型に
おいて必要ではないことを意味するのではなく、培養細胞における複製がそれら
を必要としないことのみを意味する。Ｅ３領域の欠失は、外因性ＤＮＡ配列の挿
入を可能にし、生産性感染およびコードされるタンパク質の比較的大量の一過性
の合成が可能であるベクターを生じる。

【０１４０】 Ｅ１領域の欠失は、アデノウイルスを無効にするが、このようなベクターは、
なお増殖し得る。なぜならば、確立されたヒト細胞系統（「２９３」と呼ばれる
）が存在し、これは、Ａｄ５のＥ１領域を含み、そしてこれは、Ｅ１タンパク質
を恒常的に発現する。アデノウイルスを含む最も最近の遺伝子治療適用は、２９
３細胞内で増殖されるＥ１置換ベクターを利用してきた。

【０１４１】 アデノウイルスベクターの主な利点は、これらが広範な細胞および組織におい
て効率的にエピソーム遺伝子移入し得ること、およびそれらが容易に大量に増殖
することである。この主な利点は、ウイルスに対して応答性の宿主が、少なくと
も高用量の第１世代ベクターで、発現の持続期間および繰り返し投薬する能力を
制限するようであることである。

【０１４２】 （（ｃ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）） ＡＡＶは、直線一本鎖ＤＮＡを含む、小さくて単純な非自律性ウイルスである
。Ｍｕｚｙｃｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８，９７−１２９を参照のこと；この参考文献お
よびそこに引用されている全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用され
る。このウイルスは、複製のために、アデノウイルスまたは特定のウイルスでの
同時感染を必要とする。ＡＡＶは、ウイルスに対する抗体により証明されるよう
にヒト集団において広範に存在するが、いかなる公知の疾患にも関連しない。Ａ
ＡＶゲノム創造は、直線的であり、遺伝子を２つだけ含む（ｒｅｐおよびｃａｐ
）。ゲノムの末端は、約１４５ヌクレオチドの末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。

【０１４３】 ＡＡＶベースのベクターは、典型的には、目的の転写ユニットに隣接するＩＴ
Ｒ配列のみを含む。ベクターＤＮＡの長さは、４６８０ヌクレオチドのウイルス
ゲノムの長さをおおきくは伸長できない。最近、ＡＡＶベクターの増殖は、扱い
にくくそして、ベクター自体のみではなく、ヘルパー機能を提供するためにｒｅ
ｐおよびｃａｐをコードするプラスミドを宿主に導入することを含む。このヘル
パープラスミドは、ＩＴＲを欠き、従って複製およびパッケージを行い得ない。
さらに、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）が、しばしば必要とされ
る。ＡＡＶベクターの潜在的な利点は、ウイスルＤＮＡの組み込みに起因して、
恐らく必要でなくともそれらが非分裂細胞において長期発現が可能であることで
ある。これらのベクターは構造的に単純であり、従って、これらは、アデノウイ
ルスと同様に宿主細胞応答を刺激し得る。現時点での主な制限は、ＡＡＶベクタ
ーを大量に増殖させることが非常に困難であることである。

【０１４４】 （（２）非ウイルス性遺伝子移入法） 遺伝子治療において使用される非ウイル性核酸ベクターとしては、プラスミド
、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、メチルホスホネートまた
はホスホロチオエート）、ポリアミン、核酸、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）
が挙げられる。このようなベクターは、典型的には、タンパク質またはＲＮＡを
発現するための発現カセットを含む。このような発現カセット中のプロモーター
は、構造的、細胞型特異的、段階特異的、および／または調節可能であり得る（
例えば、グルココルチコイド（ＭＭＴＶプロモーター）のようなホルモンによる
）。転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加され得る。
エンハンサーは、プロモーターにより転写を増加する１０〜３００ｂｐの間のシ
ス作動性配列である。エンハンサーは、転写ユニットに対して５’または３’の
どちらかである場合、効率的に転写を増加する。これらはまた、イントロン内ま
たはコード配列自体内に位置する場合、有効である。典型的には、ＳＶ４０エン
ハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよび
アデノウイルスエンハンサーを含むウイルス性エンハンサーが使用される。哺乳
動物系由来のエンハンサー配列もまた、通常使用される（例えば、マウス免疫グ
ロブリン重鎖エンハンサー）。

【０１４５】 全ての種類の遺伝子治療ベクターはまた、選択マーカー遺伝子を含み得る。適
切なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チ
ミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐性を与える原核生物遺伝子（ｇｐ
ｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）（これは、ｍｙ
ｃｏｐｈｎｏｌｉｃ ａｃｉｄで選択され得る）；ｎｅｏ（ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ）（これは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはプロマイシン
で選択され得る）；およびＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）（これは、メ
トトレキセートで選択され得る））が挙げられる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８１）７８，２
０７２；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（
１９８２）１，３２７）。

【０１４６】 組み込みの前に、ベクターは、多くのバリアーを横切らなければならなく、こ
れは、発現され続けるＤＮＡの非常に少数画分しか生じ得ない。高レベルの遺伝
子発現に対する限定としては、以下が挙げられる：血液および組織に存在するヌ
クレアーゼに起因するベクターの損失；細胞へのＤＮＡの無効な侵入；ＤＮＡの
細胞の核への無効な侵入および他の区画についてのＤＮＡの優先度；核における
ＤＮＡ安定性の欠如（核安定性を限定する因子は、他の細胞および細胞外区画に
影響するそれらとは異なり得る核を限定する）、染色体への組み込みの効率；お
よび組み込みの部位。

【０１４７】 これらの効率の潜在的な欠失は、治療に影響する産物が発現される発現カセッ
トに加えて非ウイルス性ベクター中にさらなる配列を含むことにより取り扱われ
得る。このさらなる配列は、細胞の外側および内側の両方における安定性を与え
ること、細胞への侵入を媒介すること、細胞の核への侵入を媒介すること、およ
び核ＤＮＡ内での組み込みを媒介することにおける役割を有し得る。例えば、ア
プタマー様ＤＮＡ構造物または他のタンパク質結合部位は、細胞表面レセプター
への、またはレセプターと結合する（これにより、細胞へのＤＮＡ移入の効率を
増加する）血清タンパク質へのベクターの結合を媒介するために使用され得る。

【０１４８】 他のＤＮＡ配列は、特定の区画の回避、およびエスケープまたは核への侵入が
より効率的である他の区画についての優先度を、直接的にかまたは間接的に生じ
得る。他のＤＮＡ部位および構造物は、核膜中のレセプターと、または核に移動
する他のタンパク質直接的にかまたは間接的に結合し得、これにより核によるベ
クターの取り込みを増強する。他のＤＮＡ配列は、取り込みの効率に直接または
間接的に影響する。相同組換えによる取り込みについて、重要な因子は、染色体
配列に対する相同性の程度および長さ、ならびにゲノムにおけるそのような配列
（例えば、ａｌｕ反復）の頻度である。相同組換えを媒介する特定の配列はまた
、重要である。なぜならば、組み込みは、転写的に活性なＤＮＡを、より容易に
生じるからである。相同標的構築物を構築するための方法および物質は、例えば
、Ｍａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３３６：３４８；Ｂｒｅｄｌｅ
ｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：５３４により記載され
る。

【０１４９】 非相同性で非嫡出かつ部位特異的な組換えについて、組換えは、組換えタンパ
ク質と相互作用する治療ベクター上の特異的部位（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘおよ
びｆｌｐ／ｆｒｔ系）により媒介される。例えば、Ｂａｕｂｏｎｉｓ＆Ｓａｕｅ
ｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１，２０２５−２０２９は、
ｌｏｘＰ部位を含むベクターがｃｒｅ酵素の存在下で染色体ＤＮＡ中のｌｏｘＰ
部位において組み込まれるようになることを報告する。

【０１５０】 遺伝子治療において有用な産物をコードする非ウイルス性ベクターは、手段（
例えば、リポフェクチン、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム
、ポリカチオン：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ウイルス粒子、薬剤により増強
されたＤＮＡの取り込み、エキソビボ伝達）により動物に導入され得る。リポフ
ェクチンは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８
７号および同第４，８９７，３５５号に記載され、そしてリポフェクチン試薬は
、市販される（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^TMおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ ^TM ）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適切であ
るカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４
２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。

【０１５１】 ウイルス性粒子をパッケージングすることについてのサイズ制限に起因して、
ウイルスゲノムへの比較的小さな非ウイルス性ポリヌクレオチド配列のみを取り
込む、現存のウイルスベース遺伝子治療ベクターと異なり、裸のＤＮＡまたはリ
ポフェクチン複合体は、細胞へ大きな（例えば、５０〜５，０００ｋｂ）外因性
ポリヌクレオチドを移入するために使用され得る。非ウイルス性ベクターのこの
特性は、特に有利である。なぜなら、１００キロベースを超える治療スパンによ
り送達され得る多くの遺伝子（例えば、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）
遺伝子、ハンティングトン舞踏病遺伝子）および大きな相同標的構築物または導
入遺伝子が効率的な組み込みのために必要とされ得るからである。必要に応じて
、このような大きな遺伝子は、標的遺伝子に、２つ以上のフラグメントとして送
達され得、そして細胞内の相同組換えにより再構築され得る（ＷＯ９２／０３９
１７を参照のこと）。

【０１５２】 （（Ｃ）遺伝子治療の適用） 遺伝子治療ベクターは、個々の患者への投与（典型的には全身投与（例えば、
静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射もしくは頭蓋内注射））または
局所適用によりインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで
細胞（例えば、個々の患者から拡張された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物
、組織生検）または万能給血者造血幹細胞）に送達され得、通常は組み込まれた
ベクターを有する細胞についての選択後、患者への細胞の再移植が続く。

【０１５３】 （（４．）治療キット） キットは、治療的用途および診断用途のために供給され得る。１つの実施形態
において、本発明の薬学的処方物は、凍結乾燥形態であり、これは、容器内に置
かれる。複合体（これもまた標識に結合されたかまたは結合されていない）緩衝
液（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、安定剤、殺生剤、不活性タンパク質
（例えば、血清アルブミン）など）および使用のための手引きと共にキットに含
まれる。一般に、これらの物質は、約５重量％未満（複合体の量に基づく）で存
在し、そして通常少なくとも約０．００１重量％（タンパク質濃度に基づく）の
総量で存在する。賦形剤が総組成物の約１重量％〜９９重量％で存在し得る場合
、頻繁に、活性成分を希釈するために不活性エキステンダーまたは賦形剤を含む
ことが所望される。複合体に結合し得る抗体がアッセイに使用される場合、これ
は通常、通常別々のバイアル中に提示される。抗体は、典型的には、標識に結合
され、そして当該分野で周知の技術に従って処方される。

【０１５４】 （実施例） 以下の実施例は例示のために提供されるが、特許請求された本発明を限定しな
い。

【０１５５】 （実施例１） （ＣＨＯ細胞における野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の発現） ＶＥＧＦ−ＢのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇スプライス変異体は、哺乳動物細胞から発現
および分泌された後、内皮細胞においてマイトジェン活性を示す非グリコシル化
および細胞関連逆方向ダイマーである（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｕ．および
Ｋ．Ａｌｉｔａｌｏ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
．（１９９９）２３７：４１−５７を参照のこと）。野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ−
Ｂ₁₆₇分子は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現され、
そしてさらに、本発明の標的化ペプチドとの化学結合に使用される。ＣＨＯ細胞
は、産生宿主として選択され得る。なぜなら、フォールディングの矯正およびｃ
ｙｓ−リッチタンパク質の二量体化は、哺乳動物細胞において優先的に生じるか
らである。Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発
現は、代替手順であり得、そして変性剤中での封入体の可溶化およびリフォール
ディングを必要とする。

【０１５６】 （プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７の構築およびＣＨＯ細胞におけるＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇の発現） 以下の材料および方法に記載されるように、プラスミドを構築する。このプラ
スミドにおいて、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡをＳＶ４０初期プロモーターにより
調節する。ＡＴＣ開始コドンのすぐ上流で、真核生物細胞における翻訳に最適な
コンテキストにＤＮＡ配列を変化する。ｄｈｆｒ−欠失ＣＨＯ細胞におけるプラ
スミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７およびｐＳＶ−ｒｄｈｒｆ（マウスＤＨＦＲ選
択マーカーを含む）の同時トランスフェクションおよび選択は、ＶＥＧＦ−Ｂ_{16 7} を発現する細胞クローンを生じる（例えば、Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．およびＬ．Ａ
．Ｃｈａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）
７７：４２１６−４２２０を参照のこと）。ＣＨＯ細胞の同時トランスフェクシ
ョンおよび選択を、標準細胞培養手順を使用して行う（例えば、Ａｕｓｅｂｅｌ
，Ｆ．Ｍ．（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６．
およびＨｅｒｌｉｔｓｃｈｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９６）８：３５８−３６４を参照のこと
）。ＶＥＧＦ−Ｂ特異的ペプチドでウサギを免疫することより得られる抗体を使
用する当該分野で公知の方法に従って、細胞培養上清のウエスタンブロッティン
グにより発現についてのスクリーニングを行う（例えば、Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：４３５０
−４３５５４を参照のこと；Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ（１９９６）２７１：１９３１０−７もまた参照のこと；これらの参考および
本明細書中に列挙された参考は、本明細書中に参考として援用される）。

【０１５７】 安定高発現ＣＨＯクローンは、生物工学における標準手順を使用するＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇を産生するために使用される（例えば、Ｇｏｍｐｅｒｔｓ，Ｅ．ら、Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ，Ｔｒａｎｓｆ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．（１９９２）６：２４
７−２５１を参照のこと）。

【０１５８】 （発現プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７の構築） プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７は、ファージλ ｇｔ１１−ＶＥＧＦ−
Ｂｓｔ１６７由来の５８０ｂｐのＰＣＲ産物の、発現プラスミドｐＳＩ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）への挿入によって構築される。このファージは、λ ｇ１
１（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）におけるヒト線維肉腫ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングより得られる。ＰＣＲ反応は、Ａｄｖａｎｔａ
ｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）を使用して、１ｎｇのプラスミドテンプレート、０．５
μＭのプライマー、Ｐ−ｗｔ１６７（１）５−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＡＧ
ＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧ−３’およびＰ−ｗｔ１
６７（２）５’−ＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣ
ＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧ−３’、ならびに０．２ｍＭ ｄＮＴＰを含む１００
μｌの最終容量で、９３℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間の３０サ
イクルの条件、次いで７２℃で１０分間の伸長（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ
Ｇｅｎｅ ＡＴＡＱ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍにおける）
を使用して行われる。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化
し、そしてＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ切断プラスミドｐＳＩに連結する。得れれるプラ
スミドを、ｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７と名付ける。

【０１５９】 （実施例２） （ペプチドＧＧＧＶＦＷＱのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合） （原理） Ｎ末端でブロックされたペプチドは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）
の存在下で、水容性カルボジイミドＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドによってＣ末端で活性化される。次いで、活性化
されたペプチドは、ＶＥＧＦ分子の第１のアミノ基と反応する。ｐＨを注意深く
調節することによって、この反応の、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子のＮ末端への配向が
可能となる（例えば、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１
９８６）１５６：２２０−２２２およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，「Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｏ Ｓｏｌ
ｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ
ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，（ＣＲＣ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）第２２１頁〜２２９頁；これらの参考およびそこに
列挙される参考は、本明細書中に参考として援用される）。

【０１６０】 （方法） １μＭの精製ペプチドを、少量のＤＭＳＯに溶解し、そしてさらに１ｍＭの溶
液を得るまで、緩衝液で希釈した。ＥＤＣおよびＮＨＳを１０倍のモル濃度過剰
で添加し、そして反応を２時間室温で起こさせた。次いで、混合物を、ＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇の溶液（緩衝液中）に移す。ｐＨを制御し、必要な場合、６．８に調節
する。反応を、４０℃で、さらに１８時間進行させる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇／ＶＥ
ＧＦ−Ｂキメラ分子由来の遊離のペプチドの分離は、ゲル濾過によって達成され
得る。その混合物をＳｅｐａｈｄｅｘ Ｇ２５で充填されたカラムにアプライし
、そしてタンパク質を空隙容量に収集するが、未反応のペプチドおよび低分子産
物を後で溶出する。

【０１６１】 ＶＥＧＦキメラ分子結合体の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｎ−末端
配列決定および分光測光法のような標準技術によってアッセイする。結合体の絶
対質量を、質量分析によって決定する。これは、結合したペプチドの量について
の情報およびＶＥＧＦ上のペプチドの位置についての情報をまた提供する。理想
的なモル濃度結合比は、ペプチドがＶＥＧＦのＮ末端に位置するときに達成され
る。結合体の生物学的な活性は、適切な動物および／または培養試験によって決
定される。

【０１６２】 （実施例３） （Ｃ末端伸長ペプチドＧＧＧＶＦＷＱのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合） （原理） 標的化ペプチドレセプターに対するＢＥＧＦレセプターｒｅｓｐ．への、ＶＥ
ＧＦ−Ｂキメラ分子の結合の間の立体化学的な障害を避けるために、ペプチドは
、Ｃ末端でいくつかの付加的なアミノ酸伸長され得る。Ｃ末端スペーサーは、最
大限に柔軟であるべきであるが、それらの特定のレセプターに対するＶＥＧＦの
結合メカニズムおよび／またはペプチドを妨害しない。通常、ポリＧｌｙまたは
ポリＡｌａ配列は、これらの要求を満たす。

【０１６３】 （方法） 結合は、上記の実施例２に記載されるように、達成され得る。

【０１６４】 （実施例４） （スペーサードメインを有するヘテロ二機能性試薬を使用することによるペプ
チドＧＧＧＶＦＷＱのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合） （原理） ペプチドの結合はまた、ペプチドのＮ末端の、ヘテロ二機能性架橋剤（例えば
、ＳＭＢＰ）のアミノ反応性部分との反応によって達成され得、次いで活性化さ
れたペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の到達できるスルフヒドリル基と反応し、チ
オエーテル結合を形成する（例えば、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７２，６０９およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．、「Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ
ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲ
ＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ、（
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）、第２２１頁〜２２９頁を参照のこと
）。ＳＭＢＰを使用する場合、スペーサーの長さは、１．５ｎｍのオーダーであ
る。以下のことに留意すべきである：結合反応に関与するスルフヒドリル基は、
レセプタータンパク質への結合に重要ではない。

【０１６５】 （方法） 遊離のＮ末端を含む１μＭのペプチドを、ＤＭＳＯ／緩衝液に溶解する。１０
倍モル濃度過剰のＳｕｌｆｏ−ＳＭＢＰ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ− マレイミドフェニル）ブチレート）を添加する。１時間室温でのペプチドの活性
化後、等モル濃度量のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇を添加する。この結合反応を、１８時間
４０Ｇで進行させる。ＶＥＧＦ−Ｂ／ＶＥＧＦ−Ｂキメラ分子からの遊離のペプ
チドの分離は、上記のゲル濾過を使用して達成され得る。

【０１６６】 （実施例５） （ペプチドＧＧＧＶＧＷＱのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への非共有結合） （原理） イオン相互作用は、タンパク質構造を形成する際の１つの優性な力である。高
分子に反対の電荷の領域を導入することによって、２つの反応パートナーの間の
タイトな複合体を形成することが可能になり、それらはまた生理学的な条件で安
定である。これらの荷電されたアミノ酸の導入は、両方の分子の機能と適合する
べきである。

【０１６７】 （方法） ペプチドＧＧＧＶＦＷＱは、ＮまたはＣ末端で、４〜５の荷電されたアミノ酸
（正の荷電の導入のためにリジン、アルギニン、負の電荷の導入のためのグルタ
ミンまたはアスパラギン酸）のストレッチによって改変されなければならない。
ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇はまた、好ましくは、４〜６の荷電されたアミノ酸の配列でＮ
末端で伸長されるべきある。一旦、反応パートナーが、合成され、そして適切な
程度の質まで精製されると、複合体は、等量の反対に荷電された反応パートナー
と混合するだけで容易に形成され得る。結合体からの未反応の分子の分離は、イ
オン交換クロマトグラフィーを使用して達成され得る。

【０１６８】 イオン性複合体の形成は、異なる分析的な道具によってモニタリングされ得る
。例えば、マイクロ熱量測定または表面プラズモン共鳴は、キメラ分子の化学量
論および結合特性についての情報を与え得る。

【０１６９】 上記の実施例３に類似の、実施例４および５に記載の結合方法はまた、伸長さ
れたペプチドで行われ得、ペプチドとＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇との間の適切な距離を可
能にする。

【０１７０】 （実施例６） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の、Ｈｉｓタグ化ペプチドＧＧＧＶＦＷＱへの結合） （原理） 遊離のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇からのＶＥＧＦキメラ分子の完全な分離が必要である
場合、ペプチドは、ＮまたはＣ末端で、４〜６のヒスチジン分子のストレッチを
用いて伸長され得る。次いで結合反応は、実施例２または５に従って行われる。
ＶＥＧＦＲ−Ｂキメラ分子の捕捉のために、金属アフィニティークロマトグラフ
ィーのアプローチが使用され得る（Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９
７５）２５８：５９８−５９９）。

【０１７１】 （方法） 実施例２に従った結合反応の完了後、反応混合物を、ニッケルキレートゲルを
充填したカラムを通過させる。多量体ヒスチジンを含むすべての分子は、このカ
ラムに結合する。カラムの洗浄後、結合したタンパク質／ペプチドを、イミダゾ
ールを含む緩衝液で溶出する。遊離のペプチドからの結合体の分離は、上記のゲ
ル濾過によって再び行われる。

【０１７２】 （実施例７） （ペプチドＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合） ＮおよびＣ末端のアミノおよびカルボニル基に加えて、このペプチドは、ＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合に使用され得る２つの機能的なスルフヒドリル基およびリ
ジンの１つのアミノ基を有する。環状構造において、ペプチドを使用する必要が
ある場合、アミノおよびカルボキシ基のみが利用可能である。なぜなら、ペプチ
ドにはより反応性の基が存在するので、理論的な副産物の量が増加する。

【０１７３】 （方法） １ｎＭの可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇を、１０倍モル濃度過剰のスルホ（ｓｕｌｆ
ｏ）−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート）で、ｐＨ６．８で、１時間室温で活性化す
る。このｐＨで、活性化は、好ましくはＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＮ末端アミノ基で生
じる。優性な副反応は、内部の遊離ＳＨ基での分子内架橋であり、従って、１０
ｎＭの減少されたペプチドを添加し、そして反応を４℃で１８時間進行させる。
反応産物を、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーま
たは逆相クロマトグラフィーによって精製する。Ｈｉｓタグ化ペプチドを使用す
ることによって、精製はまた、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを
使用して行われ得る。１つまたは両方の反応パートナーに対する利用可能な抗体
が存在する場合、精製はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって
容易になり得る。実施例１〜６に記載される同じ化学反応がまた、使用され得る
。

【０１７４】 （実施例８） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇に対する標的化ペプチドＧＧＧＶＦＮＱおよびＣＲＳＷＮ
ＫＡＤＮＲＳＣのカルボキシ末端（Ｃｔ）融合） （プラスミドｐＶＥＧＦ（ＢＨＧ４Ｓ）₃、−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧ
Ｆ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築およびＣＨＯ細胞に
おけるキメラ分子の発現） 標的化ペプチドＮＨ₂−ＧＧＧＶＦＷＱ−ＣＯＯＨおよびＮＨ₂−ＣＲＳＷＮＫ
ＡＤＮＳＣ−ＣＯＯＨを、ＮＨ₂−（ＧＧＧＧＳ）×３−ＣＯＯＨヒンジ領域を
介してＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子のＣ末端に、それぞれ融合する。この型のリンカー
は、通常、１本鎖抗体における重鎖および軽鎖を柔軟に連結するために使用され
る；あるいは、ヒト免疫グロブリン遺伝子に他の連結ペプチド（例えば、存在す
る天然のヒンジ領域）または、オリゴプロリンあるいはオリゴグリシンリンカー
が、使用され得る。さらに、リンカーペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ末端と
そのリンカーとの間に位置するプロテアーゼ切断部位（例えば、プラスミン切断
部位）を含み得、正常または虚血の心臓に対する高親和性標的化後の、ネイティ
ブなＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子の放出を可能にする。リンカーの柔軟性のせいで、Ｃ
末端融合ペプチドは、レセプター結合を妨害しない。

【０１７５】 一連のモジュラープラスミドを構築し、最終的にプラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ
）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲ
ＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣを得る（以下の材料および方法を参照のこと）。中間のプ
ラスミドｐｖｅｇｆ−ｓｓ（１）は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル配列、続いてＨｉｎ
ｃＩＩ制限部位を提供し、野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇配列または任意の他の所望の
Ｎ末端融合タンパク質のいずれかの便利な挿入を可能にする（実施例「Ｎ末端融
合」を参照のこと）。最終構築物、プラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）３
−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮ
ＲＳＣは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされる。選択マーカーでの同時トラン
スフェクション、ＣＨＯ細胞クローンの選択およびタンパク質の産生を、標準細
胞培養および生物工学手順を使用して行い得る（例えば、実施例１を参照のこと
）。キメラタンパク質の精製を、標準タンパク質化学手順（アニオンおよび／ま
たはカチオン交換樹脂を使用するクロマトグラフィー、ゲル濾過またはアフィニ
ティークロマトグラフィー）に従って行う。

【０１７６】 （材料および方法） （プラスミドの構築） （ｐＳＩ−ｖｅｇｆ−ＭＣＳ（１）） 第１の工程において、市販のベクターｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、標準条件
を使用して、クレノウポリメラーゼを用いて処理されたＢｇｌＩＩで切断しそし
て再連結する。生じる中間プラスミドを、ｐＳＩ−Ｂと称する。続いて、ｐＳＩ
−Ｂを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてアニールされたオリゴヌクレ
オチド、Ｐ−ｖｅｇｆＭＣＳ（１）５’−ＣＴＡＧＴＡＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＧ
ＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧ
ＧＣＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＧＴＡＧＧＣＣ−３’およびＰ
−ｖｅｇｆＭＣＳ（２）５’−ＧＧＣＣＴＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧ
ＡＣＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＴＡ−３’と連結する。生じるプラスミドをプライマ
ー、Ｐ−４３７１（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を使用
して配列決定し、そしてｐＳ１−ｖｅｇｆＭＣＳ（１）．ｐｖｇｅｇ−ｓｓ（１
）と称する。アミノ酸コドンＰｒｏ²²、Ｖａｌ²³およびＡｓｐ²⁷を含むＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇シグナル配列Ｍｅｔ¹−Ａｌａ²¹をコードするＤＮＡストレッチの挿入は
、Ｘｂａ１／ＳａｌＩ切断ベクター、ｐＳＩ−ｖｅｇｆ−ＭＣＳ（１）を、アニ
ールされたオリゴヌクレオチド、Ｐ−ｓｓ（１）５’−ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡ
ＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＣ
ＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＧＴ−３’
およびＰ−ｓｓ（２）５’−ＴＣＧＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣ
ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧ
ＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣ−３’と連結することによってなす。挿
入領域は、配列決定（プライマー、ｐ−４３７１）され、そして生じるプラスミ
ド１５は、ｐｖｅｇｆ−ｓｓ（１）と名付けられる。アミノ酸コドンＶａｌ²³お
よびＡｓｐ²⁷は、ＨｉｎｃＩＩ制限領域を形成する。これは、野生型ＶＥＧＦ−
Ｂ₁₆₇配列（コドンＳｅｒ²⁴Ｇｌｎ²⁵およびＰｒｏ²⁶）または任意の所望のＮ末
端融合ペプチドのいずれかの便利な挿入を可能にする。

【０１７７】 （ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６） ベクター、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６を構築するために、アミノ酸残基Ａｓｐ ²⁷ 〜Ａｒｇ¹⁸⁸に対応するＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇コード配列を、５００ｂｐＰＣＲ産物
として、プライマー、２−２７／₁₆₇（１）５’−ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣ
ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧ−３’およびＰ−２７／₁₆₇（
２）５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡ
ＧＧＴＧ−３’を使用して標準ＰＣＲ反応で増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ
／Ｂｇ１ｌｌで消化し、そして生じる４８６ｂｐのフラグメントを、ＳａｌＩ／
ＢｇＩｌｌ切断プラスミドｐｖｅｇｆ−ｓｓ（１）にクローン化する。

【０１７８】 （ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−ｄＨ） １つのＨｐａｌ部位を欠失するために、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６をＨｐａＩ
で消化し、そしてヘキサヌクレオチドＰ−ＡｇｅＩ（１）５’−ＡＣＣＧＧＴ−
３’（Ａｇｅｌ部位）で連結し、プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−ｄＨを
生じる。

【０１７９】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｆ） プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６．ｄＨを、ＨｉｎｃＩＩで消化し、そし
てアニールされたオリゴヌクレオチドＰ−２４／２６（Ｉ）５’−ＴＣＣＣＡＧ
ＣＣＴ−３’、およびＰ−２４／２６（２）５’−ＡＧＧＣＴＧＧＧＡ−３’と
連結する。オリゴヌクレオチドの正確な（センス）挿入を、プライマーＰ４３７
１を使用する配列決定によって確認し、そして生じるプラスミドをｐＶＥＧＦ（
Ｂ）−Ｆと名付ける。アンチセンス配向に挿入されたオリゴヌクレオチドを有す
るアンチセンス構築物はまた単離され、そしてｐＶＥＧＦ（Ｂ）アンチセンスと
称される。

【０１８０】 （ＰＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃） ベクター、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃の構築を完成するために、アニー
ルされたオリゴヌクレオチドＰ−Ｌｉ（１）５’−ＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧ
ＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣ
ＴＧ−３’、および（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）×３リンカー
配列をコードするＰ−Ｌｉ（２）５’ＣＴＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣ
ＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡ−３’を
、ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｆに挿入する。

【０１８１】 （ＰＶＥＧＦ（Ｂ）Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱ） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱの構築を、ＮｈｅＩ／Ｎｏ
ｔＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃の、アリールされたオリゴヌ
クレオチドＰ−Ｄ（１）５’−ＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧ
ＧＣＡＧＴＡＡＧＣ−３’、およびＰ−Ｄ（２）５’−ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧ−３’の連結によってなす。標的ペ
プチドＮＨ₂−ＧＧＧＶＰＷＱ−ＣＯＯＨをコードするＤＮＡ配列を含むプラス
ミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃、−ＧＧＧＶＦＮＱを、ＮＨ₂−（ＧＧＧＧ
Ｓ）×３−ＣＯＯＨヒンジ領域を介してＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡのＣ末端に融
合する。

【０１８２】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築を、Ｎｈ
ｅＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）の、アニールされた
オリゴヌクレオチド、Ｐ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（１）５’−ＣＴＡＧＣＴ
ＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴ
ＡＡＧＣ−３’およびＰ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（２）５’−ＧＧＣＣＧＣ
ＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴとの連結によって行った。

【０１８３】 （実施例９） （標的化ペプチドＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆へのアミノ
末端（Ｎｔ）融合） （プラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築お
よびＣＨＯ細胞におけるキメラ分子の発現） シグナルペプチドとＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆分子のＮ末端との間に、ＮＨ₂−（ＧＧＧ
ＧＳ）×３−ＣＯＯＨヒンジ領域を介して挿入されたプラスミド、ｐＶＥＧＦ（
Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣは、心臓組織標的化ペプチドＮＨ₂−Ｃ
ＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ−ＣＯＯＨをコードするＤＮＡを含む。機能的エレメン
トを含む他のリンカーペプチドは、使用され得る（上記の実施例８を参照のこと
）。Ｎ末端融合は、標的化分使用の欠失なしでＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆分子で生じる天
然のタンパク質分解プロセシングを可能にする。Ｎ末端は、二量体ＶＥＧＦ分子
の膜結合表面に対して遠位に位置するようであるので、融合された標的化ペプチ
ドは、立体的な妨害なしに、そのレセプターと相互作用し得る。実施例８に記載
される一連の調節プラスミドの一部はさらに、プラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−
Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣを構築するために使用される（材料および方法
を参照のこと）。最終構築物は、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされる。選択マ
ーカーでの同時トランスフェクション、ＣＨＯ細胞クローンの選択およびタンパ
ク質の産生は、標準細胞培養および生物工学手順を使用して行われる（実施例１
を参照のこと）。キメラタンパク質の精製は、標準タンパク質化学手順に従って
行われる。

【０１８４】 （材料および方法） （プラスミドの構築） （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６の構築は、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６
（実施例８を参照のこと）の、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩでの消化によってなさ
れる。４９２ｂｐのフラグメントを、ゲル精製によって除去する。この工程は、
プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−Ｈ（実施例８を参照のこと）由来のＶＥ
ＧＦ（Ｂ）１６７のアミノ酸Ａｓｐ２７〜Ａｒｇ１８８をコードするＤＮＡ配列
を欠失する。続いて、ＶＥＧＦ（Ｂ）１８６のアミノ酸Ａｓｐ²⁷−Ａｌａ²⁰⁷を
コードする５３３ｂｐのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ切断ＰＣＲ産物を挿入する。ＰＣ
Ｒを、プライマーｐ−２７／１６７（１）ならびにＰ−２７／１８６（１）（５
’−ＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＧＧＡ
ＧＧ−３’）およびテンプレートとしてのＶＥＧＦ（Ｂ）１８６ｃＤＮＡを使用
して、標準ＰＣＲ反応のように行う。ＶＥＧＦ（Ｂ）１６７の最終プラスミド、
ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６アミノ酸Ａｓｐ²⁷〜Ａｒｇ¹⁸⁸において
は、ＶＥＧＦ（Ｂ）１８６のアミノ酸Ａｓｐ²⁷〜Ａｌａ²⁰⁷によって置換され、
アミノ酸Ｍｅｔ¹〜Ｖａｌ²³は、両方のＶＥＧＦ（Ｂ）形成に共通であるが、ア
ミノ酸Ｓｅｒ²⁴、Ｇｌｎ²⁵およびＰｒｏ²⁶は、まだ欠いている。

【０１８５】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−Ｒ１３） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築を、Ｈｉｎ
ｄＩＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６の、アニールされた
オリゴヌクレオチドＰ−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（１）５’−ＴＧＣＣ
ＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣ
ＡＧＣＣＴ−３’およびＰ−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（２）５’−ＡＧ
ＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣ
ＴＧＣＧＧＣＡ−３’との連結によって行う。反対の方向に挿入されたオリゴヌ
クレオチドを含むプラスミドはまた単離され、そしてｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−
Ｎｔ−アンチセンスを名付ける。

【０１８６】 本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみであり、そ
してそれに関する種々の変更および変化が当業者に示唆され、そして本出願およ
び添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれることが理解される。本明
細書中に列挙されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のた
めにその全体が参考として本明細書中に援用される。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月７日（２００２．３．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００９０】 （（Ｂ）好ましい標的化分子） 本発明の好ましい標的化分子は、上に記載されそして以下で参照される、イン
ビボでのパニング手順を使用して、ＧＧＧＶＦＷＱ、ＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶ
ＴＳＳ、ＣＬＨＲＧＮＳＣ、およびＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（それぞれ、配列 番号１〜５） からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。ＧＧＧＶＦＷＱ
、ＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶＴＳＳ、およびＣＬＨＲＧＮＳＣ（それぞれ、配列 番号１〜４） のペプチドは、正常な心臓内皮に選択的に結合する。より具体的に
は、ＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）ペプチドは、正常な心臓脈管に対して５倍の
濃縮を示し、一方でＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶＴＳＳ、ＣＬＨＲＧＮＳＣ（配列 番号２〜４） のペプチドは、正常な心臓血管に対して２倍の濃縮を示した。ＣＲ
ＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（配列番号５）ペプチドは、虚血性心筋層に対して５倍の
濃縮を示した。これらのペプチドが同定された方法、およびこれらの特性の詳細
は、本願と同日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ［Ｃａｍｐｂｅｌｌ＆Ｆｌｏ
ｒｅｓ ＬＬＰ代理人文書番号Ｐ−ＬＪ３５１２］に記載され、この出願は、特
に本明細書中に参考として援用される。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１５８】 （発現プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７の構築） プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７は、ファージλ ｇｔ１１−ＶＥＧＦ−
Ｂｓｔ１６７由来の５８０ｂｐのＰＣＲ産物の、発現プラスミドｐＳＩ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）への挿入によって構築される。このファージは、λ ｇ１
１（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）におけるヒト線維肉腫ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングより得られる。ＰＣＲ反応は、Ａｄｖａｎｔａ
ｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）を使用して、１ｎｇのプラスミドテンプレート、０．５
μＭのプライマー、Ｐ−ｗｔ１６７（１）５’−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＡ
ＧＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧ−３’（配列番号６） およびＰ−ｗｔ１６７（２）５’−ＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣ
ＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号７）、ならびに０
．２ｍＭ ｄＮＴＰを含む１００μｌの最終容量で、９３℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃３０秒間の３０サイクルの条件、次いで７２℃で１０分間の伸長
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｇｅｎｅ ＡＴＡＱ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍにおける）を使用して行われる。ＰＣＲ産物をゲル精製し
、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ切断プラスミド
ｐＳＩに連結する。得れれるプラスミドを、ｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７と名付け
る。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１５９】 （実施例２） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）の結合） （原理） Ｎ末端をブロックされたペプチドは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）
の存在下で、水容性カルボジイミドＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドによってＣ末端で活性化される。次いで、活性化
されたペプチドは、ＶＥＧＦ分子の第１級アミノ基と反応する。ｐＨを注意深く
調整することによって、この反応が、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子のＮ末端へ指向する
ことが可能となる（例えば、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．（１９８６）１５６：２２０−２２２およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，「Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｏ
Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥ
ＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，（ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）第２２１頁〜２２９頁；これらの参考文献お
よびそこに列挙される参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１６２】 （実施例３） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのＣ末端伸長ペプチドＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）の
結合） （原理） 標的化ペプチドレセプターに対するＶＥＧＦレセプターｒｅｓｐ．への、ＶＥ
ＧＦ−Ｂキメラ分子の結合の間の立体障害を避けるために、ペプチドは、Ｃ末端
でいくつかの付加的なアミノ酸により伸長され得る。Ｃ末端スペーサーは、最大
限に柔軟であるべきであるが、それらの特定のレセプターへのＶＥＧＦおよび／
またはペプチドの結合メカニズムを妨害しない。通常、ポリＧｌｙまたはポリＡ
ｌａ配列は、これらの要求を満たす。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１６４】 （実施例４） （スペーサードメインを有するヘテロ二官能性試薬を使用することによるＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）の結合） （原理） ペプチドの結合はまた、ペプチドのＮ末端を、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば
、ＳＭＢＰ）のアミノ反応性部分と反応させることによって達成され得、次いで
活性化されたペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の到達できるスルフヒドリル基と反
応し、チオエーテル結合を形成する（例えば、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７２，６０９およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ
．、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ
ｉｎｇ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｏ
Ｆ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩ
ＮＧ、（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）、第２２１頁〜２２９頁を参
照のこと）。ＳＭＢＰを使用する場合、スペーサーの長さは、１．５ｎｍのオー
ダーである。以下のことに留意すべきである：結合反応に関与するスルフヒドリ
ル基は、レセプタータンパク質への結合に必須ではない。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１６６】 （実施例５） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＧＧＧＶＧＷＱ（配列番号１）の非共有結合
） （原理） イオン相互作用は、タンパク質構造を形成する際の１つの優性な力である。高
分子に反対の電荷の領域を導入することによって、２つの反応パートナーの間の
密接な複合体を形成することが可能になり、それらはまた生理学的な条件で安定
である。これらの荷電アミノ酸の導入は、両方の分子の機能と適合しなければな
らない。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１６７】 （方法） ペプチドＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）は、ＮまたはＣ末端で、４〜５の荷電
アミノ酸（正の荷電の導入のためのリジン、アルギニン、負の電荷の導入のため
のグルタミン酸またはアスパラギン酸）のストレッチによって改変されなければ
ならない。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇はまた、好ましくは、４〜６の荷電アミノ酸の配列
でＮ末端で伸長されなければならない。一旦、反応パートナーが、合成され、そ
して適切な程度の質まで精製されると、複合体は、等量の反対に荷電された反応
パートナーと混合するだけで容易に形成され得る。結合体からの未反応の分子の
分離は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して達成され得る。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１７０】 （実施例６） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の、Ｈｉｓタグ化ペプチドＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）
への結合） （原理） 遊離のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇からのＶＥＧＦキメラ分子の完全な分離が必要である
場合、ペプチドは、ＮまたはＣ末端で、４〜６のヒスチジン分子のストレッチを
用いて伸長され得る。次いで結合反応は、実施例２または５に従って行われる。
ＶＥＧＦＲ−Ｂキメラ分子の捕捉のために、金属アフィニティークロマトグラフ
ィーのアプローチが使用され得る（Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９
７５）２５８：５９８−５９９）。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１７２】 （実施例７） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（配列番号５）の
結合） ＮおよびＣ末端のアミノおよびカルボニル基に加えて、このペプチドは、ＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合に使用され得るリジンの２つの機能的なスルフヒドリル基
およびリジンの１つのアミノ基を有する。環状構造において、ペプチドを使用す
る必要がある場合、アミノおよびカルボキシ基のみが利用可能である。なぜなら
、ペプチドにはより反応性の基が存在するので、理論的な副産物の量が増加し得
る。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１７４】 （実施例８） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への標的化ペプチドＧＧＧＶＦＷＱ（配列番号１）および
ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（配列番号５）のカルボキシ末端（Ｃｔ）融合） （プラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃、−ＧＧＧＶＦＷＱおよびｐＶＥ
ＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築ならびにＣＨＯ細胞
におけるキメラ分子の発現） プラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＷＱおよびｐＶＥＧＦ
（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣは、ＮＨ₂−（Ｇ ₄ Ｓ） ₃（配列
番号８）−ＣＯＯＨヒンジ領域を介してＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子のＣ末端に、それ
ぞれ融合される標的化ペプチドＮＨ₂−ＧＧＧＶＦＷＱ−ＣＯＯＨ（配列番号１
）およびＮＨ₂−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ−ＣＯＯＨ（配列番号５）をコード
するＤＮＡ配列を含む。この型のリンカーは、通常、１本鎖抗体における重鎖お
よび軽鎖を柔軟に連結するために使用される；あるいは、ヒト免疫グロブリン遺
伝子に他の連結ペプチド（例えば、天然のヒンジ領域が表す）または、オリゴプ
ロリンリンカーもしくはオリゴグリシンリンカーが、使用され得る。さらに、リ
ンカーペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ末端とそのリンカーとの間に位置する
プロテアーゼ切断部位（例えば、プラスミン切断部位）を含み得、正常または虚
血の心臓に対する高親和性標的化後の、ネイティブなＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子の放
出を可能にする。リンカーの柔軟性に起因して、Ｃ末端融合ペプチドは、レセプ
ター結合を妨害しない。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１７５】 一連のモジュラープラスミドを構築し、最終的にプラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ
）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＷＱおよびｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＣＲＳ
ＷＮＫＡＤＮＲＳＣを得る（以下の材料および方法を参照のこと）。中間のプラ
スミドｐｖｅｇｆ−ｓｓ（１）は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル配列、続いてＨｉｎｃ
ＩＩ制限部位を提供し、野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇配列または任意の他の所望のＮ
末端融合タンパク質のいずれかの都合のよい挿入を可能にする（実施例「Ｎ末端
融合」を参照のこと）。最終構築物、プラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ） ₃ −ＧＧＧＶＦＷＱおよびｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳ
Ｃは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされる。選択マーカーとの同時トランスフ
ェクション、ＣＨＯ細胞クローンの選択およびタンパク質の産生を、標準細胞培
養および生物工学手順を使用して行い得る（例えば、実施例１を参照のこと）。
キメラタンパク質の精製を、標準タンパク質化学手順（アニオンおよび／または
カチオン交換樹脂を使用するクロマトグラフィー、ゲル濾過またはアフィニティ
ークロマトグラフィー）に従って行う。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１７６】 （材料および方法） （プラスミドの構築） （ｐＳＩ−ｖｅｇｆ−ＭＣＳ（１）） 第１の工程において、市販のベクターｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、標準条件
を使用して、クレノウポリメラーゼを用いて処理されたＢｇｌＩＩで切断しそし
て再連結する。生じる中間プラスミドを、ｐＳＩ−Ｂと称する。続いて、ｐＳＩ
−Ｂを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてアニールされたオリゴヌクレ
オチド、Ｐ−ｖｅｇｆＭＣＳ（１）５’−ＣＴＡＧＴＡＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＧ
ＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧ
ＣＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＧＣＣ−３’（配列番号９）および
Ｐ−ｖｅｇｆＭＣＳ（２）５’−ＧＧＣＣＴＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣ
ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＴＣ
ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＴＡ−３’（配列番号１０）と連結する。生じるプ
ラスミドをプライマー、Ｐ−４３７１（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ
ＡＧ−３’（配列番号１１））を使用して配列決定し、そしてｐＳ１−ｖｅｇｆ
ＭＣＳ（１）．ｐｖｇｅｇ−ｓｓ（１）と称する。アミノ酸コドンＰｒｏ²²、Ｖ
ａｌ²³およびＡｓｐ²⁷を含むＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇シグナル配列Ｍｅｔ¹−Ａｌａ²¹を
コードするＤＮＡストレッチの挿入を、Ｘｂａ１／ＳａｌＩ切断ベクター、ｐＳ
Ｉ−ｖｅｇｆ−ＭＣＳ（１）を、アニールされたオリゴヌクレオチド、Ｐ−ｓｓ
（１）５’−ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣ
ＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧ−３’（配列番号１２）およびＰ−ｓｓ（２）５’−Ｔ
ＣＧＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧ
ＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧＧ
ＴＧＧＣ−３’（配列番号１３）と連結することによって行う。挿入領域を、配
列決定（プライマー、ｐ−４３７１）し、そして生じるプラスミド１５を、ｐｖ
ｅｇｆ−ｓｓ（１）と名付ける。アミノ酸コドンＶａｌ²³およびＡｓｐ²⁷は、Ｈ
ｉｎｃＩＩ制限領域を形成する。これは、野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇配列（コドン
Ｓｅｒ²⁴Ｇｌｎ²⁵およびＰｒｏ²⁶）または任意の所望のＮ末端融合ペプチドのい
ずれかの都合のよい挿入を可能にする。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１７７】 （ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６） ベクター、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６を構築するために、アミノ酸残基Ａｓｐ ²⁷ 〜Ａｒｇ¹⁸⁸に対応するＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇コード配列を、５００ｂｐＰＣＲ産物
として、プライマー、２−２７／₁₆₇（１）５’−ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣ
ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）および
Ｐ−２７／₁₆₇（２）５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧ
ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１５）を使用して標準ＰＣＲ反応で
増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／Ｂｇ１ｌｌで消化し、そして生じる４８６
ｂｐのフラグメントを、ＳａｌＩ／ＢｇＩｌｌ切断プラスミドｐｖｅｇｆ−ｓｓ
（１）にクローン化する。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１８０】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃） ベクター、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃の構築を完成するために、アニール
されたオリゴヌクレオチドＰ−Ｌｉ（１）５’−ＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣ
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ
Ｇ−３’（配列番号１６）、および（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
）×３リンカー配列をコードするＰ−Ｌｉ（２）５’ＣＴＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧ
ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧ
ＣＣＡ−３’（配列番号１７）を、ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ切断ベクターｐＶＥＧ
Ｆ（Ｂ）−Ｆに挿入する。

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１８１】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＷＱ） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＷＱの構築を、ＮｈｅＩ／Ｎｏｔ
Ｉ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ₄Ｓ）₃の、アリールされたオリゴヌクレ
オチドＰ−Ｄ（１）５’−ＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＧＣ
ＡＧＴＡＡＧＣ−３’（配列番号１８）、およびＰ−Ｄ（２）５’−ＧＧＣＣＧ
ＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１９ ） との連結によって行う。標的ペプチドＮＨ₂−ＧＧＧＶＦＷＱ−ＣＯＯＨ（配
列番号１）をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ₄
Ｓ）₃ＧＧＧＶＦＷＱを、ＮＨ₂−（Ｇ ₄ Ｓ）₃ （配列番号８）ヒンジ領域を介して
ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡのＣ末端に融合する。

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１８２】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築を、Ｎｈｅ
Ｉ／ＮｏｔＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ ₄ Ｓ）₃の、アニールされたオ
リゴヌクレオチド、Ｐ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（１）５’−ＣＴＡＧＣＴＧ
ＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡ
ＡＧＣ−３’（配列番号２０）およびＰ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（２）５’
−ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴ（配列番号２１ ） との連結によって行った。

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１８３】 （実施例９） （標的化ペプチドＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（配列番号５）の、ＶＥＧＦ−Ｂ ₁₈₆ へのアミノ末端（Ｎｔ）融合） （プラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築お
よびＣＨＯ細胞におけるキメラ分子の発現） シグナルペプチドとＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆分子のＮ末端との間に、ＮＨ₂−（Ｇ ₄ Ｓ
） ₃（配列番号８）−ＣＯＯＨヒンジ領域を介して挿入されたプラスミド、ｐＶ
ＥＧＦ（Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣは、心臓組織標的化ペプチドＮ
Ｈ₂−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ−ＣＯＯＨ（配列番号５）をコードするＤＮＡ
配列を含む。機能的エレメントを含む他のリンカーペプチドは、使用され得る（
上記の実施例８を参照のこと）。Ｎ末端融合は、標的化分子の欠失なしでＶＥＧ
Ｆ−Ｂ₁₈₆分子で生じる天然のタンパク質分解プロセシングを可能にする。Ｎ末
端は、二量体ＶＥＧＦ分子の膜結合表面に対して遠位に位置するようであるので
、融合された標的化ペプチドは、立体障害なしに、そのレセプターと相互作用し
得る。実施例８に記載される一連のモジュラープラスミドの一部はさらに、プラ
スミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣを構築するために
使用される（材料および方法を参照のこと）。最終構築物は、ＣＨＯ細胞にトラ
ンスフェクトされる。選択マーカーでの同時トランスフェクション、ＣＨＯ細胞
クローンの選択およびタンパク質の産生は、標準細胞培養および生物工学手順を
使用して行われる（実施例１を参照のこと）。キメラタンパク質の精製は、標準
タンパク質化学手順に従って行われる。

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１８４】 （材料および方法） （プラスミドの構築） （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６の構築を、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６
−ｄＨ（実施例８を参照のこと）の、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩでの消化によっ
て行う。４９２ｂｐのフラグメントを、ゲル精製によって除去する。この工程は
、プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−ｄＨ由来のＶＥＧＦ（Ｂ）１６７のア
ミノ酸Ａｓｐ２７〜Ａｒｇ１８８をコードするＤＮＡ配列を欠失する（実施例８
を参照のこと）。続いて、ＶＥＧＦ（Ｂ）１８６のアミノ酸Ａｓｐ²⁷−Ａｌａ^{20 7} をコードする５３３ｂｐのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ切断ＰＣＲ産物を挿入する。
ＰＣＲを、プライマーＰ−２７／１６７（１）ならびにＰ−２７／１８６（１）
（５’−ＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＧ
ＧＡＧＧ−３’（配列番号２２））およびテンプレートとしてのＶＥＧＦ（Ｂ）
１８６ｃＤＮＡを使用して、標準ＰＣＲ反応のように行う。ＶＥＧＦ（Ｂ）１６
７の最終プラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６アミノ酸において
は、Ａｓｐ²⁷〜Ａｒｇ¹⁸⁸は、ＶＥＧＦ（Ｂ）１８６のアミノ酸Ａｓｐ²⁷〜Ａｌ
ａ²⁰⁷によって置換され、アミノ酸Ｍｅｔ¹〜Ｖａｌ²³は、両方のＶＥＧＦ（Ｂ）
形成に共通であり、一方アミノ酸Ｓｅｒ²⁴、Ｇｌｎ²⁵およびＰｒｏ²⁶は、まだ失
われている。

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１８５】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−Ｒ１３） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築を、Ｈｉｎ
ｄＩＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６の、アニールされた
オリゴヌクレオチドＰ−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（１）５’−ＴＧＣＣ
ＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣ
ＡＧＣＣＴ−３’（配列番号２３）およびＰ−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ
（２）５’−ＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴＴＴ
ＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号２４）との連結によって行う
。反対の方向に挿入されたオリゴヌクレオチドを含むプラスミドはまた単離され
、そしてｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−アンチセンスと称する。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月７日（２００２．３．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の名称】 標的化新脈管形成

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、末梢血管または心臓血管の疾患の処置のためにインビボにおいて新
脈管形成を促進または阻害するための組成物、方法および遺伝子治療試薬に関す
る。詳細には、本発明は、新脈管形成を誘導するために血管内皮に特異的に結合
する標的化分子に連結されている新脈管形成因子の使用に関する。

【０００２】 （発明の背景） 新脈管形成は、既存の血管からの毛細血管内皮細胞の増殖、移動および組織浸
潤を含む、新しい血管を発生するプロセスである。新脈管形成は、正常な生理学
的プロセス（胚発生、濾胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）増殖および創傷治癒を含む
）ならびに病理学的状態（腫瘍増殖および異常な新生血管形成に関連する非腫瘍
性疾患（血管新生緑内障を含む）を含む）に重要である（例えば、Ｆｏｌｋｍａ
ｎ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３５：４４２−４４７を参照のこと
）。

【０００３】 組織虚血を生じるかまたは組織虚血に関与する疾患および状態は、主要な健康
上の問題である。虚血は、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢血管疾患
（ＰＶＤ）において見られる。米国において約６０００万人の成人が心臓血管疾
患を有し、うち１１００万人の成人が冠状動脈性心臓病を有することが、米国心
臓学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって報
告されている。アンギナ（心臓虚血の症状）は、米国において１５０万人の成人
（毎年約３５０，０００例の新患を含む）が罹患している。ＰＶＤは、成人人口
の３０％が罹患していると推定されている。ＰＶＤ、アテローム性硬化症性血管
疾患、冠状動脈性心臓疾患（ＣＨＤ）および脳血管性疾患の主な原因は、糖尿病
である。

【０００４】 虚血は、組織が血液供給を十分に受けない場合に生じる。例えば、心筋虚血は
、心筋が十分な血液供給を受けない場合に生じる。これは、血管の閉塞または狭
小化（例えば、冠状動脈アテローム性硬化症に見られるような）に起因し得る。
処置としては、外科的アプローチおよび薬学的アプローチが挙げられる。外科的
介入は、狭小化した管腔を広げるため（例えば、バルーン血管形成）または心臓
血管数を増加するため（例えば、移植片を使用するバイパス手術）に使用される
。より外傷性が低い薬学的処置は、酸素および栄養分の心筋の要求量を減少する
ように、または血液供給を増加するように作用する。酸素要求量は、血流力学的
負荷に対する心臓の収縮応答を減少することによって低下され得る（例えば、β
−アドレナリン作用性ブロッカーを使用して）。心臓の血液供給は、平滑筋の壁
を有する冠状動脈血管管腔の直径を増加することによって増大され得る（例えば
、ニトログリセリンまたはカルシウムチャネルブロッカーを用いて）。しかし、
これらの薬学的処置は、不正確であり、一過的に活性であり、そして薬物相互作
用および副作用への高い傾向がある。

【０００５】 虚血組織への血液供給を増加するための別の手段は、新脈管形成を介してその
組織への血管の増殖を誘導することであるか、またはその組織を浴する血液の量
を増加させること（血液灌流の増加とも言われる）である。これは、新脈管形成
因子の投与によって達成され得る。いくつかの因子は、インビボでの新脈管形成
の潜在的なレギュレーターとして関係付けられている。これらには、トランスフ
ォーミング増殖因子（ＴＧＦβ）、酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽
細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
ならびに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．ら
、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）５３：２１７−２３９
を参照のこと）が含まれる。内皮細胞特異的マイトジェンである、ＶＥＧＦは、
内皮細胞の増殖を特異的に促進することによって、新脈管形成のインデューサー
として作用するという点で、これらの因子の間で区別される。

【０００６】 ＶＥＧＦは、新脈管形成の重要なメディエーターである。なぜなら、ＶＥＧＦ
は、直接的かつ特異的に内皮細胞に対して作用するからである。例えば、Ｇｒａ
ｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．（１９９８）３６：３７９−３８
３を参照のこと。インビボにおいて、ＶＥＧＦは、発生、創傷修復（新脈管形成
は、組織損傷によって誘発される修復機構の重要な要素である）、癌ならびに他
の疾患および状態における血管の増殖に関連する。

【０００７】 新脈管形成効果を達成するために、ポリペプチド新脈管形成因子（例えば、Ｖ
ＥＧＦ）の繰返しのおよび／または長期間の投与が必要とされる。しかし、この
アプローチは、注射による繰返しの送達を通常必要とするので、代表的には、非
常に費用がかかりかつ不便である。

【０００８】 あるいは、ポリペプチド新脈管形成因子は、そのポリペプチド自体ではなく、
そのポリペプチドをコードする核酸を投与することによって、インビボで投与さ
れ得る。新脈管形成遺伝子は、静脈内でインビボ投与されている。例えば、Ｌａ
ｉｔｅｉｎｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９８）９：１４８１−
１４８６；Ｉｓｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ（１
９９７）３０：１８５−１９７；Ｇｉｏｒｄａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．
（１９９６）２：５３４−５３９；Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．（１９９６）７５：４８７−５０１；Ｍｃ Ｄｏｎａｌｄら、米国特許第５
，８３７，２８３号（「２８３」特許）を参照のこと。

【０００９】 ポリペプチドコード遺伝子は、筋肉内注射されている（裸のプラスミドＤＮＡ
またはウイルス発現ベクターとして）。例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．
ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９８）９７：１１１４−１１２３：Ｔｓｕｒ
ｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９７）９６（補遺９）：ＩＩ−
３８２−８；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（１９９６）
７５：４８７−５０１；Ｈａｍｍｏｎｄ、米国特許第５，７９２，４５３号；お
よびＭｃＤｏｎａｌｄ、「２８３」特許（前出）を参照のこと。Ｍａｊｅｓｋｙ
，Ｍ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９６）９４：３０６２−４もまた参照のこ
と。

【００１０】 新脈管形成に関与するリガンドおよびレセプターをコードする遺伝子の同定に
おける近年の進歩にかかわらず、現在の方法が、末梢性または心筋の虚血を克服
するために必要とされる新脈管形成のレベルを促進するという指摘は全く存在し
ない。例えば、既存の治療においては、新脈管形成効果を達成するために新脈管
形成タンパク質の繰返しまたは長期間の送達の必要性が存在する。これは、臨床
設定において新脈管形成を刺激するためのこれらのタンパク質の使用の有用性を
制限し得る。言い換えると、ヒトにおける首尾よい治療は、１以上のこれらの新
脈管形成ペプチドまたは新脈管形成タンパク質の持続性かつ長期間の注入を必要
とする。この注入は、それ自体で非常に高費用であり、そして冠状動脈に配置さ
れたカテーテルによって送達される必要性があり、これが、さらに処置の費用お
よび困難性を増大する。

【００１１】 虚血組織に関連する疾患および状態に罹患している高齢集団の個体数の増加を
考慮すると、投与するためにより安全で、より予測的でかつより容易である、虚
血のための新たな処置が必要とされる。本発明は、これらの必要性および関連す
る利点を提供する。

【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、血管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結されている新脈管形
成因子を含む、キメラ分子を提供する。いくつかのこのようなキメラ分子は融合
タンパク質であり、ここで、この融合タンパク質は、血管内皮に特異的に結合す
る標的化分子に連結されている新脈管形成因子を含む。

【００１３】 本発明はまた、新脈管形成を誘導する方法を提供する。この方法は、細胞にキ
メラ分子を接触させる工程を包含し、このキメラ分子は、血管内皮に特異的に結
合する標的化分子に結合されている新脈管形成因子を含む。

【００１４】 本発明はさらに、心筋新生血管形成を増加するための方法を提供する。この方
法は、心臓血管の内皮細胞にキメラ分子を接触させる工程を包含し、このキメラ
分子はさらに、血管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結されている新脈管
形成因子を含む。

【００１５】 本発明はさらに、末梢血管系における虚血組織において新生血管形成を増加す
るための方法を提供する。

【００１６】 本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチ
ドを提供する。この融合タンパク質はさらに、新脈管形成因子および標的化分子
を含み、この標的化分子は、血管内皮に結合する。

【００１７】 本発明はさらに、組織において新脈管形成を誘導する方法を提供する。この方
法は、内皮細胞を核酸分子でトランスフェクトする工程を包含し、これによって
、この細胞は、この核酸によってコードされる融合タンパク質を発現し、ここで
、融合タンパク質は、新脈管形成因子および標的化分子を含む。

【００１８】 本発明はさらに、薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物はキメラ分
子および薬学的受容可能なキャリアを含み、このキメラ分子は、血管内皮に特異
的に結合する標的化分子に連結されている新脈管形成因子を含む。他の薬学的組
成物は、融合タンパク質を含む。これらの融合タンパク質は、新脈管形成因子お
よび標的化分子を含み、この標的化分子は、血管内皮に特異的に結合する。

【００１９】 （詳細な説明） （定義） 用語「新脈管形成」とは、新しい血管が既存の血管系（例えば、毛細血管）か
ら発生するプロセスをいう。例えば、Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
．（１９９２）１：２７−２１を参照のこと。新脈管形成は、複雑なプロセスで
あり（Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１０
９３１−４およびＦａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．（１
９９５）１６：５７−６６；これらの参考文献および本明細書中に引用される参
考文献は、本明細書中に参考として援用される）、これは、以下を含み得る：内
皮細胞および周皮細胞の活性化；基底膜の分解；内皮細胞および周皮細胞の移動
および増殖（すなわち、細胞分裂）；新しい毛細血管管腔の形成；その新しい管
の周辺での周皮細胞の出現；新しい基底膜の発生；毛細血管ループの形成；新し
い管の退縮、分化の維持；ならびに毛細血管網の形成および最終的なより大きい
微小血管への組織化。例えば、Ｓａｆｉ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄ
ｉｏｌ．（１９９７）２９：２３１１−２３２５を参照のこと。組成物は、イン
ビトロまたはインビボにおいて新脈管形成活性についてスクリーニングされ得る
。例示的なインビトロ毛細血管形成評価は、例えば、Ｄｅｒａｍａｕｄｔら、Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６８：１２１−１２７に記載のよう
に、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリクス（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に埋め込まれた内皮細胞を使用する。インビボ動
物モデルを、以下に議論する。用語「血管内皮」とは、例えば、漿液管腔、リン
パ管および血管を裏打ちする平坦な内皮細胞の薄層を意味する。血管内皮は、血
管の緊張、ホメオスタシス、免疫応答および炎症応答の調節において重要な役割
を果たす（例えば、Ｖａｎｅ Ｊ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ（１９９
０）３２３：２７−３１を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引
用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。これらの生物学的
反応は、循環細胞と血管内皮との間の密接な相互作用に関連し得る。白血球の血
管内皮への接着は、全ての形態の損傷に対する反応において最も重要な事象の１
つであり得る（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，（
１９９４）３０７：３７８−３８９；Ａｌｂｅｌｄａ，Ｓ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ
．（１９９４）８：５０４−５１２；Ｗｅｓｔｌｉｎ，Ｗ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａ
ｔｈｏｌ，（１９９３）１４２：１５９８−１６０９を参照のこと；これらの参
考文献および本明細書中に引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用
される）。内皮細胞の活性化白血球との相互作用は、欠損性の内皮依存性血管拡
張、血管浸透性および凝固カスケードの活性化の増加に関連し得る。反応性酸素
種、スーパーオキシドおよび炎症性サイトカインを含む、多くの白血球産物は、
内皮機能を損ない、そして炎症と凝固との間の正のフィードバックループについ
て可能性を生じ得る。これらの分子は、以下を含むがそれらに限定されない、多
くの病理学的プロセスにおいて役割を果たし得る：アテローム性動脈硬化症、移
植片拒絶、敗血性ショック、後期過敏性反応および再灌流障害（例えば、Ｃａｒ
ｏｌｓ，Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４：２０６８−２１０１；Ｒｏｂｅ
ｒｔ，Ｓ．ら、前出を参照のこと）。

【００２０】 新脈管形成は、通常、創傷治癒、胎児および胚の発生、ならびに黄体、子宮内
膜および胎盤の形成において観察される。持続性の調節されない新脈管形成は、
癌における腫瘍転移および内皮細胞による異常増殖を含むがこれらに限定されな
い、多くの疾患状態を生じ、そしてこれらの状態に見られる病理学的損傷を支持
する。調節されない新脈管形成が存在し得る多様な病理学的疾患状態は、まとめ
て、「新脈管形成依存性」または「新脈管形成関連疾患」とグループ化されてい
る。新脈管形成によって媒介される疾患およびプロセスとしては、以下が挙げら
れるが、これらに限定されない：血管腫、固形腫瘍、血管媒介腫瘍（ｂｌｏｏｄ
ｂｏｒｎｅ ｔｕｍｏｒ）、白血病、転移、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫（ｐ
ｈｙｇｅｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｍａ）、心筋血管形成、クローン病、プラーク
新生血管形成、冠状側副枝形成（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）
、脳側副枝形成（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、動静脈奇形、
虚血性肢血管形成、角膜疾患、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、関節炎、糖尿
病性新生血管形成、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ関連疾患、および脈管形成。

【００２１】 用語「新脈管形成活性」、「新脈管形成因子活性」、「血管内皮増殖因子活性
」および「新生血管形成」は、例えば、以下を含む、組織への血流量を増大する
広範な生理学的活性を含む：血管透過性の増大、血管密度の増加、内皮細胞（Ｅ
Ｃ）活性化、ＥＣ移動、ＥＣ増殖、毛細血管形成（新脈管形成）、脈管形成（血
管構造へのＥＣの新生組織化）；例えば、Ｆｏｌｋｍａｎら（１９９２）前出を
参照のこと）。新脈管形成活性としては、新脈管形成を誘導する新脈管形成因子
、または新脈管形成を阻害する新脈管形成因子、あるいは内皮増殖因子の発現を
誘導する新脈管形成因子（例えば、遺伝子アクチベーターまたは転写レギュレー
ター）が挙げられる。新脈管形成因子としては、血管増殖を誘導または阻害する
ように作用する、任意のタンパク質、ペプチド、化学分子または他の分子が挙げ
られるが、これらに限定されない。新脈管形成因子は、天然に存在し得るか、ま
たは天然に存在していなくともよい。種々の方法が、生物学的活性アッセイ（例
えば、ウシ毛細血管内皮細胞増殖アッセイ）を使用して所定の因子の新脈管形成
活性を測定するために使用され得る。他のバイオアッセイとしては、ニワトリＣ
ＡＭアッセイ、マウス角膜アッセイ、ならびに移植した腫瘍に対する単離された
タンパク質または合成タンパク質の投与効果が挙げられる。ニワトリＣＡＭアッ
セイは、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ，（１９９４）７９：３１５−３２８に
よって記載される。多くの系が、新脈管形成を評価するために利用可能である。
例えば、新脈管形成は固形腫瘍増殖に必要とされるので、動物モデルにおける腫
瘍増殖の阻害は、新脈管形成の阻害の指標として使用され得る。新脈管形成はま
た、創傷治癒（皮膚または器官の創傷修復における）；および慢性炎症（例えば
、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症および特発性肺線維症（ＩＰＲ）
のような疾患における）のモデルという点から評価され得る。新脈管形成因子活
性はまた、例えば、マーカー分子（例えば、ＣＤ３Ｈ、第ＶＩＩＩ因子またはＰ
ＥＣＡＭ−１）について染色した後、組織切片中の血管を計数することによって
評価され得る。新脈管形成因子活性を評価するために使用され得る他の系として
は、内皮細胞走化性アッセイが挙げられる。新脈管形成因子または新脈管形成薬
剤は、例えば、内皮細胞走化性をコントロール値を超えるよう促進する能力によ
るアッセイにおいて同定され得る。内皮細胞走化性の阻害は、抗新脈管形成活性
の証拠を提供し得る。抗新脈管形成因子または抗新脈管形成薬剤は、内皮細胞走
化性を、新脈管形成薬剤によって刺激されるレベルよりも下に一貫して減少する
ことによって同定され得る。

【００２２】 用語「血管内皮細胞増殖因子」または「ＶＥＧＦ」は、単独または他の増殖因
子（例えば、線維芽細胞増殖因子（以下で議論される））と共に、血管発生、新
脈管形成および他の新脈管形成活性を惹起し得る、増殖因子のファミリーを含む
（例えば、Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２３７巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９９９）を参照のこと；これらの参考文献および本明細
書中に引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。Ｖ
ＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａと呼ばれる；例えば、Ｌｅｕｎｇ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１３０６−１３０９を参照のこと）を
含む。このＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、７つのイントロンで分けられた、８つのエキ
ソンで組織される。単一のＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の選択的エキソンスプライシング
は、４つの分子種の生成を生じ、これらは、１２１アミノ酸、１６５アミノ酸、
１８９アミノ酸および２０６アミノ酸のヒトタンパク質（ＶＥＧＦ−Ａ₁₂₁、Ｖ
ＥＧＦ−Ａ₁₆₅、ＶＥＧＦ−Ａ₁₈₉、ＶＥＧＦ−Ａ₂₀₆：マウスＶＥＧＦ−Ａアイ
ソフォームは、ヒトアイソフォームより１アミノ酸少ない）をコードする；例え
ば、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）２
７３（５、パート２）：Ｈ２０９１−１０４；米国特許第５，１９４，５９６号
；同第５，２４０，８４８号；および同第５，３３２，６７１号を参照のこと。
他のファミリメンバーとしては、以下が挙げられる：ＶＥＧＦ−Ｂ（例えば、Ｏ
ｌｏｆｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６
）９３：２５７６−２５８１を参照のこと；この参考文献および本明細書中に引
用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される；これは、「Ｖ
ＲＦ」とも称される；例えば、Ｇｒｉｍｍｏｎｄ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅ
ｓ．（１９９６）６：１２４−１３１を参照のこと）；ＶＥＧＦ−Ｃ（例えば、
Ｊｏｕｋｏｖ，Ｖ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９６）１５：２９０−２９８およ
びＷＯ９６／３９５１５を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引
用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される；これは、ＶＥ
ＧＦ関連タンパク質または「ＶＲＰ」とも称される；例えば、Ｌｅｅ，Ｊ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１９８８−
１９９２を参照のこと）；ＶＥＧＦ−Ｄ（「ＦＩＧＦ」と称される、Ｏｒｌａｎ
ｄｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６
）９３：１１６７５−１１６８０およびＹａｍａｄａ，Ｙ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ，（１９９７）４２：４８３−４８８を参照のこと）；および胎盤増殖因子（
ＰＩＧＦ）（例えば、Ｍａｇｌｉｏｎｅ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：９２６７−９２７１を参照のこと）。近
年、ＶＥＧＦ−Ｅ（第５のＶＥＧＦファミリーメンバー）が、単離および特徴付
けられている（例えば、Ｏｇａｗａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
９８）２７３（４７）：３１２７３−３１２８２およびＭｅｙｅｒ，Ｍ．ら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．（１９９９）１８（２）：３６３−３７４を参照のこと）。

【００２３】 ヒト胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）は、ＶＥＧＦとタンパク質レベルで４６％の相
同性を共有する、グリコシル化されたホモダイマーである。ヒトＰＩＧＦ ｍＲ
ＮＡの示差的スプライシングは、１７０アミノ酸または１４９アミノ酸のいずれ
かの前駆体を導き得、これらの前駆体は、それぞれ、１５２アミノ酸長または１
３１アミノ酸長の成熟形態にタンパク質分解的にプロセシングされる。例えば、
ＢａｙｎｅおよびＴｈｏｍａｓ ＥＰ０５０６４７７；Ｍａｇｌｉｏｎｅ，Ｄ．
ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：９２５−９３１；Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．お
よびＷｅｉｃｈ，Ｈ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（１９９３）９：２５９−
２６８を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引用される参考文献
は、本明細書中に参考として援用される。

【００２４】 用語「線維芽細胞増殖因子」または「ＦＧＦ」は、単独または他の増殖因子（
例えば、ＶＥＧＦファミリーの増殖因子）と共に、血管発生、新脈管形成および
他の新脈管形成活性を惹起し得る、増殖因子のファミリーを含む。ＦＧＦファミ
リーとしては、少なくとも２０個のポリペプチドが挙げられる（例えば、Ｇｏｎ
ｃａｌｖｅｓ，Ｌ．，Ｒｅｖ Ｐｏｒｔ Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９８）１７、補
遺２：ＩＩ１１−２０を参照のこと；これらの参考文献および本明細書中に引用
される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。酸性ＦＧＦ（
ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）
は、このファミリーのうちで最も広範に特徴付けられているメンバーである。例
えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ，Ｐｒｏｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅ
ｓ（１９８９）１：２０７−３５；Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ａｎｎ ＮＹ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（１９９１）６３８：４６７−９；およびＳｌａｖｉｎ，
Ｊ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ（１９９５）１９：４３１−４４を参照のこ
と；これらの参考文献および本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細
書中に参考として援用される。

【００２５】 新脈管形成を誘導する他の新脈管形成因子としては、アンギオポイエチンタン
パク質ファミリーが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｄａｖｉｓ
，Ｓ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９
）２３７：１７３−８５；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ Ａ．ら、Ｌａｂ
Ｉｎｖｅｓｔ（１９９９）７９：２１３−２３；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．，
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：１９０４−
９；Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１１７１−１１８０；Ｔａｋｅｈ
ａｒａら、Ｃｅｌｌ（１９８７）４９：４１５−４２２；Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ
（１９９６）８７：１１７１−１１８０を参照のこと；これらの参考文献および
本明細書中に引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。用
語「アンギオポイエチン−１」または「Ａｎｇ１」とは、Ｔｉｅ−２レセプター
に対するリガンドであるタンパク質をいう（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：８１６−８１９を参照のこと）。Ａｎｇ１は、
（アゴニストとして）Ｔｉｅ−２レセプターを刺激し得る。用語「アンギオポイ
エチン−２」または「Ａｎｇ２」とは、Ｔｉｅ−２レセプターのＡｎｇ１刺激性
活性化を（アンタゴニストとして）ブロックし得るタンパク質をいう（例えば、
Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７：５５
−６０を参照のこと）。Ａｎｇ１刺激性活性化のブロックは、インビボで新脈管
形成を破壊し得る。

【００２６】 用語「ＶＥＧＦのホモログ」としては、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧ
Ｆ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−ＥおよびＰＩＧＦのホモダイマー、ならびに
ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅとの
間で形成される任意の機能的ヘテロダイマー（ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｂへテ
ロダイマーを含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

【００２７】 脈管発生および新脈管形成の間の細胞間の伝達は、少なくとも５つの内皮細胞
特異的チロシンキナーゼレセプターに関係し得る（例えば、Ｃｌａｅｓｓｏｎ−
Ｗｅｌｓｈ，Ｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２３７巻（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９９９）お
よびＭｕｓｔｏｎｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）１２９：
８９５−８９８を参照のこと；これらの参考文献およびそれらに引用される全て
の参考文献は、本明細書中において参考として援用される）。これは、少なくと
も２つの異なるサブクラスに属する：Ｔｉｅファミリーの二つのレセプター（例
えば、Ｐａｒｔａｎｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ（１９９９）２３７：１５８−１７１を参照のこと）および３つのＶＥＧ
Ｆレセプター：ＶＥＧＦＲ−１、−２、および−３。これら３つのＶＥＧＦレセ
プターは、それぞれ、もともとＦｌｔ１（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ；例えば、
Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ、Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：９８９−９９
１を参照のこと）、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（キナーゼ挿入−ドメイン含有レセプタ
ーまたは胎児肝臓キナーゼ−１；例えば、Ｔｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９２）１８７：１５７９−１５８
６を参照のこと）およびＦｌｔ４（例えば、Ｐａｊｕｓｏｌａ，Ｋら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ（１９９２）５２：５７３８−５７４３およびＧａｌｌａｎｄ、Ｆ
．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：１２３３−１２４０を参照のこと）と
呼ばれていた。ＶＥＧＦの生物学的な応答は、これらの高い親和性ＶＥＧＦレセ
プターを介して媒介される。

【００２８】 ＦＧＦレセプターもまた特徴付けられており、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＧ−２、
ＦＧＦＲ−３およびＦＧＦＲ−４を含む（例えば、Ｋｌｉｎｔ，Ｐ．ら、Ｆｒｏ
ｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９１）１５：Ｄ１６５−７７およびＧａｌｚｉｅ，
Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９７）７５：６６９−８
５を参照のこと；これらの参考文献およびそこに引用される全ての参考文献は、
本明細書中において参考として援用される）。

【００２９】 種々のインビボ動物モデルが、（上記インビトロ試験に加えて（上記Ｆｏｌｋ
ｍａｎ（１９９２）を参照のこと））本発明のキメラ分子が脈管形成活性を有す
る能力を評価するために使用され得る。例えば、虚血性筋肉の新脈管形成は、外
因的に投与される本発明のキメラ分子が、実験的に誘導されたマウスまたはラビ
ットの後肢虚血において側副肢血流を増加する実験によって示され得る。例えば
、Ｐｕ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．（１９９４）７：４９−６０；
Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ，Ｔ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２
：１６６７−１６７９；Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．
Ｐａｔｈ．（１９９８）１５３：３８１−３８４）；およびＢａｕｔｅｒｓ，Ｃ
．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９５）９１：２８０２−２８０９）を参照
のこと；これらの参考文献およびそれらに引用される全ての参考文献は、本明細
書中において参考として援用される。ＶＥＧＦの筋肉内遺伝子移動の後に側副肢
微小血管の内皮依存性弛緩は、実験的に誘導されたラットの後肢虚血において示
されている。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（
１９９８）９８：１２６１−６３を参照のこと；これらの参考文献およびそれら
に引用される全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用される。浸
透圧ポンプからの制御されたＶＥＧＦの局所的送達は、部分的虚血性後肢ラビッ
トモデルにおいて新生血管形成、肢灌流、および機能的改善を促進することが実
験的に示された。例えば、Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．
（１９９８）２７：８８６−８９４を参照のこと；この参考文献およびそれに引
用される全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用される。慢性ブ
タ心筋虚血モデルにおけるＶＥＧＦ投与に関する実験もまた、使用されている。
例えば、Ｈａｒａｄａ，Ｋ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）２７
０：８８６−９４を参照のこと；この参考文献およびそれに引用される全ての参
考文献は、本明細書中において参考として援用される。

【００３０】 用語「虚血」「末梢血管疾患」、「アテローム性動脈硬化症」および「冠動脈
疾患」は、本明細書中で使用される場合、それらの一般的な使用法を含む。これ
らの疾患、障害、または病気（ａｉｌｍｅｎｔ）は、ＶＥＧＦまたはＦＧＦによ
って、単独で、または組み合わせて、他の脈管形成因子に加えて調節され得る。
虚血は、例えば、不適切な灌流に起因する器官および四肢の組織における酸素供
給の不足によって特徴付けられる状態である。このような不適切な灌流は、少し
挙げると、アテローム性動脈硬化症損傷、再狭窄損傷、貧血、または発作を含む
多くの自然な原因を有し得る。例えば、バイパス手術の間の血流の中断のような
多くの医学的処置もまた、虚血を導く。疾患状態の心臓血管組織によって時々引
き起こされることに加えて、虚血は、時々、虚血性心臓疾患のような心臓血管組
織に影響し得る。しかし、虚血は、任意の器官または四肢において生じ得、これ
らは酸素供給の不足を被っている。

【００３１】 心臓における虚血の最も一般的な原因は、心外膜冠状動脈のアテローム性動脈
硬化症疾患である。これらの血管の管腔を減少させることによって、アテローム
性動脈硬化症は、基底状態における心筋灌流の絶対的な減少を引き起こすか、ま
たは流れに対する要求が増加する場合に灌流の適切な増加を制限する。冠状血流
はまた、動脈血栓、痙攣、およびまれに冠状塞栓によって、ならびに梅毒大動脈
炎に起因して狭くなる小孔によって制限され得る。肺動脈から左前室間冠状動脈
の異常な起点のような先天的な異常は、新生児期の心筋虚血および梗塞を引き起
こし得るが、この原因は成人においては非常に稀であり得る。心筋虚血はまた、
高血圧または大動脈狭窄に起因する重篤な心室肥大のような、心筋酸素要求が異
常に増加した場合、生じ得る。後者は、アテローム性冠状動脈硬化症によって引
き起こされる識別不能なアンギナとともに存在し得る。非常に重篤な貧血または
一酸化炭素ヘモグロビンの存在のような、血液の酸素運搬能の減少は、心筋虚血
の稀な原因であり得る。虚血の２つ以上の原因は同時に存在し得る（例えば、左
心室肥大に起因する酸素要求の増加およびアテローム性冠状動脈硬化症の次の酸
素供給の減少）。

【００３２】 心臓血管疾患は、心臓の血管の疾患をいう。例えば、Ｋａｐｌａｎ，Ｒ．Ｍ．
ら、「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、ＨＥＡＬＴＨ Ａ
ＮＤ ＨＵＭＡＮ ＢＥＨＡＶＩＯＲ，２０６〜２４２頁、（ＭｃＧｒａｗ−Ｈ
ｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３）を参照のこと；これらの参考文献および
それらに引用される全ての参考文献は、本明細書中において参考として援用され
る。心臓血管疾患は、一般的に、例えば、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｉｏｎ）（
高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）とも呼ばれる）、冠状心臓
疾患、発作、およびリウマチ様心臓疾患を含むいくつかの形態の１つであり得る
。末梢血管疾患は、心臓以外の任意の血管の疾患をいう。それは、しばしば、脚
および腕の筋肉に血液を運搬する血管の狭まりであり得る。

【００３３】 用語「アテローム性動脈硬化症」は、医学の関連する分野で活動する医師によ
って認識され理解される血管の疾患および状態を包含する。アテローム性動脈硬
化症心臓血管疾患、冠状心臓疾患（冠状動脈疾患または虚血性心臓疾患としても
公知）、脳血管疾患および末梢血管疾患はすべて、アテローム性動脈硬化症の臨
床的な徴候であり、従って、用語「アテローム性動脈硬化症」および「アテロー
ム性動脈硬化症疾患」によって包含される。

【００３４】 用語「再狭窄」は、血管形成術およびステント挿入のような血管介入に続いて
血管管腔が再び狭まることをいう。それは初期管腔直径増加の損失として臨床的
に規定され得る。血管形成術前の血管直径を回復する期待において、身体は、血
管壁を再構築するか、空間を占め、管腔を再び閉塞する新たな組織増殖を刺激す
るか、または組織収縮を刺激することを試みる。例えば、手術後に血管を治癒す
る間、平滑筋細胞は、血管の管腔を狭め、そして再びアテローム性動脈硬化症プ
ロセスを開始する内皮細胞よりも速く増殖する。

【００３５】 用語「調節する」は、抑制、増強、あるいは機能または状態の誘導をいう。例
えば、本発明のキメラ化合物は、虚血性心臓組織において血管形成を増加するこ
とによって新脈管形成を調節し得、それによって虚血を軽減する。

【００３６】 用語「処置」は、疾患、状態、または障害と戦う目的のためのヒト被験体の管
理および看護を意味し、症状または合併症の発症を妨げるためか、症状または合
併症を軽減するためか、または疾患、状態または障害を除去するための、本発明
のキメラ分子の投与を包含する。

【００３７】 用語「誘導する」または「誘導」は、本明細書中で使用される場合、本明細書
中に記載されるような任意の組織の形成、修復プロセスまたは発生に必要な細胞
機構または細胞プロセスの活性化、刺激、増強、開始および／または維持をいう
。

【００３８】 用語「ライブラリー」は、分子の収集物を意味する。ライブラリーは、数個ま
たは多数の異なる分子（約１０個の分子から数十億個以上の分子で変動する）を
含み得る。所望であれば、分子は、タグに連結され得、これは、分子の回収また
は同定を促進し得る。

【００３９】 用語「分子」は、薬物；ペプチド（ペプチド模倣物またはペプトイドのような
改変体または改変ペプチドまたはペプチド様分子を含む）；あるいはタンパク質
例えば、抗体または増殖因子レセプターまたはそれらのフラグメント（例えば、
結合ドメインを含む抗体のＦ_v、Ｆ_cまたはＦ_abフラグメント）のような、有機化
合物を意味するように広く使用される。分子は、非天然の分子（天然には存在し
ないが、インビトロ法の結果として産生される）であり得るか、またはｃＤＮＡ
ライブラリーから発現されるタンパク質またはそれらのフラグメントのような天
然に存在する分子であり得る。

【００４０】 「キメラ分子」、「キメラタンパク質」、「脈管形成キメラ分子」、または「
脈管形成キメラタンパク質」は、天然の細胞表面脈管形成レセプター、他のチロ
シンキナーゼレセプター、または標的細胞または組織上の他のレセプターを認識
する少なくとも１つの結合部位、ならびに正常な標的細胞もしくは組織または異
常な標的細胞もしくは組織のいずれかに特異的に結合する少なくとも１つの第２
結合部位を有し得る分子である。

【００４１】 「融合タンパク質」は、第２のドメインに関する少なくとも１つのポリペプチ
ドまたはペプチドドメインを含む組成物をいう。第２のドメインは、ポリペプチ
ド、ペプチド、多糖類などであり得る。「融合」は、ペプチド結合、化学連結、
電荷相互作用（例えば、塩架橋（ｓａｌｔ ｂｒｉｄｇｅ）、Ｈ結合のような静
電的引力）、非共有結合相互作用などによって生成される会合であり得る。ポリ
ペプチドが組換えである場合、「融合タンパク質」は、通常のメッセージから翻
訳され得る。あるいは、ドメインの組成物は、任意の化学的または静電的手段に
よって連結され得る。本発明の融合タンパク質はまた、リンカー、エピトープタ
グ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含み得る。

【００４２】 用語「単離された」は、本発明のキメラ分子または標的分子のような分子また
は組成物を参照する場合、キメラ分子または標的ペプチドが、少なくとも１つの
他の化合物（例えば、タンパク質、他の核酸（例えば、ＲＮＡ）、あるいはイン
ビボまたはその天然に存在する状態で付随する他の混入物）から分離されること
を意味する。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離
された組成物は、均質な状態であり得、乾燥または水溶液であり得る。純度およ
び均質性は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定
され得る。従って、単離された標的分子は、そのインサイチュの環境で通常付随
する物質を含まない。タンパク質が均質または優勢なバンドに単離された場合で
さえ、所望のタンパク質と同時精製される微量の混入物が存在する。

【００４３】 発現ベクター、核酸、脈管形成因子、または送達ビヒクルを細胞に「投与」す
ることは、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スロケーション、融合、食作用、シューティング（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）またはバ
リスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）方法（すなわち、タンパク質または核酸が
細胞膜を横切って、好ましくは細胞の核に輸送され得る任意の手段）を包含する
。

【００４４】 「送達ビヒクル」は、例えば、リポソーム、毒素、または膜トランスロケーシ
ョンポリペプチドのような化合物をいい、これは、本発明のキメラ分子を送達す
るために使用される。送達ビヒクルはまた、脈管形成因子（例えば、脂質：核酸
複合体）をコードする核酸、発現ベクター、ウイルスなどを投与するために使用
され得る。

【００４５】 用語「異種」は、相対的な用語であり、これは、核酸の部分を参照して使用さ
れる場合、核酸が互いに天然には同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列（
ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことを示す。例えば、組換え的に産生された核
酸は、典型的には、新規な機能の核酸を作製するために合成的に配置された無関
係の遺伝子由来の２つ以上の配列（例えば、１つの供給源からのプロモーターお
よび別の供給源からのコード領域）を有する。従って、２つの核酸は、この状況
において互いに異種である。細胞に加えられる場合、組換え核酸はまた、細胞の
内因性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸は、染色
体に組み込まれた非ネイティブな（非天然の）核酸、または非ネイティブ（非天
然）染色体外核酸を含む。対照的に、天然にトランスロケートされた染色体の片
は、本特許出願の状況において異種であると考えない。なぜなら、これは、変異
細胞にネイティブな内因性核酸配列を含むからである。

【００４６】 同様に、異種タンパク質は、このタンパク質が天然では互いに同じ関係では見
出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、「融合タンパク質」
、ここでは、２つの部分配列が単一の核酸配列によってコードされる）。例えば
、組換え技術の導入として、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）１９９７；これら
の参考文献およびそれらに引用される全ての参考文献は、本明細書中において参
考として援用される）を参照のこと。

【００４７】 用語「組換え」は、例えば、細胞、あるいは核酸、タンパク質、またはベクタ
ーを参照して使用される場合、細胞、あるいは核酸、タンパク質、またはベクタ
ーが、異種核酸またはタンパク質の導入、あるいはネイティブな核酸またはタン
パク質の改変、あるいは細胞がそのように改変された細胞から誘導されることに
よって、改変されたことを示す。従って、例えば、組換え細胞が、細胞のネイテ
ィブ（天然）の形態で見出されない遺伝子を発現するか、あるいは、そうではな
く正常に発現されるか、異常に発現されるか、少なく発現されるか、または全く
発現されないネイティブな遺伝子の２代目のコピーを発現する。

【００４８】 用語「プロモーター」は、転写を指向する核酸制御配列のアレイとして規定さ
れる。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、典型的に、例えば、特定
のＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡエレメント、エンハンサー
、ＣＣＡＡＴボックス、ＳＰ−１部位などの場合、転写の開始部位近くの必要な
核酸配列を含む。本明細書中で使用される場合、プロモーターはまた、必要に応
じて遠位エンハンサーまたはレプレッサエレメントを含み、これは、転写の開始
部位から数千塩基対離れて配置され得る。プロモーターは、しばしば、ポリペプ
チド（例えば、核酸レセプター、Ｇａｌ４、ｌａｃレプレッサなど）のようなＤ
ＮＡ結合部分によってトランスアクティベーションに応答性のエレメントを有す
る。

【００４９】 用語「構成」プロモーターは、大部分の環境条件および発生条件下で活性なプ
ロモーターである。「誘導」プロモーターは、特定の環境条件または発生条件下
で活性なプロモーターである。

【００５０】 用語「弱いプロモーター」は、野生型の単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）
チミジンキナーゼ（「ｔｋ」）プロモーターまたは変異ＨＳＶ ｔｋプロモータ
ー（ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．（１９８５）５：１９４０−１９４７に記載される）とおよそ同じ活性を有す
るプロモーターをいう。

【００５１】 用語「作動可能に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター
、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸との間の機能的連結をいい、
ここで、この発現制御配列が、第２の配列に対応する核酸の転写に指向する。

【００５２】 「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の核酸の転写、ならびに必要に応
じて、宿主細胞における発現ベクターの組込みまたは複製を可能にする、一連の
特定の核酸エレメントを用いて組換え的または合成的に生成される核酸構築物で
ある。発現ベクターは、ウイルスまたは非ウイルス由来のプラスミド、ウイルス
、または核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、「
発現カセット」を含み、この発現カセットは、転写される核酸を含み、プロモー
ターに作動可能に連結される。用語発現ベクターはまた、プロモーターに作動可
能に連結される裸のＤＮＡを含む。

【００５３】 「宿主細胞」は、本発明のキメラ分子あるいは本発明のキメラ分子をコードす
る発現ベクターまたは核酸を含む細胞を意味する。宿主細胞は、典型的に、発現
ベクターの複製または発現を支持する。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ．のような原
核生物細胞、あるいは酵母細胞、真菌細胞、原生動物細胞、高等植物細胞、昆虫
細胞、または両生類細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９
３、ＣＯＳ−１など）のような真核生物細胞（例えば、培養細胞（インビトロ）
、外植片および一次培養物（インビトロおよびエキソビボ）、ならびにインビボ
細胞）であり得る。

【００５４】 用語「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体をいう。この用語は、
公知のヌクレオチドアナログあるいは改変骨格残基または連結を含む核酸を含み
、これらは、合成、天然および非天然であり、これらは、参照核酸に類似した結
合性質を有し、そして参照したヌクレオチドに類似した様式で代謝される。この
ようなアナログの例としては、限定しないが、ホスホロチオエート、ホスホラミ
デード、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチル
リボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。

【００５５】 他に示さない限り、特定の核酸配列はまた、暗にそれらの保存的に改変された
改変体（例えば、コドン置換を変性する）および相補的配列、ならびに暗に示さ
れた配列を含む。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。核酸配列は、従来の５’
−３’方向で本明細書中において示される。

【００５６】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基
の重合体をいうために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１つ以
上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸のアナログまたは模倣物であるア
ミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体に適用される。ポリペプ
チドは、例えば、糖タンパク質を形成するために、炭水化物残基の付加によって
改変され得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、
糖タンパク質、ならびに非糖タンパク質を含む。ポリペプチド配列は、従来のＮ
末端からＣ末端の方向で本明細書中に示される。

【００５７】 用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似
の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然のアミノ
酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならび後に改変されるアミ
ノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、およびＯ−ホス
ホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然のアミノ酸と同じ基礎化学構造（
すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されるα炭素）を
有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、
メチオニン、およびメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、改変
されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが
、天然に存在するアミノ酸と同じ基礎化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、
アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ
酸と類似の様式で機能する化合物をいう。

【００５８】 「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適
用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一また
は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、あるいはその核酸が
アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列をいう。詳細には、縮
重コドン置換が、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位
置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製
することによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．（１９９１）１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６０５〜２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ（１９９４）８：９１〜９８）。遺伝コードの縮
重に起因して、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコード
する。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸
アラニンをコードする。従って、アラニンが本明細書中のアミノ酸におけるコド
ンにより特定されるすべての位置において、そのコドンは、コードされるポリペ
プチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかへと変更され
得る。このような核酸改変体は、「サイレント改変体」であり、これは、保存的
に改変された改変体の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの
核酸配列も、その核酸の可能なすべてのサイレントな改変体もまた記載する。核
酸中の各コドン（通常はメチオニンのみのコドンであるＡＵＧ、および通常はト
リプトファンのみのコドンであるＴＧＧは除く）は、機能的な同一な分子を生じ
るように改変され得ることを、当業者は認識する。従って、ポリペプチドをコー
ドする核酸のサイレントな変化各々が、記載される配列各々に含まれる。

【００５９】 アミノ酸配列および核酸配列に関して、その配列における単一のアミノ酸もし
くはヌクレオチド、または小さい割合のアミノ酸またはヌクレオチドを、変更、
付加または欠失する個々の置換、欠失または付加が、その変更が化学的に類似の
アミノ酸によるアミノ酸置換をもたらしている「保存的に改変された改変体」を
作製する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知
である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性改変体および
対立遺伝子に加わり、そしてこれらの多型性改変体および対立遺伝子を排除しな
い。

【００６０】 以下の群は、各々が、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン
（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；３）アスパラ
ギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；４）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ
）；５）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；６）アルギニン（Ｒ）、リジン
（Ｋ），ヒスチジン（Ｈ）；７）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン
（Ｖ）；および８）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン
（Ｗ）（例えば、アミノ酸特性の考察について、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。

【００６１】 用語「ポリヌクレオチド」とは、１つより多くのヌクレオチドの核酸である。
ポリヌクレオチドは、その単位の記載により言及される、複数のポリヌクレオチ
ド単位から構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コード配列を有するポ
リヌクレオチド、調節領域であるポリヌクレオチドおよび／または当該分野で一
般的に使用される他のポリヌクレオチド単位を含み得る。

【００６２】 用語、野生型脈管形成タンパク質の「生物学的に活性なフラグメント」、「生
物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な等価物」および「機能的誘導体」は
、その野生型脈管形成タンパク質の生物学的活性と少なくとも実質的に等しい生
物学的活性を保有する。上記の用語は、その野生型脈管形成タンパク質の「フラ
グメント」、「変異体」、または「改変体」を含むことが意図される。用語「フ
ラグメント」とは、その野生型脈管形成タンパク質の任意のポリペプチドサブセ
ットをいうことが意味される。用語「変異体」とは、野生型形態と実質的に類似
し得るが異なる生物学的特徴を保有する分子をいうことが意味される。このよう
な変化した特徴としては、その脈管規制タンパク質またはヒト脈管形成機能的誘
導体の生物学的活性に影響する化学化合物に対する、変化した基質結合、変化し
た基質親和性および変化した感受性（これらは、各変異体を本明細書中に開示さ
れるような標的化された脈管形成について魅力的にし得る）が挙げられるが、こ
れらに限定されない。上記のような用語「改変体」とは、野生型タンパク質全体
またはそのフラグメントのいずれかに、構造および機能において実質的に類似す
る分子をいう。

【００６３】 用語「遺伝子」とは、染色体（例えば、ヒト染色体）にて見出される遺伝する
遺伝物質の単位をいう。各遺伝子は、鎖を形成するヌクレオチドの配列により言
及され得る、デオキシリボヌクレオチドの直鎖から構成される。従って「配列」
とは、鎖を形成するヌクレオチドの順序付けられた列挙、およびそのヌクレオチ
ド配列を有する鎖の両方を示すために使用される。用語「配列」とは、ＲＮＡ鎖
（リボヌクレオチドからなる直鎖）に関して同じ様式で使用される。その遺伝子
は、調節配列および制御配列、ＲＮＡ分子へと転写され得る配列を含み、そして
未知の機能を有する配列を含み得る。そのＲＮＡ産物（ＤＮＡからの転写の産物
）のいくつかは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、これは、ポリペプ
チドへと翻訳されるリボヌクレオチド配列（複数または単数）および翻訳されな
いリボヌクレオチド配列を最初に含む。翻訳されない配列としては、制御配列、
イントロンおよび未知の機能を有する配列が、挙げられる。同じ遺伝子について
のヌクレオチド配列における小さい差異が、異なるヒト間、または正常な細胞と
癌性細胞との間、または正常な細胞と疾患細胞との間にて、その遺伝子の同一性
を変更することなく存在し得ることが、認識され得る。

【００６４】 用語「特異的結合」（および等価な句）は、タンパク質および他の生物学物質
の不均一な集団の存在下で、特定の標的分子（例えば、リガンドまたは抗原）に
結合部分（例えば、レセプター、抗体、またはアンチリガンド）が優先的に（す
なわち、試験サンプル中に存在する他の成分への有意な結合を伴わずに）結合す
る能力をいう。代表的には、２つの実体（例えば、リガンドとレセプター）間の
特異的結合は、少なくとも約１０⁶Ｍ^-1、そして好ましくは少なくとも約１０⁷Ｍ ^-1 、１０⁸Ｍ^-1、１０⁹Ｍ^-1または１０¹⁰Ｍ^-1の結合親和性を意味する。いくつか
の実施形態において、特異的結合は、米国特許第５，６２２，２６９号（この参
考文献およびその中に引用されるすべての参考文献は、本明細書中に参考として
援用される）の方法に従ってアッセイされ（そして特異的結合分子が同定される
）。代表的には、このアッセイによる特異的反応または選択的反応は、バックグ
ラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも約２倍であり、そしてより代表的に
は、バックグラウンドの少なくとも約５倍または少なくとも１００倍、あるいは
それ以上である。

【００６５】 結合部分が抗体である場合、種々のイムノアッセイフォーマットが、特定のタ
ンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例え
ば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、抗原と特異的に免疫反応性であるモノク
ローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定す
るために使用され得るイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載については
、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（この参考文献およびその中に引用さ
れる参考文献は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【００６６】 「特異的ハイブリダイゼーション」とは、その配列が複合混合物（例えば、総
細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合の、ストリンジェントな条件下で特
定のヌクレオチド配列にのみへの、分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイ
ゼーションをいう。ストリンジェントな条件は、プローブがその標的部分配列に
ハイブリダイズし得るが他の配列にハイブリダイズしない条件である。ストリン
ジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境にて異なる。長い配列
ほどより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントな
条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融解温度（Ｔ_m
）より約５℃低いように選択される。このＴ_mは、標的配列と相補的なプローブ
のうちの５０％が平衡して標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強
度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。（標的配列が一般的に過剰に存在する場
合、Ｔ_mにおいて、そのプローブの５０％が平衡状態で存在する）。代表的には
、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度少なくとも約０．
０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）を含み、かつ温度が、短いプ
ローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃である
。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドまたはテトラアルキルアンモニ
ウム塩のような変性剤の添加により達成され得る。例えば、条件５×ＳＳＰＥ（
７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．４）および温度２５〜３０℃が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼ
ーションに適切である。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ １９８９を参照のこと；この参考文献およびその中に引用されるすべて
の参考文献が、本明細書中に参考として援用される）。

【００６７】 用語「薬学的に受容可能な」、「生理学的に許容可能な」およびそれらの文法
的変化は、それらが組成物、キャリア、希釈剤および試薬をいう場合、交換可能
に使用され、そしてその物質が、その組成物の投与を妨げる程度まで望ましくな
い生理学的効果（例えば、悪心、めまい、胃の不調など）の生成を伴わずにヒト
に投与され得ることを示す。

【００６８】 用語「ポリサッカライド」または「オリゴサッカライド」とは、その一般的語
法を組み込み、そして例えば、下記ような、デキストロース、グルコース、ラク
トース、マンノース、マンナンなどを含む。

【００６９】 （１．標的化された新脈管形成） （Ａ．血管内皮の標的化） 本発明は、血管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結した脈管形成因子を
含むキメラ分子を提供する。

【００７０】 脈管構造における表面発現の変化は、虚血−再灌流障害において広範に研究さ
れている。例えば、Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｅ．、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．（１９９６）２７補遺１：Ｓ２６〜３０；Ｌｅｆｅｒ，Ａ．およ
びＬｅｆｅｒ，Ｄ．、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ（１９９６）３２：７４３
〜５１；Ｈａｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｄｒｕｇｓ（１９９７）５３補遺１：１〜１０；
Ｋｉｎｌａｙ，Ｓ．およびＧａｎｚ，Ｐ、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９７
）８０（９Ａ）１１Ｉ〜１６Ｉ、ならびにＬｕｓｃｈｅｒ，Ｔ．ら、Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ Ｍｅｄ（１９９３）４４：３９５〜４１８（これらの参考文献およびその
中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援用される）を参照
のこと。いくつかの器官系（心臓、腎臓、脳および骨格筋を含む）において、以
前に虚血性であった領域への流れの修復は、種々の応答を誘導する。種々の内皮
細胞マーカーが公知であり、それらとしては、内皮−白血球接着分子（ＥＬＡＭ
−１；Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８７）８４：９２３８〜９２４２）；血管細胞接着分子−
１（ＶＣＡＭ−１；Ｄｕｓｔｉｎ，Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１
３７：２４５〜２５４）および細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１；Ｏｓｂｏｒ
ｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：１２０３〜１２１１）（これらの参考
文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援用
される）が挙げられる。これらのいくつかの細胞接着分子の発現は、時間依存性
様式で増加し、そして白血球接着を増強する。最終結果は、再灌流が炎症応答お
よび好中球の補充を引き起こし、このことがその虚血障害と関連し得る細胞死を
促進し得るということであり得る。免疫グロブリン（「Ｉｇ」）スーパー遺伝子
ファミリーレセプター（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１）は、
可変数の反復する免疫グロブリン様ドメインから構成される（例えば、Ｗｉｌｌ
ａｍｓ，Ａ．ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）６：３８１〜
３８７を参照のこと）。

【００７１】 虚血−再灌流障害後の冠状血管内皮における表面発現のこれらの変化は、種々
の選択技術を使用して、例えば、心臓血管内皮に特異的に結合する分子を単離す
るために、使用され得る。

【００７２】 （Ｂ．アテローム性動脈硬化症および再狭窄を標的化するための治療因子） 損傷に対する血管応答は、少なくとも３つの基本的細胞プロセス（細胞増殖、
細胞移動および細胞外マトリックス産生）における変化を含み得る。損傷に対す
るこの血管応答は、以下を含むがこれらに限定されない、種々の血管疾患の病因
を特徴とし得る：アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、静脈バイパ
ス移植狭窄、人工器官移植狭窄、新脈管形成および高血圧。例えば、アテローム
性動脈硬化症損傷は、内膜下空間への血管平滑筋の移動、豊富な細胞外マトリッ
クスの増殖および産生の結果として、発展する。同様に、血管形成術後の再狭窄
、静脈バイパス移植狭窄、人工器官移植狭窄、新脈管形成および高血圧は、血管
細胞の増殖、移動およびマトリックス組成における異常を伴う。一般的に、Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｄ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９５）７４：５
４１〜５１を参照のこと。

【００７３】 アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の内側部分の局所的肥厚により特徴付けら
れており、このことは、個体を心筋梗塞（心臓発作）、脳梗塞（発作）、高血圧
（高い血圧）および端部の壊疽にかかりやすくする。アテローム性動脈硬化症損
傷の形成の原因である一般的基礎事象は、内皮細胞損傷に応答しての増殖する平
滑筋細胞の内膜肥厚である。「内膜（または新内膜）の肥厚または形成」とは、
動脈の内皮露出に応答しての内膜における動脈平滑筋細胞の増殖を意味する。血
管形成術またはバイパス手術により物理的に処置される冠状動脈における平滑筋
細胞の蓄積もまた、再狭窄の顕著な特徴である。主に増殖した平滑筋細胞からな
ることに加えて、アテローム性動脈硬化症の損傷は、脂質を抱えた大量のマクロ
ファージ、種々の数のリンパ球および大量の結合組織により囲まれる。ＰＤＧＦ
が、平滑筋細胞増殖の原因である主な増殖調節分子であると考えられている（例
えば、Ｄｒｉｋｓ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ（１９９５）２２：１〜
２４（この参考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に
参考として援用される）を参照のこと）。従って、ＰＤＧＦは、アテローム性動
脈硬化症の疾患プロセスにおいて重要な役割を果たし得る（例えば、Ｈｕｇｈｅ
ｓ，Ａ．、Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）２７：１０７９〜８９（
この参考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考と
して援用される）を参照のこと）。他の多数の因子が、アテローム性動脈硬化症
および再狭窄の病態生理に寄与する。これらの因子としては、アンギオテンシン
ＩＩ、ＦＧＦ、およびトランスホーミング増殖因子β１が挙げられるがこれらに
限定されない（例えば、Ｐｒａｔｔ，Ｒ．、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ
（１９９９）補遺１１：Ｓ１２０〜８；Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．、Ａｍ Ｊ Ｈｙ
ｐｅｒｔｅｎｓ（１９９８）１１：１７７Ｓ〜１８１Ｓ；Ｃｉｎｅｓ，Ｄ．ら、
Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９１：３５２７〜６１；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、ＲＥＧＵ
ＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＡＮＧＩＯＧＥＮＥＳＩＳ、ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏ
ｓｅｎ編（Ｂｉｒｋｈｏｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ １９９７）第２
７３〜２９４頁；Ｓａｌｔｉｓ，Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９６）２３：１９３〜２００（これらの参考文献およ
びその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援用される）
を参照のこと）。

【００７４】 平滑筋細胞増殖、内皮細胞増殖および新脈管形成を阻害する治療因子は、本発
明のキメラ分子、方法、および遺伝子治療試薬とともに使用され得る。例えば、
アンジオスタチンと呼ばれる１つの治療因子（プラスミノゲンの天然に存在する
内部切断産物）は、内皮細胞増殖を阻害し、そして米国特許第５，７３３，８７
６号（この参考文献は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている
。別の内皮細胞増殖阻害剤としては、エンドスタチンが挙げられ、これは、米国
特許第５，８５４，２０５号（この参考文献は、本明細書中に参考として援用さ
れる）に記載される。例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９７
）８８：２７７〜８５を参照のこと。アテローム性動脈硬化症および再狭窄なら
びに他の新脈管形成依存性（または脈管形成関連性）疾患の脈管形成プロセスの
制御に関する、アンジオスタチンおよびエンドスタチンのような治療因子は、こ
れらの疾患の排除または緩和をもたらし得る。例えば、Ｃａｏ，Ｙ、Ｐｒｏｇ
Ｍｏｌ Ｓｕｂｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９８）２０：１６１〜７６（この参
考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと。従って、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の脈管
形成プロセスを制御する治療因子は、本発明のキメラ分子において使用され得る
。

【００７５】 （（２．）キメラ分子の標的化成分の選択および調製） （（Ａ）標的化分子の同定） 種々の方法が、血管内皮（例えば、心臓血管内皮）のような特定の細胞および
組織に特異的に結合する分子を同定および単離するために利用可能である。いつ
かの例示的方法が、以下に記載される。

【００７６】 （（１）インビボパニングを利用するファージディスプレイ） この方法において、１つまたはいくつかの選択された器官に特異的に結合する
分子が、インビボパニングを使用してライブラリーをスクリーニングすることに
よって、同定され得る。この方法は、米国特許第５，６２２，６９９号に詳細に
記載され、そして本明細書中で参考として援用される。また、Ｐａｓｑｕａｌｉ
ｎｉ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：３６４〜３６６を参照のこと
。被験体に投与するための例示的ライブラリーは、ファージディスプレイペプチ
ドライブラリーである。ファージディスプレイとは、ペプチドまたはタンパク質
が、複製可能な遺伝的パッケージ（下記）のコートタンパク質に遺伝的に融合さ
れており、一般的にはその複製可能な遺伝的パッケージの外側にその融合ペプチ
ドまたはタンパク質の提示をもたらすと同時に、その融合物をコードするＤＮＡ
が一般的にはその複製可能な遺伝的パッケージ内に存在する、インビトロまたは
インビボでの選択技術を述べる。提示されるタンパク質とそれをコードするＤＮ
Ａとの間のこの物理的結合は、各々が対応するＤＮＡ配列に連結している多数の
ペプチドまたはペプチドの改変体のスクリーニングを可能にする。

【００７７】 種々の型の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質
フラグメント、ペプトイド、またはペプチド模倣物）の多様な集団を含むライブ
ラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、そして市販されている
。例えば、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ，ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍ
ｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．（１９９７）２６：４０１〜２４；Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．
ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）７（６）：６１
６〜２１；ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｄ．ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９
９６）６（２）：１５５〜６２；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：３５１〜３６０ならびにＢｌｏｎｄｅｌｌｅ
ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）１４：８３〜９２（これ
らの参考文献およびその中で引用される参考文献すべては、その各々が本明細書
中に参考として援用される）を参照のこと。また、ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、
Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、ＢＵＲＧ
ＥＲ’Ｓ ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＩ
ＳＣＯＶＥＲＹ、第１巻（Ｗｏｌｆｆ，Ｍ．Ｅ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ １９９５）ならびにＧｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９４
）３７：１３８５〜１４０１（その各々が参考として援用される）も参照のこと
。

【００７８】 ファージディスプレイ技術は、ランダムなペプチドまたは選択的にランダムに
されたペプチドの多岐の集団を発現するための手段を提供し得る。ファージディ
スプレイの種々の方法およびペプチドの多岐の集団を生成するための方法は、公
知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号（この参
考文献およびその中で引用される参考文献すべては、本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。

【００７９】 複製可能な遺伝的パッケージは、細胞、胞子またはウイルスを意味する。この
複製可能な遺伝的パッケージは、真核生物性であってもまたは原核生物性であっ
てもよい。ポリペプチドディスプレイライブラリーは、提示される外因性ポリペ
プチドをコードする核酸をその複製可能な遺伝的パッケージのゲノム中に導入し
て、その複製可能な遺伝的パッケージの外側表面から通常は発現される内因性タ
ンパク質との融合タンパク質を形成することによって、形成される。その融合タ
ンパク質の発現、外側表面への輸送およびアセンブリは、その遺伝的パッケージ
の外側表面からの外因性ポリペプチドの提示をもたらす。

【００８０】 ディスプレイライブラリーに最も頻繁に使用される遺伝的パッケージは、バク
テリオファージ、特に糸状ファージ、そしてとりわけファージＭ１３、Ｆｄおよ
びＦ１である。ほとんどの作業は、提示されるポリペプチドをコードするライブ
ラリーを、融合タンパク質を形成するこれらのファージのｇＩＩＩまたはｇＶＩ
ＩＩのいずれかに挿入している（例えば、ＷＯ ９１／１９８１８；ＷＯ ９１
／１８９８９；ＷＯ ９２／０１０４７（遺伝子ＩＩＩ）；ＷＯ ９２／０６２
０４；およびＷＯ９２／１８６１９（遺伝子ＶＩＩＩ）を参照のこと）。このよ
うな融合タンパク質は、シグナル配列（通常は、ファージコートタンパク質以外
の分泌タンパク質由来）、提示されるポリペプチド、および遺伝子ＩＩＩタンパ
ク質もしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質またはそれらのフラグメントのいずれか
を含む。外因性コード配列は、しばしば、遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩの
Ｎ末端にかまたはその付近に挿入されるが、他の挿入部位が可能である。いくつ
かの糸状ファージベクターが、遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかの
第２のコピーを生成するように操作されている。このようなベクターにおいて、
外因性配列は、その２つのコピーのうちのただ１つのみに挿入される。もう１つ
のコピーの発現は、ファージ粒子中に取り込まれる融合タンパク質の比率を効果
的に落とし、そしてファージ増殖に有害なポリペプチドに対する選択を減少する
際に有利であり得る。

【００８１】 別の改変において、外因性ポリペプチド配列は、ファージコートタンパク質お
よびファージパッケージング配列をコードするが複製不可能な、ファージミドベ
クターにクローニングされる。ファージミドは、細胞にトランスフェクトされ、
そしてヘルパーファージでの感染によってパッケージされる。ファージミド系の
使用はまた、コートタンパク質とディスプレイされたポリペプチドとから形成さ
れる融合タンパク質を、ヘルパーファージから発現されたコートタンパク質の野
生型コピーで希釈する効果を有する（例えば、ＷＯ９２／０９６９０を参照のこ
と）。

【００８２】 真核生物ウイルスを使用して、ポリペプチドを類似の様式でディスプレイし得
る。例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスのｇｐ７０に融合したヒトヒ
レグリンのディスプレイは、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ（１９９５）９２：９７４７−９７５１により報告された。胞子をまた
、複製可能な遺伝パッケージとして使用し得る。この場合には、ポリペプチドは
、この胞子の外側表面からディスプレイされる。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
由来の胞子は、適切であることが報告されている。これらの胞子のコートタンパ
ク質の配列は、Ｄｏｎｏｖａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６
：１−１０により提供されている。細胞をまた、複製可能な遺伝パッケージとし
て使用し得る。ディスプレイされるポリペプチドは、細胞表面で発現される細胞
タンパク質をコードする遺伝子に挿入される。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎ
ｏｄｏｓｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｉｓ、および特に、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む細菌細胞が、好ましい。外側表面のタンパク質の詳細
は、米国特許第５，５７１，６９８号、ならびにＧｅｏｒｇｉｏｕら、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：２９−３４およびそこに
引用される参考文献により、議論されている。

【００８３】 ポリペプチドディスプレイライブラリーによりディスプレイされるポリペプチ
ドをコードする核酸は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、複製可能な遺伝パ
ッケージのゲノムに挿入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１
９８９）を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）。核酸は、最終的
に、複製可能なパッケージの外側表面タンパク質のすべてまたは一部に融合した
ポリペプチドとして（スペーサー残基またはフレームワーク残基を伴うかまたは
伴わずに）発現される。ライブラリーは、しばしば、約１０³、１０⁴、１０⁶、
１０⁷、１０⁸以上のメンバーの大きさを有する。

【００８４】 これらおよび他の周知の方法を使用して、ファージディスプレイライブラリー
を生成し得、１つまたは少数の選択した器官および組織に特異的に結合するペプ
チドを同定するために、米国特許第５，６２２，６９９号に記載されるインビボ
パニング法に、このライブラリーを供し得る。例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，
Ｒ．およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：３６２
−３６６；Ａｒａｐ，Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：３７７−３
８０；Ｒａｊｏｔｔｅ，Ｄ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９９８）１０
２：４３０−７；およびＲａｊｏｔｔｅ，Ｄ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（
１９９９）２７４：１１５９３−８を参照のこと；これらの参考文献は、本明細
書中に参考として援用される。例えば、インビボでの選択またはパニングを使用
して、正常な心臓内皮または心筋虚血−再灌流障害により変化した心臓内皮を選
択的に結合するペプチドを同定および単離し得る。同様に、正常な脳組織または
変化した脳組織をまた使用して、これらの組織に選択的に結合するペプチドを同
定および単離し得る。

【００８５】 一般に、目的の無作為な分子または選択的に無作為化された分子の様々な集団
を含む分子のライブラリーが調製され得、次いで２．５×１０⁸形質導入単位（
ＴＵ）のファージライブラリーが、被験体に投与され得る（例えば、頸静脈を通
して静脈内で）。インビボでのファージ循環を可能にする、所定の時間の後に、
高カリウム血（３０ｍＭ ＫＣｌ）の低体温ＤＭＥＭ溶液の心室内注射によって
心臓を停止させ得、そして５〜１０ｍＬの高カリウム血ＤＭＥＭで左心室カニュ
ーレを通して潅流することによって、脈管構造から血液を除去し得る。次いで、
心臓および脳を採取し、均一化し、秤量し、そして標準的な技術によって、ファ
ージをレスキューし得る。選択の２回目および３回目については、クローンを、
先の回から採取し得、そして飽和するまで個々に増殖し得る。次いで、この培養
物をプールし、ファージ粒子を精製し、次いでこのプールの１０¹⁰ＴＵを、同様
に処置した被験体に再注入し得る。次いで、３回目以上からの個々のクローンの
ファージｓｓＤＮＡを調製し得、そして標準的な技術によって、インサートを配
列決定し得る（例えば、Ｒｏｊｏｔｔｅら、前出を参照のこと）。次いで、複数
回現れる配列を有するファージを、同様に処置した被験体へのさらなる注射によ
って、さらに特徴付け得る。スクリーニングの引き続く回を実施して、目的の器
官に選択的に結合する分子を濃縮し得る。

【００８６】 インビボでのパニングをまた使用して、変化した脈管内皮（すなわち、心臓内
皮）を選択的に標的化するファージを同定し得る。脈管内皮は、心筋虚血−再灌
流障害によって変化し得る。例えば、標準的な手順による３０分間の虚血の誘導
および引き続く３０分間の再潅流（いくらかの変化が内皮において起こることを
可能にするため）を使用して、脈管内皮を変化させ得る。次いで、再潅流障害を
受けた動物由来の心臓組織に、ファージを注射し得る。次いで、インビボでのパ
ニング手順を、上記のように実施し得る。

【００８７】 （（２）プラスミド上のペプチド） 別の方法は、プラスミド上のペプチド（「ＰＯＰＳ」）と呼ばれる。Ｓｃｈａ
ｔｚ，Ｐ．ら、米国特許第５，７３３，７３１号を参照のこと；これらの参考文
献およびこれらに引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用さ
れる。ファージディスプレイ法と同様に、ＰＯＰＳは、様々な集団のペプチドを
コードする、プールされたオリゴヌクレオチドのコレクション、大きなライブラ
リーを生成するためのエレクトロポレーション、ならびにペプチドおよびこれら
をコードするオリゴヌクレオチドの遺伝子連結を使用する。しかし、ＰＯＰＳは
、遺伝子連結が、ファージ粒子によって提供されるのではなく、融合タンパク質
をコードするベクター上の部位に結合する融合タンパク質としてＤＮＡ結合ドメ
インを有する発現ペプチドによって提供される点で、ファージディスプレイ法と
は異なる。

【００８８】 （（３）コードされた合成ライブラリー法） さらなる方法は、コードされた合成ライブラリー法（「ＥＳＬ」）と呼ばれる
。米国特許第５，６３９，６０３号；ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９３／０６１
２１、ＷＯ９４／０８０５１、ＷＯ９５／３５５０３およびＷＯ９５／３０６４
２（これらの各々が、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される）
を参照のこと。この方法において、ライブラリーにおける異なる化合物が、これ
らの化合物の種々の成分をカップリングのいくつかの回において段階的に添加す
ることによって、別の支持体（例えば、ビーズ）に付着して合成される。カップ
リングの回は、異なる反応容器間で支持体を割り当て、そして異なる成分を、異
なる反応容器内の支持体に添加することによって、実施され得る。反応容器に添
加される特定の成分が、この支持体に第二の部位でタグ成分を添加することによ
り、記録される。タグ成分は、オリゴヌクレオチドまたは他の標識であり得る。
オリゴヌクレオチドが使用される場合には、対応するタグおよび化合物は、代表
的に、遺伝子コード以外の対応レジメンにより関連付けられる。合成の各回の後
に、同じ反応容器からの支持体を、異なる反応容器間に割り当て得、そして／ま
たは合成の次の回において、別の反応容器からの支持体でプールされ得る。合成
のいずれかの回において、そして通常は全ての回において、支持体に添加される
成分は、支持体の第二の部位においてさらなるタグ成分を添加することによって
、記録され得る。合成のいくつかの回の後に、異なる化合物の大きなライブラリ
ーが生成し、ここで、化合物の識別は、その化合物を保有するそれぞれの支持体
に付着したタグにコードされる。このライブラリーを、標的に対する結合に関し
てスクリーニングし得る。ＥＳＬ法を使用して、成分ごとの様式で合成され得る
ペプチドを含む、任意の化合物のライブラリーを生成し得る。

【００８９】 上記選択技術を使用して、例えば、心臓脈管内皮、虚血性の心臓脈管内皮、末
梢脈管内皮、および虚血性の抹消脈管内皮を、標的化し得る。末梢脈管内皮は、
心臓および肢の外側の器官において、見出される。

【００９０】 （（Ｂ）好ましい標的化分子） 本発明の好ましい標的化分子は、上に記載されそして以下で参照される、イン
ビボでのパニング手順を使用して、ＧＧＧＶＦＷＱ、ＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶ
ＴＳＳ、ＣＬＨＲＧＮＳＣ、およびＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣからなる群から選
択される、アミノ酸配列を含む。ＧＧＧＶＦＷＱ、ＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶＴ
ＳＳ、およびＣＬＨＲＧＮＳＣのペプチドは、正常な心臓内皮に選択的に結合す
る。より具体的には、ＧＧＧＶＦＷＱペプチドは、正常な心臓脈管に対して５倍
の濃縮を示し、一方でＨＧＲＶＲＰＨ、ＶＶＬＶＴＳＳ、ＣＬＨＲＧＮＳＣのペ
プチドは、正常な心臓血管に対して２倍の濃縮を示した。ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲ
ＳＣペプチドは、虚血性心筋層に対して５倍の濃縮を示した。これらのペプチド
が同定された方法、およびこれらの特性の詳細は、本願と同日に出願されたＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ． ［Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆ Ｆｌｏｒｅｓ ＬＬＰ代理人文書番
号Ｐ−ＬＪ３５１２］に記載され、この出願は、特に本明細書中に参考として援
用される。

【００９１】 （（Ｃ）脈管形成因子成分の選択／調製） 脈管形成因子は、前出に記載される。例示的な脈管形成因子としては、ＶＥＧ
Ｆポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。例示的なＶＥＧＦポリペ
プチドである、ＶＥＧＦ−Ｂは、単離され、クローニングされ、そして配列決定
された。Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、米国特許第５，８４９，６９３号を参照のこと；
この参考文献およびこれに引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用
される。現在、ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生成するＶＥＧＦ−Ｂの
２つのアイソフォームが、区別されている（Ｇｒｉｍｍｏｎｄら、１９９６；Ｏ
ｌｆｓｓｏｎら、１９９６ｂ；Ｔｏｗｎｓｏｎら、１９９６；これらの参考文献
およびこれらに引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用され
る）。これら２つの分泌形態のＶＥＧＦ−Ｂは、それぞれ１６７（ＶＥＧＦ−Ｂ ₁₆₇ ）および１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆）のアミノ酸残基を有する。

【００９２】 ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアイソフォームは、それぞれ見かけ
の分子量２１ｋＤおよび３２ｋＤの、ジスルフィド連結したホモダイマーとして
生成する（Ｏｌｏｆｓｓｏｎら、１９９６）。

【００９３】 一旦、ＶＥＧＦポリペプチドが選択されるか、設計されるか、またはさもなけ
れば提供されると、ＶＥＧＦポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡが合成
される。ＶＥＧＦタンパク質をコードするＤＮＡの合成および発現の例示的な方
法は、以下および実施例に記載される。次いで、ＶＥＧＦキメラポリペプチドま
たはそれをコードするポリヌクレオチドを使用して、脈管増殖を誘導し得る。

【００９４】 ＶＥＧＦタンパク質およびこのようなＶＥＧＦタンパク質をコードする核酸を
、組換え遺伝学の分野において慣用的な技術を使用して、作製し得る。本発明に
おける使用の一般的な方法を開示する、基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）が挙げられる；これ
らの参考文献およびこれらにおいて引用される全ての参考文献は、本明細書中に
参考として援用される。さらに、本質的にあらゆる核酸を、任意の種々の市販の
供給源からあつらえて注文し得る。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種々
の市販の供給源からあつらえて注文し得る。

【００９５】 選択した脈管形成タンパク質をコードする核酸は、代表的に、例えばＫ_dを決
定するために、複製および／または発現のために、原核生物細胞または真核生物
細胞内への形質転換のために、中間体ベクターにクローニングされ得る。中間体
ベクターは、代表的に、脈管形成タンパク質をコードする核酸の貯蔵もしくは操
作のため、またはタンパク質の産生のためには、原核生物ベクター（例えば、プ
ラスミド）、またはシャトルベクターであるか、あるいは昆虫ベクターである。
脈管形成タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞（好ましくは
、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞
への投与のために、代表的に、発現ベクターにクローニングされ得る。

【００９６】 クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、キメラ脈管形成タ
ンパク質は、代表的に、転写を指向するためのプロモーターを含む発現ベクター
にサブクローニングされ得る。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモー
ターは、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎ
ｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９
０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）に記載される；これらの参考文献
およびこれらにおいて引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援
用される。脈管形成タンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａ
ら、Ｇｅｎｅ Ｉ（１９８３）２２：２２９−２３５）において利用可能である
。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、
および昆虫細胞のための、真核生物発現系は、当該分野において周知であり、そ
してまた市販されている。

【００９７】 キメラ脈管形成タンパク質核酸の発現を指向するために使用されるプロモータ
ーは、特定の応用に依存する。例えば、強力な構成的プロモーターは、代表的に
、脈管形成タンパク質の発現および精製のために、使用され得る。対照的に、脈
管形成タンパク質が遺伝子調節のためにインビボで投与される場合には、その脈
管形成タンパク質の特定の使用に依存して、構成的プロモーターまたは誘導的プ
ロモーターのいずれかが使用され得る。プロモーターはまた、代表的に、トラン
ス活性化を担うエレメント（例えば、低酸素症応答エレメント、Ｇａｌ４応答エ
レメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、および低分子コントロール系（
例えば、ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系））を含み得る（例えば、Ｇｏｓｓ
ｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．（１９９２）８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１
９９８）５：４９１−４９６；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９７）
４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８８：１１４
７−１１５５；ならびにＲｅｎｄａｈｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８
）１６：７５７−７６１を参照のこと）。

【００９８】 プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、原核生物または真核生物
のいずれかの宿主細胞において、核酸の発現のために必要とされる全てのさらな
るエレメントを含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。従って、代表的
な発現カセットは、例えば、脈管形成タンパク質をコードする核酸配列に作動可
能に連結されたプロモーター、および例えば、転写、転写終止、リボソーム結合
部位、または翻訳終止の効率的なポリアデニル化のために必要とされるシグナル
を含む。カセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、およ
び異種のスプライシングされたイントロンシグナルが挙げられ得る。

【００９９】 遺伝情報を細胞内に移送するために使用される特定の発現ベクターは、脈管形
成タンパク質の意図された使用（例えば、植物、動物、細菌、真菌、および原生
動物における発現）に関して、選択され得る。標準的な細菌発現ベクターとして
は、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミドのようなプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２
３Ｄ、および市販の融合発現系（例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺ）が挙げられる
。これらの融合タンパク質を、脈管形成タンパク質の精製のために使用し得る。
エピトープタグもまた、組換えタンパク質に添加されて、発現をモニタリングす
るため、ならびに細胞および細胞下の局在化をモニタリングするために、好都合
な単離方法を提供し得る。

【０１００】 真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば、真
核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター
、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他
の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ⁺、ｐＭＴ
Ｏ１０／Ａ⁺、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ
４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、
ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために効果的で
あることが示された他のプロモーターの指向のもとでの、タンパク質の発現を可
能にする、他の任意のベクターが挙げられる。

【０１０１】 いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされる細胞株（例えば、チミジ
ンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロフ
ォレートレダクターゼ）を選択するための、マーカーを有する。高収率の発現系
（例えば、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモ
ーターの指向の元で、脈管形成タンパク質コード配列を有するバキュロウイルス
ベクターを昆虫細胞において使用すること）もまた、適切である。

【０１０２】 発現ベクターに代表的に含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機
能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能するための、抗
生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするための、
プラスミドの本質的でない領域における独自の制限部位を含む。

【０１０３】 標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する
細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を生成し、次いでこ
れらを、標準的な技術を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４；１７６１９−１７６２２；Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照のこ
と）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換を、標準的な技術に従って実
施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９７７）１３２：３４
９−３５１；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８
３）を参照のこと）。

【０１０４】 （（Ｄ）脈管形成因子成分への標的化成分のカップリング） 本発明のキメラ分子は、少なくとも２つの成分を含む：機能的脈管形成因子お
よび標的化分子。この機能的脈管形成因子は、例えば、内皮細胞上の脈管形成因
子レセプターを結合するか、または特定の様式で標的組織に影響を与える配列を
含む、アミノ酸配列またはポリペプチド配列を含み得る。この標的化分子は、１
つ以上の型の脈管内皮細胞に結合する、アミノ酸配列またはポリペプチド配列を
含み得る。機能的脈管形成因子であるアミノ酸配列は、脈管形成因子レセプター
のリガンド結合ドメインであり得る；標的化分子であるアミノ酸配列は、細胞表
面レセプターに結合し得、従って細胞表面レセプターリガンドであり得る。

【０１０５】 選択された物質が、血液、リンパ、または細胞外流体の通常存在する成分であ
る場合には、脈管形成因子レセプターを結合するリガンド結合ドメインは、通常
は脈管形成因子レセプターを結合する（すなわち、ヒトにおいて選択された脈管
形成因子レセプターを結合する）アミノ酸配列である。このような配列の、改変
された結合特性を有する改変された形態、または通常はヒトにおいて見出されな
いアミノ酸配列であって、合成的操作もしくは遺伝子操作の方法によって生成さ
れ、そして選択された脈管形成因子レセプターを結合し得る、アミノ酸配列。例
えば、脈管形成因子および／または標的化分子は、コンビナトリアルペプチドラ
イブラリーまたはファージディスプレイライブラリーから選択された、アミノ酸
配列であり得る。脈管形成因子および／または標的化分子はまた、免疫グロブリ
ンまたは一本鎖抗体の抗原結合ドメインを含み得、ここで、この免疫グロブリン
または一本鎖抗体の抗原結合ドメインは、所望の選択された物質または細胞表面
レセプターを認識する。選択された物質が外来の成分である場合には、選択され
た物質を結合するアミノ酸配列は、天然に存在するリガンド結合ドメインから選
択されたものであり得、これは、外来の成分、または外来の成分を結合するよう
設計されたアミノ酸配列を、結合する。

【０１０６】 このキメラタンパク質のドメインは、得られるキメラタンパク質が脈管内皮増
殖因子レセプターと標的化分子レセプターとの両方を結合し得る限り、種々の構
造で連結し得る。１つの構造は、融合タンパク質の形態であり得る。「融合タン
パク質」とは、第二のドメインに関連する少なくとも１つのポリペプチドまたは
ペプチドドメインを含む、組成物をいう。第二のドメインは、ポリペプチド、ペ
プチド、多糖類などであり得る。「融合」は、ペプチド結合、化学結合、電荷相
互作用（例えば、塩橋、水素結合のような静電引力）、非共有結合相互作用など
により発生する会合であり得る。ポリペプチドが組換えられる場合には、「融合
タンパク質」は、共通のメッセージから翻訳され得る。あるいは、ドメインの組
成は、任意の化学的または静電的手段により、連結され得る。本発明の融合タン
パク質はまた、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、
分泌シグナルなどを含み得る。

【０１０７】 代表的に、これら２つのドメインは、組換えＤＮＡ分子内の単一のリーディン
グフレームによりコードされ、そしてこれら２つのドメインは、ペプチド結合に
より連結される。これら２つのドメインは、同様にオープンリーディングフレー
ムによりコードされ得る、１つ以上のアミノ酸により分離され得る。あるいは、
これら２つのドメインは、別のＤＮＡ分子から発現され得、そして非共有結合（
例えば、疎水性またはイオン性相互作用）あるいは共有結合（例えば、ジスルフ
ィド）のいずれかを介してインビトロまたはインビボで連結される。さらに、生
物学的に活性なペプチドダイマーを生成するための方法が記載された。例えば、
ＥＰ ０７２１９８３ Ａ１を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援
用される）。

【０１０８】 （３．）キメラ分子の処方および投与：薬学的組成物 （Ａ）タンパク質を基礎にした治療 本発明の新脈管形成因子キメラ分子は、代表的には、薬学的に受容可能なキャ
リア（賦形剤）と組み合わせて薬理学的組成物を形成し得る。薬学的に受容可能
なキャリアは、例えば、本発明の薬学的組成物を安定化するか、またはその吸着
またはクリアランス速度を増加または減少するために作用する生理学的に受容可
能な化合物を含み得る。生理学的に受容可能な化合物は、例えば、グルコース、
スクロース、またはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグル
タチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチドまたは
ポリペプチド複合体のクリアランスまたは加水分解を減少する組成物、または賦
形剤もしくはその他の安定化剤および／または緩衝剤を含み得る。界面活性剤も
また、薬学的組成物を安定化するため、またはその吸着を増加または減少するた
めに用いられ得る。例示の界面活性剤はリポソームキャリアを含み、後述を参照
のこと。ペプチドおよびポリペプチドのための薬学的に受容可能なキャリアおよ
び処方物は当業者に公知であり、そして科学的および特許文献中に詳細に記載さ
れている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、前述、およびＢａｎｇａ、Ａ．Ｋ
．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｍｓ（１９９６）（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ
、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照のこと；これらの参考文献およ
びこれらの中で引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される。

【０１０９】 その他の生理学的に受容可能な化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤または微生
物の増殖または作用を防ぐために特に有用である保存剤を含む。種々の保存剤が
周知であり、そして例えば、フェノールおよびアスコルビン酸を含む。当業者は
、生理学的に受容可能な化合物を含む薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例
えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドの投与の経路およびその特定の生
理化学的特徴に依存することを認識する。

【０１１０】 （１）腸、非経口または経粘膜投与のための水性溶液 投与のための組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリア、組成物が水溶
性である場合、好ましくは水性キャリア中に溶解された、本発明のペプチドまた
はポリペプチドの溶液を含む。腸、非経口または経粘膜薬物送達のための処方物
で用いられ得る水性溶液の例は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食
塩水、ハンクス溶液、リンゲル溶液、デキストロース／生理食塩水、グルコース
溶液などを含む。これら処方物は、ほぼ生理学的条件に必要な、緩衝化薬剤、浸
透圧調節剤、湿潤剤、界面活性剤などのような、薬学的に受容可能な補助物質を
含み得る。添加物はまた、静菌剤、または安定化剤のような付加的な活性成分を
含み得る。例えば、溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム
、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートまたはトリエタノ
ールアミンオレアートを含み得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法に
より滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られる水性溶液は、そのまま
で使用のためにパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された
調製物は、投与の前に滅菌水性溶液と組み合わせられる。これらの処方物中のキ
メラ分子の濃度は広く変化し得、そして選択された投与の特定の様式および患者
の必要に従って、主に流体容積、粘度、体重などに基いて選択される。

【０１１１】 （２）腸送達のための固形処方物 固形処方物が腸（経口）投与のために用いられ得る。これらは、例えば、ピル
、タブレット、粉末またはカプセルとして処方され得る。固形組成物には、従来
の非毒性固形キャリアが用いられ得、これには、例えば、薬学的グレードのマン
ニトール、乳糖、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含
まれる。経口投与には、薬学的に受容可能な非毒性組成物が、先に列挙したキャ
リアのような任意の通常採用される賦形剤、およびほぼ１０％〜９５％の活性成
分（キメラ分子）を取り込むことにより形成される。非固形処方物もまた腸投与
のために用いられ得る。キャリアは、石油、動物、植物または合成起源の、例え
ば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む種々の油から選択され得る
。適切な薬学的賦形剤は、例えば、スターチ、セルロース、タルク、グルコース
、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、
ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステア
レート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコ
ール、水、エタノールなどを含む。

【０１１２】 本発明のキメラ分子が、経口投与されるとき、消化から保護されなければなら
ないことが認識される。これは、代表的には、ペプチドまたはポリペプチド複合
体を、それを酸性かつ酵素的加水分解に耐性にするために、組成物と複合体化す
ることによるか、またはリポソームのような適切に耐性であるキャリア中にペプ
チドまたは複合体をパッケージングすることのいずれかにより達成され得る。化
合物を消化から保護する手段は当該分野で周知である。例えば、Ｆｉｘ Ｐｈａ
ｒｍ Ｒｅｓ．（１９９６）１３：１７６０−１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ Ｊ．
Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）４８：１１９−１３５；治療剤
の経口送達のための脂質組成物を記載する米国特許第５，３９１，３７７号（リ
ポソーム送達は後述にさらに詳細に論議される）を参照のこと。

【０１１３】 （３）経皮／経粘膜送達のための局所処方物 全身投与もまた、経粘膜または経皮手段によってであり得る。経粘膜または経
皮投与のために、透過されるバリアに適切な浸透剤が処方剤中に用いられ得る。
このような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与
のために、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、界面活性剤を
用いて透過を促進し得る。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐薬を用いることによ
ってであり得る。例えば、Ｂａｎｇａ、第１０章；Ｓａｙａｎｉ「吸収性粘膜を
横切るペプチドおよびタンパク質の全身送達」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９９６）１３：８５−１８４を参照の
こと。局所的、経皮投与には、薬剤は、軟膏剤、クリーム、軟膏、粉末およびゲ
ル中に処方され得る。経皮送達システムはまた、例えば、パッチを含み得る。例
えば、Ｂａｎｇａ、第９章を参照のこと。

【０１１４】 ペプチドおよびポリペプチド複合体また、持続送達または持続放出機構で投与
され得、これは、処方物を内部的に送達し得る。例えば、組成物（例えばキメラ
分子）を持続送達し得る、生分解性マイクロスフェアまたはカプセルまたはその
他の生分解性ポリマー形態が本発明の処方物中に含められ得る（例えば、Ｐｕｔ
ｎｅｙ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：１５３−１５７を
参照のこと）。

【０１１５】 （４）吸入送達のための処方物 吸入には、ペプチドまたはポリペプチドは、当該分野で公知の任意のシステム
を用いて送達され得、これには、乾燥粉末エアロゾル、液体送達システム、エア
ージェット噴霧器、噴霧剤システムなどが含まれる。例えば、Ｐａｔｔｏｎら、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）１６：１４１−１４３；例えば、Ｄｕ
ｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｒａ
ｄｉｇｍ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、Ａｅｒｏｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ
、ＣＡ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ
Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）などによるポリペプチド高分子のための産物および吸入送
達システムを参照のこと。

【０１１６】 例えば、薬学的処方物は、エアロゾルまたはミストの形態で投与され得る。エ
アロゾル投与のためには、処方物は、界面活性剤および噴霧剤とともに微細に分
割された形態で供給され得る。好ましくは、界面活性剤は噴霧剤に可溶性である
。このような薬剤の代表は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステアリン酸およびオレイン
酸のような６〜２２炭素原子を含む脂肪酸の、脂肪族多水酸基アルコールまたは
その環状無水物（例えば、エチレングリコール、グリセロール、エリスリトール
、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトール由来のヘキシトー
ル無水物）とのエステルまたは部分エステル、およびこれらエステルのポリオキ
シエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体である。混合または天然グリセリ
ドのような混合エステルが採用され得る。界面活性剤は、組成物の０．１重量％
〜２０重量％、好ましくは０．２５重量％〜５重量％を構成し得る。処方物の残
りは通常噴霧剤である。代表的には、液化性噴霧剤は、周囲温度でガスであり、
そして圧力下で濃縮されている。適切な液化性噴霧剤は、ブタンおよびプロパン
のような５つまでの炭素を含む低級アルカン；および好ましくはフッ化アルカン
またはフルオロ塩素化アルカンである。上記の混合物もまた採用され得る。エア
ロゾルを生成することにおいて、適切なバルブを装着した容器に、微細に分割さ
れた化合物および界面活性剤を含む適切な噴霧剤で充填する。従って、成分は、
バルブの作用により放出されるまで高圧に維持される。例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：１８６８−１８７１を参照のこと。

【０１１７】 別の実施形態では、呼吸組織に処方物を送達するためのデバイスは、処方物が
気化する吸入器である。その他の液体送達システムは、例えば、空気ジェット噴
霧器を含む。

【０１１８】 （５）その他の処方物 本発明の医薬を調製することで、種々の処方物の改変を用い得、そして薬物動
態学および生体内分布を改変するために操作され得る。薬物動態学および生体内
分布を改変するための多くの方法が当業者に公知である。このような方法の例は
、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム、以下を参照のこと）、炭水化物、ま
たは合成ポリマー（上記で論議）のような物質から構成されるベシクル中の複合
体の保護を含む。薬物動態学の一般的な論議については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ、第３７−３９章、またはＢａｎｇａ、第６章を参照のこと。またＬ
ｅｅ、Ｐ．Ｉ．Ｄ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ １９９６）を参照の
こと。

【０１１９】 （６）送達の経路 本発明の方法で用いられるペプチドおよびポリペプチド複合体は、当該分野で
公知の任意の手段、例えば全身的、領域的、または局所的に；動脈内、くも膜下
腔内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、筋肉内注射、非経口的、胸腔内、局所、経口、
または局所投与により、皮下、気管内（例えばエアロゾルにより）または経粘膜
（例えば、頬、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）として、単独または薬学的組成
物として送達され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業
者に公知または明らかであり、そして科学的文献および特許文献に詳細に記載さ
れている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓまたはＢａｎｇａを参照のこと。投
与の特に好適な様式は、特に例えば、特定器官（例えば、脳およびＣＮＳ（例え
ば、Ｇｕｒｕｎ Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ．（１９９７）８５：３１７−３２
３を参照のこと）および心臓）に焦点をあてるために、「領域効果」を有するこ
とが所望されるとき、動脈内、筋肉内注射またはくも膜下腔内（ＩＴ）注射を含
む。例えば、本発明のペプチドまたはポリペプチド複合体を脳に直接送達するこ
とが所望される場合、頸動脈内注射が好適である。高い全身用量が必要である場
合、非経口的投与が送達の好適な経路である。経口耐性を誘導するペプチドの投
与が治療目的である場合、腸投与が好適な方法である。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９：１０３６−１０４４；Ｋｅｎｔ
Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９７）８１５：４１２−４２２を参照
のこと。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に
公知または明らかであり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、Ｂａｎｇ
ａ第７章に詳細に記載されている。また、Ｂａｉ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９９７）８０：６５−７５；Ｗａｒｒｅｎ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ
．（１９９７）１５２：３１−３８；Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（
１９９７）１８６：５０７−５１５もまた参照のこと。

【０１２０】 （７）治療養生法：薬物動態学 薬学的組成物は、投与の方法に依存して種々の単位投与量形態で投与され得る
。代表的なペプチドおよびポリペプチド薬学的組成物の投与量は、当業者に周知
である。代表的には、このような投与量は、事実上熟慮され、そして特定の治療
内容、患者耐性などに依存して調節される。これを達成するために適切なキメラ
分子の量は、「治療的に有効な用量」として規定される。投与量スケジュールお
よびこの使用に有効な量、すなわち「用量養生法」は、種々の因子に依存し、こ
れには、疾患または症状の段階、疾患または症状の重篤度、患者の健康の一般的
状態、患者の肉体的状態、年令、活性薬剤の薬学的処方物および濃度などが含ま
れる。患者のための投与量養生法を算出するには、投与の様式もまた考慮される
。投与量養生法はまた、薬物動態学、すなわち、薬学的組成物の吸収速度、生物
学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮しなければならない。例えば、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｅｇｌｅｔｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（１９９７）１８：１
４３１−１４３９；Ｌａｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２
７−１５３３を参照のこと。

【０１２１】 治療適用には、組成物は、虚血疾患を患う患者に、疾患および／またはその合
併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するに十分な量で投与される。これを
達成するに適切な量は、「治療的に有効な用量」として規定される。この使用の
ために有効な量は、疾患の重篤度、患者の健康の一般的状態，投与の頻度および
経路、臨床医の判断などに依存する。

【０１２２】 投与量は、症状の寛解または軽減を評価することによるか、または血液または
組織病理学的標本の分析のような客観的基準によって、経験的に決定され得る。
従って、本発明の組成物は、疾患の進行を阻止するため、およびこれらまたはそ
の他の症状の発症、頻度または重篤度を低減するために投与される。

【０１２３】 本発明のペプチドおよび複合体を含む薬学的組成物は、単独またはその他の治
療処置と組み合わせて投与され得る。組成物の単回または複数投与は、患者に必
要であって、かつ患者が耐える投与量および頻度に依存して投与され得る。

【０１２４】 （８）リポソーム処方物 本発明は、キメラ分子が脂質単層または二重層中に取り込まれている処方物の
ための医薬品を提供する。本発明はまた、水可溶性ペプチドまたは複合体が単層
または二重層の表面に付着した処方物を提供する。例えば、ペプチドは、ヒドラ
ジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソ
ーム（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９５
）６：７０５−７０８を参照のこと）に付着され得る。リポソームまたはインタ
クト細胞（例えば、赤血球細胞）の平面状脂質膜または細胞膜のような任意の形
態の脂質膜が用いられ得る。リポソーム処方物は、任意の手段によってであり得
、これには、静脈内、経皮的（例えば、Ｖｕｔｌａ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．
（１９９６）８５：５−８）、経粘膜的、または経口投与が含まれる。本発明は
また、本発明のペプチドおよび／または複合体がミセルおよび／またはリポソー
ム内に取り込まれる薬学的調製物を提供する（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９４）４６：２３−２８；Ｗｏｏｄｌｅ
Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９２）９：２６０−２６５を参照のこと）。

【０１２５】 リポソームおよびリポソーム処方物は、標準的方法に従って調製され得、そし
て当該分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ
Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（１９９５）１：１９７−２１０；Ａ
ｌｖｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９５）１４５：５−３１；Ｓｚｏ
ｋａ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８０）９：４６
７、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８
３７，０２８号；これらの参考文献およびこれらの中で引用されるすべての参考
文献は参考として本明細書中に援用される、を参照のこと。１つの実施形態では
、代表的には、本発明のリポソームは、リポソームの表面上に位置するキメラ分
子複合体を、この複合体が内皮細胞上のレセプターとの相互作用に利用可能であ
るような様式で含む。米国特許第５，８７６，７４７号は、優先的に心臓および
骨格筋までたどるリポソームを記載し、そして参考として本明細書中に援用され
る。

【０１２６】 リポソーム荷電は、血液からのリポソームクリアランスにおける重要な決定因
子であり、負に荷電したリポソームは、網膜内皮系によってより迅速に摂取され
（Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
（１９７５）６３：６５１）、そしてそれ故、血流中でより短い半減期を有する
。ホスファチジルエタノールアミン誘導体を取り込むことは、リポソーム凝集を
防ぐことによって循環時間を増大する。例えば、Ｎ−（オメガ−カルボキシ）ア
シルアミド−ホスファチジルエタノールアミンを、Ｌ−α−ジステアロイルホス
ファチジルコリンの大きな単層のベシクル中への取り込みは、インビボリポソー
ム循環寿命を劇的に増大する（例えば、Ａｈｌ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３２９：３７０−３８２を参照のこと）。延長した
循環半減期を有するリポソームは、代表的には、治療および診断使用に所望され
る。例えば、血流中で、８、１２時間から、または２４時間まで維持され得るリ
ポソームは、本発明の特に好適な実施形態である。

【０１２７】 代表的には、リポソームは、約５〜１５モル％の負に荷電した、ホスファチジ
ルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールのよ
うなホスホリピドを用いて調製される。ホスファチジルグリセロールのような、
付加された負に荷電したホスホリピドはまた、自発的なリポソーム凝集を防ぐた
めに供され、そしてそれ故小型のリポソーム凝集物形成のリスクを最小にする。
スフィンゴミエリンまたは飽和中性ホスホリピドのような膜剛直化剤は、少なく
とも約５０モルパーセント、および５〜１５モルパーセントのモノシアリルガン
グリオシドの濃度で、米国特許第４，８３７，０２８号に一般に記載されるよう
に、血流中のリポソーム調製物の増大した循環を提供し得る。

【０１２８】 さらに、リポソーム懸濁液は、貯蔵に際しフリーラジカルおよび脂質過酸化損
傷に対して脂質を保護する脂質保護薬剤を含み得る。αトコフェロールおよびフ
ェリオキシアニンのような水溶性鉄特異的キレート剤のような親油性フリーラジ
カル失活剤が好適である。

【０１２９】 本発明の処方物は、異質サイズの多層ベシクルを含み得る。この方法では、ベ
シクル形成性脂質は、適切な有機溶媒または溶媒系中に溶解され、そして真空下
または不活性ガス下で乾燥され、薄い脂質膜を形成する。所望であれば、この膜
は、第三級ブタノールのような適切な溶媒中に再溶解され得、次いで凍結乾燥さ
れてより容易に水和された粉末様形態にあるより均質な脂質混合物を形成する。
この膜は、ペプチドまたはポリペプチド複合体の水性溶液でカバーされ、そして
代表的には、１５〜６０分間に亘る攪拌により水和される。得られる多層ベシク
ルのサイズ分布は、より激しい攪拌条件下で脂質を水和することによるか、また
はデオキシコレートのような可溶化界面活性剤を添加することによって、より小
さいサイズに向かってシフトされ得る。この水和媒体は、最終リポソーム懸濁液
中のリポソームの内部容量において所望される濃度で、ペプチドまたは複合体を
含む。代表的には、この薬物溶液は、緩衝化生理食塩水溶液中に、１０〜１００
ｍｇ／ｍｌの本発明のペプチドまたは複合体を含む。

【０１３０】 リポソーム調製に続いて、リポソームは、所望のサイズ範囲および比較的狭い
リポソームサイズの分布を達成するようにサイズ決めされる。１つの好ましいサ
イズ範囲は、約０．２〜０．４ミクロンであり、これは、従来のフィルター（典
型的には、０．２２ミクロンフィルター）を通して濾過することにより、リポソ
ーム懸濁液の滅菌を可能にする。このフィルター滅菌法は、リポソームが、約０
．２〜０．４ミクロンまでサイズダウンされる場合、高出量基準に基づいて実施
される。いくつかの技術は、所望のサイズにリポソームをサイズ決めするために
利用可能である（例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと）。バ
ス式またはプローブ式超音波処理手順のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音
波処理は、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さな単層ベシクルまでの漸減性
サイズ調節を生じる。ホモジナイゼーションは、大きなリポソームをより小さな
リポソームに分画するための剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的
なホモジナイゼーション手順において、多層状ベシクルが、選択されたリポソー
ムサイズ（典型的には、約０．１と０．５ミクロンとの間）が観察されるまで、
標準の乳濁ホモジナイザーを介して再循環される。両方の方法において、粒子サ
イズ分布は、従来のレーザービーム粒子サイズ分解によりモニターされ得る。小
孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通すリポソームの押し出しは
また、リポソームサイズを比較的良好に規定されたサイズ分布に減縮するための
有効な方法である。典型的に、懸濁液は、所望のリポソームサイズ分布が達成さ
れるまで、１回以上、その膜を通して循環される。このリポソームは、より小さ
な孔の膜を連続的に通して押し出され得、リポソームサイズの漸進的減少を達成
する。

【０１３１】 最も効率的な封入方法の下でさえも、初めにサイズ決めされたリポソーム懸濁
液は、遊離（カプセル化されてない）形態の５０％以上までの複合体を含み得る
。いくつかの方法は、特定の処方が所望される場合、リポソーム懸濁液から補足
されていない化合物を除去するために利用可能である。１つの方法では、懸濁液
中のリポソームは、高速遠心により叩きつけられ、懸濁液中の遊離化合物および
非常に小さいリポソームを残す。別の方法は、限外濾過、次いで濃縮したリポソ
ームを置換媒体中に再懸濁することにより懸濁液を濃縮する工程を包含する。あ
るいは、ゲル濾過は、大きなリポソーム粒子を溶質分子から分離するために使用
され得る。この処理に続いて、リポソーム懸濁液は、例えば、静脈内投与、腹腔
内（ＩＰ）投与、経皮的投与、または経粘膜投与における使用のための所望の濃
度にされ得る。この方法は、リポソームが、例えば、遠心もしくは超遠心により
濃縮されている場合、適切な容積の適切な媒体中にリポソームを再懸濁すること
を含み、または薬物除去工程が、総懸濁液容積を増加する場合、懸濁液の濃縮を
含む。次いで、この懸濁液は、上記のように濾過により滅菌される。ペプチドま
たはキメラ分子を含むこれらのリポソームは、例えは、投与の様式、送達されて
いる薬物、処置されている特定の疾患に従って変化する容量で非経口的にかまた
は局所的に投与され得る。

【０１３２】 ミセルは、非極性領域を有する分子の溶解性を増加するために、当該分野にお
いて通常使用される。従って、当業者は、ミセルが、本発明の組成物において有
用であることを認識する。本発明の複合体を含むミセルは、当該分野において周
知である方法に従って調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ第２０章を
参照のこと）。本発明のペプチドおよび／または複合体を含むミセルは、典型的
に標準的な界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）または界面活性剤（ｄｅｔｅｒ
ｇｅｎｔ）を使用して調製される。ミセルは、水溶液中で、界面活性剤（疎水性
部分および１つ以上のイオン性さもなくば強力な親水性基を含む分子）により形
成される。固体界面活性剤の濃度が増加するにつれて、空気／水またはガラス／
水の界面に吸着されるその単分子膜は、密にパッキングされるようになるので、
さらなる占有率は、既に２つの単分子膜である界面活性剤分子の過剰の圧力を必
要とする。その濃度を超える溶解した界面活性剤の量のさらなる増加は、新たな
分子をミセルに凝集するに等しい量を引き起こす。適切な界面活性剤としては、
ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オク
タオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクトキシノール９および
ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７（登録商標）（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。好ましい界面活性剤は、静脈内（ＩＶ）
注射と両立し得る非イオン性ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン界
面活性剤（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７（登録商標）、ｎ−オクチル
−α−Ｄ−グルコピラノシドなど）である。リン脂質（例えば、リポソームの作
製における使用について記載されるリン脂質）はまた、ミセル形成のために使用
され得る。混合ミセルは、共通の界面活性剤またはリン脂質およびサブユニット
の存在下で形成され得る。本発明の混合ミセルは、サブユニット、リン脂質およ
び／または界面活性剤の任意の組み合わせを含み得る。従って、ミセルは、サブ
ユニットおよび界面活性剤、リン脂質および界面活性剤の両方と組み合わされた
サブユニット、またはサブユニットおよびリン脂質を含み得る。

【０１３３】 （（Ｂ）核酸ベースの治療法） 概して述べると、遺伝子治療ベクターは、それが移入された哺乳動物細胞に対
する医学的に有用な表現型効果を生じる外来性ポリヌクレオチドである。ベクタ
ーは、複製起点を有してもよいし有さなくてもよい。例えば、ベクター中に複製
起点を含むことは、患者への投与の前のベクターの増殖のために有用である。し
かし、複製起点は、そのベクターが宿主染色体ＤＮＡに組み込まれるか、または
宿主ｍＲＮＡまたはＤＮＡと結合するように設計されている場合、しばしば投与
の前に除去され得る。遺伝子治療において使用されるベクターは、ウイルス性ま
たは非ウイルス性であり得る。ウイスルベクターは、通常、患者にウイルスの構
成要素として導入される。非ウイルス性ベクター（典型的には、ｄｓＤＮＡ）は
、裸のＤＮＡとしてまたは移入増強ビヒクル（例えば、レセプター認識タンパク
質、リポアミン、またはカチオン性脂質）に付随して移入され得る。

【０１３４】 （（１）ウイスルベースの方法） ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウ
イルスおよびヘルペスウイルス）は、しばしば２つの構成要素（修飾ウイルスゲ
ノムおよびそれを取り囲むコート構造）からなる（一般的には、Ｓｍｉｔｈら、
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）４９，８０７−８３８を参
照のこと；この参考文献およびそこに引用される全ての参考文献は、本明細書中
で参考として引用される。）が、ウイルスベクターは時々、裸の形態またはウイ
ルスタンパク質ではないタンパク質でコートされて導入される。最も最近のベク
ターは、野生型ウイルスと同様のコート構造を有する。この構造は、ウイルス核
酸をパッケージおよび保護し、そして標的細胞に結合しそして侵入する手段を提
供する。しかし、遺伝子治療のために設計されたベクター中のこのウイルス核酸
は、多くの方法で変化される。これらの変化の目的は、利用可能なパッケージン
グ細胞またはヘルパー細胞においてベクター形態を増殖するその能力を維持して
いる間、標的細胞中でウイルスを増殖不能にすること、外来性ＤＮＡ配列の挿入
のための空間をウイルスゲノム内に提供すること、および目的の遺伝子をコード
する新たな配列を組み込みそしてその適切な発現を可能にすることである。従っ
て、ベクターの核酸は、一般に、以下の２つの構成要素を含む：ヘルパー系統中
に複製しそしてパッケージングするために必須のシス作動性ウイルス配列および
外来性遺伝子のための転写ユニット。他のウイルス機能は、特異的なパッケージ
ング細胞系統またはヘルパー細胞系統中にトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）発現
される。

【０１３５】 （（ａ）レトロウイルス） レトロウイルスは、ウイルスゲノムとして一本鎖ＲＮＡを含む大きなクラスの
エンベロープウイルスを含む。正常なウイルスのライフサイクルの間、ウイルス
ＲＮＡは、逆転写され、宿主ゲノム中に組み込まれそして長期間発現される二本
鎖ＤＮＡを生じる。結果として、感染された細胞は、宿主細胞への明確な傷害を
伴わずに連続してウイルスを減少する。ウイルスゲノムは、小さく（およそ１０
ｋｂ）、そしてそのプロトタイプの組織は、極度に単純であり、ｇａｇ（抗原ま
たはコアタンパク質に特異的な群）；ｐｏｌ（逆転写トランスクリプターゼ）；
およびｅｎｖ（ウイルスエンベロープタンパク質）をコードする３つの遺伝子を
含む。ＲＮＡゲノムの末端は、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれ、そしてプロモ
ーターおよびエンハンサーの活性および組み込みに関与する配列を含む。このゲ
ノムはまた、ウイルスＲＮＡをパッケージングするために必要とされる配列およ
び別々のエンベロープｍＲＮＡの生成のためのスプライスのアクセプター部位お
よびドナー部位を含む。ほとんどのレトロウイルスは、複製している細胞中にの
み組み込まれ得るが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、除外されるようであ
る。この特性は、レトロウイルスの遺伝子治療のためのベクターとしての使用を
制限する。

【０１３６】 レトロウイルスベクターは、比較的単純であり、５’および３’ＬＴＲ、パッ
ケージング配列、および目的の遺伝子からなる転写ユニットを含み、これは、典
型的には、発現カセットである。このようなベクターを増殖するために、いわゆ
るパッケージング細胞系統を使用して、失ったウイルス機能をトランスで提供し
なければならない。このような細胞は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの組み込ま
れたコピーを含むがパッケージングシグナルを欠くように操作され、その結果、
ヘルパーウイルス配列は、キャプシド形成されなくなる。ベクターおよびパッケ
ージング細胞系統に付加されるかそれらから除去されるさらなる特質は、ヘルパ
ーウイルスによる混入のより有効なまたは減少した可能性をベクターに与えるた
めの試みを反映する。

【０１３７】 レトロウイルスベクターの主な利点は、それらが組み込まれ、それゆえ潜在的
に長期発現が可能であることである。それらは、比較的大量に増殖され得るが、
ヘルパースウイルスの非存在を確実にするためには注意が必要とされる。

【０１３８】 （（ｂ）アデノウイルス） アデノウイルスは、直線二本鎖ＤＮＡを含む、大きなクラスの非エンベロープ
化ウイルスを含む。ウイルスの正常なライフサイクルは、分裂細胞を必要とせず
、そして大量のウイルス蓄積の間の許容細胞における生産的感染を含む。生産的
感染サイクルは、細胞培養物において約３２〜３６時間かかり、そして２つの相
（初期相（ウイスルＤＮＡ合成の前）および後期相（構造タンパク質およびウイ
ルスＤＮＡが合成され、そしてウイルス粒子に組み込まれる間））を含む。一般
に、アデノウイルス感染は、ヒトにおける軽度な疾患に関連する。

【０１３９】 アデノウイルスベクターは、いくらか大きく、そしてレトロウイルスまたはＡ
ＡＶベクターよりも複雑である。これは、ウイルスゲノムの小画分がほとんどの
現在のベクターから取り除かれることに、部分的に起因する。さらなる遺伝子が
除去される場合、この困難性が証明されるかぎり、これらは、トランスで提供さ
れ、ベクターを産生する。実際、アデノウイルスベースのベクターの一般的なタ
イプは、研究されてきた（Ｅ３−欠失ベクターおよびＥ１−欠失ベクター）。研
究室のストック中の野生型のくつかのウイルスは、Ｅ３領域を欠失しており、そ
してヘルパーの非存在下で増殖し得る。この能力は、Ｅ３遺伝子産物が野生型に
おいて必要ではないことを意味するのではなく、培養細胞における複製がそれら
を必要としないことのみを意味する。Ｅ３領域の欠失は、外因性ＤＮＡ配列の挿
入を可能にし、生産性感染およびコードされるタンパク質の比較的大量の一過性
の合成が可能であるベクターを生じる。

【０１４０】 Ｅ１領域の欠失は、アデノウイルスを無効にするが、このようなベクターは、
なお増殖し得る。なぜならば、確立されたヒト細胞系統（「２９３」と呼ばれる
）が存在し、これは、Ａｄ５のＥ１領域を含み、そしてこれは、Ｅ１タンパク質
を恒常的に発現する。アデノウイルスを含む最も最近の遺伝子治療適用は、２９
３細胞内で増殖されるＥ１置換ベクターを利用してきた。

【０１４１】 アデノウイルスベクターの主な利点は、これらが広範な細胞および組織におい
て効率的にエピソーム遺伝子移入し得ること、およびそれらが容易に大量に増殖
することである。この主な利点は、ウイルスに対して応答性の宿主が、少なくと
も高用量の第１世代ベクターで、発現の持続期間および繰り返し投薬する能力を
制限するようであることである。

【０１４２】 （（ｃ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）） ＡＡＶは、直線一本鎖ＤＮＡを含む、小さくて単純な非自律性ウイルスである
。Ｍｕｚｙｃｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８，９７−１２９を参照のこと；この参考文献お
よびそこに引用されている全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用され
る。このウイルスは、複製のために、アデノウイルスまたは特定の他のウイルス
での同時感染を必要とする。ＡＡＶは、ウイルスに対する抗体により証明される
ようにヒト集団において広範に存在するが、いかなる公知の疾患にも関連しない
。ＡＡＶゲノム機構は、直線的であり、遺伝子を２つだけ含む（ｒｅｐおよびｃ
ａｐ）。ゲノムの末端は、約１４５ヌクレオチドの末端反復（ＩＴＲ）配列を含
む。

【０１４３】 ＡＡＶベースのベクターは、典型的には、目的の転写ユニットに隣接するＩＴ
Ｒ配列のみを含む。ベクターＤＮＡの長さは、４６８０ヌクレオチドのウイルス
ゲノムの長さを大きくは伸長できない。最近、ＡＡＶベクターの増殖は、扱いに
くくそして、ベクター自体のみではなく、ヘルパー機能を提供するためにｒｅｐ
およびｃａｐをコードするプラスミドを宿主に導入することを含む。このヘルパ
ープラスミドは、ＩＴＲを欠き、従って複製およびパッケージを行い得ない。さ
らに、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）が、しばしば必要とされる
。ＡＡＶベクターの潜在的な利点は、ウイスルＤＮＡの組み込みに起因して、恐
らく必要でなくともそれらが非分裂細胞において長期発現が可能であることであ
る。これらのベクターは構造的に単純であり、従って、これらは、アデノウイル
スより宿主細胞応答を刺激し得ない。現時点での主な制限は、ＡＡＶベクターを
大量に増殖させることが非常に困難であることである。

【０１４４】 （（２）非ウイルス性遺伝子移入法） 遺伝子治療において使用される非ウイル性核酸ベクターとしては、プラスミド
、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、メチルホスホネートまた
はホスホロチオエート）、ポリアミン、核酸、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）
が挙げられる。このようなベクターは、典型的には、タンパク質またはＲＮＡを
発現するための発現カセットを含む。このような発現カセット中のプロモーター
は、構造的、細胞型特異的、段階特異的、および／または調節可能であり得る（
例えば、グルココルチコイド（ＭＭＴＶプロモーター）のようなホルモンによる
）。転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加され得る。
エンハンサーは、プロモーターにより転写を増加する１０〜３００ｂｐの間のシ
ス作動性配列である。エンハンサーは、転写ユニットに対して５’または３’の
どちらかである場合、効率的に転写を増加する。これらはまた、イントロン内ま
たはコード配列自体内に位置する場合、有効である。典型的には、ＳＶ４０エン
ハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよび
アデノウイルスエンハンサーを含むウイルス性エンハンサーが使用される。哺乳
動物系由来のエンハンサー配列もまた、通常使用される（例えば、マウス免疫グ
ロブリン重鎖エンハンサー）。

【０１４５】 全ての種類の遺伝子治療ベクターはまた、選択マーカー遺伝子を含み得る。適
切なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チ
ミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐性を与える原核生物遺伝子（ｇｐ
ｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）（これは、ｍｙ
ｃｏｐｈｎｏｌｉｃ ａｃｉｄで選択され得る）；ｎｅｏ（ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ）（これは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはプロマイシン
で選択され得る）；およびＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）（これは、メ
トトレキセートで選択され得る））が挙げられる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８１）７８，２
０７２；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（
１９８２）１，３２７）。

【０１４６】 組み込みの前に、ベクターは、多くのバリアーを横切らなければならなく、こ
れは、発現され続けるＤＮＡの非常に少数画分しか生じ得ない。高レベルの遺伝
子発現に対する限定としては、以下が挙げられる：血液および組織に存在するヌ
クレアーゼに起因するベクターの損失；細胞へのＤＮＡの無効な侵入；ＤＮＡの
細胞の核への無効な侵入および他の区画についてのＤＮＡの優先度；核における
ＤＮＡ安定性の欠如（核安定性を限定する因子は、他の細胞および細胞外区画に
影響するそれらとは異なり得る）、染色体への組み込みの効率；および組み込み
の部位。

【０１４７】 これらの効率の潜在的な欠失は、治療に影響する産物が発現される発現カセッ
トに加えて非ウイルス性ベクター中にさらなる配列を含むことにより取り扱われ
得る。このさらなる配列は、細胞の外側および内側の両方における安定性を与え
ること、細胞への侵入を媒介すること、細胞の核への侵入を媒介すること、およ
び核ＤＮＡ内での組み込みを媒介することにおける役割を有し得る。例えば、ア
プタマー様ＤＮＡ構造物または他のタンパク質結合部位は、細胞表面レセプター
への、またはレセプターと結合する（これにより、細胞へのＤＮＡ移入の効率を
増加する）血清タンパク質へのベクターの結合を媒介するために使用され得る。

【０１４８】 他のＤＮＡ配列は、特定の区画の回避、およびエスケープまたは核への侵入が
より効率的である他の区画についての優先度を、直接的にかまたは間接的に生じ
得る。他のＤＮＡ部位および構造物は、核膜中のレセプターと、または核に移動
する他のタンパク質直接的にかまたは間接的に結合し、これにより核によるベク
ターの取り込みを増強する。他のＤＮＡ配列は、取り込みの効率に直接または間
接的に影響する。相同組換えによる取り込みについて、重要な因子は、染色体配
列に対する相同性の程度および長さ、ならびにゲノムにおけるそのような配列（
例えば、ａｌｕ反復）の頻度である。相同組換えを媒介する特定の配列はまた、
重要である。なぜならば、組み込みは、転写的に活性なＤＮＡを、より容易に生
じるからである。相同標的構築物を構築するための方法および物質は、例えば、
Ｍａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３３６：３４８；Ｂｒｅｄｌｅｙ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：５３４により記載される
。

【０１４９】 非相同性で非嫡出かつ部位特異的な組換えについて、組換えは、組換えタンパ
ク質をコードする細胞と相互作用する治療ベクター上の特異的部位（例えば、ｃ
ｒｅ／ｌｏｘおよびｆｌｐ／ｆｒｔ系）により媒介される。例えば、Ｂａｕｂｏ
ｎｉｓ＆Ｓａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１，２０２
５−２０２９は、ｌｏｘＰ部位を含むベクターがｃｒｅ酵素の存在下で染色体Ｄ
ＮＡ中のｌｏｘＰ部位において組み込まれるようになることを報告する。

【０１５０】 遺伝子治療において有用な産物をコードする非ウイルス性ベクターは、手段（
例えば、リポフェクチン、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム
、ポリカチオン：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ウイルス粒子、薬剤により増強
されたＤＮＡの取り込み、エキソビボ伝達）により動物に導入され得る。リポフ
ェクチンは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８
７号および同第４，８９７，３５５号に記載され、そしてリポフェクチン試薬は
、市販される（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^TMおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ ^TM ）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適切であ
るカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４
２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。

【０１５１】 ウイルス性粒子をパッケージングすることについてのサイズ制限に起因して、
ウイルスゲノムへの比較的小さな非ウイルス性ポリヌクレオチド配列のみを取り
込む、現存のウイルスベース遺伝子治療ベクターと異なり、裸のＤＮＡまたはリ
ポフェクチン複合体は、細胞へ大きな（例えば、５０〜５，０００ｋｂ）外因性
ポリヌクレオチドを移入するために使用され得る。非ウイルス性ベクターのこの
特性は、特に有利である。なぜなら、１００キロベースを超える治療スパンによ
り送達され得る多くの遺伝子（例えば、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）
遺伝子、ハンティングトン舞踏病遺伝子）および大きな相同標的構築物または導
入遺伝子が効率的な組み込みのために必要とされ得るからである。必要に応じて
、このような大きな遺伝子は、標的遺伝子に、２つ以上のフラグメントとして送
達され得、そして細胞内の相同組換えにより再構築され得る（ＷＯ９２／０３９
１７を参照のこと）。

【０１５２】 （（Ｃ）遺伝子治療の適用） 遺伝子治療ベクターは、個々の患者への投与（典型的には全身投与（例えば、
静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射もしくは頭蓋内注射））または
局所適用によりインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで
細胞（例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物
、組織生検）または万能給血者造血幹細胞）に送達され得、通常は組み込まれた
ベクターを有する細胞についての選択後、患者への細胞の再移植が続く。

【０１５３】 （（４．）治療キット） キットは、治療的用途および診断用途のために供給され得る。１つの実施形態
において、本発明の薬学的処方物は、凍結乾燥形態であり、これは、容器内に置
かれ得る。複合体（これもまた標識に結合され得たかまたは結合され得ていない
）緩衝液は、（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、安定剤、殺生剤、不活性
タンパク質（例えば、血清アルブミン）など）および使用のための手引きと共に
キットに含まれる。一般に、これらの物質は、約５重量％未満（複合体の量に基
づく）で存在し、そして通常少なくとも約０．００１重量％（タンパク質濃度に
基づく）の総量で存在する。賦形剤が総組成物の約１重量％〜９９重量％で存在
し得る場合、頻繁に、活性成分を希釈するために不活性エキステンダーまたは賦
形剤を含むことが所望される。複合体に結合し得る抗体がアッセイに使用される
場合、これは通常、通常別々のバイアル中に提示される。抗体は、典型的には、
標識に結合され、そして当該分野で周知の技術に従って処方される。

【０１５４】 （実施例） 以下の実施例は例示のために提供されるが、特許請求された本発明を限定しな
い。

【０１５５】 （実施例１） （ＣＨＯ細胞における野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の発現） ＶＥＧＦ−ＢのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇スプライス変異体は、哺乳動物細胞から発現
および分泌された後、内皮細胞においてマイトジェン活性を示す非グリコシル化
および細胞関連逆平行ダイマーである（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｕ．および
Ｋ．Ａｌｉｔａｌｏ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
．（１９９９）２３７：４１−５７を参照のこと）。野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦ−
Ｂ₁₆₇分子は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現され、
そしてさらに、本発明の標的化ペプチドとの化学結合に使用される。ＣＨＯ細胞
は、産生宿主として選択され得る。なぜなら、フォールディングの矯正およびｃ
ｙｓ−リッチタンパク質の二量体化は、哺乳動物細胞において優先的に生じるか
らである。Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発
現は、代替手順であり得、そして変性剤中での封入体の可溶化およびリフォール
ディングを必要とし得る。

【０１５６】 （プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７の構築およびＣＨＯ細胞におけるＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇の発現） 以下の材料および方法に記載されるように、プラスミドを構築する。このプラ
スミドにおいて、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡをＳＶ４０初期プロモーターにより
調節する。ＡＴＣ開始コドンのすぐ上流で、真核生物細胞における翻訳に最適な
状況にＤＮＡ配列を変化させる。ｄｈｆｒ−欠失ＣＨＯ細胞へのプラスミドｐＶ
ＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７およびｐＳＶ−ｒｄｈｒｆ（これは、マウスＤＨＦＲ選択
マーカーを含む）の同時トランスフェクションおよび選択は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇
を発現する細胞クローンを生じる（例えば、Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．およびＬ．Ａ．
Ｃｈａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７
７：４２１６−４２２０を参照のこと）。ＣＨＯ細胞の同時トランスフェクショ
ンおよび選択を、標準細胞培養手順を使用して行う（例えば、Ａｕｓｅｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６．お
よびＨｅｒｌｉｔｓｃｈｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９６）８：３５８−３６４を参照のこと）
。ＶＥＧＦ−Ｂ特異的ペプチドでウサギを免疫することより得られる抗体を使用
する当該分野で公知の方法に従って、細胞培養上清のウエスタンブロッティング
により発現についてのスクリーニングを行う（例えば、Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：４３５０−
４３５５４を参照のこと；Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
（１９９６）２７１：１９３１０−７もまた参照のこと；これらの参考および本
明細書中に列挙された参考は、本明細書中に参考として援用される）。

【０１５７】 安定高発現ＣＨＯクローンは、生物工学における標準手順を使用するＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇を産生するために使用される（例えば、Ｇｏｍｐｅｒｔｓ，Ｅ．ら、Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ．Ｔｒａｎｓｆ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．（１９９２）６：２４
７−２５１を参照のこと）。

【０１５８】 （発現プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７の構築） プラスミドｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７は、ファージλ ｇｔ１１−ＶＥＧＦ−
Ｂｓｔ１６７由来の５８０ｂｐのＰＣＲ産物の、発現プラスミドｐＳＩ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）への挿入によって構築される。このファージは、λ ｇ１
１（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）におけるヒト線維肉腫ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングより得られる。ＰＣＲ反応は、Ａｄｖａｎｔａ
ｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．）を使用して、１ｎｇのプラスミドテンプレート、０．５
μＭのプライマー、Ｐ−ｗｔ１６７（１）５−ＧＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＡＧ
ＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧ−３’およびＰ−ｗｔ１
６７（２）５’−ＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣ
ＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧ−３’、ならびに０．２ｍＭ ｄＮＴＰを含む１００
μｌの最終容量で、９３℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間の３０サ
イクルの条件、次いで７２℃で１０分間の伸長（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ
Ｇｅｎｅ ＡＴＡＱ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍにおける）
を使用して行われる。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化
し、そしてＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ切断プラスミドｐＳＩに連結する。得れれるプラ
スミドを、ｐＶＥＧＦ−Ｂｗｔ１６７と名付ける。

【０１５９】 （実施例２） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＧＧＧＶＦＷＱの結合） （原理） Ｎ末端をブロックされたペプチドは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）
の存在下で、水容性カルボジイミドＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドによってＣ末端で活性化される。次いで、活性化
されたペプチドは、ＶＥＧＦ分子の第１級アミノ基と反応する。ｐＨを注意深く
調整することによって、この反応が、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子のＮ末端へ指向する
ことが可能となる（例えば、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．（１９８６）１５６：２２０−２２２およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，「Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｔｏ
Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥ
ＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，（ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）第２２１頁〜２２９頁；これらの参考文献お
よびそこに列挙される参考文献は、本明細書中に参考として援用される）。

【０１６０】 （方法） １μＭの精製ペプチドを、少量のＤＭＳＯに溶解し、そしてさらに１ｍＭの溶
液を得るまで、緩衝液で希釈した。ＥＤＣおよびＮＨＳを１０倍のモル濃度過剰
で添加し、そして２時間室温で反応させた。次いで、混合物を、ＶＥＧＦ−Ｂ_{16 7} の溶液（緩衝液中）に移す。ｐＨを制御し、必要な場合、６．８に調整する。
反応を、４０℃で、さらに１８時間進行させる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇／ＶＥＧＦ−
Ｂキメラ分子由来の遊離のペプチドの分離は、ゲル濾過によって達成され得る。
その混合物をＳｅｐａｈｄｅｘ Ｇ２５で充填されたカラムにアプライし、そし
てタンパク質を空隙容量に収集し得るが、未反応のペプチドおよび低分子反応産
物を後で溶出する。

【０１６１】 ＶＥＧＦキメラ分子結合体の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｎ−末端
配列決定および分光測定法のような標準技術によってアッセイする。結合体の絶
対質量を、質量分析法によって決定する。これは、結合したペプチドの量につい
ての情報およびＶＥＧＦ上のペプチドの位置についての情報をまた提供し得る。
理想的なモル濃度結合比は、ペプチドがＶＥＧＦのＮ末端に位置するときに達成
される。結合体の生物学的な活性は、適切な動物および／または培養試験によっ
て決定される。

【０１６２】 （実施例３） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのＣ末端伸長ペプチドＧＧＧＶＦＷＱの結合） （原理） 標的化ペプチドレセプターに対するＶＥＧＦレセプターｒｅｓｐ．への、ＶＥ
ＧＦ−Ｂキメラ分子の結合の間の立体障害を避けるために、ペプチドは、Ｃ末端
でいくつかの付加的なアミノ酸により伸長され得る。Ｃ末端スペーサーは、最大
限に柔軟であるべきであるが、それらの特定のレセプターへのＶＥＧＦおよび／
またはペプチドの結合メカニズムを妨害しない。通常、ポリＧｌｙまたはポリＡ
ｌａ配列は、これらの要求を満たす。

【０１６３】 （方法） 結合は、上記の実施例２に記載されるように、達成され得る。

【０１６４】 （実施例４） （スペーサードメインを有するヘテロ二官能性試薬を使用することによるＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＧＧＧＶＦＷＱの結合） （原理） ペプチドの結合はまた、ペプチドのＮ末端を、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば
、ＳＭＢＰ）のアミノ反応性部分と反応させることによって達成され得、次いで
活性化されたペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の到達できるスルフヒドリル基と反
応し、チオエーテル結合を形成する（例えば、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７２，６０９およびＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ
．、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ
ｉｎｇ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｏ
Ｆ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩ
ＮＧ、（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）、第２２１頁〜２２９頁を参
照のこと）。ＳＭＢＰを使用する場合、スペーサーの長さは、１．５ｎｍのオー
ダーである。以下のことに留意すべきである：結合反応に関与するスルフヒドリ
ル基は、レセプタータンパク質への結合に必須ではない。

【０１６５】 （方法） 遊離のＮ末端を含む１μＭのペプチドを、ＤＭＳＯ／緩衝液に溶解する。１０
倍モル濃度過剰のＳｕｌｆｏ−ＳＭＢＰ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ− マレイミドフェニル）ブチレート）を添加する。１時間室温でのペプチドの活性
化後、等モル濃度量のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇を添加する。この結合反応を、さらに１
８時間４０Ｇで進行させる。ＶＥＧＦ−Ｂ／ＶＥＧＦ−Ｂキメラ分子からの遊離
のペプチドの分離は、上記のようにゲル濾過を使用して達成され得る。

【０１６６】 （実施例５） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＧＧＧＶＧＷＱの非共有結合） （原理） イオン相互作用は、タンパク質構造を形成する際の１つの優性な力である。高
分子に反対の電荷の領域を導入することによって、２つの反応パートナーの間の
密接な複合体を形成することが可能になり、それらはまた生理学的な条件で安定
である。これらの荷電アミノ酸の導入は、両方の分子の機能と適合しなければな
らない。

【０１６７】 （方法） ペプチドＧＧＧＶＦＷＱは、ＮまたはＣ末端で、４〜５の荷電アミノ酸（正の
荷電の導入のためのリジン、アルギニン、負の電荷の導入のためのグルタミン酸
またはアスパラギン酸）のストレッチによって改変されなければならない。ＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇はまた、好ましくは、４〜６の荷電アミノ酸の配列でＮ末端で伸長
されなければならない。一旦、反応パートナーが、合成され、そして適切な程度
の質まで精製されると、複合体は、等量の反対に荷電された反応パートナーと混
合するだけで容易に形成され得る。結合体からの未反応の分子の分離は、イオン
交換クロマトグラフィーを使用して達成され得る。

【０１６８】 イオン性複合体の形成は、異なる分析ツールによってモニタリングされ得る。
例えば、マイクロ熱量測定（ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）または表面プ
ラズモン共鳴は、キメラ分子の化学量論および結合特性についての情報を与え得
る。

【０１６９】 上記の実施例３に類似の、実施例４および５に記載の結合方法はまた、伸長さ
れたペプチドで行われ得、ペプチドとＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇との間の適切な距離を可
能にする。

【０１７０】 （実施例６） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の、Ｈｉｓタグ化ペプチドＧＧＧＶＦＷＱへの結合） （原理） 遊離のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇からのＶＥＧＦキメラ分子の完全な分離が必要である
場合、ペプチドは、ＮまたはＣ末端で、４〜６のヒスチジン分子のストレッチを
用いて伸長され得る。次いで結合反応は、実施例２または５に従って行われる。
ＶＥＧＦＲ−Ｂキメラ分子の捕捉のために、金属アフィニティークロマトグラフ
ィーのアプローチが使用され得る（Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９
７５）２５８：５９８−５９９）。

【０１７１】 （方法） 実施例２に従った結合反応の完了後、反応混合物を、ニッケルキレートゲルを
充填したカラムを通過させる。多量体ヒスチジンを含むすべての分子は、このカ
ラムに結合する。カラムの洗浄後、結合したタンパク質／ペプチドを、イミダゾ
ールを含む緩衝液で溶出する。遊離のペプチドからの結合体の分離は、上記のゲ
ル濾過によって再び行われる。

【０１７２】 （実施例７） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇へのペプチドＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの結合） ＮおよびＣ末端のアミノおよびカルボニル基に加えて、このペプチドは、ＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇への結合に使用され得るリジンの２つの機能的なスルフヒドリル基
およびリジンの１つのアミノ基を有する。環状構造において、ペプチドを使用す
る必要がある場合、アミノおよびカルボキシ基のみが利用可能である。なぜなら
、ペプチドにはより反応性の基が存在するので、理論的な副産物の量が増加し得
る。

【０１７３】 （方法） １ｎＭの可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇を、１０倍モル濃度過剰のスルホ（ｓｕｌｆ
ｏ）−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート）（ｐＨ６．８）で、１時間室温で活性化す
る。このｐＨで、活性化は、好ましくはＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＮ末端アミノ基で生
じる。優性な副反応は、内部の遊離ＳＨ基との分子内架橋であり、従って、１０
ｎＭの還元されたペプチドを添加し、そして反応を４℃で１８時間進行させる。
反応産物を、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーま
たは逆相クロマトグラフィーによって精製する。Ｈｉｓタグ化ペプチドを使用す
ることによって、精製はまた、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを
使用して行われ得る。１つまたは両方の反応パートナーに対して利用可能な抗体
が存在する場合、精製はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって
容易になり得る。実施例１〜６に記載される同じ化学がまた、使用され得る。

【０１７４】 （実施例８） （ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇への標的化ペプチドＧＧＧＶＦＮＱおよびＣＲＳＷＮＫＡ
ＤＮＲＳＣのカルボキシ末端（Ｃｔ）融合） （プラスミドｐＶＥＧＦ（ＢＨＧ４Ｓ）₃、−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧ
Ｆ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築ならびにＣＨＯ細胞
におけるキメラ分子の発現） プラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧ
Ｆ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣは、ＮＨ₂−（ＧＧＧＧＳ）
×３−ＣＯＯＨヒンジ領域を介してＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子のＣ末端に、それぞれ
融合される標的化ペプチドＮＨ₂−ＧＧＧＶＦＷＱ−ＣＯＯＨおよびＮＨ₂−ＣＲ
ＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ−ＣＯＯＨをコードするＤＮＡ配列を含む。この型のリン
カーは、通常、１本鎖抗体における重鎖および軽鎖を柔軟に連結するために使用
される；あるいは、ヒト免疫グロブリン遺伝子に他の連結ペプチド（例えば、天
然のヒンジ領域が表す）または、オリゴプロリンリンカーもしくはオリゴグリシ
ンリンカーが、使用され得る。さらに、リンカーペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇
のＣ末端とそのリンカーとの間に位置するプロテアーゼ切断部位（例えば、プラ
スミン切断部位）を含み得、正常または虚血の心臓に対する高親和性標的化後の
、ネイティブなＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇分子の放出を可能にする。リンカーの柔軟性に
起因して、Ｃ末端融合ペプチドは、レセプター結合を妨害しない。

【０１７５】 一連のモジュラープラスミドを構築し、最終的にプラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ
）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲ
ＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣを得る（以下の材料および方法を参照のこと）。中間のプ
ラスミドｐｖｅｇｆ−ｓｓ（１）は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル配列、続いてＨｉｎ
ｃＩＩ制限部位を提供し、野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇配列または任意の他の所望の
Ｎ末端融合タンパク質のいずれかの都合のよい挿入を可能にする（実施例「Ｎ末
端融合」を参照のこと）。最終構築物、プラスミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ
）３−ＧＧＧＶＦＮＱおよびｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡ
ＤＮＲＳＣは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされる。選択マーカーとの同時ト
ランスフェクション、ＣＨＯ細胞クローンの選択およびタンパク質の産生を、標
準細胞培養および生物工学手順を使用して行い得る（例えば、実施例１を参照の
こと）。キメラタンパク質の精製を、標準タンパク質化学手順（アニオンおよび
／またはカチオン交換樹脂を使用するクロマトグラフィー、ゲル濾過またはアフ
ィニティークロマトグラフィー）に従って行う。

【０１７６】 （材料および方法） （プラスミドの構築） （ｐＳＩ−ｖｅｇｆ−ＭＣＳ（１）） 第１の工程において、市販のベクターｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、標準条件
を使用して、クレノウポリメラーゼを用いて処理されたＢｇｌＩＩで切断しそし
て再連結する。生じる中間プラスミドを、ｐＳＩ−Ｂと称する。続いて、ｐＳＩ
−Ｂを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてアニールされたオリゴヌクレ
オチド、Ｐ−ｖｅｇｆＭＣＳ（１）５’−ＣＴＡＧＴＡＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＧ
ＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧ
ＣＧＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＧＣＣ−３’およびＰ−ｖｅｇｆＭ
ＣＳ（２）５’−ＧＧＣＣＴＡＣＧＴＡＣＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧ
ＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡ
ＧＡＴＡＣＧＴＡ−３’と連結する。生じるプラスミドをプライマー、Ｐ−４３
７１（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）を使用して配列決定
し、そしてｐＳ１−ｖｅｇｆＭＣＳ（１）．ｐｖｇｅｇ−ｓｓ（１）と称する。
アミノ酸コドンＰｒｏ²²、Ｖａｌ²³およびＡｓｐ²⁷を含むＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇シグ
ナル配列Ｍｅｔ¹−Ａｌａ²¹をコードするＤＮＡストレッチの挿入を、Ｘｂａ１
／ＳａｌＩ切断ベクター、ｐＳＩ−ｖｅｇｆ−ＭＣＳ（１）を、アニールされた
オリゴヌクレオチド、Ｐ−ｓｓ（１）５’−ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣ
ＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＣＴＣＣＴＧ
ＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧ−３’およびＰ−ｓｓ（
２）５’−ＴＣＧＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡ
ＧＧＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣ
ＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣ−３’と連結することによって行う。挿入領域を、配列決
定（プライマー、ｐ−４３７１）し、そして生じるプラスミド１５を、ｐｖｅｇ
ｆ−ｓｓ（１）と名付ける。アミノ酸コドンＶａｌ²³およびＡｓｐ²⁷は、Ｈｉｎ
ｃＩＩ制限領域を形成する。これは、野生型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇配列（コドンＳｅ
ｒ²⁴Ｇｌｎ²⁵およびＰｒｏ²⁶）または任意の所望のＮ末端融合ペプチドのいずれ
かの都合のよい挿入を可能にする。

【０１７７】 （ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６） ベクター、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６を構築するために、アミノ酸残基Ａｓｐ ²⁷ 〜Ａｒｇ¹⁸⁸に対応するＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇コード配列を、５００ｂｐＰＣＲ産物
として、プライマー、２−２７／₁₆₇（１）５’−ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣ
ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧ−３’およびＰ−２７／₁₆₇（
２）５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡ
ＧＧＴＧ−３’を使用して標準ＰＣＲ反応で増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ
／Ｂｇ１ｌｌで消化し、そして生じる４８６ｂｐのフラグメントを、ＳａｌＩ／
ＢｇＩｌｌ切断プラスミドｐｖｅｇｆ−ｓｓ（１）にクローン化する。

【０１７８】 （ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−ｄＨ） １つのＨｐａｌ部位を欠失するために、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６をＨｐａＩ
で消化し、そしてヘキサヌクレオチドＰ−ＡｇｅＩ（１）５’−ＡＣＣＧＧＴ−
３’（Ａｇｅｌ部位）で連結し、プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−ｄＨを
生じる。

【０１７９】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｆ） プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６．ｄＨを、ＨｉｎｃＩＩで消化し、そし
てアニールされたオリゴヌクレオチドＰ−２４／２６（Ｉ）５’−ＴＣＣＣＡＧ
ＣＣＴ−３’、およびＰ−２４／２６（２）５’−ＡＧＧＣＴＧＧＧＡ−３’と
連結する。オリゴヌクレオチドの正確な（センス）挿入を、プライマーＰ４３７
１を使用する配列決定によって確認し、そして生じるプラスミドをｐＶＥＧＦ（
Ｂ）−Ｆと称する。アンチセンス配向に挿入されたオリゴヌクレオチドを有する
アンチセンス構築物はまた単離され、そしてｐＶＥＧＦ（Ｂ）アンチセンスと称
される。

【０１８０】 （ＰＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃） ベクター、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃の構築を完成するために、アニー
ルされたオリゴヌクレオチドＰ−Ｌｉ（１）５’−ＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧ
ＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣ
ＴＧ−３’、および（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）×３リンカー
配列をコードするＰ−Ｌｉ（２）５’ＣＴＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣ
ＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡ−３’を
、ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｆに挿入する。

【０１８１】 （ＰＶＥＧＦ（Ｂ）Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱ） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＧＧＧＶＦＮＱの構築を、ＮｈｅＩ／Ｎｏ
ｔＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃の、アリールされたオリゴヌ
クレオチドＰ−Ｄ（１）５’−ＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧ
ＧＣＡＧＴＡＡＧＣ−３’、およびＰ−Ｄ（２）５’−ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧ−３’との連結によって行う。標的
ペプチドＮＨ₂−ＧＧＧＶＰＷＱ−ＣＯＯＨをコードするＤＮＡ配列を含むプラ
スミドｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃、−ＧＧＧＶＦＮＱを、ＮＨ₂−（ＧＧＧ
ＧＳ）×３−ＣＯＯＨヒンジ領域を介してＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡのＣ末端に
融合する。

【０１８２】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）₃−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築を、Ｎｈ
ｅＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）−（Ｇ４Ｓ）の、アニールされた
オリゴヌクレオチド、Ｐ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（１）５’−ＣＴＡＧＣＴ
ＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴ
ＡＡＧＣ−３’およびＰ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（２）５’−ＧＧＣＣＧＣ
ＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴとの連結によって行った。

【０１８３】 （実施例９） （標的化ペプチドＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆へのアミノ
末端（Ｎｔ）融合） （プラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築お
よびＣＨＯ細胞におけるキメラ分子の発現） シグナルペプチドとＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆分子のＮ末端との間に、ＮＨ₂−（ＧＧＧ
ＧＳ）×３−ＣＯＯＨヒンジ領域を介して挿入されたプラスミド、ｐＶＥＧＦ（
Ｂ）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣは、心臓組織標的化ペプチドＮＨ₂−Ｃ
ＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ−ＣＯＯＨをコードするＤＮＡ配列を含む。機能的エレ
メントを含む他のリンカーペプチドは、使用され得る（上記の実施例８を参照の
こと）。Ｎ末端融合は、標的化分子の欠失なしでＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆分子で生じる
天然のタンパク質分解プロセシングを可能にする。Ｎ末端は、二量体ＶＥＧＦ分
子の膜結合表面に対して遠位に位置するようであるので、融合された標的化ペプ
チドは、立体障害なしに、そのレセプターと相互作用し得る。実施例８に記載さ
れる一連のモジュラープラスミドの一部はさらに、プラスミド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ
）−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣを構築するために使用される（材料および
方法を参照のこと）。最終構築物は、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされる。選
択マーカーでの同時トランスフェクション、ＣＨＯ細胞クローンの選択およびタ
ンパク質の産生は、標準細胞培養および生物工学手順を使用して行われる（実施
例１を参照のこと）。キメラタンパク質の精製は、標準タンパク質化学手順に従
って行われる。

【０１８４】 （材料および方法） （プラスミドの構築） （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６の構築を、ｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６
−ｄＨ（実施例８を参照のこと）の、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩでの消化によっ
て行う。４９２ｂｐのフラグメントを、ゲル精製によって除去する。この工程は
、プラスミドｐｖｅｇｆ−ｄ２４／２６−ｄＨ由来のＶＥＧＦ（Ｂ）１６７のア
ミノ酸Ａｓｐ２７〜Ａｒｇ１８８をコードするＤＮＡ配列を欠失する（実施例８
を参照のこと）。続いて、ＶＥＧＦ（Ｂ）１８６のアミノ酸Ａｓｐ²⁷−Ａｌａ^{20 7} をコードする５３３ｂｐのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ切断ＰＣＲ産物を挿入する。
ＰＣＲを、プライマーＰ−２７／１６７（１）ならびにＰ−２７／１８６（１）
（５’−ＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＧ
ＧＡＧＧ−３’）およびテンプレートとしてのＶＥＧＦ（Ｂ）１８６ｃＤＮＡを
使用して、標準ＰＣＲ反応のように行う。ＶＥＧＦ（Ｂ）１６７の最終プラスミ
ド、ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６アミノ酸においては、Ａｓｐ²⁷〜Ａ
ｒｇ¹⁸⁸は、ＶＥＧＦ（Ｂ）１８６のアミノ酸Ａｓｐ²⁷〜Ａｌａ²⁰⁷によって置換
され、アミノ酸Ｍｅｔ¹〜Ｖａｌ²³は、両方のＶＥＧＦ（Ｂ）形成に共通であり
、一方アミノ酸Ｓｅｒ²⁴、Ｇｌｎ²⁵およびＰｒｏ²⁶は、まだ失われている。

【０１８５】 （ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−Ｒ１３） ｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣの構築を、Ｈｉｎ
ｄＩＩ切断ベクターｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−ｄ２４／２６の、アニールされた
オリゴヌクレオチドＰ−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（１）５’−ＴＧＣＣ
ＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣ
ＡＧＣＣＴ−３’およびＰ−Ｎｔ−ＣＲＳＷＮＫＡＤＮＲＳＣ（２）５’−ＡＧ
ＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣ
ＴＧＣＧＧＣＡ−３’との連結によって行う。反対の方向に挿入されたオリゴヌ
クレオチドを含むプラスミドはまた単離され、そしてｐＶＥＧＦ（Ｂ）１８６−
Ｎｔ−アンチセンスと称する。

【０１８６】 本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみであり、そ
してそれを考慮する種々の変更および変化が当業者に示唆され、そして本出願お
よび添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれることが理解される。本
明細書中に列挙されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的の
ためにその全体が参考として本明細書により援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 バクスター アクチェンゲゼルシャフト オーストリア国 ウィーン アー−1221， インドュストゥリーシュトラーセ 67 (72)発明者 レビン， アーノルド ジェイ． アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021， ニューヨーク， ヨーク アベニュー 1230， ロックフェラー ユニバーシテ ィ， プレジデンツ ハウス (72)発明者 ミッテラー， アルトゥア オーストリア国 ドナウ， アー−2304 オース， シュヴァーツェッカーヴェク 10 (72)発明者 ファルクナー， ファルコ−ギュンター オーストリア国 ドナウ， アー−2304 オース， ノイジードルツァイレ 76アー (72)発明者 シャイフリンガー， フリードリッヒ オーストリア国 アー−1090 ウィーン， ミヒェルボイエルンガッセ ４／17 (72)発明者 ドーナー， フリードリッヒ オーストリア国 アー−1238 ウィーン， ペーターリニガッセ 17 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA07 DA02 EA02 EA04 FA02 FA20 GA11 HA01 HA03 4C076 AA11 BB01 BB11 BB13 BB14 BB15 BB16 BB21 BB29 BB30 CC11 4C084 AA01 AA02 AA07 BA03 DB57 MA02 MA17 MA52 MA56 MA60 MA66 NA14 ZA36 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 EA20 FA72 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脈管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結された脈管形
   成因子を含む、キメラ分子。
2. 【請求項２】 前記脈管形成因子が、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ま
   たはＶＥＧＦ−Ｒ３の少なくとも１つに特異的に結合する、請求項１に記載のキ
   メラ分子。
3. 【請求項３】 前記標的化分子がペプチドである、請求項１に記載のキメラ
   分子。
4. 【請求項４】 請求項１の記載のキメラ分子であって、ここで前記脈管形成
   因子が、脈管内皮増殖因子Ａ（ＶＡＧＦ−Ａ）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₂₁（ＶＡ
   ＧＦ−Ａ₁₂₁）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₄₅（ＶＡＧＦ−Ａ₁₄₅）、脈管内皮増殖因
   子Ａ₁₆₅（ＶＡＧＦ−Ａ₁₆₅）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₈₉（ＶＡＧＦ−Ａ₁₈₉）、脈
   管内皮増殖因子Ａ₂₀₆（ＶＡＧＦ−Ａ₂₀₆）、脈管内皮増殖因子Ｂ（ＶＡＧＦ−Ｂ
   ）、脈管内皮増殖因子Ｂ₁₆₇（ＶＡＧＦ−Ｂ₁₆₇）、脈管内皮増殖因子Ｂ₁₈₆（Ｖ
   ＡＧＦ−Ｂ₁₈₆）、脈管内皮増殖因子Ｃ（ＶＡＧＦ−Ｃ）、脈管内皮増殖因子Ｄ
   （ＶＡＧＦ−Ｄ）、脈管内皮増殖因子Ｅ（ＶＡＧＦ−Ｅ）、胎盤増殖因子（ＰＩ
   ＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ
   ＦＧＦ）、またはアンジオポイエチン−１（Ａｎｇ１）である、キメラ分子。
5. 【請求項５】 前記脈管形成因子が、Ａｎｇ２、エンドスタチンまたはアン
   ジオスタチンである、請求項１に記載のキメラ分子。
6. 【請求項６】 融合タンパク質である、請求項１に記載のキメラ分子であっ
   て、ここで該融合タンパク質が、脈管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結
   された脈管形成因子を含む、キメラ分子。
7. 【請求項７】 前記脈管形成因子が、ＶＥＧＦ−Ｂ、脈管内皮増殖因子Ｂ_{16 7} （ＶＡＧＦ−Ｂ₁₆₇）、脈管内皮増殖因子Ｂ₁₈₆（ＶＡＧＦ−Ｂ₁₈₆）、または脈
   管内皮増殖因子Ｃ（ＶＡＧＦ−Ｃ）である、請求項６に記載の融合タンパク質。
8. 【請求項８】 新脈管形成の誘発方法であって、該方法は、細胞をキメラ分
   子と接触させる工程を包含し、ここで該キメラ分子は、脈管内皮に特異的に結合
   する標的化分子に結合された脈管形成因子を含む、方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここで前記キメラ分子が、
   融合タンパク質を含み、該融合タンパク質は脈管内皮に特異的に結合する標的化
   分子に連結された脈管形成因子を含む、方法。
10. 【請求項１０】 前記細胞が、心臓脈管構造の内皮細胞である、請求項８に
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記細胞が、虚血性組織の内皮細胞である、請求項８に記
    載の方法。
12. 【請求項１２】 前記脈管形成因子が、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２ま
    たはＶＥＧＦ−Ｒ３の少なくとも１つに特異的に結合する、請求項８に記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 前記標的化分子がペプチドである、請求項８に記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 請求項８に記載の方法であって、こで前記脈管形成因子が
    、脈管内皮増殖因子Ａ（ＶＡＧＦ−Ａ）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₂₁（ＶＡＧＦ−
    Ａ₁₂₁）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₄₅（ＶＡＧＦ−Ａ₁₄₅）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₆₅ （ＶＡＧＦ−Ａ₁₆₅）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₈₉（ＶＡＧＦ−Ａ₁₈₉）、脈管内皮
    増殖因子Ａ₂₀₆（ＶＡＧＦ−Ａ₂₀₆）、脈管内皮増殖因子Ｂ（ＶＡＧＦ−Ｂ）、脈
    管内皮増殖因子Ｂ₁₆₇（ＶＡＧＦ−Ｂ₁₆₇）、脈管内皮増殖因子Ｂ₁₈₆（ＶＡＧＦ
    −Ｂ₁₈₆）、脈管内皮増殖因子Ｃ（ＶＡＧＦ−Ｃ）、脈管内皮増殖因子Ｄ（ＶＡ
    ＧＦ−Ｄ）、脈管内皮増殖因子Ｅ（ＶＡＧＦ−Ｅ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）
    、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ
    ）、またはアンジオポイエチン−１（Ａｎｇ１）である、方法。
15. 【請求項１５】 心臓新生を増加させる方法であって、該方法は、心臓脈管
    構造の内皮細胞を、キメラ分子と接触させる方法を包含し、ここで該キメラ分子
    は、脈管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結された脈管形成因子を含む、
    方法。
16. 【請求項１６】 前記脈管形成因子が、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２ま
    たはＶＥＧＦ−Ｒ３の少なくとも１つに特異的に結合する、請求項１５に記載の
    方法。
17. 【請求項１７】 前記標的化分子がペプチドである、請求項１５に記載の方
    法。
18. 【請求項１８】 請求項１５に記載の方法であって、こで前記脈管形成因子
    が、脈管内皮増殖因子Ａ（ＶＡＧＦ−Ａ）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₂₁（ＶＡＧＦ
    −Ａ₁₂₁）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₄₅（ＶＡＧＦ−Ａ₁₄₅）、脈管内皮増殖因子Ａ_{1 65} （ＶＡＧＦ−Ａ₁₆₅）、脈管内皮増殖因子Ａ₁₈₉（ＶＡＧＦ−Ａ₁₈₉）、脈管内
    皮増殖因子Ａ₂₀₆（ＶＡＧＦ−Ａ₂₀₆）、脈管内皮増殖因子Ｂ（ＶＡＧＦ−Ｂ）、
    脈管内皮増殖因子Ｂ₁₆₇（ＶＡＧＦ−Ｂ₁₆₇）、脈管内皮増殖因子Ｂ₁₈₆（ＶＡＧ
    Ｆ−Ｂ₁₈₆）、脈管内皮増殖因子Ｃ（ＶＡＧＦ−Ｃ）、脈管内皮増殖因子Ｄ（Ｖ
    ＡＧＦ−Ｄ）、脈管内皮増殖因子Ｅ（ＶＡＧＦ−Ｅ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ
    ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
    Ｆ）、またはアンジオポイエチン−１（Ａｎｇ１）である、方法。
19. 【請求項１９】 前記キメラ分子が融合タンパク質であり、ここで該融合タ
    ンパク質は、脈管内皮に特異的に結合する標的化分子に連結された脈管形成因子
    を含む、請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記脈管形成因子が、脈管内皮増殖因子Ｂ、脈管内皮増殖
    因子Ｂ₁₆₇（ＶＡＧＦ−Ｂ₁₆₇）、脈管内皮増殖因子Ｂ₁₈₆（ＶＡＧＦ−Ｂ₁₈₆）、
    または脈管内皮増殖因子Ｃ（ＶＡＧＦ−Ｃ）である、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記キメラ分子が、薬学的に受容可能なキャリアに懸濁ま
    たは溶解される、請求項１５に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記キメラ分子が、細胞培養培地に懸濁または溶解される
    、請求項１５に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記薬学的組成物が注入可能な溶液の形態である、請求項
    １５に記載の方法。
24. 【請求項２４】 脈管形成因子および標的化分子を含む融合タンパク質コー
    ドする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで該標的核酸分使用が、
    脈管内皮に特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 前記核酸配列が、配列カセット内にある、請求項２４に記
    載のポリヌクレオチド。
26. 【請求項２６】 前記発現カセットが、レトロウイルスベクターまたはアデ
    ノウイルス関連関連ベクターである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
27. 【請求項２７】 組織における新脈管形成の誘導方法であって、該方法は、
    内皮細胞を、請求項２４に記載の核酸でトランスフェクトする工程を包含し、そ
    れによって該細胞が該核酸によってコードされる融合タンパク質を発現する、方
    法。
28. 【請求項２８】 請求項１に記載のキメラ分子および薬学的に受容可能なキ
    ャリアを含む、薬学的組成物。
29. 【請求項２９】 請求項６に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。