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Description
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んでなり、天然のプロモータの転写制御下での前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素ポリペプチドの発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分;及び
分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種ポリヌクレオチド部分であって、前記第一のポリヌクレオチド部分及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける多糖分解酵素の産生と比べて、組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生の増加を引き起こすものである第二の異種ポリヌクレオチド部分、を含んでなる組換えホスト細胞。
【請求項2】
前記産生の増加が前記多糖分解酵素の活性の増大、前記多糖類の量の増加又は活性の増大及び量の増加の組み合わせを含むものである、請求項1に記載の組換えホスト細胞。
【請求項3】
前記多糖分解酵素ポリペプチドが分泌される、請求項1又は2に記載の組換えホスト細胞。
【請求項4】
前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項1乃至3の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項5】
前記ホスト細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項4に記載の組換えホスト細胞。
【請求項6】
前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項5に記載の組換えホスト細胞。
【請求項7】
前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)科から選択される、請求項6に記載の組換えホスト細胞。
【請求項8】
前記ホスト細胞が、エシェリヒア(Escherichia)及びクレブシエラ(Klebsiella)から成る群より選択される、請求項7に記載の組換えホスト細胞。
【請求項9】
前記エシェリヒアが、 E.コリ(coli)B、E.コリ DH5α、E.コリ K04(ATCC 55123)、E.コリ K011(ATCC 55124)、E.コリ K012(ATCC 55125)及びE.コリ LY01(ATCC PTA−3466)、K.オキシトカ(oxytoca)M5A1(ATCC 68564)、及びK.オキシトカ P2(ATCC 55307)から成る群より選択される、請求項8に記載の組換えホスト細胞。
【請求項10】
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、エンド−1,4−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−L−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、及びこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項1乃至9の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項11】
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項10に記載の組換えホスト細胞。
【請求項12】
前記多糖分解酵素がcelZ遺伝子の発現産物である、請求項10又は11に記載の組換えホスト細胞。
【請求項13】
前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chrysanthemi)由来である、請求項12に記載の組換えホスト細胞。
【請求項14】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項1乃至13の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項15】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセアエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項1乃至14の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項16】
前記第二の異種のポリヌクレオチドがエルウィニア−アウト遺伝子(Erwinia out)を含んで成る、請求項2に記載の組換えホスト細胞。
【請求項17】
前記細菌細胞が、K.オキシトカ、E.カロトボーラ(carotovora)、E.カロトボーラ亜種カロトボーラ、E.カロトボーラ亜種アトロセプティカ(atroseptica)、及びE.クリサンセミから成る群より選択される、請求項15に記載の組換えホスト細胞。
【請求項18】
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス(Zymomonas mobilis)由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項1乃至16の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項19】
前記サロゲート・プロモータが、SEQ ID NO:1若しくは2、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る、請求項17に記載の組換えホスト細胞。
【請求項20】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項1乃至18の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項21】
多糖分解酵素を外来のサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る、請求項19に記載の組換えエタノール生成性ホスト細胞。
【請求項22】
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス(Zymomonas mobilis)由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項20に記載の組換えホスト細胞。
【請求項23】
前記サロゲート・プロモータが、SEQ ID NO:1若しくは2、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る前記サロゲート・プロモータである、請求項21に記載の組換えホスト細胞。
【請求項24】
SEQ ID:1若しくは2、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含むサロゲート・プロモータの転写制御下に第一のポリペプチドをコードする配列を含んで成る第一の異種のポリヌクレオチド部分;及び
第二の異種ポリヌクレオチド部分が分泌ポリペプチドをコードする配列を含んでなり、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける前記第一のポリペプチドの産生と比べて、ホスト細胞による第一のポリペプチドの産生の増加を引き起こすものである、組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞。
【請求項25】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が、異種のadh及びpdc遺伝子を含んで成る、請求項19又は23に記載の組換えホスト細胞。
【請求項26】
前記第一のポリペプチドが分泌される、請求項23に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項27】
前記組換え細菌ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項23又は24に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項28】
前記組換え細菌ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項25に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項29】
前記組換え細菌ホスト細胞が、エシェリヒア及びクレブシエラから成る群より選択される、請求項26に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項30】
前記エシェリヒア及びクレブシエラが、E.コリ B、E.コリ DH5α、E.コリ K04(ATCC 55123)、E.コリ K011(ATCC 55124)、E.コリ K012(ATCC 55125)、E.コリ LY01、K.オキシトカM5A1及びK.オキシトカP2(ATCC 55307)から成る群より選択される、請求項27に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項31】
前記第一のポリペプチドが多糖分解酵素である、請求項23乃至28に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項32】
前記産生増加が活性の増大を含むものである、請求項29に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項33】
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンド−1,4−α−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−L−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項29又は30に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項34】
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項31に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項35】
前記グルカナーゼがcelZ遺伝子の発現産物である、請求項32に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項36】
前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chrysanthemi)由来である、請求項33に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項37】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項23乃至34の何れかに記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項38】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項23乃至35に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項39】
前記細菌細胞が、K.オキシトカ、E.カロトボーラ(carotovora)、E.カロトボーラ亜種カロトボーラ、E.カロトボーラ亜種アトロセプティカ(atroseptica)、及びE.クリサンセミから成る群より選択される、請求項36に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項40】
オリゴ糖を提供するステップ;及び
請求項1乃至22の何れかに記載の組換えホスト細胞に、前記オリゴ糖を接触させるステップ
を含んで成るオリゴ糖を酵素分解する方法であって、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖が酵素分解されるよう、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成を増加させる、方法。
【請求項41】
前記方法が、水溶液中で行われる、請求項38に記載の方法。
【請求項42】
前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項38又は39に記載の方法。
【請求項43】
前記オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項38乃至40の何れかに記載の方法。
【請求項44】
組換えホスト細胞中の目的遺伝子の発現を増加させることのできるサロゲート・プロモータを特定する方法であって、 一生物のゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の断片に断片化するステップと、 前記目的遺伝子を、少なくとも一つの断片の転写制御下に置くステップと、 前記断片及び目的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、 前記目的遺伝子の発現が増加したことで、前記断片がサロゲート・プロモータであることが示されている、発現が増加した組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、方法。
【請求項45】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んで成り、その天然のプロモーターの転写制御下で前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分を、前記ホスト細胞に導入するステップ;及び
分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチド部分を前記ホスト細胞に導入するステップ;
を含むものであり、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分の発現の欠如に於ける前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生が増加するものであり、
同時糖化発酵に用いることができる、請求項1乃至22の何れかに記載の組換えホスト細胞を作製する方法 。
【請求項46】
pLOI2306(SEQ ID NO:12)のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタ。
【請求項47】
請求項44に記載のベクターを含んで成る組換えホスト細胞。
【請求項48】
pLOI2306(SEQ ID NO:12)のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 前記ベクタが安定に組み込まれた組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞を作成する方法。
【請求項49】
pLOI2306(SEQ ID NO:12)のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 多糖分解酵素を発現している組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞で多糖分解酵素を発現させる方法。
【請求項50】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項46又は47に記載の方法。
【請求項51】
請求項19乃至22の何れかに記載のエタノール生成性組換えホスト細胞に前記オリゴ糖源を接触させるステップを含み、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖源が酵素分解されて発酵してエタノールになるよう、前記エタノール生成性組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成が増加するものである、
オリゴ糖源からエタノールを生成する方法。
【請求項52】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が異種のadh及びpdc遺伝子を含んで成る、請求項48又は49に記載の方法
【請求項53】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が第二の異種のポリヌクレオチド部分として、少なくとも一つのpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、組換えホスト細胞を用いる請求項49に記載の方法。
【請求項54】
前記方法が水溶液中で行われる、請求項49又は50に記載の方法。
【請求項55】
前記オリゴ糖がリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項49乃至51の何れかに記載の方法。
【請求項56】
前記第一の異種のポリヌクレオチド部分が、pLOI2306(SEQ ID NO:12)であるか、又は、pLOI2306(SEQ ID NO:12)由来である、請求項49乃至52の何れかに記載の方法。
【請求項1】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んでなり、天然のプロモータの転写制御下での前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素ポリペプチドの発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分;及び
分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種ポリヌクレオチド部分であって、前記第一のポリヌクレオチド部分及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける多糖分解酵素の産生と比べて、組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生の増加を引き起こすものである第二の異種ポリヌクレオチド部分、を含んでなる組換えホスト細胞。
【請求項2】
前記産生の増加が前記多糖分解酵素の活性の増大、前記多糖類の量の増加又は活性の増大及び量の増加の組み合わせを含むものである、請求項1に記載の組換えホスト細胞。
【請求項3】
前記多糖分解酵素ポリペプチドが分泌される、請求項1又は2に記載の組換えホスト細胞。
【請求項4】
前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項1乃至3の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項5】
前記ホスト細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項4に記載の組換えホスト細胞。
【請求項6】
前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項5に記載の組換えホスト細胞。
【請求項7】
前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)科から選択される、請求項6に記載の組換えホスト細胞。
【請求項8】
前記ホスト細胞が、エシェリヒア(Escherichia)及びクレブシエラ(Klebsiella)から成る群より選択される、請求項7に記載の組換えホスト細胞。
【請求項9】
前記エシェリヒアが、 E.コリ(coli)B、E.コリ DH5α、E.コリ K04(ATCC 55123)、E.コリ K011(ATCC 55124)、E.コリ K012(ATCC 55125)及びE.コリ LY01(ATCC PTA−3466)、K.オキシトカ(oxytoca)M5A1(ATCC 68564)、及びK.オキシトカ P2(ATCC 55307)から成る群より選択される、請求項8に記載の組換えホスト細胞。
【請求項10】
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、エンド−1,4−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−L−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、及びこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項1乃至9の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項11】
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項10に記載の組換えホスト細胞。
【請求項12】
前記多糖分解酵素がcelZ遺伝子の発現産物である、請求項10又は11に記載の組換えホスト細胞。
【請求項13】
前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chrysanthemi)由来である、請求項12に記載の組換えホスト細胞。
【請求項14】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項1乃至13の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項15】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセアエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項1乃至14の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項16】
前記第二の異種のポリヌクレオチドがエルウィニア−アウト遺伝子(Erwinia out)を含んで成る、請求項2に記載の組換えホスト細胞。
【請求項17】
前記細菌細胞が、K.オキシトカ、E.カロトボーラ(carotovora)、E.カロトボーラ亜種カロトボーラ、E.カロトボーラ亜種アトロセプティカ(atroseptica)、及びE.クリサンセミから成る群より選択される、請求項15に記載の組換えホスト細胞。
【請求項18】
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス(Zymomonas mobilis)由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項1乃至16の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項19】
前記サロゲート・プロモータが、SEQ ID NO:1若しくは2、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る、請求項17に記載の組換えホスト細胞。
【請求項20】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項1乃至18の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項21】
多糖分解酵素を外来のサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る、請求項19に記載の組換えエタノール生成性ホスト細胞。
【請求項22】
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス(Zymomonas mobilis)由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項20に記載の組換えホスト細胞。
【請求項23】
前記サロゲート・プロモータが、SEQ ID NO:1若しくは2、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る前記サロゲート・プロモータである、請求項21に記載の組換えホスト細胞。
【請求項24】
SEQ ID:1若しくは2、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含むサロゲート・プロモータの転写制御下に第一のポリペプチドをコードする配列を含んで成る第一の異種のポリヌクレオチド部分;及び
第二の異種ポリヌクレオチド部分が分泌ポリペプチドをコードする配列を含んでなり、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける前記第一のポリペプチドの産生と比べて、ホスト細胞による第一のポリペプチドの産生の増加を引き起こすものである、組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞。
【請求項25】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が、異種のadh及びpdc遺伝子を含んで成る、請求項19又は23に記載の組換えホスト細胞。
【請求項26】
前記第一のポリペプチドが分泌される、請求項23に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項27】
前記組換え細菌ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項23又は24に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項28】
前記組換え細菌ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項25に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項29】
前記組換え細菌ホスト細胞が、エシェリヒア及びクレブシエラから成る群より選択される、請求項26に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項30】
前記エシェリヒア及びクレブシエラが、E.コリ B、E.コリ DH5α、E.コリ K04(ATCC 55123)、E.コリ K011(ATCC 55124)、E.コリ K012(ATCC 55125)、E.コリ LY01、K.オキシトカM5A1及びK.オキシトカP2(ATCC 55307)から成る群より選択される、請求項27に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項31】
前記第一のポリペプチドが多糖分解酵素である、請求項23乃至28に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項32】
前記産生増加が活性の増大を含むものである、請求項29に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項33】
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンド−1,4−α−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−L−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項29又は30に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項34】
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項31に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項35】
前記グルカナーゼがcelZ遺伝子の発現産物である、請求項32に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項36】
前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chrysanthemi)由来である、請求項33に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項37】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項23乃至34の何れかに記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項38】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項23乃至35に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項39】
前記細菌細胞が、K.オキシトカ、E.カロトボーラ(carotovora)、E.カロトボーラ亜種カロトボーラ、E.カロトボーラ亜種アトロセプティカ(atroseptica)、及びE.クリサンセミから成る群より選択される、請求項36に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項40】
オリゴ糖を提供するステップ;及び
請求項1乃至22の何れかに記載の組換えホスト細胞に、前記オリゴ糖を接触させるステップ
を含んで成るオリゴ糖を酵素分解する方法であって、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖が酵素分解されるよう、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成を増加させる、方法。
【請求項41】
前記方法が、水溶液中で行われる、請求項38に記載の方法。
【請求項42】
前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項38又は39に記載の方法。
【請求項43】
前記オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項38乃至40の何れかに記載の方法。
【請求項44】
組換えホスト細胞中の目的遺伝子の発現を増加させることのできるサロゲート・プロモータを特定する方法であって、 一生物のゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の断片に断片化するステップと、 前記目的遺伝子を、少なくとも一つの断片の転写制御下に置くステップと、 前記断片及び目的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、 前記目的遺伝子の発現が増加したことで、前記断片がサロゲート・プロモータであることが示されている、発現が増加した組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、方法。
【請求項45】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んで成り、その天然のプロモーターの転写制御下で前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分を、前記ホスト細胞に導入するステップ;及び
分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチド部分を前記ホスト細胞に導入するステップ;
を含むものであり、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分の発現の欠如に於ける前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生が増加するものであり、
同時糖化発酵に用いることができる、請求項1乃至22の何れかに記載の組換えホスト細胞を作製する方法 。
【請求項46】
pLOI2306(SEQ ID NO:12)のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタ。
【請求項47】
請求項44に記載のベクターを含んで成る組換えホスト細胞。
【請求項48】
pLOI2306(SEQ ID NO:12)のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 前記ベクタが安定に組み込まれた組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞を作成する方法。
【請求項49】
pLOI2306(SEQ ID NO:12)のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 多糖分解酵素を発現している組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞で多糖分解酵素を発現させる方法。
【請求項50】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項46又は47に記載の方法。
【請求項51】
請求項19乃至22の何れかに記載のエタノール生成性組換えホスト細胞に前記オリゴ糖源を接触させるステップを含み、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖源が酵素分解されて発酵してエタノールになるよう、前記エタノール生成性組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成が増加するものである、
オリゴ糖源からエタノールを生成する方法。
【請求項52】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が異種のadh及びpdc遺伝子を含んで成る、請求項48又は49に記載の方法
【請求項53】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が第二の異種のポリヌクレオチド部分として、少なくとも一つのpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、組換えホスト細胞を用いる請求項49に記載の方法。
【請求項54】
前記方法が水溶液中で行われる、請求項49又は50に記載の方法。
【請求項55】
前記オリゴ糖がリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項49乃至51の何れかに記載の方法。
【請求項56】
前記第一の異種のポリヌクレオチド部分が、pLOI2306(SEQ ID NO:12)であるか、又は、pLOI2306(SEQ ID NO:12)由来である、請求項49乃至52の何れかに記載の方法。
別の実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ(Enterobacteriaceae)科である。別の関連する実施例では、組換えホスト細胞は、エシェリヒア(Escherichia)属又はクレブシエラ(Klebsiella)属のものであり、好ましくは株E. コリ(coli)B(ATCC 11303)、E. コリDH5α、 E.コリK04(ATCC 55123)、E.コリK011(ATCC 55124)、E.コリK012(ATCC 55125)、E.コリLY01(ATCC PTA−3466)、K. オキシトカ(oxytoca)M5A1(ATCC 68564)、K.オキシトカP2(ATCC 55307)である。
一実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ科由来である。関連する実施例では、前記組換えエタノール生成性ホスト細胞は、エシェリヒア(Escherichia)属又はクレブシエラ(Klebsiella)属のものであり、好ましくは株E.コリB(ATCC 11303)、E.コリDH5α、E.コリK04(ATCC 55123)、E.コリK011(ATCC 55124)、E.コリK012(ATCC 55125)、E.コリLY01(ATCC PTA−3466)、K.オキシトカM5A1(ATCC 68564)、K.オキシトカP2(ATCC 55307)である。
三番目の態様では、本発明は、第一のポリペプチドをコードする配列を含有する第一の異種のポリヌクレオチド部分と、分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分と、を含有する組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞を特徴とし、前記第一の異種のポリヌクレオチドは、サロゲート・プロモータの転写制御下にあり、このホスト細胞による前記第一のポリペプチドの産生が増加させられる。
別の実施例では、前記組換えホスト細胞は通性嫌気性細菌細胞である。関連する実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科由来、好ましくはエシェリヒア(Escherichia)属又はクレブシエラ(Klebsiella)属のものであり、より好ましくは株E.コリB(ATCC 11303)、E.コリDH5α、E.コリK04(ATCC 55123)、E.コリK011(ATCC 55124)、E.コリK012(ATCC 55125)、又はE.コリLY01(ATCC PTA−3466)、K.オキシトカM5A1(ATCC 68564)、K.オキシトカP2(ATCC 55307)である。
好適な実施例では、本発明は、エタノール生成性でもある組換えホストを利用するものである。実施例の一つでは、この組換えホストはグラム陰性細菌である。別の実施例では、この組換えホストはエンテロバクテリアセエ科由来である。例えば、言及をもってここに編入する米国特許第5,821,093号のエタノール生成性ホストが適したホストであり、具体的には、E.コリ株K04(ATCC 55123)、K011(ATCC 55124)、及びK012(ATCC 55125)、及びクレブシエラ−オキシトカ(Klebsiella oxytoca)株M5A1がある。その代わりに、例えば、ジモモナス−モビリス(Zymomonas mobilis)など、効率的なエタノール生成生物由来のエタノール生成遺伝子を導入することで、本発明の非エタノール生成性ホスト(例えば上記の株など)をエタノール生成性ホストに変換してもよい。標準的な技術を用いたこの種類の遺伝子操作の結果、糖をエタノールに効率的に発酵させることのできる組換えホストが得られる。加えて、LY01エタノール耐性株(ATCC PTA−3466)を公開済みPCT国際出願WO98/45425号に説かれたように利用してもよく、この公開済み出願を言及をもってここに編入することとする(また、例えばYomanoら(1998)J.of Ind.Micro.&Bio.20:132−138を参照されたい)。
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