JP2003500058A5 - - Google Patents

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JP2003500058A5
JP2003500058A5 JP2000620106A JP2000620106A JP2003500058A5 JP 2003500058 A5 JP2003500058 A5 JP 2003500058A5 JP 2000620106 A JP2000620106 A JP 2000620106A JP 2000620106 A JP2000620106 A JP 2000620106A JP 2003500058 A5 JP2003500058 A5 JP 2003500058A5
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んでなり、天然のプロモータの転写制御下での前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素ポリペプチドの発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分；及び
分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種ポリヌクレオチド部分であって、前記第一のポリヌクレオチド部分及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける多糖分解酵素の産生と比べて、組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生の増加を引き起こすものである第二の異種ポリヌクレオチド部分、を含んでなる組換えホスト細胞。
【請求項２】
前記産生の増加が前記多糖分解酵素の活性の増大、前記多糖類の量の増加又は活性の増大及び量の増加の組み合わせを含むものである、請求項１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３】
前記多糖分解酵素ポリペプチドが分泌される、請求項１又は２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項４】
前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項１乃至３の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項５】
前記ホスト細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項４に記載の組換えホスト細胞。
【請求項６】
前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項５に記載の組換えホスト細胞。
【請求項７】
前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科から選択される、請求項６に記載の組換えホスト細胞。
【請求項８】
前記ホスト細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）から成る群より選択される、請求項７に記載の組換えホスト細胞。
【請求項９】
前記エシェリヒアが、 Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）Ｂ、Ｅ．コリ ＤＨ５α、Ｅ．コリ Ｋ０４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリ Ｋ０１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリ Ｋ０１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）及びＥ．コリ ＬＹ０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４６６）、Ｋ．オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）Ｍ５Ａ１（ＡＴＣＣ ６８５６４）、及びＫ．オキシトカ Ｐ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）から成る群より選択される、請求項８に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１０】
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、及びこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項１乃至９の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１１】
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項１０に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１２】
前記多糖分解酵素がｃｅｌＺ遺伝子の発現産物である、請求項１０又は１１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１３】
前記ｃｅｌＺ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来である、請求項１２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１４】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子を含んで成る、請求項１乃至１３の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１５】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセアエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項１乃至１４の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１６】
前記第二の異種のポリヌクレオチドがエルウィニア−アウト遺伝子（Ｅｒｗｉｎｉａ ｏｕｔ）を含んで成る、請求項２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１７】
前記細菌細胞が、Ｋ．オキシトカ、Ｅ．カロトボーラ（ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、及びＥ．クリサンセミから成る群より選択される、請求項１５に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１８】
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項１乃至１６の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１９】
前記サロゲート・プロモータが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくは２、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１７に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２０】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項１乃至１８の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項２１】
多糖分解酵素を外来のサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る、請求項１９に記載の組換えエタノール生成性ホスト細胞。
【請求項２２】
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項２０に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２３】
前記サロゲート・プロモータが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１若しくは２、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る前記サロゲート・プロモータである、請求項２１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２４】
ＳＥＱ ＩＤ：１若しくは２、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含むサロゲート・プロモータの転写制御下に第一のポリペプチドをコードする配列を含んで成る第一の異種のポリヌクレオチド部分；及び
第二の異種ポリヌクレオチド部分が分泌ポリペプチドをコードする配列を含んでなり、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける前記第一のポリペプチドの産生と比べて、ホスト細胞による第一のポリペプチドの産生の増加を引き起こすものである、組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞。
【請求項２５】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が、異種のａｄｈ及びｐｄｃ遺伝子を含んで成る、請求項１９又は２３に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２６】
前記第一のポリペプチドが分泌される、請求項２３に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項２７】
前記組換え細菌ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項２３又は２４に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項２８】
前記組換え細菌ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項２５に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項２９】
前記組換え細菌ホスト細胞が、エシェリヒア及びクレブシエラから成る群より選択される、請求項２６に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３０】
前記エシェリヒア及びクレブシエラが、Ｅ．コリ Ｂ、Ｅ．コリ ＤＨ５α、Ｅ．コリ Ｋ０４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリ Ｋ０１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリ Ｋ０１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、Ｅ．コリ ＬＹ０１、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１及びＫ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）から成る群より選択される、請求項２７に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３１】
前記第一のポリペプチドが多糖分解酵素である、請求項２３乃至２８に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３２】
前記産生増加が活性の増大を含むものである、請求項２９に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３３】
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンド−１，４−α−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項２９又は３０に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３４】
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項３１に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３５】
前記グルカナーゼがｃｅｌＺ遺伝子の発現産物である、請求項３２に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３６】
前記ｃｅｌＺ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来である、請求項３３に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３７】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子を含んで成る、請求項２３乃至３４の何れかに記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３８】
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項２３乃至３５に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３９】
前記細菌細胞が、Ｋ．オキシトカ、Ｅ．カロトボーラ（ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、及びＥ．クリサンセミから成る群より選択される、請求項３６に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項４０】
オリゴ糖を提供するステップ；及び
請求項１乃至２２の何れかに記載の組換えホスト細胞に、前記オリゴ糖を接触させるステップ
を含んで成るオリゴ糖を酵素分解する方法であって、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖が酵素分解されるよう、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成を増加させる、方法。
【請求項４１】
前記方法が、水溶液中で行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項３８乃至４０の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
組換えホスト細胞中の目的遺伝子の発現を増加させることのできるサロゲート・プロモータを特定する方法であって、 一生物のゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の断片に断片化するステップと、 前記目的遺伝子を、少なくとも一つの断片の転写制御下に置くステップと、 前記断片及び目的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、 前記目的遺伝子の発現が増加したことで、前記断片がサロゲート・プロモータであることが示されている、発現が増加した組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、方法。
【請求項４５】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んで成り、その天然のプロモーターの転写制御下で前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分を、前記ホスト細胞に導入するステップ；及び
分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチド部分を前記ホスト細胞に導入するステップ；
を含むものであり、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分の発現の欠如に於ける前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生が増加するものであり、
同時糖化発酵に用いることができる、請求項１乃至２２の何れかに記載の組換えホスト細胞を作製する方法 。
【請求項４６】
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタ。
【請求項４７】
請求項４４に記載のベクターを含んで成る組換えホスト細胞。
【請求項４８】
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 前記ベクタが安定に組み込まれた組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞を作成する方法。
【請求項４９】
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 多糖分解酵素を発現している組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞で多糖分解酵素を発現させる方法。
【請求項５０】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１９乃至２２の何れかに記載のエタノール生成性組換えホスト細胞に前記オリゴ糖源を接触させるステップを含み、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖源が酵素分解されて発酵してエタノールになるよう、前記エタノール生成性組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成が増加するものである、
オリゴ糖源からエタノールを生成する方法。
【請求項５２】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が異種のａｄｈ及びｐｄｃ遺伝子を含んで成る、請求項４８又は４９に記載の方法
【請求項５３】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が第二の異種のポリヌクレオチド部分として、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子を含んで成る、組換えホスト細胞を用いる請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が水溶液中で行われる、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴ糖がリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項４９乃至５１の何れかに記載の方法。
【請求項５６】
前記第一の異種のポリヌクレオチド部分が、ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）であるか、又は、ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）由来である、請求項４９乃至５２の何れかに記載の方法。 [Claims]
(1)
A sequence encoding the polysaccharide degrading enzyme under the transcriptional control of a surrogate promoter, wherein the promoter is a polysaccharide degrading enzyme polypeptide compared to the expression of the polysaccharide degrading enzyme under the transcriptional control of a natural promoter. A first heterologous polynucleotide portion that causes increased expression; and
A second heterologous polynucleotide portion containing a sequence encoding a secreted polypeptide, wherein expression of said first polynucleotide portion and second polynucleotide portion is under the transcriptional control of its native promoter and A second heterologous polynucleotide portion that causes an increase in production of the polysaccharide degrading enzyme by the recombinant host cell as compared to production of the polysaccharide degrading enzyme when the second polynucleotide portion is not expressed. Recombinant host cells.
(2)
2. The recombinant host cell of claim 1, wherein the increase in production comprises an increase in the activity of the polysaccharide degrading enzyme, an increase in the amount of the polysaccharide or a combination of an increase in the activity and an increase in the amount.
(3)
The recombinant host cell according to claim 1 or 2, wherein the polysaccharide-degrading enzyme polypeptide is secreted.
(4)
The recombinant host cell according to any one of claims 1 to 3, wherein the host cell is a bacterial cell.
(5)
5. The recombinant host cell according to claim 4, wherein said host cell is a Gram-negative bacterial cell.
6.
The recombinant host cell according to claim 5, wherein the host cell is a facultative anaerobic bacterial cell.
7.
7. The recombinant host cell according to claim 6, wherein said host cell is selected from the family Enterobacteriaceae.
Claim 8.
The recombinant host cell according to claim 7, wherein the host cell is selected from the group consisting of Escherichia and Klebsiella.
9.
Said Escherichia; Coli B, E. Coli DH5α, E. coli. E. coli K04 (ATCC 55123); E. coli K011 (ATCC 55124); Coli K012 (ATCC 55125) and E. coli K012. Coli LY01 (ATCC PTA-3466); Oxytoca M5A1 (ATCC 68564); 9. The recombinant host cell of claim 8, wherein the host cell is selected from the group consisting of Oxytoka P2 (ATCC 55307).
10.
The polysaccharide-degrading enzyme is glucanase, endoglucanase, exoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, endo-1,4-β-xylanase, α-xylosidase, α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase, acetyl Esterase, acetyl xylan esterase, α-amylase, β-amylase, glucoamylase, pullulanase, β-glucanase, hemicellulase, arabinosidase, mannanase, pectin hydrolase, pectate melting enzyme, and combinations thereof. The recombinant host cell according to any one of claims 1 to 9, which is selected.
11.
The recombinant host cell according to claim 10, wherein the polysaccharide-degrading enzyme is glucanase.
12.
The recombinant host cell according to claim 10, wherein the polysaccharide-degrading enzyme is an expression product of a celZ gene.
Claim 13
13. The recombinant host cell according to claim 12, wherein said celZ gene is derived from Erwinia chrysanthemi.
14.
14. The recombinant host cell according to any one of claims 1 to 13, wherein the second heterologous polynucleotide portion comprises at least one pu gene or out gene.
15.
15. The recombinant host cell according to any of claims 1 to 14, wherein said second heterologous polynucleotide portion is derived from a bacterial cell selected from the family Enterobacteriaceae.
16.
3. The recombinant host cell according to claim 2, wherein the second heterologous polynucleotide comprises an Erwinia out gene (Erwinia out).
17.
The bacterial cell is K. Oxytoka, E. Carotovora, E. coli. Carotobola subsp. Carotobora subsp. Atroseptica, and E. coli. 16. The recombinant host cell of claim 15, wherein the host cell is selected from the group consisting of chrysanthemum.
18.
17. The recombinant host cell according to any one of claims 1 to 16, wherein the surrogate promoter comprises a polynucleotide fragment from Zymomonas mobilis.
(19)
18. The recombinant host cell of claim 17, wherein the surrogate promoter comprises the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or a fragment thereof.
20.
19. The recombinant host cell according to any of claims 1 to 18, wherein said recombinant host cell is ethanologenic.
21.
20. The recombinant ethanologenic host cell of claim 19, comprising a heterologous polynucleotide portion encoding a polysaccharide degrading enzyme under the transcriptional control of a foreign surrogate promoter.
22.
21. The recombinant host cell of claim 20, wherein the surrogate promoter comprises a polynucleotide fragment from Zymomonas mobilis.
23.
22. The recombinant host cell of claim 21, wherein the surrogate promoter is the surrogate promoter comprising a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or a fragment thereof.
24.
A second heterologous polynucleotide portion comprising a sequence encoding a first polypeptide under the transcriptional control of a surrogate promoter comprising the polynucleotide sequence of SEQ ID: 1 or 2, or a fragment thereof; and The heterologous polynucleotide portion comprises a sequence encoding a secreted polypeptide, wherein expression of said first and second polynucleotide portions is under the transcriptional control of its native promoter and said second polynucleotide portion is not expressed A recombinant ethanologenic Gram-negative bacterial host cell, which causes an increase in production of the first polypeptide by the host cell relative to the production of the first polypeptide in some cases.
25.
24. The recombinant host cell according to claim 19 or 23, wherein the ethanol-producing recombinant host cell comprises a heterologous adh and pdc gene.
26.
24. The recombinant bacterial host cell of claim 23, wherein said first polypeptide is secreted.
27.
The recombinant bacterial host cell according to claim 23 or 24, wherein the recombinant bacterial host cell is a facultative anaerobic bacterial cell.
28.
26. The recombinant bacterial host cell of claim 25, wherein said recombinant bacterial host cell is selected from the family Enterobacteriaceae.
29.
27. The recombinant bacterial host cell of claim 26, wherein said recombinant bacterial host cell is selected from the group consisting of Escherichia and Klebsiella.
30.
The Escherichia and Klebsiella are E. coli. Coli B, E. Coli DH5α, E. coli. E. coli K04 (ATCC 55123); E. coli K011 (ATCC 55124); E. coli K012 (ATCC 55125); Coli LY01, K.I. Oxytoka M5A1 and K.I. 28. The recombinant bacterial host cell of claim 27, wherein the host cell is selected from the group consisting of oxytoca P2 (ATCC 55307).
31.
29. The recombinant bacterial host cell of claim 23, wherein said first polypeptide is a polysaccharide degrading enzyme.
32.
30. The recombinant bacterial host cell of claim 29, wherein said increased production comprises increased activity.
33.
The polysaccharide-degrading enzyme is glucanase, endoglucanase, exoglucanase, cellobiohydrolase, α-glucosidase, endo-1,4-α-xylanase, β-xylosidase, β-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase, acetyl Esterase, acetylxylan esterase, α-amylase, β-amylase, glucoamylase, pullulanase, β-glucanase, hemicellulase, arabinosidase, mannanase, pectin hydrolase, pectate melting enzyme, or a combination thereof. 31. The recombinant bacterial host cell according to claim 29 or 30, which is selected.
34.
32. The recombinant bacterial host cell of claim 31, wherein said polysaccharide degrading enzyme is glucanase.
35.
33. The recombinant bacterial host cell of claim 32, wherein said glucanase is an expression product of the celZ gene.
36.
34. The recombinant bacterial host cell according to claim 33, wherein said celZ gene is derived from Erwinia chrysanthemi.
37.
35. The recombinant bacterial host cell according to any of claims 23 to 34, wherein the second heterologous polynucleotide portion comprises at least one pu gene or out gene.
38.
36. The recombinant bacterial host cell of claims 23-35, wherein said second heterologous polynucleotide portion is derived from a bacterial cell selected from the family Enterobacteriaceae.
39.
The bacterial cell is K. Oxytoka, E. Carotovora, E. coli. Carotobola subsp. Carotobora subsp. Atroseptica, and E. coli. 37. The recombinant bacterial host cell of claim 36, wherein the host cell is selected from the group consisting of chrysanthemum.
40.
23. A method for enzymatically degrading an oligosaccharide, comprising: providing an oligosaccharide; and contacting the oligosaccharide with a recombinant host cell according to any of claims 1 to 22, wherein And increasing the production of polysaccharidase activity by the recombinant host cell such that the oligosaccharide is enzymatically degraded as a result of the expression of the second polynucleotide moiety.
41.
39. The method of claim 38, wherein said method is performed in an aqueous solution.
42.
40. The method according to claim 38 or 39, wherein said method is used for simultaneous saccharification and fermentation.
Claim 43
41. The method according to any of claims 38 to 40, wherein the oligosaccharide is selected from the group consisting of lignocellulose, hemicellulose, cellulose, pectin and any combination thereof.
44.
A method for identifying a surrogate promoter capable of increasing expression of a gene of interest in a recombinant host cell, comprising the steps of: fragmenting a genomic polynucleotide of one organism into one or more fragments; Placing the gene under the transcriptional control of at least one fragment; introducing the fragment and the target gene into a host cell; and increasing the expression of the target gene, whereby the fragment is a surrogate promoter. Identifying a recombinant host cell with increased expression.
45.
Comprising a sequence encoding a polysaccharide degrading enzyme under the transcriptional control of a surrogate promoter, wherein the promoter increases expression of the polysaccharide degrading enzyme as compared to the expression of the polysaccharide degrading enzyme under the transcriptional control of its natural promoter. Introducing into the host cell a first heterologous polynucleotide moiety that causes
Introducing into the host cell a second heterologous polynucleotide portion comprising a sequence encoding a secreted polypeptide;
Including
The expression of the first and second polynucleotide portions is compared to the expression of the polysaccharide degrading enzyme under the transcriptional control of its native promoter and in the absence of expression of the second polynucleotide portion. The production of polysaccharide degrading enzymes by the modified host cells is increased,
The method for producing a recombinant host cell according to any one of claims 1 to 22, which can be used for simultaneous saccharification and fermentation.
46.
A vector comprising the polynucleotide sequence of pLOI2306 (SEQ ID NO: 12).
47.
A recombinant host cell comprising the vector of claim 44.
48.
a recombinant host cell comprising the steps of: introducing a vector comprising a polynucleotide sequence of pLOI2306 (SEQ ID NO: 12) into a host cell; and identifying a recombinant host cell into which the vector has been stably integrated. How to create.
49.
A recombinant host cell comprising the steps of: introducing a vector comprising the polynucleotide sequence of pLOI2306 (SEQ ID NO: 12) into a host cell; and identifying a recombinant host cell expressing a polysaccharide-degrading enzyme. A method for expressing a polysaccharide-degrading enzyme in the method.
50.
48. The method of claim 46 or 47, wherein the recombinant host cells are ethanologenic.
51.
Contacting the oligosaccharide source with the ethanol-producing recombinant host cell according to any of claims 19 to 22,
As a result of the expression of the first and second polynucleotide portions, the production of polysaccharidase activity by the ethanol-producing recombinant host cells is increased such that the oligosaccharide source is enzymatically degraded and fermented to ethanol. Is a thing,
A method for producing ethanol from an oligosaccharide source.
52.
53. The method of claim 48 or 49, wherein said ethanologenic recombinant host cell comprises a heterologous adh and pdc gene.
50. The method of claim 49, wherein said ethanologenic recombinant host cell comprises a recombinant host cell comprising at least one pu gene or out gene as a second heterologous polynucleotide moiety.
54.
The method according to claim 49 or 50, wherein the method is performed in an aqueous solution.
55.
52. The method according to any of claims 49 to 51, wherein said oligosaccharide is selected from the group consisting of lignocellulose, hemicellulose, cellulose, pectin and any combination thereof.
56.
53. The method of any one of claims 49 to 52, wherein the first heterologous polynucleotide portion is pLOI2306 (SEQ ID NO: 12) or is derived from pLOI2306 (SEQ ID NO: 12).

別の実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科である。別の関連する実施例では、組換えホスト細胞は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のものであり、好ましくは株E. コリ（ｃｏｌｉ）Ｂ（ＡＴＣＣ １１３０３）、Ｅ． コリＤＨ５α、 Ｅ．コリＫ０４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリＫ０１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリＫ０１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、Ｅ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４６６）、K. オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）Ｍ５Ａ１（ＡＴＣＣ ６８５６４）、Ｋ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）である。 In another embodiment, the host cell is a bacterial cell, preferably a Gram-negative facultative anaerobic bacterium, of the family Enterobacteriaceae. In another related embodiment, the recombinant host cell is of the genus Escherichia or Klebsiella, preferably strain E. coli B (ATCC 11303), E. coli B. E. coli DH5α, E. coli. E. coli K04 (ATCC 55123), E. coli. Coli K011 (ATCC 55124); E. coli K012 (ATCC 55125); Coli LY01 (ATCC PTA-3466); K. oxytoca M5A1 (ATCC 68564); Oxytoka P2 (ATCC 55307).

一実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ科由来である。関連する実施例では、前記組換えエタノール生成性ホスト細胞は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のものであり、好ましくは株Ｅ．コリＢ（ＡＴＣＣ １１３０３）、Ｅ．コリＤＨ５α、Ｅ．コリＫ０４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリＫ０１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリＫ０１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、Ｅ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４６６）、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１（ＡＴＣＣ ６８５６４）、Ｋ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）である。 In one embodiment, the host cell is a bacterial cell, preferably a Gram-negative facultative anaerobic bacterium, from the family Enterobacteriaceae. In a related embodiment, the recombinant ethanologenic host cell is of the genus Escherichia or Klebsiella, preferably strain E. coli. Coli B (ATCC 11303), E. coli. Coli DH5α, E. coli. E. coli K04 (ATCC 55123), E. coli. Coli K011 (ATCC 55124); E. coli K012 (ATCC 55125); Coli LY01 (ATCC PTA-3466); Oxytoca M5A1 (ATCC 68564); Oxytoka P2 (ATCC 55307).

三番目の態様では、本発明は、第一のポリペプチドをコードする配列を含有する第一の異種のポリヌクレオチド部分と、分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分と、を含有する組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞を特徴とし、前記第一の異種のポリヌクレオチドは、サロゲート・プロモータの転写制御下にあり、このホスト細胞による前記第一のポリペプチドの産生が増加させられる。 In a third aspect, the invention provides a first heterologous polynucleotide portion containing a sequence encoding a first polypeptide and a second heterologous polynucleotide portion containing a sequence encoding a secreted polypeptide. Wherein the first heterologous polynucleotide is under the transcriptional control of a surrogate promoter, and wherein the first polypeptide is expressed by the host cell. Production is increased.

別の実施例では、前記組換えホスト細胞は通性嫌気性細菌細胞である。関連する実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科由来、好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のものであり、より好ましくは株Ｅ．コリＢ（ＡＴＣＣ １１３０３）、Ｅ．コリＤＨ５α、Ｅ．コリＫ０４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリＫ０１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリＫ０１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、又はＥ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４６６）、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１（ＡＴＣＣ ６８５６４）、Ｋ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）である。 In another embodiment, the recombinant host cells are facultative anaerobic bacterial cells. In a related embodiment, the host cell is from the family Enterobacteriaceae, preferably of the genus Escherichia or Klebsiella, more preferably the strain E. coli. Coli B (ATCC 11303), E. coli. Coli DH5α, E. coli. E. coli K04 (ATCC 55123), E. coli. Coli K011 (ATCC 55124); E. coli K012 (ATCC 55125), or E. coli. Coli LY01 (ATCC PTA-3466); Oxytoca M5A1 (ATCC 68564); Oxytoka P2 (ATCC 55307).

好適な実施例では、本発明は、エタノール生成性でもある組換えホストを利用するものである。実施例の一つでは、この組換えホストはグラム陰性細菌である。別の実施例では、この組換えホストはエンテロバクテリアセエ科由来である。例えば、言及をもってここに編入する米国特許第５，８２１，０９３号のエタノール生成性ホストが適したホストであり、具体的には、Ｅ．コリ株Ｋ０４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｋ０１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、及びＫ０１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、及びクレブシエラ−オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）株Ｍ５Ａ１がある。その代わりに、例えば、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）など、効率的なエタノール生成生物由来のエタノール生成遺伝子を導入することで、本発明の非エタノール生成性ホスト（例えば上記の株など）をエタノール生成性ホストに変換してもよい。標準的な技術を用いたこの種類の遺伝子操作の結果、糖をエタノールに効率的に発酵させることのできる組換えホストが得られる。加えて、ＬＹ０１エタノール耐性株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４６６）を公開済みＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／４５４２５号に説かれたように利用してもよく、この公開済み出願を言及をもってここに編入することとする（また、例えばＹｏｍａｎｏら（１９９８）Ｊ．ｏｆ Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．＆Ｂｉｏ．２０：１３２−１３８を参照されたい）。 In a preferred embodiment, the present invention utilizes a recombinant host that is also ethanologenic. In one embodiment, the recombinant host is a gram-negative bacterium. In another embodiment, the recombinant host is from the family Enterobacteriaceae. For example, the ethanologenic host of US Pat. No. 5,821,093, which is incorporated herein by reference, is a suitable host, and in particular E. coli. There are E. coli strains K04 (ATCC 55123), K011 (ATCC 55124), and K012 (ATCC 55125), and Klebsiella oxytoca strain M5A1. Instead, the non-ethanologenic host of the present invention (e.g., the strains described above) may be produced by introducing an efficient ethanologenic gene from an ethanologenic organism, such as, for example, Zymomonas mobilis. May be converted to a sex host. This type of genetic manipulation using standard techniques results in a recombinant host that can efficiently ferment sugar to ethanol. In addition, the LY01 ethanol resistant strain (ATCC PTA-3466) may be utilized as described in published PCT International Application WO 98/45425, which is hereby incorporated by reference. See also, for example, Yomano et al. (1998) J. of Ind. Micro. & Bio. 20: 132-138).

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