JP2001518789A

JP2001518789A - Development of Escherichia coli with high ethanol tolerance

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Publication number: JP2001518789A
Application number: JP54287898A
Authority: JP
Inventors: ロニーオー．イングラム; ロレインピー．ヨマノ; ショーンダブル．ヨーク
Original assignee: ユニバーシティーオブフロリダリサーチファウンデーション，インク．
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 2001-10-16
Also published as: AU6875298A; WO1998045425A9; EP0973882A1; CA2286334A1; ZA982742B; WO1998045425A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、親Escherichia coli K011が生存できるエタノール濃度を超えるエタノール濃度で成長及び生存する能力を呈する、Escherichia coli K011の新規な変異体であるエタノール産生細菌を同定する新規な選別プロセスに関するものである。エタノール耐性に関する選別と、多量のクロラムフェニコールを含有する固体培地での急速な成長に関する選別とを交互に行なうこの新規なアプローチにより、エタノール生成に有用となり得る株が得られた。 (57) [Summary] The present invention relates to a novel selection process for identifying a novel mutant of Escherichia coli K011, an ethanol-producing bacterium that exhibits the ability to grow and survive at ethanol concentrations above that at which the parent Escherichia coli K011 can survive. . This new approach of alternating between selection for ethanol tolerance and selection for rapid growth on solid media containing high amounts of chloramphenicol has yielded strains that may be useful for ethanol production.

Description

【発明の詳細な説明】エタノール耐性の高いEscherichia coliの開発発明の背景反故紙及びその他のリグノセルロース産品、例えば穀物残渣など、の発酵によるエタノールの生成は、環境のゴミ問題を解消し、また石油燃料を基にした自動車燃料への依存を減らすための機会をもたらすものである。ヘミセルロースの加水分解で生じるペントース及びヘキトース糖類の両方をエタノールに転化させる Escherichia coli K011(米国特許第5,000,000号)及びKlebsiella oxytoca P2（米国特許第5,424,202号）などの遺伝子操作された細菌が、これまでに開発されている。ショ糖や加水分解されたコーン・スターチからエタノールを商業生産する際に現在用いられているSaccharomycesなどの酵母に比較し、Escherichia coli K011 はエタノールに対する耐性がはるかに低い。従って、リグノセルロースなどから出来た糖類をエタノールに転化させることができる細菌が開発されながら、これらの細菌のエタノール耐性が、この発酵生物によって達成可能なはずのエタノール生成率及び最終エタノール濃度を制限しているという問題が残っている。発明の概要本発明は、Escherichia coli K011の新規な変異体が、親株のEscherichia col i K011が生存できるエタノール濃度を超える濃度で成長かつ生存する能力を呈するという発見に基づく。本発明は、さらに、エタノール耐性に関する液体培地での選別と、多量のクロラムフェニコールを含有する固体培地での急速な成長に関する選別とを交互に行なうという、優れたエタノール選別プロセスの発見にも基づくものである。この選別プロセスの結果、上述したように、エタノール生成にとって有用なEscherichia coli K011の新規な株が得られた。またこの新しい方法を用い、親株のE.coli K011に比べてエタノールを20％多く生成し、より早く発酵を終了する変異体を作ることができたことが発見された。さらに、親株は35g/Lエタノールでも成長ができないのに対し、当該変異体は最大で50g/Lのエタノールで成長することができる。最後に、親株とは対照的に、当該変異体は100g/Lエタノールという劇的に高い生存暴露度を呈する。当該変異体の持つこれらの特徴は、短時間で高濃度のエタノールが得られ、また栄養物質、資本設備、製品回収、及び廃棄物処理の費用を削減できることで、リグノセルロースの加水分解産物からエタノールを生成する際の費用を削減できることを意味するものである。ある一つの実施例では、本発明はエタノール産生微生物を選別する方法を含み、前記方法は、該微生物を液体培地及び固体培地に順に接触させるステップを含むが、このとき前記の液体培地を用いてエタノール耐性について選別が行なわれ、前記固体培地を用いて、成長可能かつエタノール産生可能なエタノール産生微生物について選別が行なわれるものである。ある好適な実施例では、本発明は、次第に濃度を濃くしたエタノールを含有する液体培地と、抗生物質、及び上記の選別プロ七スに用いる発酵可能な糖とを含有する固体培地とを含む。別の実施例では、本発明は、35g/Lを超えるエタノール濃度で成長可能なエタノール産生微生物を含む。ある好適な実施例では、当該エタノール産生微生物は、Erwinia、Klebsiella、Xanthomonas、Zymomonas及びEscherichia、特にK.oxyt oca及びE.coliのうちのいずれかから選択される。より好適な実施例では、E.col i細菌はLY01、LY02及びLY03のうちのいずれかから選択される。更に別の実施例では、本発明は親細菌、好ましくはEscherichia coli K011、よりも少なくとも10％多いエタノールを、等価の発酵条件下で産生する能力を有するエタノール産生変異体を含む。さらに、サイクリックAMPレセプタたんぱく及び／又は活性生合成アラニンラセマーゼを不活化すると、エタノール耐性のより高い微生物ができることが発見された。図面の簡単な説明本発明の上述及びその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に示されるように、以下により詳しく記載した本発明の好適な実施例から明白となるであろう。尚、前記図面において同様の参照記号は、異なる図面を通じて同じ部分を言及するものである。図面は必ずしも実寸ではなく、本発明の原理の実例を挙げることに重きを置いている。図１Ａは、親Escherichia coli K011に比較して、次第に高くしたエタノール濃度で成長できる変異体の能力を示す。図１Ｂは、親Escherichia coli K011に比較して、10％のエタノール(w/w)で生存する変異体の能力を示す。図２Ａは、親Escherichia coli K011に比較して、グルコースの存在下及びエタノールの不在下で成長する変異体の能力を示す。図２Ｂは、3.5％のエタノール及び一定のグルコース中に置いた親Escherichia coli K011株に比較して、様々な濃度のエタノール及び一定のグルコース中で成長するLY01変異体の能力を示す。図２Ｃは、親Escherichia coli K011株に比較して、キシロースの存在下及びエタノールの不在下で成長する変異体の能力を示す。図２Ｄは、3.5％のエタノール及び一定のキシロース中に置いた親Escherichia coli K011株に比較して、様々な濃度のエタノール及び一定のキシロース中で成長するLY01変異体の能力を示す。図３Ａは、親Escherichia coli K011に比較して、次第に濃度を高くしたグルコースに対する変異体の浸透圧許容性を示す。図３Ｂは、親Escherichia coli K011に比較して、次第に濃度を高くしたキシロースに対する変異体の浸透圧許容性を示す。図４Ａは、親Escherichia coli K011に比較して、14％のグルコースをエタノールに転化させる変異体の能力を示す。図４Ｂは、親Escherichia coli K011に比較して、14％のキシロースをエタノールに転化させる変異体の能力を示す。図５は、pLOI1531及びサブクローンのマップを示す。このマップはK011から採ったインサートＤＮＡのものである。ベクタは示していない。図６は、pLOI1534及びサブクローンのマップである。発明の詳細な説明上述したように、本発明はエタノール耐性の高いエタノール産生変異体に関するものである。ある一つの実施例では、当該変異体は、等価条件下で成長させたときに親細菌（例えばEscherichia coli K011）よりも少なくとも10％多いエタノールを産生することができる。別の実施例では、当該変異体は、親微生物のそれを超えるエタノール濃度中で成長することができる。本発明による微生物（例えばエタノール産生微生物）、又は「変異体」は、（１）親微生物（例えばエタノール産生微生物）を、エタノールを含む水溶液を含む第一液体培地に接触させ、生存する一つ又はそれ以上の微生物を選別するステップと、（２）前記のステップで得られた一つ又はそれ以上の微生物を、成長が可能な充分な時間、固体成長培地に接触させるステップと、から成るプロセスにより作製が可能である。このステップを例えば二回、三回、四回又はそれ以上の回数繰り返すことで、エタノール耐性をさらに向上させることもできる。ステップをそれぞれ繰り返すにつれ、エタノールの濃度は漸増させる。このように、ステップ（２）で得られた微生物を、前記第一液体培地中に存在するよりも多い量のエタノールを含む水溶液を含む第二液体培地に接触させ（ステップ（３））、生存する一つ又はそれ以上の微生物を選別し、そして（４）前のステップで得られた一つ又はそれ以上の微生物を、成長が可能な充分な時間、固体成長培地に接触させてもよい。このような方法で選別された微生物は、親微生物よりも優れたエタノール耐性を有するものである。液体及び固体培地には、さらに必要又は所望に応じて別の成分を含めてもよい。例えば、固体培地は、親微生物の成長に適した炭素、硫黄及び窒素源など、栄養分を含んでいてもよい。適した成長培地の例は、ルリア・ブロス及び基本塩培地がある。一般的には、固体培地は、例えばキシロース及び／又はグルコースなどの糖を含むこととなろう。これは、このステップで選別された微生物が（親微生物と同じ又はより優れたエタノール産生能力を持つなど）、良から優の収率でこの糖源からエタノールを確実に産生できるようにするために、望ましいことである。培地にはさらに、例えばクロラムフェニコール、テトラサイクリン、又はアンピシリンなどの抗生物質や、発酵可能な糖を含めてもよい。液体培地には、エタノールの水溶液が含まれる。加えて、この培地には、選択に応じ、適した炭素、硫黄及び窒素源などを含め、栄養分を含めることができる。液体培地にはさらに、培地のpHを調節する緩衝剤を含めてもよい。固体培地と同様、液体培地には、好ましくはキシロース及び／又はグルコースなどの糖を含めるとよい。第一液体培地、第二液体培地又は両方は、概して少なくとも約3.5( 重量)％のエタノールを含む。第二及び次の液体培地は次第に高い濃度のエタノールを含む。例えば、第二液体培地に、少なくとも4(重量)％のエタノールを含めることができる。第三液体培地（存在する場合）には少なくとも約4.5(重量) ％のエタノールを含めることができる。上記のプロセスを行なうことのできる微生物は原核生物でも真核生物でもよく、また細菌、酵母及び真菌がこれに含まれる。当該プロセスは、糖（例えばペントース（例えばキシロース）又はヘキトース（例えばグルコース））をエタノールに転化させる一つ又はそれ以上の酵素を含むエタノール産生微生物（例えばエタノール産生細菌）に特に適している。適したエタノール産生微生物の例は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする一つ又はそれ以上の核酸分子を含むものである。（例えばZymomonas mobilisなどのZymomonas種から単離された）アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする一つ又はそれ以上の核酸分子を含むエタノール産生細菌が公知である。さらに、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ及びキシロースイソメラーゼを持つ微生物も公知である（例えばEscherichia coliなどの腸内細菌が発現するものなど）。数多くの微生物が、キシロース及びグルコースの両方をエタノールに転化させる能力を有する。このような生物は、両方の組の酵素を持つ。これらの生物は、組換えDNA技術により、これらの酵素のうちの一組（又はオペロン）をコードする核酸分子を、好ましくはこれらの酵素のうちの第二の組（又はオペロン）を発現するホスト細胞に挿入することで製造されたものである。表１では、ペントース及びヘキトースの両方を良から高の収率でエタノールに転化させる能力を持ったいくつかの酵素を要約している。これらの及びその他の関連する組換え生物や、それらの作製に用いられる技術及び材料のより詳細な説明は、例えば米国特許でIngram氏らの第5,028,539号、I ngram氏らの第5,000,000号、Ingram氏らの第5,424,202号、Fowler氏らの第5,487 ,989号、Ingram氏らの第5,482,846号、Fowler氏らの第5,554,520号、Picataggio 氏らの第5,514,583号、同時係属出願である1994年12月27日出願の米国特許出願番号08/363,868号、1995年６月７日出願の米国特許出願番号 08/475,925号、及び1994年３月28日出願の米国特許出願番号08/218,914号、並びに例えばAusubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley-In terscience，New York(1988)（以下「Ausubel et al．」とする）、Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second and Third Edition、Co ld Spring Harbor Laboratory Press(1989 and 1992)（以下「Sambrook et al. 」とする）、及びBergey's Manual of Systematic Bacteriology,William & Wil kins Co.，Baltimore（1984）(以下「Bergey's Manual」とする)に見ることができ、これらすべての教示するところ全体を参考文献としてここに編入することとする。優れたエタノール産生活性を有する微生物は、さらに、同時係属出願である、 Ingram et al．による1997年４月７日出願の米国特許出願番号08/834,901号に説かれており、この文献も参考としてここに編入することとする。一つ又はそれ以上の糖をエタノールに転化させる酵素を挿入するのに採用可能なエタノール産生微生物、又はホスト細胞は、細菌、酵母、真菌、又はその他の細胞から選択することができる。適した細菌には、Erwinia、Klebsiella、Xanth omonas、Zymomonas（例えばZymomonas mobilis）及びEscherichiaがある。好適な種にはK.oxytoca及びE.coliが含まれる。さらに、グラム陽性細菌、例えばBac illus属の仲間、例えばB.pumilus、B.Subtilis及びB.coagulans、Clostridium属の仲間、例えばCl．acetobutylicum，Cl．aerotolerans，Cl．thermocellum、Cl .thermohydrosulfuricum及びCl.thermosaccharolyticum、Cellulomanas属の仲間、例えばC．uda及びButyrivibrio fibrisolvensも考察されている。容認可能な酵母は、例えば、Cr.albidus、Monilia、及びPichia stipitis、並びにPullular ia pullulansのようなCryptococcusの種のものである。上記の微生物には、それらが自然発生した後、又は突然変異又は遺伝子操作など、それらを単離後又は遺伝子操作で作製した後に、本発明の選別プロセスを行なってよい。例えば、微生物を含有する土壌又は糞便試料に、説明したプロセスを行なうことができる。このような実施例においては、変異した微生物のエタノール産生性は、上記の特許で説かれたように、糖をエタノールに転化させる一つ又はそれ以上の酵素を挿入することにより、導入又はさらに向上させることができる。あるいはその代わりに、良から優のエタノール産生性を持つ分離されたエタノール産生微生物(例えば上記の組換え微生物のうちの一つ又はそれ以上など) に上記のプロセスを行なってもよい。当該プロセスの温度及び圧力は一般には重要ではないが、微生物の生存及び成長が確実であるよう、選択されねばならない。適した温度は約20℃から約60℃の間であるかも知れない。圧力は一般には大気圧であろう。pHもまた、微生物が生存かつ成長が可能であるように選択されるべきである。例えば、このpHは一般には約4.5から8.0の間で選択されるとよい。微生物（又はその種の仲間）の耐性は容易に判定することができ、またしばしばその微生物の天然の環境の条件に関係がある。成長にとって最適な条件を選択するための指針は、例えばBergey's Man ual of Bacteriologyで得ることができる。本プロセスの各ステップの保持時間もまた、一般には重要ではない。微生物をエタノール含有液体培地にさらす時間は、一般的には、その集団のすべてではなく一部が死ぬように選択される。例えば、このステップは約８時間から２週間続くかも知れない。多くの場合、数日で充分であろう。このステップが数日続く場合、同じ又はより高い濃度のエタノールを含む新鮮な液体培地を交換する又はその微生物に加えることが好ましい場合がある。同様に、固体培地上で微生物を成長させる時間も、一般には重要ではないが、その微生物に左右される。当業において広く公知であるように、成長の遅い微生物には、成長の早い微生物よりも長い保持時間が必要であろう。この時間は、一般には、その他のコロニよりも良好に成長しているコロニを分別するのに充分な長さである。多くの場合、数日あれば成長の早い細菌には充分である。上述したように、請求の範囲にあるプロセスで生じた変異体は、親の微生物よりも高いエタノール耐性を有することとなる。エタノール産生微生物を変異させると、この微生物のエタノール産生能力も向上するかも知れない。変異体を分離しさえすれば、その変異の遺伝子的根拠を同定することができる。例えば、その変異微生物の染色体及び／又はRNA転写産物を親微生物に比較してもよい。これはSambrook et al．及びAusubel et al.に概ね説かれたように、ハイブリダイゼーション技術により行なうことができる。改良された変異体の遺伝的根拠を同定したら、その変異を繰り返させても、又は等価のものを遺伝子操作により作製してもよい。例えば、その変異が、ある一つの遺伝子又は複数の遺伝子の不活化に基づくものであれば、Ausubel et al.及びSambrook et al.に説かれたように、その遺伝子を削除したり、その遺伝子の調節配列を削除したり、又は、部位特異的変異をターゲットして読み枠をずらす又はその遺伝子の活性部位を除いたりすることにより、組換えにより等価物を作製してもよい。いずれの場合も、結果としてその微生物は活性遺伝子産物を発現できなくなる。変異が、ある遺伝子の発現の増加に基づく場合、その遺伝子の天然のプロモータをより強力なプロモータに置換する、エンハンサを加える、又はその遺伝子のコピーをさらに導入することにより、等価物を組換え的に作製することができる。更なる実施例では、変異が、ある遺伝子のコドン領域で起きた変異により生じたある一つの活性に基づく場合、組換えにより生まれる等価物は、この変異した配列を、ホスト細胞が認識するプロモータ領域の制御下に導入することで作製が可能である。下記の実施例では、活性サイクリックAMPレセプタたんぱく、活性生合成アラニンラセマーゼ又は両方を発現しない変異体のエタノール耐性は高くなることが発見された。このように、本発明はエタノール耐性の高い微生物を含むが、この微生物は活性サイクリックAMPレセプタたんぱく、活性生合成アラニンラセマーゼ又は両方を発現しないものである。これは、例えば位置指定突然変異誘発や、「ノックアウト」としても知られる遺伝子のノッキング・アウトなどの分子生物学技術により達成することができる。これは、例えばAusubel et al.及びSambro ok et al.に説かれた相同組換え法などにより、達成することができる。活性サイクリックAMPレセプタたんぱく、及び／又は、活性生合成アラニンラセマーゼを発現しない微生物は、糖をエタノールに転化させる酵素を（例えば組換えにより）発現させるホスト細胞に特に適するであろう。本発明で使用するのに適した微生物は上述した通りである。好適な微生物は細菌、特にEscherichia coli、Erwinia chrysanthia及びKlebsiella oxytocaなどのグラム陰性細菌（例えば腸内細菌）である。特に好適な微生物には、Ingram et al．及びPicataggio et al．の上記の米国特許及び出願に説かれたものが含まれる。本発明はさらに、ここに説かれたエタノール耐性微生物を用いる方法に関するものである。エタノール耐性の高い微生物はエタノール産生でもエタノール産生でなくともよい。エタノール産生微生物は、当業において広く公知のプロセスを利用してエタノールを生成する方法に利用することができる。適したエタノール生成プロセスの例には、ここに参考文献として編入された、Ingram et al．及び Picataggio et al．の上記の特許及び出願に説かれたものが含まれる。エタノールを生成するための優れたプロセスの一つが、やはりここに参考文献として編入することとする、Ingram et al．による1997年４月７日に出願された同時係属出願である米国特許出願番号08/833,435号に説かれている。これらのプロセスは、リグノセルロース廃棄物からエタノールを生成するのに特に有用である。エタノール産生微生物を利用するためのプロセスには、他にも、糖を含有する物質を食料及び飲料にする発酵法がある。例えば、エタノール産生微生物は、しょうゆ、さけ、ビール及びワインの製造に利用されている。従って、これらのプロセスで用いられる微生物の活性及びエタノール耐性を高めるためにも本発明を利用することができる。エタノール産生性でない、又は僅かにエタノール産生性である場合の本発明による微生物が特に有用であるのは、解糖経路における、又は、糖をエタノールに転化させるその他の経路における一つ又はそれ以上の反応を触媒する一つ又はそれ以上の酵素をコードする核酸分子を挿入するためのホスト細胞としてである。つまり、このような微生物は、エタノール産生微生物を組換えＤＮＡ技術を通じて作製する場合に特に有用なのである。以下、一つ又はそれ以上の非限定的な実施例により、本発明の実例を挙げることとする。例示方法及び材料以下に説明する方法及び材料が、その後に記載された実施例で説明された作業を行なうのに用いられた。便宜上、そして理解の助けとなるよう、方法及び材料の項を以下のように小見出しに分ける。細菌株及び培地 E．coli K011がこれらの研究で用いられた。これは、エタノール生成のための Zymomonas mobilis遺伝子（pdc、adhB）がクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（cat）のすぐ上流の染色体に組み込まれた、E．coli Bのエタノール産生由来株である（米国特許第5,424,202号）。この株では、クロラムフェニコール（600mgリットル^-1）に対する耐性を用いてpdc及びadhBの発現量の大きいものを選別した。培養株は、リットル当り5gのNaCl、5gの酵母抽出液、10gのトリプトン、40又は600mgのクロラムフェニコール、及び20-140gの発酵可能な炭水化物を含有する改良されたルリア・ブロス中で成長させた。アルコール耐性の変異体の保存株を、グルコース（20gリットル^-1）、クロラムフェニコール（600mgリットル^-1）、イソプロパノール（10gリットル^-1）、及び寒天（15gリットル^-1）を含有する固体培地上に維持した。エタノールをこのブロスに重量を基に加えて保存溶液（100gkg^-1）を調製したが、この溶液は必要に応じて希釈した。エタノールを含有するブロスをNalgene50mm、0.45μmのボトル・トップ・フィルタ（SFCA）を用いてフィルタ滅菌した。 E．coli DH5αが、pUC18を基にしたプラスミドの構築のためのホストとして用いられた。この株を炭水化物を加えない改良されたルリア・ブロス中で成長させた。適宜アンピシリン（50mgリットル^-1）を選別のために用いた。 E.coli K011変異体の強化及び選別 K011培養株を、エタノール及びグルコース（50gリットル^-1）を含有する18×1 50mmの培養チューブ中の新鮮なブロス10mlに1：20から1：200に希釈することで、毎日移した。チューブを攪拌せずに35℃で24時間インキュベートした。順に移されていく間に培養株の密度が高くなるにつれ、エタノール濃度も次第に高められ、耐性変異体の選別が行なわれた。１週間に２回、培養株を希釈し、固体培地に広げて、急速に成長し、かつZ.mobilis遺伝子の高い発現量を維持したままのエタノール耐性変異体を強化した。これらのプレート上のコロニをこそげ取って新鮮なブロスに移し、希釈した。次にこの希釈液をエタノール含有ブロスの接種材料として用いた。K011をまず3.5％のエタノールに移した。５日間連続して移した後では、ブロスのエタノール濃度は4.0％まで上昇し、13日後ではエタノール濃度は4.5％まで上昇しており、14日後では、エタノール濃度は5.0％まで上昇した。エタノール濃度をより高くした希釈液で生じた変異体では、エタノール耐性がさらに上昇することはなかったが、それでも急速な成長が可能であった。培養液を希釈し、クロラムフェニコールを含有する固体培地に広げて変異体の分離ができるようにした。大きな高く盛り上がったコロニを、親であるK011に比較しながらエタノール耐性について調べた。コロニを3mlのブロスに移し、こうして出来た懸濁液を、0％、4.5％、及び５％のエタノールを容れた13×100の培養チューブに60倍に希釈した。35℃で24時間インキュベートした後に、細胞成長をO.D._550nmで測定した。変異体をｌ％のイソプロパノールを含有するプレート上に維持し、40％のグリセロール中に-75℃で保存した。 10％（w/w）エタノールの時の細胞生存率 10％のエタノールに希釈した後の変異株の生存率をK011に比較した。グルコース（50gリットル^-1）を含有するルリア・ブロスに、一晩置いたプレートから細胞を移して、細胞懸濁液（550nmで約0.05O.D.）を調製した。これらを35℃まで予熱し、20％のエタノールを含有する等量の予熱されたブロスで時間０の時点で希釈した。エタノールのないブロスによる希釈液を対照試料として用いた。連続希釈液を時点０（エタノールのないもののみ）、0.5分後、及び５分後の時点で固体培地に広げた。30℃で一晩インキュベートした後、適切な希釈液からのコロニを計数してコロニ形成単位（CFU）として相対的生存率を判定した。発酵実験接種材料を、グルコース又はキシロース（50g/L）を含有するルリア・ブロス中で攪拌せずに16時間（Beall，D．S．et al.，“Parametric studies of ethan ol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia co li”Biotechnol．Bioeng．38:296-303(1991)）（30℃）成長させた。遠心分離（ 6000×g、５分間、周囲温度）して細胞を回収し、加えて発酵を開始させ、550nm で 1.0O.D.になるようにした（約330mgリットル^-1、乾燥細胞重量）。グルコース又はキシロース（140gリットル^-1）を補った350mlのルリア・ブロスを容れた改良された500-mlのFleaker^TMビーカで35℃（100rpm）でバッチ発酵を行なった。塘溶液は別々にオートクレーブして滅菌した。２ＮのKOHの自動添加を用いてpH６より上の酸化を防いだ。試料を取り出して細胞量及びエタノールを測定した、塩基の消費及びpHも記録した。遺伝子的方法及びゲノム・ライブラリの構築染色体DNAを、基本的にはCutting,S.M．and Vander Horn，P.B.，Genetic ana lysis，p．37-74 In C.R．Harwood and S.M．Cutting(ed.)，Molecular biologi cal methods for Bacillus.John Wiley & sons Ltd.，Chlchester,England(1990 )に説かれたようにK011から単離した。親株K011のゲノム・ライブラリを、Sau3A I部分消化産物（4.9kbp断片）をpUC18のBamHI部位に連結した後にDHSαに形質転換することで、構築した。その結果出来たライブラリは約8,000のクローンから構成されていた。これらのコロニをプールした後、プラスミドを単離してライブラリを作製した。プラスミドの構築、単離、形質転換、及び分析には標準的手法を用いた（Sambrook et al.，1989）。リバース・コンプルメンテーション（原語：Reverse Complementation）によるエタノール耐性の低下したK011からの天然DNA断片を含有するプラスミドの単離 D-シクロセリンを用いて、3.5％のエタノール（w/w）でも成長できる細胞を選択的に殺し、一方成長しない細胞を生存させた。このエタノール濃度では、変異体は成長を続けるが、親は細胞数は増えないまま生き延びる。LY02及びLY03をK0 11プラスミド・ライブラリで形質転換して一晩成長させてコロニを形成させた。各変異体の組換えコロニを、グルコース（50gリットル-1）及び3.5％のエタノールを含有するルリア・ブロス中にこそげ取って回収し、接種して550nmで0.1O.D. にし、35℃でインキュベートした。1.5時間後、D-シクロセリン（100mgリットル^-1 ）を加え、引き続き４時間インキュベートした。４時間後、CFU／ml は95％を超える低下を見せていた。エタノール耐性が低下したもとになった推定上の遺伝子を持つクローンをこれらのプレートから単離した。 DNA配列決定及び配列分析 QIAprepスピン・プラスミド・キット（カリフォルニア州チャッツワース、キアゲン社製）をプラスミドの精製に用いた。ジデオキシ配列決定法を、蛍光プライマ[前方、5'CACGACGTTGTAAAACGAC−3'（配列同定番号第１番）；逆、5'−ATAA CAATTTCACACAGGA−3'（配列同定番号第２番）]（ネブラスカ州リンカーン、LIHA ‐COR社製）を用いて行なった。伸長反応は、パーキン・エルマー社製のGeneAmp PCRシステム9600（コネチカット州ノーウォーク）で、エクセル・シークエンシング・キット−LC（ウィスコンシン州マジソン、エピセンター・テクノロジーズ社製）（30サイクル；変性は95℃で30秒間、アニーリングは60℃で30秒間、そして伸長は70℃で１分間）を用いて行なった。伸長産物を分離し、LI-COR社製のDN Aシークエンサ・モデル4000Lで読み取った。配列は、ウィスコンシン・ジェネティックス・コンピュータ・グループ(GCG) のソフトウェア・パッケージ及びナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーションのBLASTネットワーク・サービスを用いて分析した。分析の手法細胞密度をボシュロム社製のスペクトロニック70分光光度計を用いて測定し、この生物の標準曲線に基づいて乾燥細胞重量に変換した。エタノールは、n-プロパノールを内基準として（Beall et al.，1991）Varian Star 3400 CXガスクロマトグラフを用いたガスクロマトグラフィで測定した。実施例１‐E.coli K011のエタノール耐性変異体の分離上に概観した材料及び手法を用い、まず合計135のコロニを、親K011は成長できなかった濃度である4.5％(w/w)のエタノール中での成長について調べた。４３のコロニが、35℃で24時間インキュベートした後では混濁しており、更なるテストに向けて保存された。エタノール耐性形質の安定性を、-75℃で凍結保存されたクローンと、エタノールのない固体培地上に維持されたクローンとを再テストして調べた。実施例２ − E.coli K011の変異体のエタノール耐性に関するテスト図１Ａに示すように、２４時間後では、変異体は親K011よりもエタノールに対してはるかに耐性が高かった。図２Ｂ、図２Ｄ、及び表１Ａ及び１Ｂは様々な濃度のエタノールを含有する培地に希釈したときの当初の成長を比較したものである。エタノール不在下では、K011は、図２Ａ及び２Ｃに示すように、グルコース及びキシロースの両方を発酵可能な糖とした状態で、変異体よりも僅かに良好に成長したように思われた。しかしながら、K011は3.5％(w/w)のエタノール中では成長できなかったのに対し、変異体はすべて、最大5％(w/w)のエタノール濃度でも成長した。エタノール耐性は、燃料エタノール生成について該当するであろうその他の発酵可能な糖を用いても比較された。ラクトース、アラビノース、及びマンノース、ガラクトース、スクロース及びラフィノースである。K011の成長はエタノール不在下では一定して変異体のそれを上回っていた。しかしながら、K0 11は３％(w/w)を超えるエタノール濃度では成長できなかったが、一方、変異体はテストしたすべての糖類について、5％のエタノールで成長した。次に、10％のエタノールに暴露した状態での細胞生存率を調べた（図１Ｂ）。テストされた変異体はすべて、K011よりも耐性が高かった。この違いは、0.5分間の暴露を行なったときに特に劇的であり、このとき変異体のうち63から84％がコロニ形成能力を保持したが、K011で生存したのは10％未満だった。エタノール耐性形質の安定性も調べた。LY01、LY02、LY03、及びLY04を30日間、アルコールのない固体培地に毎日移した。次に、図２Ｃ及び２Ｄに示すように、エタノールを含有するブロス培養液を細胞を用いて接種した。こうして得られた成長曲線は最初に判定されたものと同一であった。糖類に対する浸透圧許容性が残っていることが、K011のエタノール耐性変異体を利用するには不可欠である。図３Ａ及び３Ｂに示すように、キシロース及びグルコースに対する耐性はモルベースでは同様である。両方の糖がある場合、 K011はエタノール耐性変異体よりも浸透圧ストレスに対する耐性が高いように見えたが、この差は劇的なものではなかった。成長にとって最高限度の高温48℃では成長に差は観察されなかった。K011及び変異体の両方がこの温度ではゆっくり成長した。実施例３ − 糖のエタノールへの発酵２０個の最も期待される変異体を、pHを調節した発酵液中で14％のグルコース（図４Ａ及び表２）及び14％のキシロース（図４Ｂ及び表２）からエタノールを産生する能力についてスクリーニングした。すべて、エタノールをより高速で産生する能力、及び、より高い最終エタノール濃度を達成する能力、という点で親株K011よりも優れていた。変異体はすべて、より高い収率を上げる能力という点でも親株K011よりも優れていた。テストでの偏差を確定すべく、変異体LY01、LY 02、LY03、及びLY04をより詳細に調べた。すべての変異体について、グルコース又はキシロースの発酵中に生じた細胞量はK011で生じたそれより一致して多かった。少量の有機酸及び用かいCO₂を中和するのに消費された塩基は、発酵率がより高いためにキシロースでよりもグルコースでの方が多かった。ざっと等量のKO Hが両K011及び変異体についてpH6.0を維持するのに必要であった。塩基を加えると生成物が僅かに希釈された。表２のエタノールの値は、エタノール収率の推定ができるようにこの希釈分を補正してある（生成エタノール＝測定されたエタノール＊（1000+1/2mM KOH/1000）。96時間後では、14％の糖のときのK011のエタノール収率は、グルコース及びキシロースについて、それぞれ理論上の最大値( ペントース又はヘキトース１グラム当り0.51gのエタノール)の74％及び80％であった。株LY01はテストした変異体のうちの最良のものの一つだった。この株は72 時間の時点でグルコース及びキシロースから理論上の最大収率の85％を達成し、ほぼ65gリットル^-1（体積比7.5％のエタノール）の最終エタノール濃度に達した。実施例４ − エタノール耐性を低下させるK011からの天然の遺伝子を含有するプラスミドの単離 3.5％のエタノールで成長できない生存株についてD-シクロセリン強化した後、合計32のLY02組換え体及び40のLY03組換え体を5％のグルコース及び4％のエタノールを含有するルリア・ブロス中での成長に関して三つの複本にしてスクリーニングした。すべて、24時間後ではもとの変異体に比べて低い密度に成長した。最も期待される19のクローンのうち７つの複本を同時に比較した。LY02（pUC18 ）に比較してエタノール耐性を等しく低下させていた四つのクローンを更なる研究に選別した。実施例５ − エタノール耐性を低下させる遺伝子の同定四つの選択されたプラスミド中のインサートの両端を配列分析したところ、これらが二対の兄弟から成ることが判明した。E.coliゲノム全体は現在、GenBank データベースから入手可能である。このクローン断片をこの末端配列及びBLAST ネットワーク・サーバを用いて容易に同定した。プラスミドpLOI1531は、E．coli染色体の67.4分座から76.0分座領域にある3.6 kbpのK011 DNA断片を含む（GenBank受け入れ番号U18997）。サブクローンを作製し、配列決定してK011の遺伝子構成を確認し、エタノール耐性の低下の起因となっている遺伝子を同定した（図５）。僅かに二つの開放読み取り枠が存在していた。crpと、働きが不明の大型の開放読み取り枠である（ORF0696）。pU C18、pLOI1531及び削除されたクローン（pLOI1532及びpLOI1533）のLY03への影響を比較すると、このcrp遺伝子（サイクリックAMPレセプタたんぱく）が、エタノール耐性の低下の起因であることが示唆された。 pLOI1534は、E.coli染色体の89.2分座から92.8分座領域にある7.39kbpのK011 DNA断片（受け入れ番号U00006を含む（図６）。このクローンの削除された由来株も配列決定し、遺伝子構成を確認すると、３つの完全な、そして２つの部分的な開放読み取り枠が存在することが判明した。dnaB'、alr、tyrB、napA(hobH)、及びuvrA‘である。削除された由来株を比較すると、alr遺伝子（生合成アラニンラセマーゼ）が、LY02のエタノール耐性の低下の起因であることが明らかになった。等価物以上、本発明をその好適な実施例を参考にしながら具体的に示し、かつ説明してきたが、当業者であれば、様々な形式上及び詳細の変更を、添付の請求の範囲に記載された本発明の精神及び範囲を逸脱することなく行なうことができることは理解されよう。当業者であれば、ごく通常の実験を行なうのみで、ここに具体的に説かれた本発明の特定の実施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価物は、本請求の範囲の包含するところとして意図されている。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Development of Escherichia coli with High Ethanol Tolerance Background of the Invention The production of ethanol by fermentation of waste paper and other lignocellulosic products, such as cereal residues, solves environmental waste problems and reduces It offers the opportunity to reduce reliance on fuel-based motor fuels. Genetically engineered bacteria such as Escherichia coli K011 (U.S. Pat.No. 5,000,000) and Klebsiella oxytoca P2 (U.S. Pat. Is being developed. Escherichia coli K011 is much less resistant to ethanol than yeasts such as Saccharomyces currently used in the commercial production of ethanol from sucrose and hydrolyzed corn starch. Thus, as bacteria are being developed that can convert sugars made from lignocellulose and the like to ethanol, the ethanol tolerance of these bacteria limits the ethanol production rate and final ethanol concentration that could be achieved by this fermenting organism. The problem remains. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on the discovery that a novel mutant of Escherichia coli K011 exhibits the ability to grow and survive at concentrations above the ethanol concentration at which the parent strain Escherichia col i K011 can survive. The present invention is further directed to the discovery of an excellent ethanol selection process in which selection in a liquid medium for ethanol tolerance and selection for rapid growth in a solid medium containing a large amount of chloramphenicol are alternated. It is based on As a result of this selection process, a new strain of Escherichia coli K011 useful for ethanol production was obtained, as described above. Using this new method, they found that they could produce a mutant that produced 20% more ethanol than the parent strain, E. coli K011, and terminated fermentation earlier. Furthermore, the parent strain cannot grow at 35 g / L ethanol, whereas the mutant can grow at a maximum of 50 g / L ethanol. Finally, in contrast to the parent strain, the mutant exhibits a dramatically higher survival exposure of 100 g / L ethanol. These features of this variant include the ability to obtain high-concentration ethanol in a short time and reduce the cost of nutrients, capital equipment, product recovery, and waste disposal, allowing ethanol to be converted from lignocellulose hydrolysis products. This means that the cost of generating the can be reduced. In one embodiment, the present invention includes a method for selecting an ethanol-producing microorganism, the method comprising the steps of contacting the microorganism with a liquid medium and a solid medium in order, wherein the liquid medium is used. Selection is performed for ethanol tolerance, and the solid medium is used to select for an ethanol-producing microorganism capable of growing and producing ethanol. In a preferred embodiment, the invention comprises a liquid medium containing increasingly concentrated ethanol, and a solid medium containing antibiotics and fermentable sugars used in the above-mentioned screening process. In another embodiment, the invention includes an ethanol-producing microorganism capable of growing at an ethanol concentration of greater than 35 g / L. In a preferred embodiment, the ethanol-producing microorganism is selected from any of Erwinia, Klebsiella, Xanthomonas, Zymomonas and Escherichia, especially K. oxytoca and E. coli. In a more preferred embodiment, the E. coli bacterium is selected from any of LY01, LY02 and LY03. In yet another embodiment, the invention includes an ethanologenic variant capable of producing at least 10% more ethanol than the parent bacterium, preferably Escherichia coli K011, under equivalent fermentation conditions. In addition, it has been discovered that inactivating the cyclic AMP receptor protein and / or the active biosynthetic alanine racemase results in a more ethanol-tolerant microorganism. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The above and other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the preferred embodiments of the invention described in more detail below, as illustrated in the accompanying drawings. In the drawings, like reference characters refer to the same parts throughout the different drawings. The drawings are not necessarily to scale, emphasis instead being placed upon illustrating the principles of the present invention. FIG. 1A shows the ability of the mutant to grow at progressively higher ethanol concentrations compared to the parent Escherichia coli K011. FIG. 1B shows the ability of the mutant to survive at 10% ethanol (w / w) compared to the parent Escherichia coli K011. FIG. 2A shows the ability of the mutant to grow in the presence of glucose and in the absence of ethanol, compared to the parent Escherichia coli K011. FIG. 2B shows the ability of the LY01 mutant to grow in various concentrations of ethanol and constant glucose compared to the parent strain Escherichia coli K011 placed in 3.5% ethanol and constant glucose. FIG. 2C shows the ability of the mutant to grow in the presence of xylose and in the absence of ethanol compared to the parent Escherichia coli K011 strain. FIG. 2D shows the ability of the LY01 mutant to grow in various concentrations of ethanol and constant xylose compared to the parent strain Escherichia coli K011 placed in 3.5% ethanol and constant xylose. FIG. 3A shows the osmolarity of the mutant to increasing concentrations of glucose as compared to the parental Escherichia coli K011. FIG. 3B shows the osmolarity of the mutant to xylose at progressively higher concentrations compared to the parent Escherichia coli K011. FIG. 4A shows the ability of the mutant to convert 14% of glucose to ethanol as compared to the parent Escherichia coli K011. FIG. 4B shows the ability of the mutant to convert 14% xylose to ethanol compared to the parent Escherichia coli K011. FIG. 5 shows a map of pLOI1531 and subclones. This map is for the insert DNA taken from K011. Vectors are not shown. FIG. 6 is a map of pLOI1534 and subclones. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION As described above, the present invention relates to an ethanol-producing mutant having high ethanol tolerance. In one embodiment, the mutant is capable of producing at least 10% more ethanol when grown under equivalent conditions than the parent bacterium (eg, Escherichia coli K011). In another embodiment, the mutant is capable of growing in ethanol concentrations above that of the parent microorganism. The microorganism (eg, an ethanol-producing microorganism) or “variant” according to the present invention is obtained by (1) contacting a parent microorganism (eg, an ethanol-producing microorganism) with a first liquid medium containing an aqueous solution containing ethanol, and Selecting a further microorganism, and (2) contacting the one or more microorganisms obtained in the preceding step with a solid growth medium for a time sufficient for growth. Fabrication is possible. This step can be repeated two, three, four or more times, for example, to further improve ethanol tolerance. As each step is repeated, the concentration of ethanol is gradually increased. Thus, the microorganism obtained in step (2) is brought into contact with a second liquid medium containing an aqueous solution containing a larger amount of ethanol than is present in the first liquid medium (step (3)). One or more microorganisms may be selected and (4) the one or more microorganisms obtained in the previous step may be contacted with a solid growth medium for a sufficient time to allow for growth. Microorganisms selected by such a method have better ethanol tolerance than the parent microorganism. Liquid and solid media may further include other components as needed or desired. For example, the solid medium may contain nutrients such as carbon, sulfur and nitrogen sources suitable for growth of the parent microorganism. Examples of suitable growth media include Luria broth and basal salt media. In general, the solid medium will contain sugars, for example xylose and / or glucose. This is to ensure that the microorganism selected in this step (e.g., has the same or better ethanol production capacity as the parent microorganism) can produce ethanol from this sugar source in good to excellent yields. That is desirable. The medium may further include antibiotics such as, for example, chloramphenicol, tetracycline, or ampicillin, and fermentable sugars. The liquid medium includes an aqueous solution of ethanol. In addition, the medium can contain nutrients, including suitable carbon, sulfur and nitrogen sources, depending on the selection. The liquid medium may further include a buffer for adjusting the pH of the medium. Like the solid medium, the liquid medium preferably contains sugars such as xylose and / or glucose. The first broth, the second broth, or both, generally contains at least about 3.5% (by weight) ethanol. The second and subsequent liquid media contain progressively higher concentrations of ethanol. For example, the second liquid medium can include at least 4% (by weight) ethanol. The third liquid medium (if present) can include at least about 4.5% (by weight) ethanol. Microorganisms capable of carrying out the above processes may be prokaryotic or eukaryotic, and include bacteria, yeasts and fungi. The process is particularly suitable for ethanol-producing microorganisms (eg, ethanol-producing bacteria) that include one or more enzymes that convert sugars (eg, pentoses (eg, xylose) or hexoses (eg, glucose)) to ethanol. Examples of suitable ethanol-producing microorganisms are those containing one or more nucleic acid molecules encoding alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase. Ethanol-producing bacteria are known which contain one or more nucleic acid molecules encoding alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase (eg, isolated from Zymomonas species such as Zymomonas mobilis). Furthermore, microorganisms having xylulokinase, transaldolase, transketolase, and xylose isomerase are also known (for example, those expressed by intestinal bacteria such as Escherichia coli). Many microorganisms have the ability to convert both xylose and glucose to ethanol. Such organisms have both sets of enzymes. These organisms are capable of producing, by recombinant DNA technology, a nucleic acid molecule encoding one set (or operon) of these enzymes, preferably a host expressing the second set (or operon) of these enzymes. It is manufactured by inserting it into cells. Table 1 summarizes some enzymes capable of converting both pentoses and hexoses to ethanol in good to high yields. A more detailed description of these and other related recombinant organisms, and the techniques and materials used to make them, can be found, for example, in U.S. Patents Nos. 5,028,539, Ingram et al., 5,000,000, Ingram et al. No. 5,424,202, Fowler et al., No. 5,487,989, Ingram et al., No. 5,482,846, Fowler et al., No. 5,554,520, Picataggio et al., No. 5,514,583, co-pending application, December 1994. U.S. Patent Application No. 08 / 363,868 filed on 27th, U.S. Patent Application No. 08 / 475,925 filed on June 7, 1995, and U.S. Patent Application No. 08 / 218,914 filed on March 28, 1994, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York (1988) (hereinafter "Ausubel et al."), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second and Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 and 1992) (hereinafter "Sambrook et al."), And Bergey's Manu al of Systematic Bacteriology, William & Wilkins Co., Baltimore (1984) (hereinafter "Bergey's Manual"), the teachings of all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Microorganisms with excellent ethanologenic activity are further described in co-pending application, Ingram et al. No. 08 / 834,901, filed Apr. 7, 1997, which is hereby incorporated by reference. Ethanol-producing microorganisms or host cells that can be employed to insert an enzyme that converts one or more sugars to ethanol can be selected from bacteria, yeast, fungi, or other cells. Suitable bacteria include Erwinia, Klebsiella, Xanth omonas, Zymomonas (eg, Zymomonas mobilis) and Escherichia. Suitable species include K. oxytoca and E. coli. In addition, Gram-positive bacteria, such as members of the genus Bacillus, such as B. pumilus, B. Subtilis and B. coagulans, members of the genus Clostridium, such as Cl. acetobutylicum, Cl. aerotolerans, Cl. thermocellum, Cl. thermohydrosulfuricum and Cl. thermosaccharolyticum, members of the genus Cellulomanas, such as C. uda and Butyrivibrio fibrisolvens are also considered. Acceptable yeasts are, for example, of the species Cryptococcus such as Cr. Albidus, Monilia, and Pichia stipitis, and Pullular ia pullulans. The above-mentioned microorganisms may be subjected to the selection process of the present invention after their natural occurrence or after they have been isolated or made by genetic engineering, such as by mutation or genetic engineering. For example, the described process can be performed on soil or fecal samples containing microorganisms. In such embodiments, the ethanologenicity of the mutated microorganism is introduced or further enhanced by inserting one or more enzymes that convert sugars to ethanol, as set forth in the above patents. Can be done. Alternatively, the above process may be performed on isolated ethanol producing microorganisms having good to excellent ethanol productivity (eg, one or more of the above recombinant microorganisms). The temperature and pressure of the process are generally not critical, but must be chosen to ensure the survival and growth of the microorganism. Suitable temperatures may be between about 20 ° C and about 60 ° C. The pressure will generally be atmospheric. The pH should also be chosen so that the microorganism can survive and grow. For example, the pH may generally be selected between about 4.5 and 8.0. The resistance of a microorganism (or a member of the species) can be readily determined and is often related to the conditions of the microorganism's natural environment. Guidance for selecting optimal conditions for growth can be obtained, for example, from Bergey's Manual of Bacteriology. The retention time of each step in the process is also generally not critical. The time of exposing the microorganism to the liquid medium containing ethanol is generally chosen such that some but not all of the population dies. For example, this step may last about 8 hours to 2 weeks. In many cases, a few days will be sufficient. If this step lasts for several days, it may be preferable to replace or add to the microorganism a fresh broth containing the same or a higher concentration of ethanol. Similarly, the time for growing the microorganism on the solid medium is also generally, although not critical, dependent on the microorganism. As is widely known in the art, slow growing microorganisms will require longer retention times than fast growing microorganisms. This time is generally long enough to sort out colonies that are growing better than other colonies. Often, a few days are sufficient for fast growing bacteria. As mentioned above, the variants resulting from the claimed process will have a higher ethanol tolerance than the parent microorganism. Mutating an ethanol-producing microorganism may also improve the ethanol-producing ability of this microorganism. As long as the mutant is isolated, the genetic basis of the mutation can be identified. For example, the chromosome and / or RNA transcript of the mutant microorganism may be compared to the parent microorganism. This is described in Sambrook et al. And hybridization techniques, as generally described in Ausubel et al. Once the genetic basis of the improved variant has been identified, the mutation may be repeated or an equivalent may be made by genetic engineering. For example, if the mutation is based on the inactivation of a gene or genes, as described in Ausubel et al. And Sambrook et al., The gene may be deleted or the gene may be deleted. Equivalents may be produced by recombination by deleting regulatory sequences or by shifting the reading frame to target site-specific mutations or removing the active site of the gene. In either case, the result is that the microorganism cannot express the active gene product. If the mutation is based on an increase in expression of a gene, the equivalent can be recombinantly replaced by replacing the native promoter of the gene with a stronger promoter, adding an enhancer, or introducing additional copies of the gene. Can be manufactured. In a further embodiment, if the mutation is based on one activity caused by a mutation occurring in the codon region of a gene, the equivalent produced by recombination will recognize the mutated sequence as a promoter region recognized by the host cell. It can be manufactured by introducing under the control of. In the examples below, it was discovered that mutants that do not express active cyclic AMP receptor protein, active biosynthetic alanine racemase or both have increased ethanol tolerance. Thus, the invention includes microorganisms that are highly ethanol-tolerant, but which do not express active cyclic AMP receptor protein, active biosynthetic alanine racemase, or both. This can be achieved by molecular biology techniques, such as, for example, site-directed mutagenesis and knockout of genes, also known as "knockouts". This can be achieved, for example, by the method of homologous recombination described in Ausubel et al. And Sambrook et al. Microorganisms that do not express active cyclic AMP receptor protein and / or active biosynthetic alanine racemase would be particularly suitable for host cells that express (eg, recombinantly) an enzyme that converts sugars to ethanol. Microorganisms suitable for use in the present invention are as described above. Suitable microorganisms are bacteria, especially Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, Erwinia chrysanthia and Klebsiella oxytoca (eg enterobacteria). Particularly suitable microorganisms include Ingram et al. And Picataggio et al. Including those set forth in the aforementioned US patents and applications. The invention further relates to methods for using the ethanol-resistant microorganisms described herein. Microorganisms with high ethanol tolerance may or may not produce ethanol. Ethanol-producing microorganisms can be used in methods for producing ethanol using processes well known in the art. Examples of suitable ethanol production processes include Ingram et al., Incorporated herein by reference. And Picataggio et al. And those mentioned in the above patents and applications. One of the better processes for producing ethanol is Ingram et al., Also incorporated herein by reference. No. 08 / 833,435, filed Apr. 7, 1997, which is incorporated herein by reference. These processes are particularly useful for producing ethanol from lignocellulosic waste. Other processes for utilizing ethanol-producing microorganisms include fermentation of sugar-containing substances into foods and beverages. For example, ethanol-producing microorganisms are used in the manufacture of soy sauce, salmon, beer and wine. Therefore, the present invention can also be used to increase the activity and ethanol tolerance of the microorganism used in these processes. Microorganisms according to the invention, which are not or only slightly ethanologenic, are particularly useful in one or more of the glycolytic pathways or other pathways that convert sugars to ethanol. As a host cell to insert a nucleic acid molecule encoding one or more enzymes that catalyze the reaction. That is, such microorganisms are particularly useful when producing ethanol-producing microorganisms through recombinant DNA technology. The following examples illustrate one or more non-limiting examples of the invention. Exemplary Methods and Materials The methods and materials described below were used to perform the operations described in the examples set forth below. For convenience and to aid understanding, the Methods and Materials section is divided into subheadings as follows: Bacterial strains and media coli K011 was used in these studies. This indicates that the Zymomonas mobilis gene for ethanol production (pdc, adhB) was integrated into the chromosome just upstream of chloramphenicol acyltransferase (cat). It is a strain derived from ethanol production of E. coli B (US Patent No. 5,424,202). In this strain, chloramphenicol (600 mg liter ^-1 ) Were selected using the resistance to pdc and adhB. Cultures are grown in modified Luria broth containing 5 g NaCl, 5 g yeast extract, 10 g tryptone, 40 or 600 mg chloramphenicol, and 20-140 g fermentable carbohydrate per liter. I let it. A stock strain of the alcohol-resistant mutant was replaced with glucose (20 g ^-1 ), Chloramphenicol (600mg l ^-1 ), Isopropanol (10g l ^-1 ) And agar (15g liter) ^-1 ) Was maintained on a solid medium. Ethanol is added to this broth on a weight basis and a stock solution (100 g kg ^-1 ) Was prepared, but this solution was diluted as needed. The broth containing ethanol was filter sterilized using a Nalgene 50 mm, 0.45 μm bottle top filter (SFCA). E. coli DH5α was used as a host for the construction of a plasmid based on pUC18. This strain was grown in modified Luria broth without the addition of carbohydrates. Ampicillin as appropriate (50mg liter ^-1 ) Was used for sorting. Enhancement and selection of E. coli K011 mutant K011 culture was prepared using ethanol and glucose (50 g liter). ^-1 ) Were transferred daily by diluting 1:20 to 1: 200 into 10 ml of fresh broth in 18 x 150 mm culture tubes containing The tubes were incubated without shaking at 35 ° C. for 24 hours. As the density of the cultures increased during the sequential transfer, the ethanol concentration was gradually increased and selection for resistant mutants was performed. Twice a week, the cultures were diluted and spread on solid media to enhance ethanol-tolerant mutants that grew rapidly and maintained high expression of the Z. mobilis gene. The colonies on these plates were scraped off, transferred to fresh broth and diluted. This dilution was then used as an inoculum for the broth containing ethanol. K011 was first transferred to 3.5% ethanol. After 5 consecutive days of transfer, the broth ethanol concentration had risen to 4.0%, after 13 days the ethanol concentration had risen to 4.5% and after 14 days the ethanol concentration had risen to 5.0%. Mutants produced at higher ethanol dilutions did not further increase ethanol tolerance, but still allowed rapid growth. The culture was diluted and spread on a solid medium containing chloramphenicol to allow isolation of mutants. Large, raised colonies were examined for ethanol tolerance compared to their parent, K011. The colonies were transferred to 3 ml of broth, and the resulting suspension was diluted 60-fold into 13 x 100 culture tubes containing 0%, 4.5%, and 5% ethanol. After incubation at 35 ° C for 24 hours, cell growth was _550nm Was measured. Mutants were maintained on plates containing 1% isopropanol and stored in -75 ° C in 40% glycerol. Cell viability at 10% (w / w) ethanol The viability of the mutant strain after dilution in 10% ethanol was compared to K011. Glucose (50g l ^-1 The cells were transferred from the overnight plate to Luria broth containing ()) to prepare a cell suspension (約 0.05 OD at 550 nm). These were preheated to 35 ° C and diluted at time 0 with an equal volume of preheated broth containing 20% ethanol. A dilution in broth without ethanol was used as a control sample. Serial dilutions were spread on solid media at time points 0 (only without ethanol), 0.5 minutes, and 5 minutes later. After overnight incubation at 30 ° C., colonies from appropriate dilutions were counted to determine relative viability as colony forming units (CFU). Fermentation experiments The inoculum was grown in Luria broth containing glucose or xylose (50 g / L) for 16 hours without stirring (Beall, DS et al., Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli "Biotechnol. Bioeng. 38: 296-303 (1991)) (30 ° C). The cells were collected by centrifugation (6000 × g, 5 minutes, ambient temperature) and added to start fermentation to 1.0 OD at 550 nm (approximately 330 mg liter). ^-1 , Dry cell weight). Glucose or xylose (140g liter ^-1 Improved 500-ml Fleaker with 350ml Luria Broth supplemented with) ^TM Batch fermentation was performed at 35 ° C. (100 rpm) in a beaker. The tongue solution was sterilized by autoclaving separately. Oxidation above pH 6 was prevented using automatic addition of 2N KOH. Samples were removed to measure cell volume and ethanol, base consumption and pH were also recorded. Genetic method and construction of genomic library Chromosomal DNA was basically prepared by Cutting, SM. and Vander Horn, PB, Genetic analysis, p. 37-74 In CR. Harwood and SM. It was isolated from K011 as described in Cutting (ed.), Molecular biologi cal methods for Bacillus. John Wiley & sons Ltd., Chlchester, England (1990). A genomic library of the parent strain K011 was constructed by ligating the partially digested Sau3A I product (4.9 kbp fragment) to the BamHI site of pUC18 and then transforming it into DHSα. The resulting library consisted of about 8,000 clones. After pooling these colonies, the plasmid was isolated to create a library. Standard procedures were used for plasmid construction, isolation, transformation, and analysis (Sambrook et al., 1989). Isolation of Plasmid Containing Natural DNA Fragment from K011 with Reduced Ethanol Tolerance by Reverse Complementation (original: Reverse Complementation) Cells that can grow with 3.5% ethanol (w / w) using D-cycloserine Were selectively killed, while cells that did not grow survived. At this ethanol concentration, the mutant continues to grow, but the parent survives without increasing cell numbers. LY02 and LY03 were transformed with the K0111 plasmid library and grown overnight to form colonies. Recombinant colonies of each mutant were harvested by scraping into Luria broth containing glucose (50 g liter-1) and 3.5% ethanol, inoculated to 0.1 OD at 550 nm, and incubated at 35 ° C. 1.5 hours later, D-cycloserine (100 mg liter ^-1 ) Was added, followed by incubation for 4 hours. After 4 hours, the CFU / ml had dropped by over 95%. Clones with the putative gene from which ethanol tolerance was reduced were isolated from these plates. DNA sequencing and sequence analysis QIAprep spin plasmid kit (Qiagen, Chatsworth, CA) was used for plasmid purification. Dideoxy sequencing was performed using fluorescent primers [forward, 5 'CACGACGTTGTAAAACGAC-3' (sequence identification number 1); reverse, 5'-ATAA CAATTTCACACAGAGGA-3 '(sequence identification number 2)] (Lincoln, NE, LIHA-COR). The extension reaction was performed using the GeneAmp PCR System 9600 (Norwalk, CT) manufactured by Perkin-Elmer and Excel Sequencing Kit-LC (Epicenter Technologies, Madison, Wis.) (30 cycles; denaturation at 95 ° C). For 30 seconds, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension at 70 ° C. for 1 minute). The extension products were separated and read on a LI-COR DNA Sequencer model 4000L. Sequences were analyzed using the Wisconsin Genetics Computer Group (GCG) software package and the BLAST network service of the National Center for Biotechnology Information. Analytical Procedure Cell density was measured using a Spectronic 70 spectrophotometer from Bausch & Lomb and converted to dry cell weight based on a standard curve for this organism. Ethanol was measured by gas chromatography using a Varian Star 3400 CX gas chromatograph with n-propanol as the internal standard (Beall et al., 1991). Example 1-Isolation of Ethanol Tolerant Mutants of E. coli K011 Using the materials and techniques outlined above, a total of 135 colonies were first used, at a concentration of 4.5% (w / w) at which parent K011 failed to grow. The growth in ethanol was examined. Forty-three colonies were turbid after incubation at 35 ° C. for 24 hours and were stored for further testing. The stability of the ethanol tolerance trait was determined by retesting clones stored frozen at -75 ° C and clones maintained on solid medium without ethanol. Example 2-Testing of mutants of E. coli K011 for ethanol tolerance As shown in Figure 1A, after 24 hours, the mutants were much more resistant to ethanol than the parent K011. 2B, 2D, and Tables 1A and 1B compare the initial growth when diluted in media containing various concentrations of ethanol. In the absence of ethanol, K011 appeared to grow slightly better than the mutant with both glucose and xylose as fermentable sugars, as shown in FIGS. 2A and 2C. However, K011 failed to grow in 3.5% (w / w) ethanol, whereas all mutants grew at up to 5% (w / w) ethanol concentration. Ethanol tolerance was also compared using other fermentable sugars that would be relevant for fuel ethanol production. Lactose, arabinose, and mannose, galactose, sucrose, and raffinose. The growth of K011 was consistently higher than that of the mutant in the absence of ethanol. However, K011 failed to grow at ethanol concentrations above 3% (w / w), while the mutant grew at 5% ethanol for all saccharides tested. Next, the cell viability in a state exposed to 10% ethanol was examined (FIG. 1B). All mutants tested were more resistant than K011. This difference was particularly dramatic at 0.5 minutes of exposure, when 63-84% of the mutants retained colony-forming ability, but less than 10% survived K011. The stability of the ethanol tolerance trait was also examined. LY01, LY02, LY03, and LY04 were transferred daily to solid media without alcohol for 30 days. Next, as shown in FIGS. 2C and 2D, a broth culture solution containing ethanol was inoculated using the cells. The growth curves thus obtained were identical to those initially determined. Remaining osmolarity to sugars is essential for utilizing ethanol-tolerant mutants of K011. As shown in FIGS. 3A and 3B, tolerance to xylose and glucose is similar on a molar basis. With both sugars, K011 appeared to be more resistant to osmotic stress than the ethanol-resistant mutant, but the difference was not dramatic. No difference in growth was observed at 48 ° C, the highest temperature for growth. Both K011 and the mutant grew slowly at this temperature. Example 3-Fermentation of Sugar to Ethanol The 20 most promising mutants were combined with 14% glucose (Figure 4A and Table 2) and 14% xylose (Figure 4B and Table) in a pH-adjusted fermentation broth. Screened for ability to produce ethanol from 2). All were superior to the parent strain K011 in their ability to produce ethanol faster and to achieve higher final ethanol concentrations. All mutants were superior to the parent strain K011 in their ability to increase higher yields. Mutants LY01, LY02, LY03, and LY04 were examined in more detail to determine test deviations. For all mutants, the amount of cells produced during the fermentation of glucose or xylose was consistently higher than that produced with K011. Small amount of organic acid and extra CO _Two The base consumed to neutralize was higher in glucose than in xylose due to higher fermentation rates. Rough equivalents of KOH were required to maintain pH 6.0 for both K011 and the mutant. The product was slightly diluted upon addition of the base. The ethanol values in Table 2 are corrected for this dilution to allow estimation of ethanol yield (ethanol produced = ethanol measured * (1000 + 1/2 mM KOH / 1000). After 96 hours, The ethanol yield of K011 at 14% sugar was 74% and 80% of the theoretical maximum (0.51 g ethanol per gram of pentose or hexose) for glucose and xylose, respectively. One of the best mutants tested, this strain achieved 85% of the theoretical maximum yield from glucose and xylose at 72 hours, almost 65 g liters ^-1 A final ethanol concentration of (7.5% ethanol by volume) was reached. Example 4-Isolation of a plasmid containing the native gene from K011 that reduces ethanol tolerance A total of 32 LY02 recombinants and 40 LY03 after D-cycloserine enrichment for surviving strains that cannot grow in 3.5% ethanol Recombinants were screened in triplicate for growth in Luria broth containing 5% glucose and 4% ethanol. All grew to a lower density after 24 hours compared to the original mutant. Seven duplicates of the 19 most promising clones were compared simultaneously. Four clones that had equally reduced ethanol tolerance compared to LY02 (pUC18) were selected for further study. Example 5-Identification of Genes that Reduce Ethanol Tolerance Sequence analysis of both ends of the inserts in the four selected plasmids revealed that they consisted of two pairs of siblings. The entire E. coli genome is currently available from the GenBank database. This clone fragment was easily identified using this terminal sequence and the BLAST network server. Plasmid pLOI1531 is available from E. coli. It contains a K011 DNA fragment of 3.6 kbp in the 67.4 locus to 76.0 locus region of the E. coli chromosome (GenBank accession number U18997). A subclone was prepared and sequenced to confirm the gene composition of K011, and a gene responsible for a decrease in ethanol tolerance was identified (FIG. 5). There were only two open reading frames. It is a large open reading frame with unknown function and crp (ORF0696). Comparison of the effects of pUC18, pLOI1531 and the deleted clones (pLOI1532 and pLOI1533) on LY03 suggested that this crp gene (cyclic AMP receptor protein) was responsible for reduced ethanol tolerance. pLOI1534 is a 7.39 kbp K011 DNA fragment (located at 89.2 to 92.8 loci in the E. coli chromosome, including accession number U00006 (FIG. 6). The deleted strain of this clone was also sequenced, Confirmed that there were three complete and two partial open reading frames: dnaB ', alr, tyrB, napA (hobH), and uvrA'. A comparison revealed that the alr gene (biosynthetic alanine racemase) is responsible for the reduced ethanol tolerance of LY02.Equivalents The present invention has been specifically described with reference to the preferred examples. Having described and described, those skilled in the art will recognize that various formal and detailed changes may be made without departing from the spirit and scope of the invention as set forth in the appended claims. Well, if you are a person skilled in the art, It is to be understood that, with no more than routine experimentation, many equivalents of the specific embodiments of the invention specifically set forth herein will be apparent or attained by those skilled in the art. It is intended to be inclusive.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:18 1:18 1:64 1:64 1:22） 1:22）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヨークショーンダブル. アメリカ合衆国 32603 フロリダ州ゲインズビル、ファーストアベニューエヌ．ダブル．2231──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1:19 C12R 1:18 1:18 1:64 1:64 1:22) 1:22) C12N 15 / 00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE , ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UG , VN, YU, ZW (72) Inventor York Sean Double. First Avenue N., Gainesville, FL 32603, United States of America. double. 2231

Claims

[Claims] 1. An ethanol producing microorganism comprising one or more nucleic acid molecules encoding alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase, wherein said bacterium does not express an active cyclic AMP receptor protein, an active biosynthetic alanine racemase, or both, Microorganisms. 2. The ethanol-producing microorganism according to claim 1, wherein the microorganism is a bacterium selected from any of Erwinia, Klebsiella, Xanthomonas, and Escherichia. 3. The ethanol producing bacterium according to claim 2, wherein the bacterium is Klebsiella oxytoca. 4. The ethanol-producing bacterium according to claim 2, wherein the bacterium is Escherichia coli. 5. 3. The ethanol producing bacterium of claim 2, wherein said bacterium comprises a heterologous nucleic acid molecule encoding Zymomonas alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase. 6. 6. The ethanol producing bacterium according to claim 5, wherein said Zymomonas alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase are encoded by a nucleic acid molecule isolated from Zymomonas mobilis. 7. An ethanol-producing Escherichia coli comprising a heterologous nucleic acid molecule isolated from Zymomonas mobilis that encodes an alcohol dehydrogenase and a pyruvate decarboxylase, wherein the bacterium is an active cyclic AMP receptor protein, an active biosynthetic alanine racemase or both. Escheric hia coli that does not express E. coli. 8. (A) contacting an ethanol-producing microorganism with a first liquid medium containing an aqueous solution containing ethanol to select one or more viable microorganisms; and (b) one obtained from step (a). Or more microorganisms in contact with a solid growth medium for a time sufficient to allow growth; and (c) one or more microorganisms obtained from step (b) in the first liquid medium. Contacting a second liquid medium containing an aqueous solution containing a greater amount of ethanol than is present in the step (c) to select one or more surviving microorganisms; and (d) one obtained from step (c). Or more microorganisms in contact with a solid growth medium for a time sufficient to allow growth to occur. 9. The ethanol-producing microorganism according to claim 8, wherein the microorganism is a bacterium. 10. The ethanol-producing microorganism according to claim 9, wherein the microorganism is selected from any of Erwinia, Klebsiella, Xanthomonas, and Escherichia. 11. The ethanol-producing microorganism according to claim 10, wherein the microorganism is Klebsiella oxytoca. 12. The ethanol-producing microorganism according to claim 10, wherein the microorganism is Escherichia coli. 13. The ethanol-producing microorganism according to claim 10, wherein the microorganism comprises a heterologous nucleic acid molecule encoding Zymomonas alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase. 14． 14. The ethanol-producing microorganism of claim 13, wherein the Zymomonas alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase are encoded by a nucleic acid molecule isolated from Zymomonas mobilis. 15. (A) contacting an ethanol-producing microorganism with a first liquid medium containing an aqueous solution containing ethanol to select one or more viable microorganisms; and (b) one obtained from step (a). Or more microorganisms in contact with a solid growth medium for a time sufficient to allow growth; and (c) one or more microorganisms obtained from step (b) in the first liquid medium. Contacting a second liquid medium containing an aqueous solution containing a greater amount of ethanol than is present in the step (c) to select one or more surviving microorganisms; and (d) one obtained from step (c). Or more microorganisms are contacted with a solid growth medium for a time sufficient for growth. 16. The method according to claim 15, wherein the microorganism is a bacterium. 17． 17. The method of claim 16, wherein said microorganism is selected from any of Erwinia, Klebsiella, Xanthomonas, and Escherichia. 18. The method according to claim 17, wherein the microorganism is Klebsiella oxytoca. 19. The method according to claim 17, wherein the microorganism is Escherichia coli. 20. 18. The method of claim 17, wherein said microorganism comprises a heterologous nucleic acid molecule encoding Zymomonas alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase. 21. 21. The method of claim 20, wherein the Zymomonas alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase are encoded by a nucleic acid molecule isolated from Zymomonas mobilis. 22. 16. The method of claim 15, wherein said solid medium comprises an antibiotic and a fermentable sugar. 23. 23. The method of claim 22, wherein the antibiotic is selected from any of chloramphenicol, tetracycline, and ampicillin. 24. 17. The method of claim 15, wherein the first liquid medium, the second liquid medium, or both, further comprise a sugar. 25. 25. The method of claim 24, wherein the first liquid medium, the second liquid medium, or both comprise at least 3.5% (by weight) ethanol. 26. 26. The method of claim 25, wherein the second liquid medium comprises at least about 4% (by weight) ethanol. 27. (E) contacting one or more microorganisms obtained from step (d) with a third liquid medium containing an aqueous solution containing a larger amount of ethanol than is present in the second liquid medium and surviving; Selecting one or more microorganisms; and (f) contacting the one or more microorganisms obtained from step (e) with a solid growth medium for a time sufficient for growth. 27. The method of claim 26, further comprising: 28. 16. The method of claim 15, wherein the ethanologenic microbial mutant is capable of growing at an ethanol concentration of greater than 35 gL- ¹ . 29. 16. The method of claim 15, wherein the ethanologenic microbial variant is capable of producing at least 10% more ethanol than Escherichia coli K011 under equivalent fermentation conditions.