JP2003144158A - コンピテント細胞の迅速形質転換法 - Google Patents
コンピテント細胞の迅速形質転換法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】プラスミドＤＮＡで細菌を形質転換するときの
作業時間を短縮すること、および、自動形質転換装置で
実施できる迅速形質転換法を提供すること。 【解決手段】室温またはウォーターバスの中の容器（１
５）の中でコンピテント細胞（１０）を解凍するステッ
プと、前記容器の中でプラスミドＤＮＡおよびコンピテ
ント細胞（２０）を混合し、混合物（３０）にするステ
ップと、前記容器の中の前記混合物を約０〜１８０秒間
加熱して熱ショック処理するステップと、約−９０℃〜
３０℃の植えつけ器具により、前記混合物を約０℃〜３
０℃の選択培地（４０）に植えつけるステップと、形質
転換細胞を得るために、選択培地（５０）の上で前記混
合物を培養するステップとを含む。
作業時間を短縮すること、および、自動形質転換装置で
実施できる迅速形質転換法を提供すること。 【解決手段】室温またはウォーターバスの中の容器（１
５）の中でコンピテント細胞（１０）を解凍するステッ
プと、前記容器の中でプラスミドＤＮＡおよびコンピテ
ント細胞（２０）を混合し、混合物（３０）にするステ
ップと、前記容器の中の前記混合物を約０〜１８０秒間
加熱して熱ショック処理するステップと、約−９０℃〜
３０℃の植えつけ器具により、前記混合物を約０℃〜３
０℃の選択培地（４０）に植えつけるステップと、形質
転換細胞を得るために、選択培地（５０）の上で前記混
合物を培養するステップとを含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞への遺伝子導入
法、より具体的には、コンピテント細胞の迅速形質転換
法に関する。
法、より具体的には、コンピテント細胞の迅速形質転換
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ分子の透過性を高める前処理を施
した宿主細胞をコンピテント細胞という。培地中のＤＮ
Ａ分子を宿主細胞の中に送達する技術を形質転換とい
う。最近の遺伝子工学の進歩を考慮すると、コンピテン
ト細胞の作成およびコンピテント細胞の形質転換は非常
に重要である。
した宿主細胞をコンピテント細胞という。培地中のＤＮ
Ａ分子を宿主細胞の中に送達する技術を形質転換とい
う。最近の遺伝子工学の進歩を考慮すると、コンピテン
ト細胞の作成およびコンピテント細胞の形質転換は非常
に重要である。
【０００３】上記の技術は、ＣａＣｌ２を用いる化学的
形質転換法を発表したマンデル、Ｍ．およびヒガ、Ａ．
（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ、Ａ．、非特許
文献１）まで遡ることができる。その後の３０年間の改
良を経た今なお、形質転換に要する時間は１．５〜３．
０時間であるが、それは、前記宿主細胞が化学的処理に
より損傷を受けるためである。この損傷を受けた宿主細
胞を回復させるステップが必要である。この回復させる
ステップでは、前記損傷を受けた宿主細胞はその生理機
能と薬剤耐性とを回復することができるように、栄養培
地で培養される。その後、前記宿主細胞は、形質転換に
成功した宿主細胞をスクリーニングするために、選択培
地の上に植えつけられる（ｐｌａｔｅｄ）。こうしない
と、形質転換の効率に数倍の影響がある。近年、エレク
トロポレーション法という迅速な形質転換法が開発され
た。このエレクトロポレーション法は、一過性の電流に
より大腸菌宿主細胞の中にＤＮＡ分子を送達することが
できるが、この一時的な電流処理後の前記宿主細胞は、
高い形質転換効率を得るためには、やはり１時間の回復
を必要とする（非特許文献２）。１９８８年にゴルブ、
Ｅ．Ｉ．（Ｇｏｌｕｂ、Ｅ．Ｉ．、非特許文献３）が１
分間形質転換法を発表した。しかし、前記形質転換法で
は、回復させるステップを行うにもかかわらず、形質転
換効率は１０ ４〜１０５コロニー／μｇプラスミドＤＮ
Ａにすぎない。
形質転換法を発表したマンデル、Ｍ．およびヒガ、Ａ．
（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ、Ａ．、非特許
文献１）まで遡ることができる。その後の３０年間の改
良を経た今なお、形質転換に要する時間は１．５〜３．
０時間であるが、それは、前記宿主細胞が化学的処理に
より損傷を受けるためである。この損傷を受けた宿主細
胞を回復させるステップが必要である。この回復させる
ステップでは、前記損傷を受けた宿主細胞はその生理機
能と薬剤耐性とを回復することができるように、栄養培
地で培養される。その後、前記宿主細胞は、形質転換に
成功した宿主細胞をスクリーニングするために、選択培
地の上に植えつけられる（ｐｌａｔｅｄ）。こうしない
と、形質転換の効率に数倍の影響がある。近年、エレク
トロポレーション法という迅速な形質転換法が開発され
た。このエレクトロポレーション法は、一過性の電流に
より大腸菌宿主細胞の中にＤＮＡ分子を送達することが
できるが、この一時的な電流処理後の前記宿主細胞は、
高い形質転換効率を得るためには、やはり１時間の回復
を必要とする（非特許文献２）。１９８８年にゴルブ、
Ｅ．Ｉ．（Ｇｏｌｕｂ、Ｅ．Ｉ．、非特許文献３）が１
分間形質転換法を発表した。しかし、前記形質転換法で
は、回復させるステップを行うにもかかわらず、形質転
換効率は１０ ４〜１０５コロニー／μｇプラスミドＤＮ
Ａにすぎない。
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ． ａｎｄ Ｈｉｇ
ａ、Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー）、５３巻、１５９−１
６２頁）
ａ、Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー）、５３巻、１５９−１
６２頁）
【非特許文献２】Ｄｏｗｅｒ（ダウワー）ら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（ニュークレイック・ア
シッズ・リサーチ）、１６巻、６１２８−６１４５頁、
１９８８年）
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（ニュークレイック・ア
シッズ・リサーチ）、１６巻、６１２８−６１４５頁、
１９８８年）
【非特許文献３】Ｇｏｌｕｂ、Ｅ．Ｉ．、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻、１６４１頁）
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻、１６４１頁）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、作業
時間を節約するために、コンピテント細胞の迅速形質転
換法を提供することである。本発明の別の目的は、自動
形質転換装置により実行される、迅速形質転換法を提供
することである。
時間を節約するために、コンピテント細胞の迅速形質転
換法を提供することである。本発明の別の目的は、自動
形質転換装置により実行される、迅速形質転換法を提供
することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明に係る迅速形質転
換法は、室温でまたはウォーターバスの中の容器の中で
コンピテント細胞を解凍するステップと、混合物を形成
するために、プラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞
とを前記容器の中で混合するステップと、熱ショック処
理を施すために、前記容器の中の前記混合物を約０〜１
８０秒間加熱するステップと、約−９０°Ｃ〜３０°Ｃ
の植えつけ器具により、前記混合物を約０°Ｃ〜３０°
Ｃの選択培地に植えつけるステップと、形質転換細胞を
得るために、前記混合物を前記選択培地の上で培養する
ステップとをを含む。
換法は、室温でまたはウォーターバスの中の容器の中で
コンピテント細胞を解凍するステップと、混合物を形成
するために、プラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞
とを前記容器の中で混合するステップと、熱ショック処
理を施すために、前記容器の中の前記混合物を約０〜１
８０秒間加熱するステップと、約−９０°Ｃ〜３０°Ｃ
の植えつけ器具により、前記混合物を約０°Ｃ〜３０°
Ｃの選択培地に植えつけるステップと、形質転換細胞を
得るために、前記混合物を前記選択培地の上で培養する
ステップとをを含む。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の好ましい実施態様では、
前記迅速形質転換法は以下のステップを含む。容器の中
のコンピテント細胞は、室温でまたはウォーターバスの
中で解凍される。プラスミドＤＮＡと、コンピテント細
胞とは前記容器の中で混合され、その混合物は約０〜１
８０秒間熱ショック処理を施される。前記混合物を、約
−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植えつけ器具により約０°Ｃ〜
３０°Ｃの選択培地の上に植えつけた後、前記混合物
は、形質転換細胞を得るために、前記選択培地の上で培
養される。
前記迅速形質転換法は以下のステップを含む。容器の中
のコンピテント細胞は、室温でまたはウォーターバスの
中で解凍される。プラスミドＤＮＡと、コンピテント細
胞とは前記容器の中で混合され、その混合物は約０〜１
８０秒間熱ショック処理を施される。前記混合物を、約
−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植えつけ器具により約０°Ｃ〜
３０°Ｃの選択培地の上に植えつけた後、前記混合物
は、形質転換細胞を得るために、前記選択培地の上で培
養される。
【０００８】別の好ましい実施態様では、上記の混合す
るステップと、上記の加熱するステップとの間に、約０
〜９０分間アイスバスの中で前記コンピテント細胞をイ
ンキュベーションをするステップが挿入されることがあ
る。前記加熱するステップと、上記の植えつけるステッ
プとの間に、約０〜６０分間前記コンピテント細胞をア
イスバスの中でインキュベーションをする別のステップ
が挿入される場合がある。
るステップと、上記の加熱するステップとの間に、約０
〜９０分間アイスバスの中で前記コンピテント細胞をイ
ンキュベーションをするステップが挿入されることがあ
る。前記加熱するステップと、上記の植えつけるステッ
プとの間に、約０〜６０分間前記コンピテント細胞をア
イスバスの中でインキュベーションをする別のステップ
が挿入される場合がある。
【０００９】上記のとおり、従来の形質転換法の回復さ
せるステップは省略され、前記形質転換細胞は、低温の
植えつけ器具により、低温の選択培地の上に直接植えつ
けられる。そのため、従来必要とされた回復時間が１．
５〜３．０時間であったのに対し、本発明の方法は、数
分、またことによると、数秒しか要しない。
せるステップは省略され、前記形質転換細胞は、低温の
植えつけ器具により、低温の選択培地の上に直接植えつ
けられる。そのため、従来必要とされた回復時間が１．
５〜３．０時間であったのに対し、本発明の方法は、数
分、またことによると、数秒しか要しない。
【００１０】上記の短い作業時間に加えて、前記迅速形
質転換法の別の長所は、１つの容器が解凍するステップ
から植えつけるステップまで使用できることである。し
たがって、自動形質転換装置を前記迅速形質転換法を実
行するために使用することができる。
質転換法の別の長所は、１つの容器が解凍するステップ
から植えつけるステップまで使用できることである。し
たがって、自動形質転換装置を前記迅速形質転換法を実
行するために使用することができる。
【００１１】自動形質転換装置によって行われる迅速形
質転換法では、コンピテント細胞は、最初に室温の第１
のタンクに置かれた容器の中で解凍される。それから、
プラスミドＤＮＡが前記容器の中にピペットで注入さ
れ、混合物となるように、マイクロピペットにより前記
容器の中の前記コンピテント細胞と混合される。次に、
前記容器の中の前記混合物が熱ショック処理を施される
ように、前記容器は、温度制御ユニットにより加熱され
た第２のタンクにロボットアームにより約０〜１８０秒
間移される。約０°Ｃ〜３０°Ｃの選択培地を入れたプ
レートと、該プレート上の−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植え
つけ器具とは、プレート装填ユニット（ｐｌａｔｅ−ｌ
ｏａｄｉｎｇ ｕｎｉｔ）により提供される。前記植え
つけ器具は、前記混合物を塗布するために、植えつけユ
ニット（ｐｌａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）により前記選択培
地の上を動く。最後に、前記混合物は、形質転換細胞を
得るために、インキュベーションユニット（ｉｎｃｕｂ
ａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）の中で前記選択培地の上で培養
される。
質転換法では、コンピテント細胞は、最初に室温の第１
のタンクに置かれた容器の中で解凍される。それから、
プラスミドＤＮＡが前記容器の中にピペットで注入さ
れ、混合物となるように、マイクロピペットにより前記
容器の中の前記コンピテント細胞と混合される。次に、
前記容器の中の前記混合物が熱ショック処理を施される
ように、前記容器は、温度制御ユニットにより加熱され
た第２のタンクにロボットアームにより約０〜１８０秒
間移される。約０°Ｃ〜３０°Ｃの選択培地を入れたプ
レートと、該プレート上の−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植え
つけ器具とは、プレート装填ユニット（ｐｌａｔｅ−ｌ
ｏａｄｉｎｇ ｕｎｉｔ）により提供される。前記植え
つけ器具は、前記混合物を塗布するために、植えつけユ
ニット（ｐｌａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）により前記選択培
地の上を動く。最後に、前記混合物は、形質転換細胞を
得るために、インキュベーションユニット（ｉｎｃｕｂ
ａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）の中で前記選択培地の上で培養
される。
【００１２】したがって、室温の第１のタンクの中に置
かれた容器の中でコンピテント細胞を解凍すること、前
記容器の中にプラスミドＤＮＡをピペットで注入して、
混合物となるように、マイクロピペットにより前記容器
の中の前記コンピテント細胞と混合すること、前記容器
の中の前記混合物が熱ショック処理を施されるように、
温度制御ユニットにより加熱された第２のタンクに、前
記容器をロボットアームにより約０〜１８０秒間移すこ
と、プレート装填ユニットにより、約０°Ｃ〜３０°Ｃ
の選択培地を入れたプレートを提供すること、植えつけ
ユニットにより、前記選択培地の上の約−９０°Ｃ〜３
０°Ｃの植えつけ器具を提供すること、前記混合物を前
記選択培地の上に塗布するために、前記植えつけユニッ
トにより前記植えつけ器具を動かすこと、および、形質
転換細胞を得るために前記選択培地の上の前記混合物を
インキュベーションユニットの中で培養することを含
む、自動形質転換装置により実行される迅速形質転換法
を提供することが本発明の別の目的である。
かれた容器の中でコンピテント細胞を解凍すること、前
記容器の中にプラスミドＤＮＡをピペットで注入して、
混合物となるように、マイクロピペットにより前記容器
の中の前記コンピテント細胞と混合すること、前記容器
の中の前記混合物が熱ショック処理を施されるように、
温度制御ユニットにより加熱された第２のタンクに、前
記容器をロボットアームにより約０〜１８０秒間移すこ
と、プレート装填ユニットにより、約０°Ｃ〜３０°Ｃ
の選択培地を入れたプレートを提供すること、植えつけ
ユニットにより、前記選択培地の上の約−９０°Ｃ〜３
０°Ｃの植えつけ器具を提供すること、前記混合物を前
記選択培地の上に塗布するために、前記植えつけユニッ
トにより前記植えつけ器具を動かすこと、および、形質
転換細胞を得るために前記選択培地の上の前記混合物を
インキュベーションユニットの中で培養することを含
む、自動形質転換装置により実行される迅速形質転換法
を提供することが本発明の別の目的である。
【００１３】従来の形質転換法の回復させるステップ
は、最も時間がかかり、かつ、面倒なステップである。
前記回復させるステップでは、ＳＯＣまたはＬＢ液体培
地を入れた新しいチューブが必要であり、液体培地と形
質転換細胞とを入れた前記チューブは、少なくとも１〜
２時間振盪しながら３７°Ｃでインキュベーションをす
る必要がある。前記回復させるステップを省略すること
ができるか、あるいは、前記回復させるステップに要す
る時間を短縮することができると、形質転換法は非常に
簡単になる。
は、最も時間がかかり、かつ、面倒なステップである。
前記回復させるステップでは、ＳＯＣまたはＬＢ液体培
地を入れた新しいチューブが必要であり、液体培地と形
質転換細胞とを入れた前記チューブは、少なくとも１〜
２時間振盪しながら３７°Ｃでインキュベーションをす
る必要がある。前記回復させるステップを省略すること
ができるか、あるいは、前記回復させるステップに要す
る時間を短縮することができると、形質転換法は非常に
簡単になる。
【００１４】従来の形質転換法では、抗生物質耐性プラ
スミドのＤＮＡを吸収した形質転換細胞をＳＯＣまたは
ＬＢ液体培地中で３７°Ｃで１．０〜２．０時間振盪培
養することにより回復させるステップは、通常、植えつ
けるステップおよび選択するステップの前に行う。前記
回復させるステップの目的は、上記の吸収したプラスミ
ドＤＮＡが抗生物質耐性を発現するための時間を前記形
質転換細胞に与えることである。これにより、前記形質
転換細胞は、前記選択するステップにおいて抗生物質の
含む選択培地の中で生き残ることができる。前記回復さ
せるステップに要する時間を短縮するときには、前記形
質転換細胞に抗生物質耐性をより迅速に発現させるため
に、解凍するステップ、アイスバスの中でインキュベー
ションをするステップ、および熱ショックのステップの
間に宿主細胞に生じる損傷も減らさなければならない。
スミドのＤＮＡを吸収した形質転換細胞をＳＯＣまたは
ＬＢ液体培地中で３７°Ｃで１．０〜２．０時間振盪培
養することにより回復させるステップは、通常、植えつ
けるステップおよび選択するステップの前に行う。前記
回復させるステップの目的は、上記の吸収したプラスミ
ドＤＮＡが抗生物質耐性を発現するための時間を前記形
質転換細胞に与えることである。これにより、前記形質
転換細胞は、前記選択するステップにおいて抗生物質の
含む選択培地の中で生き残ることができる。前記回復さ
せるステップに要する時間を短縮するときには、前記形
質転換細胞に抗生物質耐性をより迅速に発現させるため
に、解凍するステップ、アイスバスの中でインキュベー
ションをするステップ、および熱ショックのステップの
間に宿主細胞に生じる損傷も減らさなければならない。
【００１５】本発明の好ましい実施態様では、前記迅速
形質転換法は、以下のステップを含む。チューブの中の
コンピテント細胞は、室温でまたはウォーターバスの中
で解凍される。プラスミドＤＮＡとコンピテント細胞と
を前記チューブの中で混合して、その後、この混合物は
熱ショック処理を施される。前記混合物を低温の植えつ
け器具により低温の選択培地の上に植えつけた後、前記
コンピテント細胞は前記選択培地の上で培養される。
形質転換法は、以下のステップを含む。チューブの中の
コンピテント細胞は、室温でまたはウォーターバスの中
で解凍される。プラスミドＤＮＡとコンピテント細胞と
を前記チューブの中で混合して、その後、この混合物は
熱ショック処理を施される。前記混合物を低温の植えつ
け器具により低温の選択培地の上に植えつけた後、前記
コンピテント細胞は前記選択培地の上で培養される。
【００１６】本発明の好ましい実施態様では、前記形質
転換細胞は前記低温の選択培地の上に直接植えつけられ
るのであって、前記植えつけるステップおよび選択する
ステップの前に行われるのが通常である、従来の回復さ
せるステップは省略される。したがって、複数のステッ
プ（複数のチューブ）および時間がかかること（約１，
５〜３．０時間）のような、前記従来の形質転換法の短
所は、所要時間が短いこと（数秒ないし数分）および１
本のチューブを使用することのような、本発明の長所に
より解決される。
転換細胞は前記低温の選択培地の上に直接植えつけられ
るのであって、前記植えつけるステップおよび選択する
ステップの前に行われるのが通常である、従来の回復さ
せるステップは省略される。したがって、複数のステッ
プ（複数のチューブ）および時間がかかること（約１，
５〜３．０時間）のような、前記従来の形質転換法の短
所は、所要時間が短いこと（数秒ないし数分）および１
本のチューブを使用することのような、本発明の長所に
より解決される。
【００１７】一般に、コンピテント細胞は−７０°Ｃで
保存される。プラスミドＤＮＡとコンピテント細胞とを
混合する前、まず前記コンピテント細胞を解凍しなけれ
ばならない。前記コンピテント細胞を解凍する方法は、
ゆっくりと解凍するために、アイスバスの中で約５〜３
０分間インキュベーションをすることである。前記コン
ピテント細胞を迅速に解凍する方法は、ウォーターバス
の中で約５秒〜５分間インキュベーションをすることで
ある。
保存される。プラスミドＤＮＡとコンピテント細胞とを
混合する前、まず前記コンピテント細胞を解凍しなけれ
ばならない。前記コンピテント細胞を解凍する方法は、
ゆっくりと解凍するために、アイスバスの中で約５〜３
０分間インキュベーションをすることである。前記コン
ピテント細胞を迅速に解凍する方法は、ウォーターバス
の中で約５秒〜５分間インキュベーションをすることで
ある。
【００１８】前記コンピテント細胞は、例えば、ＨＢ１
０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｔ
Ｇ１、ＢＬ２１、ＪＭ１０９等のさまざまな大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株から調製する
ことができる。大腸菌は、最も広範に応用される微生物
である。特に、分子生物学および遺伝子工学の分野で
は、大腸菌の変異体は、異なる種類のＤＮＡまたはタン
パク質を大量生産するために実験室で使用される必須の
宿主細胞である。
０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｔ
Ｇ１、ＢＬ２１、ＪＭ１０９等のさまざまな大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株から調製する
ことができる。大腸菌は、最も広範に応用される微生物
である。特に、分子生物学および遺伝子工学の分野で
は、大腸菌の変異体は、異なる種類のＤＮＡまたはタン
パク質を大量生産するために実験室で使用される必須の
宿主細胞である。
【００１９】それから、プラスミドＤＮＡと前記コンピ
テント細胞とは混合される。前記コンピテント細胞につ
いて特別な限定条件は全く必要ではない。前記コンピテ
ント細胞は、いかなる商業的に入手可能な供給源から購
入することもでき、あるいはいかなる既知の技術によっ
て作成することもできる。前記プラスミドＤＮＡは、い
かなる天然の供給源から得ることもでき、あるいは遺伝
子工学による組み換えの後に得ることもできる。前記コ
ンピテント細胞と前記プラスミドＤＮＡとは、指で前記
チューブをそっと逆さまにするか、シェーカで前記チュ
ーブを激しく振盪するか、といういずれかにより、混合
することができる。
テント細胞とは混合される。前記コンピテント細胞につ
いて特別な限定条件は全く必要ではない。前記コンピテ
ント細胞は、いかなる商業的に入手可能な供給源から購
入することもでき、あるいはいかなる既知の技術によっ
て作成することもできる。前記プラスミドＤＮＡは、い
かなる天然の供給源から得ることもでき、あるいは遺伝
子工学による組み換えの後に得ることもできる。前記コ
ンピテント細胞と前記プラスミドＤＮＡとは、指で前記
チューブをそっと逆さまにするか、シェーカで前記チュ
ーブを激しく振盪するか、といういずれかにより、混合
することができる。
【００２０】均一に混合した後、前記プラスミドＤＮＡ
と前記コンピテント細胞との混合物は、熱ショック処理
のために、約３６°Ｃ〜４８°Ｃのウォーターバスの中
でインキュベーションをされる。前記熱ショック処理に
必要な時間は、約０〜１８０秒間が好ましく、約１０〜
９０秒間がより好ましい。
と前記コンピテント細胞との混合物は、熱ショック処理
のために、約３６°Ｃ〜４８°Ｃのウォーターバスの中
でインキュベーションをされる。前記熱ショック処理に
必要な時間は、約０〜１８０秒間が好ましく、約１０〜
９０秒間がより好ましい。
【００２１】次に、前記混合物は、低温の植えつけ器具
により、低温の選択培地の上に植えつけられる。前記植
えつけ器具は、ガラスビーズまたはガラス製ループのよ
うな、従来の器具でよい。前記植えつけ器具の温度は、
約−９０°Ｃ〜３０°Ｃが好ましく、約−２０°Ｃ〜８
°Ｃがより好ましい。前記選択培地の温度は、約０°Ｃ
〜３０°Ｃが好ましく、約０°Ｃ〜４°Ｃがより好まし
い。
により、低温の選択培地の上に植えつけられる。前記植
えつけ器具は、ガラスビーズまたはガラス製ループのよ
うな、従来の器具でよい。前記植えつけ器具の温度は、
約−９０°Ｃ〜３０°Ｃが好ましく、約−２０°Ｃ〜８
°Ｃがより好ましい。前記選択培地の温度は、約０°Ｃ
〜３０°Ｃが好ましく、約０°Ｃ〜４°Ｃがより好まし
い。
【００２２】最後に、前記コンピテント細胞は前記選択
培地の上で培養される。抗生物質が前記選択培地に添加
される。前記抗生物質の量は、必要に応じ、あるいは既
知の技術によって加減することができる。例えば、アン
ピシリンのような抗生物質の濃度は、約２５〜１００μ
ｇ／ｍｌである。
培地の上で培養される。抗生物質が前記選択培地に添加
される。前記抗生物質の量は、必要に応じ、あるいは既
知の技術によって加減することができる。例えば、アン
ピシリンのような抗生物質の濃度は、約２５〜１００μ
ｇ／ｍｌである。
【００２３】本発明の別の好ましい実施態様によると、
アイスバスの中でインキュベーションをするステップ
を、前記回復させるステップと上記の熱ショック処理の
ステップとの間に挿入することができる。すなわち、前
記プラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞とを混合し
た後、前記混合物をアイスバスの中でインキュベーショ
ンをし、それから、前記熱ショック処理を施すのであ
る。前記混合物を前記アイスバスの中でインキュベーシ
ョンをする時間は、約０〜９０分が好ましく、約０〜３
０分がより好ましい。アイスバスの中でインキュベーシ
ョンをする別のステップを、前記熱ショック処理のステ
ップと前記植えつけるステップとの間に挿入することが
できる。前記アイスバスの中に前記混合物をインキュベ
ーションをする時間は、約０〜６０分が好ましく、約０
〜３０分がより好ましい。
アイスバスの中でインキュベーションをするステップ
を、前記回復させるステップと上記の熱ショック処理の
ステップとの間に挿入することができる。すなわち、前
記プラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞とを混合し
た後、前記混合物をアイスバスの中でインキュベーショ
ンをし、それから、前記熱ショック処理を施すのであ
る。前記混合物を前記アイスバスの中でインキュベーシ
ョンをする時間は、約０〜９０分が好ましく、約０〜３
０分がより好ましい。アイスバスの中でインキュベーシ
ョンをする別のステップを、前記熱ショック処理のステ
ップと前記植えつけるステップとの間に挿入することが
できる。前記アイスバスの中に前記混合物をインキュベ
ーションをする時間は、約０〜６０分が好ましく、約０
〜３０分がより好ましい。
【００２４】
【実施例】コンピテント細胞の調製
本発明のコンピテント細胞は以下の４つの化学的方法に
より作成された。前記４つの化学的方法とは、ＣａＣｌ
２法（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ．およびＨｉｇａ、Ａ．、１９
７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３巻、１５９−１６
２頁）、ＴＢ法（Ｉｎｏｕｅ、Ｈ．（イノウエ、
Ｈ．）、１９９０年、Ｇｅｎｅ（ジーン）、９６巻、２
３−２８頁）、ＴＳＳ法（Ｃｈｕｎｇ、Ｃ．Ｔ．（チュ
ン、Ｃ．Ｔ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．（米国科学アカデミー会報）、８６巻、２
１７２−２１７５頁）およびＴＦＢ法（Ｈａｎａｈａ
ｎ、Ｄ．（ハナハン、Ｄ．）、１９８３年、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６巻、５５７−５８０頁）であ
る。使用した大腸菌の菌株は、分子生物学の研究に慣用
されている、ＤＨ５αであった。ＤＨ５α株の遺伝子型
の情報は、Ｆ−（φ８０ｄ ｌａｃＺΔＭ１５） Δ
（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ） Ｕ１６９ ｓｕｐＥ４４
ｈｓｄＲ１７（ｒｋ− ｍｋ ＋） ｒｅｃＡ１ ｇｙ
ｒＡ９６ ｅｎｄＡ１ ｔｈｉ−１ ｒｅｌＡ１ ｄｅ
ｏＲ λ−である。
より作成された。前記４つの化学的方法とは、ＣａＣｌ
２法（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ．およびＨｉｇａ、Ａ．、１９
７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３巻、１５９−１６
２頁）、ＴＢ法（Ｉｎｏｕｅ、Ｈ．（イノウエ、
Ｈ．）、１９９０年、Ｇｅｎｅ（ジーン）、９６巻、２
３−２８頁）、ＴＳＳ法（Ｃｈｕｎｇ、Ｃ．Ｔ．（チュ
ン、Ｃ．Ｔ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．（米国科学アカデミー会報）、８６巻、２
１７２−２１７５頁）およびＴＦＢ法（Ｈａｎａｈａ
ｎ、Ｄ．（ハナハン、Ｄ．）、１９８３年、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６巻、５５７−５８０頁）であ
る。使用した大腸菌の菌株は、分子生物学の研究に慣用
されている、ＤＨ５αであった。ＤＨ５α株の遺伝子型
の情報は、Ｆ−（φ８０ｄ ｌａｃＺΔＭ１５） Δ
（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ） Ｕ１６９ ｓｕｐＥ４４
ｈｓｄＲ１７（ｒｋ− ｍｋ ＋） ｒｅｃＡ１ ｇｙ
ｒＡ９６ ｅｎｄＡ１ ｔｈｉ−１ ｒｅｌＡ１ ｄｅ
ｏＲ λ−である。
【００２５】前記形質転換法の手順では、ＤＨ５α株の
１つのクローンをＬＢ液体培地に接種し、約３７°Ｃで
約１６時間培養した。次に、ＤＨ５α株の細胞は、もと
の濃度の約１／１００の濃度にＬＢ液体培地で希釈され
た。それから、希釈されたＤＨ５α株の細胞の液を４本
のボトルに分注し、吸光度が約０．２〜０．６になるま
でＬＢ液体培地で連続培養した。その後、コンピテント
細胞がそれぞれ上記の４つの化学的方法で作成され（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（メソッズ
・イン・エンザイモロジー）、１９９１年、２０４巻、
６３−１１３頁）、約−７０°Ｃで保存された。
１つのクローンをＬＢ液体培地に接種し、約３７°Ｃで
約１６時間培養した。次に、ＤＨ５α株の細胞は、もと
の濃度の約１／１００の濃度にＬＢ液体培地で希釈され
た。それから、希釈されたＤＨ５α株の細胞の液を４本
のボトルに分注し、吸光度が約０．２〜０．６になるま
でＬＢ液体培地で連続培養した。その後、コンピテント
細胞がそれぞれ上記の４つの化学的方法で作成され（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（メソッズ
・イン・エンザイモロジー）、１９９１年、２０４巻、
６３−１１３頁）、約−７０°Ｃで保存された。
【００２６】実施例１
従来の形質転換法の効率
「コンピテント細胞の調製」の項に記載の前記４つの化
学的方法により調製されたコンピテント細胞は、プラス
ミドｐＵＣ１９で形質転換された。作業ステップおよび
時間は表１に示される。プラスミドｐＵＣ１９のテスト
された濃度は１０−４または１０−５μｇ／μｌで、使
用量は各回１μｌであった。用いたコンピテント細胞の
量は毎回１００μｌであった。解凍は、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１年、２０４巻、
６３−１１３頁に記載のさまざまな形質転換法によって
実施された。表１に示すとおり、従来の形質転換法の所
要時間は約１．５〜３．０時間であった。
学的方法により調製されたコンピテント細胞は、プラス
ミドｐＵＣ１９で形質転換された。作業ステップおよび
時間は表１に示される。プラスミドｐＵＣ１９のテスト
された濃度は１０−４または１０−５μｇ／μｌで、使
用量は各回１μｌであった。用いたコンピテント細胞の
量は毎回１００μｌであった。解凍は、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１年、２０４巻、
６３−１１３頁に記載のさまざまな形質転換法によって
実施された。表１に示すとおり、従来の形質転換法の所
要時間は約１．５〜３．０時間であった。
【００２７】
【表１】従来の形質転換法（ＣａＣｌ２、ＴＳＳ、ＴＢ
およびＴＦＢ法）の作業ステップおよび所要時間 前記抗生物質の添加された濃度は、例えばアンピシリン
については、通常、２５〜６０μｇ／ｍｌである。４０
μｇ／ｍｌのアンピシリン入りのＬＢ寒天ゲル中（以下
「ＬＢＡｐ４０」という。）が本発明の一連のテストに
用いられた。
およびＴＦＢ法）の作業ステップおよび所要時間 前記抗生物質の添加された濃度は、例えばアンピシリン
については、通常、２５〜６０μｇ／ｍｌである。４０
μｇ／ｍｌのアンピシリン入りのＬＢ寒天ゲル中（以下
「ＬＢＡｐ４０」という。）が本発明の一連のテストに
用いられた。
【００２８】前記４つの化学的方法により調製されたコ
ンピテント細胞の形質転換効率は、表２に示される。こ
れらの結果は関連文献に発表された結果と適合する。し
たがって、「コンピテント細胞の調製」の項で調製され
たコンピテント細胞は、本発明の形質転換法をテストす
るために用いることができる。
ンピテント細胞の形質転換効率は、表２に示される。こ
れらの結果は関連文献に発表された結果と適合する。し
たがって、「コンピテント細胞の調製」の項で調製され
たコンピテント細胞は、本発明の形質転換法をテストす
るために用いることができる。
【００２９】
【表２】「コンピテント細胞の調製」の項に記載の前記
４つの化学的方法によって調製されたコンピテント細胞
の形質転換効率
４つの化学的方法によって調製されたコンピテント細胞
の形質転換効率
【００３０】実施例２〜１４
各ステップの所要時間の影響
多くの商業化された化学的なコンピテント細胞は改良さ
れたＴＦＢ法により調製されているため（ストラタジー
ン、プロメガ、インビトロジェンおよびライフ・テクノ
ロジー各社から購入したコンピテント細胞の指示マニュ
アルからの要約）、ＴＦＢ法により調製されたコンピテ
ント細胞（以下「ＴＦＢコンピテント細胞」という。）
が以下のテストに用いられた。実施例２〜１４の結果は
各ステップの形質転換効率への影響を示す（表３）。
れたＴＦＢ法により調製されているため（ストラタジー
ン、プロメガ、インビトロジェンおよびライフ・テクノ
ロジー各社から購入したコンピテント細胞の指示マニュ
アルからの要約）、ＴＦＢ法により調製されたコンピテ
ント細胞（以下「ＴＦＢコンピテント細胞」という。）
が以下のテストに用いられた。実施例２〜１４の結果は
各ステップの形質転換効率への影響を示す（表３）。
【００３１】
【表３】各ステップの形質転換効率への影響
【００３２】前記形質転換のプロセスは、冷凍庫に保存
された前記コンピテント細胞を、約５〜２０秒間２５°
Ｃのウォーターバスの中で迅速に解凍することから始ま
った。前記コンピテント細胞の１／２〜１／４が解凍状
態になったときに、前記プラスミドＤＮＡが前記コンピ
テント細胞に添加された。それから、指で弾いて前記プ
ラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞とを均一に混合
した。その後のステップは表３に示す。
された前記コンピテント細胞を、約５〜２０秒間２５°
Ｃのウォーターバスの中で迅速に解凍することから始ま
った。前記コンピテント細胞の１／２〜１／４が解凍状
態になったときに、前記プラスミドＤＮＡが前記コンピ
テント細胞に添加された。それから、指で弾いて前記プ
ラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞とを均一に混合
した。その後のステップは表３に示す。
【００３３】驚いたことに、表３の実施例２に示すとお
り、前記植えつけるステップを除いて、形質転換の過程
全作業時間は４５秒に短縮できる。前記形質転換のプロ
セスのうち、熱ショック処理の前後に行う前記プラスミ
ドＤＮＡと前記コンピテント細胞との混合物を氷の上に
置くステップと、培養するステップとは省略可能であ
る。実施例２の形質転換効率は表２に記載の従来の形質
転換法の形質転換効率に匹敵する。
り、前記植えつけるステップを除いて、形質転換の過程
全作業時間は４５秒に短縮できる。前記形質転換のプロ
セスのうち、熱ショック処理の前後に行う前記プラスミ
ドＤＮＡと前記コンピテント細胞との混合物を氷の上に
置くステップと、培養するステップとは省略可能であ
る。実施例２の形質転換効率は表２に記載の従来の形質
転換法の形質転換効率に匹敵する。
【００３４】植えつけ器具および選択培地の温度の効果
「コンピテント細胞の調製」の項に記載の化学的方法に
よって調製された４種類のコンピテント細胞は、実施例
２の手順で形質転換された。そして、植えつけ器具およ
び選択培地の温度の影響をテストするために、異なる温
度の植えつけ器具、すなわち、４ｍｍガラスビーズと、
室温または４°Ｃの選択培地とが用いられた。結果を表
４に示す。表４の結果から、低温の植えつけ器具および
選択培地は、細胞コンピテント細胞の形質転換効率を上
げることが示される。
よって調製された４種類のコンピテント細胞は、実施例
２の手順で形質転換された。そして、植えつけ器具およ
び選択培地の温度の影響をテストするために、異なる温
度の植えつけ器具、すなわち、４ｍｍガラスビーズと、
室温または４°Ｃの選択培地とが用いられた。結果を表
４に示す。表４の結果から、低温の植えつけ器具および
選択培地は、細胞コンピテント細胞の形質転換効率を上
げることが示される。
【００３５】
【表４】植えつけ器具または選択培地の形質転換効率へ
の影響 ＊コンピテント細胞は、それぞれＣａＣｌ２法、ＴＢ
法、ＴＳＳ法およびＴＦＢ法という化学的方法により調
製される。
の影響 ＊コンピテント細胞は、それぞれＣａＣｌ２法、ＴＢ
法、ＴＳＳ法およびＴＦＢ法という化学的方法により調
製される。
【００３６】実施例１５〜２２
熱ショック処理の時間の影響
「コンピテント細胞の調製」の項に記載の化学的方法に
より調製された４種類のコンピテント細胞は実施例２の
手順によって形質転換された。カラスビーズおよびＬＢ
Ａｐ４０培地は両方とも４°Ｃであった。しかし、熱シ
ョック処理の時間の影響をテストするため、熱ショック
（４２°Ｃのウォーターバス）の処理時間を変化させ
た。結果を表５に示す。
より調製された４種類のコンピテント細胞は実施例２の
手順によって形質転換された。カラスビーズおよびＬＢ
Ａｐ４０培地は両方とも４°Ｃであった。しかし、熱シ
ョック処理の時間の影響をテストするため、熱ショック
（４２°Ｃのウォーターバス）の処理時間を変化させ
た。結果を表５に示す。
【００３７】
【表５】熱ショック処理の時間の影響
【００３８】表５から、熱ショック処理なしの場合の形
質転換効率（実施例１５）は、熱ショック処理ありの場
合の形質転換効率（実施例１６〜２２）に匹敵する。熱
ショック処理ありの場合の形質転換効率は、約１０〜９
０秒間の場合の方が良好である（実施例１６〜２０）。
したがって、表３および５の結果から、冷却および加熱
の処理時間が短縮され、ＬＢまたはＳＯＣ液体培地の中
で回復させるステップが省略されたときでも、従来の方
法の結果に匹敵するか、あるいはそれ以上に良好な結果
を得ることができる。形質転換効率は上記の商業化され
た標準の形質転換効率に近い。
質転換効率（実施例１５）は、熱ショック処理ありの場
合の形質転換効率（実施例１６〜２２）に匹敵する。熱
ショック処理ありの場合の形質転換効率は、約１０〜９
０秒間の場合の方が良好である（実施例１６〜２０）。
したがって、表３および５の結果から、冷却および加熱
の処理時間が短縮され、ＬＢまたはＳＯＣ液体培地の中
で回復させるステップが省略されたときでも、従来の方
法の結果に匹敵するか、あるいはそれ以上に良好な結果
を得ることができる。形質転換効率は上記の商業化され
た標準の形質転換効率に近い。
【００３９】迅速形質転換法の適用可能性
コンピテント細胞は、「コンピテント細胞の調製」の項
に記載のＴＢ法およびＴＦＢ法により調製された。表６
に示すとおり、使用した大腸菌の菌株はＤＨ５αおよび
ＪＭ１０９で、プラスミドＤＮＡはｐＵＣ１９、ｐＢＲ
３２２およびｐＵＣ４Ｋであった。
に記載のＴＢ法およびＴＦＢ法により調製された。表６
に示すとおり、使用した大腸菌の菌株はＤＨ５αおよび
ＪＭ１０９で、プラスミドＤＮＡはｐＵＣ１９、ｐＢＲ
３２２およびｐＵＣ４Ｋであった。
【００４０】
【表６】プラスミドｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐ
ＵＣ４Ｋのデータ
ＵＣ４Ｋのデータ
【００４１】選択培地に添加された抗生物質は、アンピ
シリン（Ａｐ）、カナマイシン（Ｋｍ）、テトラサイク
リン（Ｔｃ）、Ａｐ／ＫｍおよびＡｐ／Ｔｃであった。
使用した植えつけ器具すなわちガラスビーズと、選択培
地とは４°Ｃであった。結果を表７に示す。表７から、
形質転換効率は、１０６形質転換クローン／μｇ プラ
スミドより高かいことがわかった。そこで、前記迅速形
質転換法は、さまざまな大腸菌の菌株と、選択培地とに
ついて広範な適用可能性がある。
シリン（Ａｐ）、カナマイシン（Ｋｍ）、テトラサイク
リン（Ｔｃ）、Ａｐ／ＫｍおよびＡｐ／Ｔｃであった。
使用した植えつけ器具すなわちガラスビーズと、選択培
地とは４°Ｃであった。結果を表７に示す。表７から、
形質転換効率は、１０６形質転換クローン／μｇ プラ
スミドより高かいことがわかった。そこで、前記迅速形
質転換法は、さまざまな大腸菌の菌株と、選択培地とに
ついて広範な適用可能性がある。
【００４２】
【表７】異なる菌株、プラスミドおよび抗生物質に対す
る前記迅速形質転換法の適用可能性
る前記迅速形質転換法の適用可能性
【００４３】１．使用したプラスミドの量は１回の形質
転換あたり１０−４μｇであった。 ２．使用した抗生物質Ａｐ、ＫｍおよびＴｃの濃度は、
それぞれ、４０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび１
２．５μｇ／ｍｌであった。
転換あたり１０−４μｇであった。 ２．使用した抗生物質Ａｐ、ＫｍおよびＴｃの濃度は、
それぞれ、４０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび１
２．５μｇ／ｍｌであった。
【００４４】植えつけ器具の形状の影響
形質転換効率は、植えつけ器具として、ガラスビーズを
使用するか、あるいはガラスループを使用するかによっ
てはほとんど影響を受けなかった（結果示さず）。した
がって、植えつけ器具の形状は、形質転換効率には明白
な影響を与えなかった。
使用するか、あるいはガラスループを使用するかによっ
てはほとんど影響を受けなかった（結果示さず）。した
がって、植えつけ器具の形状は、形質転換効率には明白
な影響を与えなかった。
【００４５】実施例２３〜３９
ＹＥＡコンピテント細胞への実用的な応用
Ｙｅａｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．
のＹＥＡコンピテント細胞（ＤＨ５α由来の菌株をＴＦ
Ｂ法で調製したコンピテント細胞）は、従来の形質転換
法（２時間プロトコール）により形質転換された。前記
ＹＥＡコンピテント細胞の形質転換効率は、１ｘ１０８
〜５ｘ１０８形質転換クローン／μｇプラスミドであっ
た。
のＹＥＡコンピテント細胞（ＤＨ５α由来の菌株をＴＦ
Ｂ法で調製したコンピテント細胞）は、従来の形質転換
法（２時間プロトコール）により形質転換された。前記
ＹＥＡコンピテント細胞の形質転換効率は、１ｘ１０８
〜５ｘ１０８形質転換クローン／μｇプラスミドであっ
た。
【００４６】前記ＹＥＡコンピテント細胞は、本発明の
迅速形質転換法によって形質転換された。冷凍庫に保存
されたＹＥＡコンピテント細胞は、２５°Ｃのウォータ
ーバスの中で約５〜２０秒間迅速に解凍された。前記コ
ンピテント細胞の１／２〜１／４が解凍状態のときに、
プラスミドｐＵＣ１９のＤＮＡが細胞コンピテント細胞
に添加された。それから、チューブを弾くことにより、
プラスミドｐＵＣ１９と前記コンピテント細胞とが均一
に混合された。植えつけ器具、ガラスビーズおよび選択
培地は４°Ｃで保存された。残りのステップを表８に示
す。
迅速形質転換法によって形質転換された。冷凍庫に保存
されたＹＥＡコンピテント細胞は、２５°Ｃのウォータ
ーバスの中で約５〜２０秒間迅速に解凍された。前記コ
ンピテント細胞の１／２〜１／４が解凍状態のときに、
プラスミドｐＵＣ１９のＤＮＡが細胞コンピテント細胞
に添加された。それから、チューブを弾くことにより、
プラスミドｐＵＣ１９と前記コンピテント細胞とが均一
に混合された。植えつけ器具、ガラスビーズおよび選択
培地は４°Ｃで保存された。残りのステップを表８に示
す。
【００４７】表８に示す実験結果から、所要時間が、従
来の形質転換法の１．５〜３．０時間（表１）から、前
記迅速形質転換法の１分間未満（実施例２３および実施
例２９〜３１、表８）まで短縮されることが証明され
た。表８に示した前記迅速形質転換法の形質転換効率
は、１０７〜１０９形質転換クローン／μｇ ｐＵＣ１
９ＤＮＡに到達することができる。
来の形質転換法の１．５〜３．０時間（表１）から、前
記迅速形質転換法の１分間未満（実施例２３および実施
例２９〜３１、表８）まで短縮されることが証明され
た。表８に示した前記迅速形質転換法の形質転換効率
は、１０７〜１０９形質転換クローン／μｇ ｐＵＣ１
９ＤＮＡに到達することができる。
【００４８】
【表８】ＹＥＡコンピテント細胞の形質転換効率
【００４９】
【表９】迅速形質転換法の大腸菌のさまざまな菌株への
適用可能性
適用可能性
【００５０】
【００５１】他の大腸菌の菌株のコンピテント細胞が、
前記ＹＥＡコンピテント細胞が調製されたのと同じ方法
で調製され、前記迅速形質転換法により形質転換され
た。（表９に掲げた）形質転換効率は１０７〜１０１０
形質転換コロニー／μｇプラスミドであり、商業化の水
準（１０７〜１０１０形質転換コロニー／μｇプラスミ
ド）に達している。表９に掲げた形質転換効率は、ゲノ
ムＤＮＡライブラリまたはｃＤＮＡライブラリのような
高度なクローニングには不十分であるが、サブクローニ
ングまたはＴＡクローニングのような分子生物学実験用
の一般的なクローニングには十分である。
前記ＹＥＡコンピテント細胞が調製されたのと同じ方法
で調製され、前記迅速形質転換法により形質転換され
た。（表９に掲げた）形質転換効率は１０７〜１０１０
形質転換コロニー／μｇプラスミドであり、商業化の水
準（１０７〜１０１０形質転換コロニー／μｇプラスミ
ド）に達している。表９に掲げた形質転換効率は、ゲノ
ムＤＮＡライブラリまたはｃＤＮＡライブラリのような
高度なクローニングには不十分であるが、サブクローニ
ングまたはＴＡクローニングのような分子生物学実験用
の一般的なクローニングには十分である。
【００５２】自動化された迅速形質転換法
作業時間の短縮に加え、大腸菌の迅速形質転換法には、
解凍するステップから植えつけるステップまで１本のチ
ューブで済ませることができるという、別な長所があ
る。したがって、迅速形質転換法によって、多数の形質
転換を同時に行うことができる。例えば、２４、９６、
３８４個またはそれ以上の数の形質転換をアレイ状の配
置で行うことができる。
解凍するステップから植えつけるステップまで１本のチ
ューブで済ませることができるという、別な長所があ
る。したがって、迅速形質転換法によって、多数の形質
転換を同時に行うことができる。例えば、２４、９６、
３８４個またはそれ以上の数の形質転換をアレイ状の配
置で行うことができる。
【００５３】さらに、迅速形質転換法では１本のチュー
ブしか必要でないことおよび回復させるステップを省略
することのおかげで、大腸菌の迅速形質転換法を実行し
て時間および経費を節約するために、自動形質転換装置
を使用することができる。前記自動形質転換装置は、例
えば、温度制御ユニット、マイクロピペット、ロボット
アーム、プレート装填ユニット、植えつけユニットおよ
びインキュベーションユニットを含む。
ブしか必要でないことおよび回復させるステップを省略
することのおかげで、大腸菌の迅速形質転換法を実行し
て時間および経費を節約するために、自動形質転換装置
を使用することができる。前記自動形質転換装置は、例
えば、温度制御ユニット、マイクロピペット、ロボット
アーム、プレート装填ユニット、植えつけユニットおよ
びインキュベーションユニットを含む。
【００５４】温度制御ユニットは、解凍、熱ショック処
理および低温ショック処理の各ステップにおいて、プラ
スミドおよび／またはコンピテント細胞か、選択培地か
を入れる容器を保持するためのドライバスのような異な
るタンクの異なる温度を制御するために使用される。前
記容器は、例えば、マルチウェルプレートであってもよ
い。前記ロボットアームは、前記容器を異なる温度のタ
ンクの間を移動させるために使用される。
理および低温ショック処理の各ステップにおいて、プラ
スミドおよび／またはコンピテント細胞か、選択培地か
を入れる容器を保持するためのドライバスのような異な
るタンクの異なる温度を制御するために使用される。前
記容器は、例えば、マルチウェルプレートであってもよ
い。前記ロボットアームは、前記容器を異なる温度のタ
ンクの間を移動させるために使用される。
【００５５】マルチチャンネルマイクロピペットのよう
なマイクロピペットが、プラスミドＤＮＡを前記容器に
ピペット操作で注入し混合するために使用される。前記
マイクロピペットは、上記の混合物を選択培地の上にピ
ペット操作で滴下するために使用される。プレート装填
ユニットは、約０°Ｃ〜３０°Ｃの選択培地を入れたプ
レートを積み上げて提供するために使用される。植えつ
けユニットは、前記混合物を選択培地の上に均一に塗布
するために、選択培地の上に植えつけ器具を提供し、該
植えつけ器具を水平運動、または軌道運動（ｏｒｂｉｔ
ａｌｌｙ）をするように、振盪のような動きをさせるた
めに使用される。前記植えつけ器具は、例えば、４ｍｍ
ガラスビーズであってもよい。そして、前記ロボットア
ームは、前記植えつけるステップが実行された後、前記
選択培地の上の植えつけ器具を取り除くことができる。
前記インキュベーションユニットは、前記プレートの中
の選択培地の上でコンピテント細胞を増殖させるため
に、約３７°Ｃのような適当な温度を提供するために使
用される。
なマイクロピペットが、プラスミドＤＮＡを前記容器に
ピペット操作で注入し混合するために使用される。前記
マイクロピペットは、上記の混合物を選択培地の上にピ
ペット操作で滴下するために使用される。プレート装填
ユニットは、約０°Ｃ〜３０°Ｃの選択培地を入れたプ
レートを積み上げて提供するために使用される。植えつ
けユニットは、前記混合物を選択培地の上に均一に塗布
するために、選択培地の上に植えつけ器具を提供し、該
植えつけ器具を水平運動、または軌道運動（ｏｒｂｉｔ
ａｌｌｙ）をするように、振盪のような動きをさせるた
めに使用される。前記植えつけ器具は、例えば、４ｍｍ
ガラスビーズであってもよい。そして、前記ロボットア
ームは、前記植えつけるステップが実行された後、前記
選択培地の上の植えつけ器具を取り除くことができる。
前記インキュベーションユニットは、前記プレートの中
の選択培地の上でコンピテント細胞を増殖させるため
に、約３７°Ｃのような適当な温度を提供するために使
用される。
【００５６】好ましい実施例はここに示される。約８〜
１０個のガラスビーズと、約８〜３８４個のウェルのよ
うな複数のウェルを有する回収プレートとを含む各プレ
ートが用意される。前記回収プレートは、例えば、ＥＬ
ＩＳＡ用プレートであってもよい。約−７０°Ｃで保存
されたコンピテント細胞は、約１０〜２００μｌ／ウェ
ルの量が前記ウェルに添加される。
１０個のガラスビーズと、約８〜３８４個のウェルのよ
うな複数のウェルを有する回収プレートとを含む各プレ
ートが用意される。前記回収プレートは、例えば、ＥＬ
ＩＳＡ用プレートであってもよい。約−７０°Ｃで保存
されたコンピテント細胞は、約１０〜２００μｌ／ウェ
ルの量が前記ウェルに添加される。
【００５７】前記回収プレートはマニホルド基部に配置
され、約０．１〜２０μｌのプラスミドＤＮＡが各ウェ
ルに添加される。そして、前記コンピテント細胞および
プラスミドＤＮＡは、２〜５秒間シェーカで振盪する
か、またはマルチチャンネルマイクロピペットで前記ウ
ェル中の混合物を２〜３回ピペット操作で上下するかに
より、完全に混合される。前記回収プレートは、ロボッ
トアームによってヒータまたはドライバスブロックに移
され、約０〜１８０秒間約４２°Ｃで加熱されて、熱シ
ョック処理を施される。
され、約０．１〜２０μｌのプラスミドＤＮＡが各ウェ
ルに添加される。そして、前記コンピテント細胞および
プラスミドＤＮＡは、２〜５秒間シェーカで振盪する
か、またはマルチチャンネルマイクロピペットで前記ウ
ェル中の混合物を２〜３回ピペット操作で上下するかに
より、完全に混合される。前記回収プレートは、ロボッ
トアームによってヒータまたはドライバスブロックに移
され、約０〜１８０秒間約４２°Ｃで加熱されて、熱シ
ョック処理を施される。
【００５８】選択培地を入れたプレートは、プレート装
填ユニットから前記マニホルド基部までロボットアーム
によって移動される。前記形質転換細胞は前記ウェルか
ら前記選択培地に前記マルチチャンネルマイクロピペッ
トによりピペット操作で移され、植えつけユニットによ
りガラスビーズが前記選択培地の上に添加される。前記
植えつけユニットは前記選択培地の上のガラスビーズを
動かして、前記選択培地の上に形質転換細胞を均一に塗
布する。それから、前記ロボットアームは前記プレート
を傾けて前記ガラスビーズを前記プレートの外に出す。
次に、形質転換細胞を得るために、前記プレートを約３
７°Ｃのインキュベーションユニットの中に１２〜２０
時間入れて、前記コンピテント細胞を培養する。
填ユニットから前記マニホルド基部までロボットアーム
によって移動される。前記形質転換細胞は前記ウェルか
ら前記選択培地に前記マルチチャンネルマイクロピペッ
トによりピペット操作で移され、植えつけユニットによ
りガラスビーズが前記選択培地の上に添加される。前記
植えつけユニットは前記選択培地の上のガラスビーズを
動かして、前記選択培地の上に形質転換細胞を均一に塗
布する。それから、前記ロボットアームは前記プレート
を傾けて前記ガラスビーズを前記プレートの外に出す。
次に、形質転換細胞を得るために、前記プレートを約３
７°Ｃのインキュベーションユニットの中に１２〜２０
時間入れて、前記コンピテント細胞を培養する。
【００５９】アレイ状の配置で形質転換を行うことを前
記自動形質転換装置と組み合わせることにより、多数の
形質転換を自動的に行って、多数のさまざまな形質転換
細胞を同時に得ることができる。
記自動形質転換装置と組み合わせることにより、多数の
形質転換を自動的に行って、多数のさまざまな形質転換
細胞を同時に得ることができる。
【００６０】化学的方法により形質転換された細菌の広
い適用範囲 ストラタジーン、インビトロジェン、プロメガおよびラ
イフ・テクノロジー各社の操作マニュアルに言明されて
いるように、大抵のコンピテント細胞が改良ＴＦＢ法に
より調製されるため、迅速形質転換法は大抵の商業的な
コンピテント細胞に適用することができる。さらに、迅
速形質転換法を適用するときには、形質転換効率を下げ
ることなく、作業時間を約１．５〜３．０時間から数分
間または数秒間まで短縮することができる。
い適用範囲 ストラタジーン、インビトロジェン、プロメガおよびラ
イフ・テクノロジー各社の操作マニュアルに言明されて
いるように、大抵のコンピテント細胞が改良ＴＦＢ法に
より調製されるため、迅速形質転換法は大抵の商業的な
コンピテント細胞に適用することができる。さらに、迅
速形質転換法を適用するときには、形質転換効率を下げ
ることなく、作業時間を約１．５〜３．０時間から数分
間または数秒間まで短縮することができる。
【００６１】そのうえ、大腸菌はグラム陰性菌であり、
大抵のグラム陰性またはグラム陽性の細菌のコンピテン
ト細胞の調製法は大腸菌の形質転換法を改変したもので
ある（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー)、２０４巻、６３−
１１３頁、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ（メソッズ・イン・マイクロバイオロジー）、２１
巻、７９−１２８頁）。したがって、迅速形質転換法は
化学的方法により形質転換されたグラム陰性またはグラ
ム陽性の細菌のコンピテント細胞の形質転換に適用でき
る。実施例は、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ、２１巻、７９−１２８頁に記載されている。
上記に列挙された実施例は、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔ
ｒｏｐｈｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａ
ｎｄｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａ
ｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒ
ａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌ
ｇａｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅ
ｓｔｒｉｓを含む。
大抵のグラム陰性またはグラム陽性の細菌のコンピテン
ト細胞の調製法は大腸菌の形質転換法を改変したもので
ある（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ(メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー)、２０４巻、６３−
１１３頁、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ（メソッズ・イン・マイクロバイオロジー）、２１
巻、７９−１２８頁）。したがって、迅速形質転換法は
化学的方法により形質転換されたグラム陰性またはグラ
ム陽性の細菌のコンピテント細胞の形質転換に適用でき
る。実施例は、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ、２１巻、７９−１２８頁に記載されている。
上記に列挙された実施例は、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔ
ｒｏｐｈｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａ
ｎｄｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａ
ｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒ
ａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌ
ｇａｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅ
ｓｔｒｉｓを含む。
【００６２】図１を参照して、更に本発明は、コンピテ
ント細胞１０を室温でまたはウォーターバスの中の容器
１５の中で解凍する手段と、容器１５の中でプラスミド
ＤＮＡとコンピテント細胞２０とを混合して混合物にす
る手段と、容器１５の中の混合物３０を約０〜１８０秒
間加熱して熱ショック処理を施す手段と、約−９０°Ｃ
〜３０°Ｃの植えつけ器具により約０°Ｃ〜３０°Ｃの
選択培地４０の上に前記混合物を植えつける手段と、形
質転換細胞を得るために選択培地５０上で前記混合物を
培養する手段とを含む、迅速形質転換法のための自動形
質転換装置を提供する。上記の手段は、商業化された製
品により容易に作成され、かつ、当業者により改変され
うる。
ント細胞１０を室温でまたはウォーターバスの中の容器
１５の中で解凍する手段と、容器１５の中でプラスミド
ＤＮＡとコンピテント細胞２０とを混合して混合物にす
る手段と、容器１５の中の混合物３０を約０〜１８０秒
間加熱して熱ショック処理を施す手段と、約−９０°Ｃ
〜３０°Ｃの植えつけ器具により約０°Ｃ〜３０°Ｃの
選択培地４０の上に前記混合物を植えつける手段と、形
質転換細胞を得るために選択培地５０上で前記混合物を
培養する手段とを含む、迅速形質転換法のための自動形
質転換装置を提供する。上記の手段は、商業化された製
品により容易に作成され、かつ、当業者により改変され
うる。
【００６３】
【発明の効果】迅速形質転換法を適用するときには、形
質転換効率を下げることなく、作業時間を約１．５〜
３．０時間から数分または数秒まで短縮することができ
る。作業時間の短縮に加え、大腸菌の迅速形質転換法に
は、解凍するステップから植えつけるステップまで１本
のチューブで済ませることができる。
質転換効率を下げることなく、作業時間を約１．５〜
３．０時間から数分または数秒まで短縮することができ
る。作業時間の短縮に加え、大腸菌の迅速形質転換法に
は、解凍するステップから植えつけるステップまで１本
のチューブで済ませることができる。
【図１】本発明の迅速形質転換法のための自動形質転換
装置の概略図である。
装置の概略図である。
１０ コンピテント細胞
１５ 容器
２０ プラスミドＤＮＡおよびコンピテント細胞
３０ 混合物
４０ 選択培地
５０ 選択
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１５年２月２５日（２００３．２．２
５）
５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明に係る迅速形質転
換法は、室温でまたはウォーターバスの中の容器の中で
コンピテント細胞を解凍するステップと、混合物を形成
するために、プラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞
とを前記容器の中で混合するステップと、熱ショック処
理を施すために、前記容器の中の前記混合物を約０〜１
８０秒間加熱するステップと、約−９０°Ｃ〜３０°Ｃ
の植えつけ器具により、前記混合物を約０°Ｃ〜３０°
Ｃの選択培地に植えつけるステップと、形質転換細胞を
得るために、前記混合物を前記選択培地の上で培養する
ステップとを含む。
換法は、室温でまたはウォーターバスの中の容器の中で
コンピテント細胞を解凍するステップと、混合物を形成
するために、プラスミドＤＮＡと前記コンピテント細胞
とを前記容器の中で混合するステップと、熱ショック処
理を施すために、前記容器の中の前記混合物を約０〜１
８０秒間加熱するステップと、約−９０°Ｃ〜３０°Ｃ
の植えつけ器具により、前記混合物を約０°Ｃ〜３０°
Ｃの選択培地に植えつけるステップと、形質転換細胞を
得るために、前記混合物を前記選択培地の上で培養する
ステップとを含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】したがって、室温の第１のタンクの中に置
かれた容器の中でコンピテント細胞を解凍すること、前
記容器の中にプラスミドＤＮＡをピペットで注入して、
混合物となるように、マイクロピペットにより前記容器
の中の前記コンピテント細胞と混合すること、前記容器
の中の前記混合物が熱ショック処理を施されるように、
温度制御ユニットにより加熱された第２のタンクに、前
記容器をロボットアームにより約０〜１８０秒間移すこ
と、プレート装填ユニットにより、約０°Ｃ〜３０°Ｃ
の選択培地を入れたプレートを提供すること、植えつけ
ユニットにより、前記選択培地の上の約−９０°Ｃ〜３
０°Ｃの植えつけ器具を提供すること、前記混合物を前
記選択培地の上に塗布するために、前記植えつけユニッ
トにより前記植えつけ器具を動かすこと、および、形質
転換細胞を得るために前記選択培地の上の前記混合物を
インキュベーションユニットの中で培養することを含
む、自動形質転換装置により実行される迅速形質転換法
を提供することが本発明の別の目的である。
かれた容器の中でコンピテント細胞を解凍すること、前
記容器の中にプラスミドＤＮＡをピペットで注入して、
混合物となるように、マイクロピペットにより前記容器
の中の前記コンピテント細胞と混合すること、前記容器
の中の前記混合物が熱ショック処理を施されるように、
温度制御ユニットにより加熱された第２のタンクに、前
記容器をロボットアームにより約０〜１８０秒間移すこ
と、プレート装填ユニットにより、約０°Ｃ〜３０°Ｃ
の選択培地を入れたプレートを提供すること、植えつけ
ユニットにより、前記選択培地の上の約−９０°Ｃ〜３
０°Ｃの植えつけ器具を提供すること、前記混合物を前
記選択培地の上に塗布するために、前記植えつけユニッ
トにより前記植えつけ器具を動かすこと、および、形質
転換細胞を得るために前記選択培地の上の前記混合物を
インキュベーションユニットの中で培養することを含
む、自動形質転換装置により実行される迅速形質転換法
を提供することが本発明の別の目的である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:01）
Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA05 DA05 DA06 EA04
GA11 GA19
4B029 AA08 AA09 AA23 BB02 BB20
GA08 GB10 HA09
Claims (21)
- 【請求項１】 室温でまたはウォーターバスの中の容器
の中でコンピテント細胞を解凍するステップと、 混合物を形成するために、プラスミドＤＮＡと前記コン
ピテント細胞とを前記容器の中で混合するステップと、 熱ショック処理を施すために、前記容器の中の前記混合
物を約０〜１８０秒間加熱するステップと、 約−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植えつけ器具により、前記混
合物を約０°Ｃ〜３０°Ｃの選択培地に植えつけるステ
ップと、 形質転換細胞を得るために、前記混合物を前記選択培地
の上で培養するステップとを含む、コンピテント細胞の
迅速形質転換法。 - 【請求項２】 前記解凍するステップから前記植えつけ
るステップまでは同一の容器の中で行われる、請求項１
に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項３】 前記混合するステップと、前記加熱する
ステップとの間に、前記混合物をアイスバスの中で約０
〜９０分間インキュベーションをするステップを含む、
請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項４】 前記混合するステップと、前記加熱する
ステップとの間に、前記混合物をアイスバスの中で約０
〜３０分間インキュベーションをするステップを含む、
請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項５】 前記加熱するステップと、前記植えつけ
るステップとの間に、前記混合物をアイスバスの中で約
０〜６０分間インキュベーションをするステップを含
む、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項６】 前記加熱するステップと、前記植えつけ
るステップとの間に、前記混合物をアイスバスの中で約
０〜３０分間インキュベーションをするステップを含
む、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項７】 前記解凍するステップは約５秒間〜約５
分間行われる、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項８】 前記解凍するステップは前記コンピテン
ト細胞の約１／２〜１／４が解凍した状態になるまで行
われる、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項９】 前記プラスミドＤＮＡは組み換えＤＮＡ
を含む、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項１０】 前記熱ショック処理は約３６°Ｃ〜４
８°Ｃの温度で行われる、請求項１に記載の迅速形質転
換法。 - 【請求項１１】 前記熱ショック処理は約１０〜９０秒
間行われる、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項１２】 前記植えつけ器具の温度は約−２０°
Ｃ〜８°Ｃまでである、請求項１に記載の迅速形質転換
法。 - 【請求項１３】 前記植えつけ器具はガラスビーズまた
はガラスループを含む、請求項１に記載の迅速形質転換
法。 - 【請求項１４】 前記選択培地の温度は約０°Ｃ〜４°
Ｃである、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項１５】 前記選択培地は抗生物質が添加された
培地を含む、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項１６】 前記コンピテント細胞は、Ａｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ
ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖ
ｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、Ｅｒｗ
ｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａ
ｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌ
ａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｕｒｅｇｉｎｏｓａ、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｒｏｔｅ
ｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓからなるグループから選択され
る細菌から調製される、請求項１に記載の迅速形質転換
法。 - 【請求項１７】 前記コンピテント細胞は大腸菌から調
製される、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項１８】 自動形質転換装置によりアレイ状の配
置で行われる、請求項１に記載の迅速形質転換法。 - 【請求項１９】 請求項１に記載の方法により作成され
た形質転換細胞。 - 【請求項２０】 コンピテント細胞を室温の第１のタン
クの中の容器の中で解凍すること、 混合物を形成するべく、前記容器の中の前記コンピテン
ト細胞とマイクロピペットにより混合するために、プラ
スミドＤＮＡを前記容器にピペット操作で注入するこ
と、 前記容器の中の前記混合物に熱ショック処理が施される
ように、温度制御ユニットにより加熱された第２のタン
クに前記容器をロボットアームによる約０〜１８０秒間
移すこと、 約０°Ｃ〜３０°Ｃの選択培地を入れたプレートをプレ
ート装填ユニットにより提供すること、 約−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植えつけ器具を前記選択培地
の上に植えつけユニットにより提供すること、 前記選択培地の上に前記混合物を塗布するために、前記
植えつけユニットにより前記選択培地の上の植えつけ器
具を動かすこと、および形質転換細胞を得るために、前
記選択培地の上の前記混合物をインキュベーションユニ
ットの中で培養することを含む、自動形質転換装置によ
り行われる迅速形質転換法。 - 【請求項２１】 室温でまたはウォーターバスの中の容
器の中のコンピテント細胞を解凍する手段と、 混合物にするために、プラスミドＤＮＡと前記容器の中
のコンピテント細胞とを混合する手段と、 熱ショック処理を施すために、前記容器の中の前記混合
物を約０〜１８０秒間加熱する手段と、 約−９０°Ｃ〜３０°Ｃの植えつけ器具により約０°Ｃ
〜３０°Ｃの選択培地の上に前記混合物を植えつける手
段と、 形質転換細胞を得るために、前記選択培地の上で前記混
合物を培養する手段とを含む、迅速形質転換法のための
自動形質転換装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW090127915 | 2001-11-09 | ||
| TW090127915A TWI229696B (en) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | A fast method of transforming competent cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003144158A true JP2003144158A (ja) | 2003-05-20 |
Family
ID=21679702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002324057A Pending JP2003144158A (ja) | 2001-11-09 | 2002-11-07 | コンピテント細胞の迅速形質転換法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6864088B2 (ja) |
| JP (1) | JP2003144158A (ja) |
| DE (1) | DE10251429B4 (ja) |
| FR (1) | FR2832727B1 (ja) |
| GB (1) | GB2383582B (ja) |
| TW (1) | TWI229696B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200024247A (ko) * | 2017-06-30 | 2020-03-06 | 인스크립타 인코포레이티드 | 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4896006B2 (ja) * | 2004-04-08 | 2012-03-14 | バイオマトリカ， インコーポレイテッド | ライフサイエンスのためのサンプル保存とサンプル管理との統合 |
| US20080176209A1 (en) * | 2004-04-08 | 2008-07-24 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
| US20060099567A1 (en) * | 2004-04-08 | 2006-05-11 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
| CN100462436C (zh) * | 2005-10-12 | 2009-02-18 | 益生生技开发股份有限公司 | 感受态细胞快速转化方法 |
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