KR101350283B1 - 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 플라스미드 DNA를 이온 용액에 현탁된 컴피턴트 세포와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; (b) 상기 혼합액을 따뜻한 선별 배지에 도말하는 단계; 및 (c) 상기 혼합액을 배지상에서 배양하는 단계를 포함하는, 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법에 관한 것으로, 상기 이온 용액은 Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Cd2+, Fe2+, Sr2+ 및 Co2+로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 양이온을 포함하며, 상기 이온 용액은 Ca2+ 만을 단독으로 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법에 관한 것이다.
컴피턴트 세포, 형질전환

Description

컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법{A FAST METHOD OF TRANSFORMING COMPETENT CELLS}
본 발명은 유전자 형질전환 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법에 관한 것이다.
E. coli는 가장 널리 사용되는 미생물이다. 특히 분자 생물학과 유전공학 분야에서, E. coli 변이체들은 여러가지 종류의 DNA나 단백질을 대량 생산하기 위한 실험에 필수적으로 사용되는 숙주 세포이다. DNA 분자를 주변 배지중에서 숙주 세포로 전달하는 기술을 형질전환이라고 하며, DNA 분자에 보다 투과적일 수 있도록 전처리한 숙주 세포를 컴피턴트 세포(competent cell)라고 한다.
따라서, 컴피턴트 세포를 제조하는 방법과 컴피턴트 세포를 형질전환하는 방법은 최근 유전자공학의 발전 측면에서 매우 중요하다. 전술한 기술들은 CaCl2를 이용한 화학적인 형질전환 방법을 개시한 Mandel, M.과 Higa, A.(J. Mol. Biol. 53:159-162)로 거슬러 올라간다. 이후 30년간의 향상이 이루어졌지만, 숙주 세포는 화학적 처리에 의해 손상되므로 형질전환에 요구되는 시간은 여전히 1.5 내지 3.0 시간에 머물러 있다. 손상된 숙주 세포는 회복 단계가 필요하다. 회복 단계에서 숙주 세포를 영양 배지에서 배양하여, 손상된 숙주 세포가 그것의 생리학적 기능과 약물 내성을 회복하도록 한다. 이후, 숙주 세포를 형질전환된 숙주 세포를 스크리닝하기 위해 선별 배지에 도말한다. 이렇게 하지 않으면, 형질전환 효율은 몇 배 낮아질 수 있다. 최근, 전기충격(electroporation)이라고 하는 신속한 형질전환 방법으로 일시적인 전류에 의해 DNA 분자를 E. coli 숙주 세포에 전달할 수 있게 되었다. 그러나, 일시적인 전류 처리 후에 형질전환 효율을 향상시키기 위해서 숙주 세포를 한시간동안 회복시키는 회복 단계가 여전히 요구된다(Dower et. al., 1988 Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). 1988년에 Golub E. I.(Nucleic Acids Res. 16: 1641)은 1분 형질전환 방법을 개시하였다. 이 방법에서도 회복 단계가 수행되지만, 형질전환 효율은 104 -105 colony/㎍(플라스미드 DNA)에 불과하였다.
형질전환 효율의 감소없이도 기존의 형질전환 방법에서 장시간 소요되며 시간 소모적인 컴피턴트 세포의 회복 단계를 생략시킨 신속한 형질전환 방법(미국 특허 제 6,864,088호)이 이스턴 바이오텍 컴퍼니, 리미티드사에 의해 최근 개발되었다. 이러한 신속 방법은 튜브내에서 플라스미드 DNA와 컴피턴트 세포를 혼합하는 단계, 상기 혼합액에 열 충격을 처리하는 단계, 및 감온된 온도의 도말 방법을 이용하여 보다 낮은 온도의 선별 배지에 상기 혼합액을 도말하는 단계를 포함한다. 여기서, 비선별 배지(예, SOC, LB...)를 첨가하는 회복 단계는 생략된다. 따라서, 기존의 여러 단계의 형질전환 과정을 수행하는데 걸리는 시간 1.5 내지 3.0 시간을 수 분 단축시킬 수 있으며, 하나의 튜브에서 형질전환 효율 감소없이 완료할 수 있다.
상기한 컴피턴트 세포의 형질전환 방법은 종래 기술 보다 우수하지만, 열 충격 처리용 온도 조절 장치가 여전히 꼭 필요한 실정이다. 또한, 세포가 튜브안에 있을때에는 균등하게 열처리되지 않을 수 있다. 따라서, 형질전환 세포의 시간 소모적인 회복 단계를 생략시키고, 온도 조절 장치가 필요없는 혁신적인 형질전환 방법이 개발된다면, 막대한 시간, 비용 및 노력을 절약할 수 있을 것이며, 세포가 불균등하게 열처리되지 않을 수 있으며, 형질전환 효율이 낮아지지 않을 수 있다.
본 발명은 형질전환 세포의 시간 소모적인 회복 단계를 생략시키고, 온도 조절 장치가 필요없는 혁신적인 형질전환 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법을 제공한다. 본 발명은 열 충격 처리 과정을 간단화하는 것을 특징으로 하며, 세포가 불균등하게 열처리되는 현상을 방지하며, E. coli(Escherichia coli) 형질전환 세포의 오래 걸리고 시간 소모적인 회복 단계를 생략할 수 있으며, 본래의 형질전환 효율을 감소시키지 않는다.
컴피턴트 세포는 다양한 미생물, 가장 바람직하기로는 HB101, DH5α GM2929, XL1-Blue, TG1, BL21 및 JM109 등과 같이 다양한 E. coli 균주로부터 제조할 수 있 다. E. coli는 가장 널리 사용되는 미생물이다. 특히, 분자 생물학과 유전공학 분야에서, E. coli 변이체는 다양한 종류의 DNA 또는 단백질을 대량 생산하기 위한 실험에 사용되는 필수적인 숙주 세포이다. DNA 분자에 보다 투과적일 수 있도록 전처리한 숙주 세포를 컴피턴트 세포라고 하며, DNA 분자를 주변 배지중에서 숙주 세포로 전달하는 기술을 형질전환이라고 한다.
미국 특허 제 6,864,088호에 개시된 신속한 E. coli 형질전환 방법에 따르면, 플라스미드 DNA를 컴피턴트 세포와 혼합하고, 이 혼합액에 열 충격을 가한 다음 형질전환체를 선별적으로 배양하기 위한 냉각 도말 방법을 이용하여 냉각 선별 배지에 도말한다.
본 발명은, 전술한 방법의 장점을 취할 뿐만 아니라(특히, 형질전환 세포의 시간 소모적인 회복 단계를 생략함), 플라스미드 DNA 및 컴피턴트 세포를 직접 보다 고온의 선별 배지에 도말함으로써 열 충격 처리 단계를 추가적으로 간략화한다. 세포는 선별 배지의 온도에 의해 직접적으로 열 충격 처리된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법을 제공한다:
(a) 플라스미드 DNA를 이온 용액에 현탁된 컴피턴트 세포와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;
(b) 상기 혼합액을 따뜻한 선별 배지에 도말하는 단계; 및
(c) 상기 혼합액을 배지상에서 배양하는 단계.
상기 컴피턴트 세포가 현탁되어 있는 이온 용액은 Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Cd2+, Fe2+, Sr2+ 및 Co2+로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 양이온을 포함하며, 상기 이온 용액은 Ca2+ 만을 단독으로 포함하지 않는다. 가장 바람직한 예로, 상기 2가 양이온은 Mg2+이다. 2가 양이온의 농도는 5mM 내지 500mM이며, 더 바람직하기로는 10mM 내지 300mM이며, 가장 바람직하기로는 30mM 내지 150mM이다. 상기 이온 용액은 NH4 +, Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, Ag+ 및 Co+로 이루어진 군으로부터 선택된 1가 양이온을 더 포함할 수 있다. 가장 바람직한 예로, 상기 1가 양이온은 Rb+이다. 상기 1가 양이온의 농도는 10mM 내지 1000mM이며, 더 바람직하기로는 20mM 내지 600mM이며, 가장 바람직하기로는 60mM 내지 300mM이다. 상기 이온 용액은 Al3+, Cr3+, Fe3+ 및 Co3+로 이루어진 군으로부터 선택된 3가 양이온을 더 포함할 수 있다. 가장 바람직한 예로, 상기 3가 양이온은 Co3+이다.
일반적으로, 형질전환 효율은 106를 초과하며, 더 바람직하기로는 107, 가장 바람직하기로는 108보다 높다.
배양 배지를 첨가하는 회복 단계는 본 발명에서 없어도 되는 단계이다. 즉, 따뜻한 선별 배지에 도말하기 전에 수 십분간 배양하기 위해 비선택 배지를 첨가하 는 단계는 필수적인 사항이 아니다. 또한, 열 충격 처리 단계 역시 본 발명에 없어도 되는 단계이다. 즉, 따뜻한 선별 배지에 도말하기 전의 열 충격 단계는 필수적인 사항이 아니다. 상기 따뜻한 선별 배지의 온도는 20℃ 내지 50℃이고, 바람직하기로는 25℃ 내지 45℃이며, 더 바람직하기로는 30℃ 내지 42℃이다.
기존의 미리 가온된 열 조절 장치에 의한 열 충격 처리를 따뜻한 선별 배지에 도말하는 것으로 대체하는 방법은 3가지 이점을 가진다: (1) 보다 신속함- 기존의 열 충격 처리 시간 절약; (2) 보다 용이함 - 미리 가온된 열 조절 장치를 준비할 필요가 없으며 실험실 작업이 보다 용이함; (3) 세포가 균일하게 열처리됨 - 세포가 튜브의 벽을 통해 간접적으로 열처리되지 않고, 따뜻한 선별 배지상에 도말에 의해 균일하게 열처리됨. 세포와 열원간의 폭넓은 경계면이 상기한 방식으로 존재하기 때문에, 세포는 균일하게 열처리된다.
본 발명의 신속한 방법은 플라스미드 DNA를 이온 용액에 현탁된 컴피턴트 세포와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계와 상기 혼합액을 따뜻한 선별 배지에 도말하는 단계 사이에, 얼음 조에 플라스미드 DNA와 컴피턴트 세포 혼합액을 두는 단계, 및 플라스미드 DNA와 컴피턴트 세포의 혼합액을 열처리하여 열 충격을 실시하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 한 단계 이상의 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 열 충격 온도 범위는 20℃ 내지 50℃이며, 더 바람직하기로는 34℃ 내지 45℃이다.
본 발명은, 상기 혼합액을 따뜻한 선별 배지에 도말하는 단계와 상기 혼합액을 배지에서 배양하는 단계 사이에, 냉각 처리, 즉 상기 따뜻한 선별 배지를 냉각 환경에서 냉각시키는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 상기 냉각 환경은 실온이거나, 얼음조, 냉각 장치, 동결 장치 또는 상기 따뜻한 선별 배지 보다 온도가 낮은 임의의 조건이다. 상기 냉각 환경의 온도는 -35℃ 내지 30℃이며, 더 바람직하기로는 -20℃ 내지 20℃이며, 가장 바람직하기로는 -10℃ 내지 10℃이다.
본 발명에서 컴피턴트 세포와 혼합되는 플라스미드 DNA는 통상의 플라스미드 DNA 또는 재조합 플라스미드 DNA이며, 바람직하기로는 재조합 플라스미드 DNA이다.
본 발명의 상기 선별 배지는 항생제가 첨가된 배지이다. 바람직한 예에서, 상기 선별 배지에는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 메토트렉세이트, 히그로마이신, 네오마이신 및 제오신으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제가 첨가된다.
E. coli는 그람 음성 균주이며, 그람 음성 또는 그람 양성 세균으로부터 대부분의 컴피턴트 세포를 제조하는 방법은 E. coli의 형질전환 방법으로부터 변형된다(Method In Enzymology 204: 63-113, Method in Microbiology 21: 79-128). 따라서, 신속한 형질전환 방법은 그람 음성 또는 그람 양성 세균의 컴피턴트 세포의 형질전환에 적용할 수 있다. 바람직한 예로, 본 발명의 컴피턴트 세포는 E. coli로부터 제조된다.
하기 실시예는 비제한적이며, 본 발명의 다양한 측면과 특징을 주로 나타낸다.
실시예
실시예 1: 재료
이스턴 바이오텍 컴퍼니, 리미티드사의 ECOS 컴피턴스 세포는, Inoue H., 1990, Gene 96:23-28에 따른 방법과 Hanahan D., 1983, J. Mol. Bio. 166:557-580에 따른 방법을 조합한 방법에 따라 제조된 것이다. ECOS 세포를 하기 실시예로 테스트하였으며, 기존의 CaCl2 방법(Mandel, M., and Higa A. 1970, J. Mol. Biol. 53: 159-162)으로도 컴피턴트 세포를 준비하여, 대조군으로 사용하였다. ECOS-101 컴피턴트 세포를 50mM Mg2+ 및 100mM Rb+가 포함되어 있는 용액에 현탁하였고, 기존의 컴피턴트 세포는 100 mM CaCl2이 포함되어 있는 용액에 현탁하였다.
실시예 2: 기존의 열 충격 처리를 따뜻한 선별 배지로 대체
상기 세포(균주 DH5α)를 플라스미드 pBR322로 형질전환시켰다. 컴피턴트 세포 분주액(100 ㎕/분주액)을 -30℃ 냉동고에서 꺼내어 상온의 수조 또는 수돗물을 이용하여 1/3이 해동될때까지(10-20 초) 해동시켰다. 즉시, 플라스미드 pBR322를 첨가한 다음, 튜브를 0.5-1 초간 볼텍스(vortexe)하였다. ECOS 세포와 기존의 CaCl2 방법으로 준비한 컴피턴트 세포 둘다에 첨가하기 위한 플라미스드 pBR322의 농도는 10-5 ㎍/ml이다. 샘플 일부는 바로 2분간 42℃ 수조에서 열 충격을 가하였고, 나머지는 열 충격을 실시하지 않았다. 혼합액을 잘 혼합하기 위해 튜브를 상하 흔들었다. 샘플 절반에는 항생제가 첨가된 선별 배지에 도말하기 전에 비선별 배지(LB) 900 ㎕를 첨가하여 37℃에서 40분간 배양하였고, 나머지는 직접 항생제가 첨가된 선별 배지에 도말하였다. 상기 사용한 선별 배지의 온도는 4℃ 또는 37℃ 이다. 도말 온도는 대응되는 선별 배지의 온도와 동일하였다. 형질전환 효율 결과는 다음과 같다.
표 1: 형질전환 효율에 대한 열 충격 처리 방법과 다양한 온도의 선별 배지를 이용한 방법의 효과
배양 배지의 온도 ECOS CaCl2
2분간 열 충격 LB를 첨가하여 회복 단계 실시 4℃ 6.44 x 107 7.14 x 105
37℃ 5.65 x 106 6.96 x 105
직접 도말 4℃ 4.32 x 107 4.12 x 105
37℃ 7.15 x 106 3.32 x 105
열 충격 실시 안함 LB를 첨가하여 회복 단계 실시 4℃ 2.36 x 107 4.48 x 105
37℃ 3.72 x 107 9.75 x 104
직접 도말 4℃ 1.02 x 107 1.38 x 106
37℃ 9.58 x 107 1.17 x 106
살기 표 1의 결과로부터 하기 결론을 내릴 수 있다:
(1) LB를 첨가하는 회복 단계는 없어도 된다: LB를 첨가하는 회복 단계를 생략하고 혼합액을 직접 도말하는 방법은 형질전환 효율 측면에서 명확한 차이가 없었다. ECOS 컴피턴트 세포의 형질전환 효율은 여전히 5 x 106 - 108을 유지하였다.
(2) 열 충격 처리 단계 역시 없어도 된다: 42℃ 수조에서의 열 충격 처리를 생략하였을때 형질전환 효율에 있어 차이가 없었다. ECOS 컴피턴트 세포의 형질전환 효율은 여전히 107 - 108로 유지되었지만, 기존의 컴피턴트 세포의 형질전환 효율은 105 - 106에 불과하였다.
(3) 따뜻한 선별 배지는 특별히 제조된 ECOS 컴피턴트 세포의 형질전환 효율 을 증가시킨다: LB를 첨가하는 회복 단계와 열 충격 처리 단계 둘다를 생략하고 4℃ 선별 배지 대신 37℃ 선별 배지를 사용하는 조건에서, 형질전환 효율 결과가 9배 증가되었다. 그러나, 기존의 CaCl2 방법에 따른 형질전환 효율은 개선되지 않았다.
실시예 3: 다양한 균주 및 다양한 선별 배지에 대한 신속한 형질전환 방법의 폭넓은 적용성
E coli 균주들, DH5α JM109, BL21(DE3) 및 XL1Blue의 ECSO 컴피턴트 세포를 사용하였고, 50mM Mg2+ 및 100mM Rb+를 포함하고 있는 수용액에 현탁하였다. 실시예 2의 방법을 사용하여, 다양한 온도의 따뜻한 선별 배지를 테스트하였다. 그 결과는 다음과 같다.
표 2: 여러가지 온도의 선별 배지에 도말한 다양한 균주들의 형질전환 효율
균주 열 충격 열 충격 실시 안함
4℃ 4℃ 25℃ 37℃ 42℃
DH5α 4.3 x 107 1.0 x 107 --- 9.6 x 107 ---
JM109 6.4 x 107 4.0 x 107 --- 7.1 x 107 ---
BL21(DE3) 1.3 x 107 1.5 x 106 8.8 x 106 1.2 x 107 1.5 x 107
XL1Blue 4.8 x 107 1.2 x 107 8.2 x 107 1.1 x 108 4.5 x 107
상기 표 2는 하기한 바를 의미한다:
(1) 상기 신속한 형질전환 방법은 다양한 E. coli 균주에 폭넓게 적용가능하다: DH5α JM109, BL21(DE3) 및 XL1Blue 균주들의 형질전환 효율은 모두 8 x 106를 초과한다.
(2) 상기 신속한 형질전환 방법은 여러가지 온도의 선별 배지에 폭넓게 적용가능하다: 25℃, 37℃ 및 42℃ 선별 배지에 도말한 결과 유사한 효과가 나타났다.
실시예 4: 여러가지 항생제가 함유된 선별 배지에 대한 신속한 형질전환 방법의 폭넓은 적용성
다양한 종류의 항생제를 따뜻한 선별 배지에 첨가하여, 7.4 kb의 플라스미드(항생제 마커 Apr, Tcr 및 Cmr가 있는 pBP325 유도체들)을 이용하여 테스트하였다. 그 결과는 다음과 같다.
표 3: 여러가지 항생제의 형질전환 효율에 대한 효과
pBR325-KR(7.4kb)
10-5 ㎍
암피실린(30㎍/ml) 2.6 x 107
암피실린(50㎍/ml) 2.2 x 107
테트라사이클린(7.5㎍/ml) 1.3 x 107
클로람페니콜(20㎍/ml) 1.4 x 107
클로람페니콜(25㎍/ml) 1.2 x 107
형질전환 효율 결과는 거의 유사한 것으로 확인되었으며, 이는 본 발명의 여러가지 항생제가 함유된 선별 배지에 대한 폭넓은 적용성이 있음을 의미한다.
실시예 5: 다양한 크기의 플라스미드에 대한 신속한 형질전환 방법의 폭넓은 적용성
ECOS 컴피턴트 세포를 다양한 크기의 플라스미드로 테스트하였다. 그 결과는 다음과 같다.
표 4: 여러가지 크기의 플라스미드 DNA의 형질전환 효율
pUC19 (2.7kb) pBR325-KR(7.4kb) pMS12 (10kb)
Sigma
Amp (30㎍/ml)		 3.2 x 108 2.6 x 107 2.2 x 106
Sigma
Amp (50㎍/ml)		 3.4 x 108 2.2 x 107 2.1 x 106
상기 표 4에서, 여러가지 크기의 플라스미드를 이용한 ECOS 컴피턴트 세포의 형질전환 효율은 106를 초과하였다. 이는, 본 방법인 다양한 크기의 플라스미드와 다양한 농도의 항생제에 폭넓게 적용가능함을 의미한다.
본 발명에 따른 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법은 열 충격 처리 과정을 간단화하는 것을 특징으로 하며, 세포가 불균등하게 열처리되는 현상을 방지하며, E. coli(Escherichia coli) 형질전환 세포의 오래 걸리고 시간 소모적인 회복 단계를 생략할 수 있으며 본래의 형질전환 효율을 감소시키지 않는다.

Claims (16)

  1. (a) 플라스미드 DNA를 이온 용액에 현탁된 컴피턴트 세포(competent cell)와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 혼합액을 20℃~50℃의 따뜻한 선별 배지에 도말하는 단계; 및
    (c) 상기 혼합액을 배지상에서 배양하는 단계;로 이루어지고,
    상기 이온 용액은 Mg2+및 Rb+을 포함하며, 107 콜로니/㎍ 플라스미드 DNA를 초과하는 높은 형질전환 효율을 가지는 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Mg2+의 농도는 5mM 내지 500mM인 것을 특징으로 하는 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법.
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  4. 제 1항에 있어서, 상기 Rb+의 농도는 10mM 내지 1000mM인 것을 특징으로 하는 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법.
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  9. 제 1항에 있어서, 상기 따뜻한 선별 배지의 온도는 30℃~42℃인 것을 특징으로 하는 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법.
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  15. 제 1항에 있어서, 상기 선별 배지에 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 메토트렉세이트, 히그로마이신, 네오마이신 및 제오신으로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제가 첨가되는 것을 특징으로 하는 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 컴피턴트 세포는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 컴피턴트 세포의 신속한 형질전환 방법.
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