CN118147188A - 一种大肠杆菌t7表达系统的半安慰诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，实现大肠杆菌以葡萄糖为主要碳源，并利用乳糖及其代谢产物为有效诱导物的基因线路。该方法以野生型E.coli BL21(DE3)为宿主，借助组成型启动子pdc过表达非特异性糖转运通道基因secY(ΔP),secE,secG,sCVE和乳糖异构酶基因lacZ，构建不受葡萄糖CCR效应影响的乳糖转运及分解途径；随后，利用葡萄糖CCR效应遏制半乳糖激酶基因galk表达，阻断半乳糖磷酸化的下游代谢途径，形成诱导物半乳糖的稳定积累；最后，通过检测T7启动子控制下绿色荧光蛋白GFP的荧光强度，实现对该系统中乳糖及其代谢产物诱导效果的验证。

Description

一种大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法

技术领域

本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种构建乳糖半安慰型诱导的大肠杆菌的方法。

背景技术

乳糖，化学定义为1,4-O-b-D-半乳糖基D-葡萄糖，是由一分子D-半乳糖和一分子D-葡萄糖缩合形成的二糖，广泛存在于哺乳动物的乳汁中。乳糖较低的经济价值和高环境污染能力，使得提高乳糖及其下游产品的经济价值，将乳糖转化为具有高附加值的工业副产品至关重要。乳糖的微生物发酵是一种绝佳的乳糖利用方式，具体可以根据乳糖在发酵过程中发挥的作用不同，大致分为两类：一种是将乳糖作为生产目的产物的底物碳源；另一种则是将乳糖作为诱导微生物表达某种特定基因或蛋白的诱导剂。乳糖因其价格低廉，诱导条件没有严格限制，可以作为碳源被代谢，且在正常代谢下对细胞无毒性，而成为了一种优秀的IPTG替代物。

糖类分子进入大肠杆菌细胞，主要依赖糖分子转运系统完成。根据转运方式的不同，可将糖类分PTS依赖型和非PTS依赖型。PTS依赖型的糖会在被转运进胞内的同时实现磷酸化，而非PTS依赖型的糖，则是在被转运进胞内后，才会发生磷酸化。当PTS依赖型糖与非PTS依赖型糖同时存在时，细胞会优先利用PTS依赖型糖，并产生CCR效应，抑制非PTS依赖型糖的转运与代谢。其中葡萄糖就是一种典型的PTS依赖型单糖，而乳糖则是非PTS依赖型糖。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，而提供一种构建乳糖半安慰型诱导的大肠杆菌的方法。通过重组载体为大肠杆菌构建不受葡萄糖CCR效应影响的乳糖转运、分解途径，利用葡萄糖CCR效应形成诱导物稳定积累。最终依靠测量荧光强度，间接定量表征诱导效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为原始宿主细胞，通过具有组成型启动子的重组载体pETDuet、pACYCDuet过表达细胞外膜致孔蛋白sCVE、非特异性糖类运输通道secY(Δp)、secE、secG以及乳糖异构酶lacZ共5个基因，构建不受葡萄糖CCR效应影响的乳糖转运、分解途径。同时利用葡萄CCR效应遏制半乳糖激酶galk的表达，阻断半乳糖磷酸化的下游代谢路径，形成半乳糖的稳定积累。其次，通过被具有乳糖操纵子的T7启动子控制的绿色荧光蛋白GFP对该系统中乳糖及其代谢产物诱导效果的进行定量表征。最后，使用10g/L的葡萄糖和0.5g/L的乳糖，在37℃下进行发酵培养，验证菌株效果。

上述一种构建乳糖半安慰型诱导的大肠杆菌的方法，具体包括以下步骤：

(1)使用引物gfp-F,gfp-R对目的基因gfp进行pcr，使用NcoⅠ,BamHⅠ分别对载体与目的基因进行酶切，使用T4 DNA连接酶连接目的基因与载体。经转染、验证、抽提后完成重组载体pRSFDuet-gfp的构建。

(2)使用引物pdc-F,pdc-R,lacZ-F-外,lacZ-R-外,lacZ-F,lacZ-R对目的基因pdc,lacZ进行pcr，分别使用ApaⅠ,HindⅢ,MfeⅠ对载体与目的基因进行酶切，使用T4 DNA连接酶连接目的基因与载体。经转染、验证、抽提后完成重组载体pACYCDuet-pdc-lacZ的构建。

(3)使用引物pdc-F,pdc-R-L,sCVE-F-L,sCVE-R对目的基因pdc,sCVE进行pcr，并通过overlap pcr进行连接，获得pdc-sCVE。使用ApaⅠ,NcoⅠ分别对载体与目的片段进行酶切，使用T4 DNA连接酶连接目的基因与载体。经转染、验证、抽提后获得重组载体pETDuet-pdc-sCVE。分别使用引物secG-F,secG-R,secE-F,secE-R,secY-F,secY-R对目的基因secG,secE,secY(Δp)进行pcr，分别使用NcoⅠ,BamHⅠ,HindⅢ,KpnⅠ对载体与目的基因进行酶切，使用T4 DNA连接酶连接目的基因与载体。经转染、验证、抽提后完成重组载体pETDuet-pdc-sCVE-secG-secE-secY(Δp)的构建。

(4)通过热刺激法，将重组载体转染至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞，得到大肠杆菌E.coli(gfp,lacZ,sCVE,secG,secE,secY[Δp])。

(5)使用含有10g/L葡萄糖和0.5g/L乳糖的LB培养基，在37℃下进行发酵培养。发酵24h后，取样对荧光强度进行检测。

所述目的基因secY(Δp)基因序列如SEQ ID NO.1所示,secE基因序列如SEQ IDNO.2所示,secG基因序列如SEQ ID NO.3所示,sCVE基因序列如SEQ ID NO.4所示,lacZ基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述绿色荧光蛋白GFP所对应的gfp基因的序列如SEQ ID NO.6所示；所述组成型启动子pdc基因序列如SEQ ID NO.7所示。

图1为大肠杆菌乳糖半安慰型诱导的路径、机理示意图，图2为重组载体图谱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明依靠组成型启动子pdc与非特异性糖类运输通道secY(Δp)，克服了葡萄糖的大肠杆菌造成的碳分解代谢抑制效应，实现了葡萄糖和乳糖混合碳源的共同利用。使用乳糖做诱导剂，与传统IPTG诱导剂相比，具有成本低廉、操作简便、无生物毒性、诱导时间可控，诱导剂无残留等显著特性，为大肠杆菌更好发挥细胞工厂作用提供了更多可能。

附图说明

图1为大肠杆菌乳糖半安慰型诱导的路径、机理示意图。

图2为重组载体图谱。

图3为表征乳糖及半乳糖诱导具有乳糖操纵子的基因表达的功能。

图4为表征组成型启动子pdc在高葡萄糖浓度下表达乳糖代谢相关基因能力。

图5为乳糖半安慰诱导型大肠杆菌E.coli(gfp,lacZ,sCVE,secG,secE,secY[Δp])发酵结果。

具体实施方式

以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施实例仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。

实施例1

以人工优化合成的gfp基因为模板，以gfp-F,gfp-R为引物，进行pcr反应。单个反应体系总体积为50μL,其中包含：2×primer star mix酶25μL，无菌超纯水20μL，模板1μL,引物各2μL。在pcr仪中循环30轮后，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离纯化，使用胶回收试剂盒，回收纯净的目的基因片段。使用限制性内切酶NcoⅠ,BamHⅠ分别对载体与目的基因进行酶切，在37℃下反应2h。单个反应体系总体积50μL，其中包含：待酶切模板30μL，无菌超纯水11μL,10×cutsmart缓冲液5μL，内切酶各2μL。随后，再次通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离纯化，使用胶回收试剂盒，回收纯净的具有粘性末端的目的基因和载体片段。使用T4 DNA连接酶连接目的基因与载体片段，在25℃下反应1h。单个反应体系总体积10μL，其中包含：待连接目的基因片段6μL，待连接载体片段2.5μL，10×缓冲液1μL，T4 DNA连接酶0.5μL。将连接后的10μL重组载体，混入感受态细胞Trans 10中，于冰上静置30min化冻，42℃水浴热激45s，冰浴3min后混入500μL LB液体培养基。置于摇床37℃下，复苏1h。随后，将菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，过夜培养。经验证后，抽提重组载体，转染至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,得到E.coli(gfp)菌株。

将菌株E.coli(gfp)过夜活化后，以1％的接种量接于100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，而后分别加入终浓度为0.5g/L的乳糖和半乳糖，置于摇床中37℃、220rpm发酵24h。而后将发酵液4℃、6000rpm冷冻离心10min，弃去上清液。使用30mL浓度0.02mM的Tris-Hcl溶液混悬沉淀，4℃、6000rpm冷冻离心10min，重复两次，洗去残余LB培养基。最后，用20mL浓度0.02mM的Tris-Hcl溶液混悬沉淀，并通过紫外-可见分光光度计测量600nm处吸光度记为细胞浓度，并将样品浓度稀释至相同水平。取样品3mL置于四面透光的比色皿中，使用荧光分光光度计，设定激发波长395nm，扫描范围400-600nm，以发射波长509nm处吸光度记为荧光强度。比较荧光强度可知，乳糖与半乳糖均具有与IPTG类似的诱导功能(图3)。

实施例2

以大肠杆菌基因组为模板，以lacZ-F-外,lacZ-R-外,lacZ-F,lacZ-R对目的基因lacZ进行巢式pcr反应。单个反应体系总体积为50μL,其中包含：2×primer star mix酶25μL，无菌超纯水20μL，模板1μL,引物lacZ-F-外,lacZ-R-外各2μL。在pcr仪中循环20轮后取出，以反应物为模板重新配置反应体系。单个反应体系总体积为50μL,其中包含：2×primerstar mix酶25μL，无菌超纯水20μL，模板1μL,引物lacZ-F,lacZ-R各2μL。在pcr仪中循环25轮。同时以人工优化合成的pdc基因为模板，以pdc-F、pdc-R为引物，进行pcr反应，反应体系配置同前。通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离纯化，使用胶回收试剂盒，回收纯净的目的基因片段。使用限制性内切酶ApaⅠ,HindⅢ,MfeⅠ进行酶切。酶切、连接、转染筛选步骤同前。抽提重组载体，转染至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,得到E.coli(lacZ)菌株。准备含10mg/mL葡萄糖、30μg/mL氯霉素抗性的LB固体培养基平板，取20mg/mLx-gal试剂，均匀涂布于平板上。将过夜活化后的菌株E.coli(lacZ)于平板上划线培养，37℃静置过夜。观察平板可发现，相较于空白组,菌株E.coli(lacZ)成明显蓝色，可见组成型启动子pdc能够在高葡萄糖浓度下实现乳糖代谢相关基因的正常表达(图4)。

实施例3

以人工优化合成的pdc基因和SARS细胞外膜破孔蛋白sCVE基因为模板，以pdc-F,pdc-R-L,sCVE-F-L,sCVE-R为引物，进行pcr反应，获得具有同源臂的目的基因片段。反应体系配置、分离纯化方法同前。通过overlap pcr反应连接具有同源臂的两个目的基因片段，单个反应体系总体积为50μL,其中包含：2×primer star mix酶25μL，无菌超纯水21μL，模板各2μL。在在pcr仪中循环15轮后取出，向反应体系内加入引物pdc-F,sCVE-R各1μL，放回pcr仪中再次循环25轮。分离纯化、酶切连接、转染筛选方法同前。以大肠杆菌基因组为模板，获得目的基因secG,secE片段，以及人工合成的secY(Δp)基因(secY(Δp)基因是大肠杆菌secY基因的突变序列)。最终获得重组载体pETDuet-pdc-sCVE-secG-secE-secY(Δp)，进而获得菌株E.coli(gfp,lacZ,sCVE,secG,secE,secY[Δp])。

将菌株过夜活化后，以1％的接种量接于100mL含100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素、30μg/mL氯霉素、10mg/mL葡萄糖、0.5mg/mL乳糖的LB液体培养基中，置于摇床中37℃、220rpm发酵。每隔12h取样，使用酶标仪，以600nm处吸光度测定细胞生长情况，使用高能液相色谱HPLC，以超纯水为糖分析柱流动相，测量碳源消耗情况。并在发酵24h后，取样测量荧光强度，测量方法同前。从结果可知(图5)，该体系实现了葡萄糖和乳糖的共同利用，且正常发挥了诱导功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：通过组成型启动子pdc过表达secY(Δp),secE,secG,sCVE,lacZ，为大肠杆菌构建不受葡萄糖CCR效应影响的乳糖转运、分解途径，实现葡萄糖乳糖共利用；同时，利用葡萄糖CCR效应遏制半乳糖激酶基因galk表达，阻断半乳糖磷酸化的下游代谢途径，形成诱导物半乳糖的稳定积累，进而实现半安慰型诱导；最后，通过检测T7启动子控制下绿色荧光蛋白GFP的荧光强度，实现对该系统诱导效果的验证。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，其特征在于：所述目的基因secY(Δp)基因序列如SEQ ID NO.1所示,secE基因序列如SEQ ID NO.2所示,secG基因序列如SEQ ID NO.3所示,sCVE基因序列如SEQ ID NO.4所示,lacZ基因序列如SEQ IDNO.5所示；所述绿色荧光蛋白GFP所对应的gfp基因的序列如SEQ ID NO.6所示；所述组成型启动子pdc基因序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)构建重组载体pRSFDuet-gfp；

(2)构建重组载体pACYCDuet-pdc-lacZ；

(3)构建重组载体pETDuet-pdc-sCVE-secG-secE-secY(Δp)；

(4)使用热刺激法转化法将重组载体转染之大肠杆菌E.coli BL21内，以葡萄糖和乳糖作为混合碳源，在LB培养基内进行发酵，记录碳源消耗、细胞生长情况及荧光强度。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，其特征在于：在步骤(1)(2)(3)中，还包括依靠聚合酶链式反应，使用引物对对目的基因进行扩增，借助限制性内切酶酶切位点将目的基因连接至重组载体特定点位，以完成重组载体构建，所述限制性内切酶包括ApaⅠ,NcoⅠ,BamHⅠ,HindⅢ,MfeⅠ,KpnⅠ。

5.根据权利要求3所述的大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，其特征在于：在步骤(4)中，以百分之一的接种量接菌株于含有10g/L的葡萄糖和0.5g/L的乳糖的LB培养基，在37℃下于中进行发酵培养。

6.根据权利要求3所述的大肠杆菌T7表达系统的半安慰诱导方法，其特征在于：在步骤(4)中，取发酵24h的发酵液100mL，冷冻离心后用Tris-Hcl洗涤、重悬沉淀；取细胞重悬液3mL，置于荧光分光光度计，设定激发波长395nm，记录发射波长509nm处峰值，记为荧光强度。

7.利用权利要求1-6任一所述方法制备得到的大肠杆菌T7表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli(gfp,lacZ,sCVE,secG,secE,secY[Δp])。