CN105670970A - 一种高转化效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备高转化效率、稳定的大肠杆菌热激感受态细胞方法，包括下述步骤：1）从-80？℃取出菌种解冻前涂板；2）37？℃过夜小摇菌液；3）室温过夜扩繁菌液；4）4000？rpm低温离心，收集菌体；5）梯度递减漂洗菌细胞；6）用含7%DMSO的SB溶液作为菌保存液，-80？℃保存。利用本发明技术，大肠杆菌热激感受态细胞转化效率及稳定性大幅度提高。

Description

一种高转化效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域对大肠杆菌热激感受态细胞的培养及制备方法，特别是涉及对大肠杆菌菌株DH5α的培养及制备方法，尤其是涉及一项显著提高大肠杆菌菌株热激转化效率和稳定性的关键技术。
背景技术
大肠杆菌热激转化技术是基因工程和分子生物学研究的基础，在DNA片段测序、功能载体构建和质粒扩繁等方面广泛使用。转化效率对于注重克隆数量试验来说（如文库构建等），一直是个技术瓶颈。截至目前，除市售的大肠杆菌热激感受态细胞外，实验室自制的感受态细胞转化效率参差不齐。也有科研机构采用电击转化代替热激转化，以提高转化效率，但此方法需要特殊仪器设备即电转仪，试验条件要求苛刻，同时电击感受态细胞比热激感受态细胞价格上要贵数倍。在国家大力提倡节约的大环境下，如何减少不必要的科研专用材料费用支出，显得尤为重要。相比之下，大肠杆菌热激感受态细胞因其无需特殊设备、制备方法简单而备受科研人员青睐，其转化原理是利用大肠杆菌处于0℃的氯化钙低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的外源DNA形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，附着在细胞表面，经42℃短时间热激处理，细菌细胞能吸收外源DNA复合物，通过在相应培养基上复苏并分裂增殖，从而实现外源DNA的大量复制。然而目前尚无一个稳定、高效的大肠杆菌热激感受态细胞制备技术。经过本课题组多年的探索，在高转化效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方面取得一定进展，并已成功应用在DNA测序载体、基因功能分析载体等转化方面，取得了理想的转化效率。无论是哪种大肠杆菌菌株，常规方法是先将大肠杆菌菌种在固体平板上复苏，过夜培养后挑单菌落在液体培养基中进行少量及后续的大量培养，随后采用氯化钙溶液在4℃条件下进行菌体漂洗，并保存于含10%甘油的氯化钙保存液中，置-80℃长期保存。利用这种制备方案得到的大肠杆菌热激感受态细胞转化效率十分不稳定，且不同批次、不同制备方法得到的热激感受态细胞转化效率也不同，同时操作人员的熟练程度也影响制备的感受态细胞最终转化效率。转化效率是评价感受态细胞优劣的核心标准。通过改进大肠杆菌细胞培养、漂洗环节及菌保存液成分，进一步提高制备的大肠杆菌热激感受态细胞转化效率及稳定性，对于加快基因工程和分子生物学研究进程具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一项从大肠杆菌菌株制备高转化效率和稳定的热激感受态细胞的关键技术，作为分子生物学试验基础，为基因工程及功能基因组学研究提供技术支撑，减少不必要的科研专用材料费用支出，提高科研工作效率。
一项广泛适宜于高效大肠杆菌热激感受态细胞制备的关键技术，是将-80℃保存的菌种（市售或实验室保存均可）用接种环在LB固体平板上（10g/L胰蛋白胨，Oxoid货号：LP0042；5g/L酵母提取物，Oxoid货号：LP0021；10g/L氯化钠；12g/L琼脂粉，Sigma货号：A5306）划线，37℃过夜培养，挑取直径约1.5-2mm的单菌落于5mLLB液体培养基（10g/L胰蛋白胨，Oxoid货号：LP0042；5g/L酵母提取物，Oxoid货号：LP0021；10g/L氯化钠）中，37℃，220rpm过夜培养，于次日下午按1:100转接于100mL与上述同样的新配制LB液体培养基中，200rpm室温（20-25℃）培养10-12h，直至OD600达到0.4-0.6间。取出菌液置于冰水混合物上10min，忌晃动。随后转入50mL锥形离心管（BDFALCON货号：352098，实验前预冷），并于冰水混合物上静置5min，置于离心机（ThermoSorvallST16R），在4℃、4000rpm离心10min，取出、倒净培养液。加入等量（50mL）预冷的SB溶液（10mMPIPES，sigma货号：P6757；55mMMnCl2；15mMCaCl2；用KOH或HCl调pH至6.7，0.22μm孔径的无菌滤膜过滤灭菌后4℃保存备用），轻柔重悬菌体，冰水混合物上静置10min，再4℃、4000rpm离心10min，取出、倒净SB溶液，并倒扣于无菌吸水纸上2min，加入半量（25mL）预冷的SB溶液，轻柔重悬菌体，冰水混合物上静置10min，同上条件离心10min，取出、倒净SB溶液，并倒扣于无菌吸水纸上2min，加入10mL预冷的SB溶液（此步需添加二甲基亚砜（DMSO）至终浓度为7%），用去头的蓝色移液管轻轻吸打菌体至完全松散，100μL分装，垂直置于液氮中，-80℃保存。
上述发明中，将大肠杆菌在室温条件下进行过夜扩繁，设置37℃扩繁1-2h为对照，经过梯度递减漂洗后收集分装制备的大肠杆菌菌株DH5α（本课题组保存）热激感受态细胞。分别用本发明和对照制备的感受态细胞进行pUC19质粒（Takara货号：3219，大小为2686bp）、pMD18-T与1.023kb外源片段的连接产物（片段为小麦ARGcDNA，GenBank登录号：JN415197；pMD18-T载体Takara货号：6011，大小为2692bp）及pAH028与上述同样片段的连接产物（载体为本课题组改造，空载体大小为10141bp）转化，经37℃、200rpm复苏1h后，涂在含有抗生素的LB固体平板中，倒置37℃过夜培养，拍照统计转化效率。
经过反复试验和对比发现，室温过夜扩繁，相比正常用37℃培养1-2h后制备的大肠杆菌热激感受态细胞，无论在转化对照质粒（pUC19）、T载体连接产物（pMD18-T与1.023kb小麦ARG基因cDNA全长片段的连接产物）及基因功能研究载体（pAH028与上述同样片段的连接产物）上，转化效率显著提高。其中，转化对照质粒时，转化效率为3x108cfu（colonyformingunits），比对照提高5倍（图1），转化T载体连接产物时，转化效率比对照提高8倍（图2），转化基因功能研究载体时，转化效率比对照提高40倍（图3）。同时，取出保存1年以上利用该发明制备的大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞，进行基因功能研究载体（pAH028与1.023kb的小麦ARGcDNA片段的连接产物，pAH028在载体图见图4）转化试验，发现转化效率比新制备的热激感受态略差，对于大多数实验来说，此差别可以忽略。上述实验结果表明，室温、低速扩繁大肠杆菌菌株能很好地维持大肠杆菌活力，梯度递减方式漂洗菌细胞，极大地维持细胞膜的通透性，促进大肠杆菌对外源DNA的融合，进而提高转化效率。
下面结合附图和附表对本发明做进一步说明。
附图和附表说明
图1.本发明与对照转pUC19结果图
图2.本发明与对照转pMD18-T与1.023kb外源片段的连接产物结果图
图3.本发明与对照转pAH028与1.023kb外源片段的连接产物结果图
图4.pAH028载体图
表1.连接反应体系
具体实施方式
下述实施例中所用水皆为超纯水，所用方法非特别说明皆为常规方法。
实施例1、大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞制备
一、培养基、抗生素及相关溶液配制和灭菌
LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨（Oxoid货号：LP0042）；5g/L酵母提取物（Oxoid货号：LP0021）；10g/L氯化钠（国产分析纯）；调pH=7.0，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20min。
LB固体培养基：在LB液体培养基中仅添加15g/L琼脂粉（Sigma货号：A5306）；调pH=7.0，以上成分采用121℃高压湿热灭菌20min。
SB溶液：10mMPIPES（sigma货号：P6757）；55mMMnCl2（国产分析纯）；15mMCaCl2（国产分析纯）；用KOH或HCl调pH至6.7，0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，4℃保存备用。
50mg/mL卡那霉素配制：准确称量0.5g卡那霉素粉剂溶于10mL超纯水中，待彻底溶解后，0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，-20℃保存备用，工作液浓度为50μg/mL。
100mg/mL氨苄霉素配制：准确称量1g卡那霉素粉剂溶于10mL超纯水中，待彻底溶解后，0.22μm孔径的无菌滤膜过滤，-20℃保存备用，工作液浓度为100μg/mL。
20mg/mLX-Gal配制：准确称量0.2g卡那霉素粉剂溶于10mL二甲基甲酰胺中，待彻底溶解后，-20℃避光保存备用，工作液浓度为40μg/mL。
二、大肠杆菌菌株DH5α复苏
1、从-80℃取出大肠杆菌菌株DH5α；
2、用无菌接种环挑取少量大肠杆菌菌种在无抗生素的LB固体培养基平板上划“Z”字型图案；
3、将平板倒扣，37℃过夜避光培养。
注意事项：为避免大肠杆菌菌种反复冻融，影响活力，可从-80℃取出后置于液氮中。
三、大肠杆菌菌株DH5α扩繁
1、从过夜培养的平板中挑取单菌落于5mLLB液体培养基中（无抗生素）；
2、37℃，220rpm，过夜振荡培养；
3、按1:100取1mL过夜培养菌液至新的100mLLB液体培养基中（无抗生素）；
4、室温，200rpm，过夜培养，待OD600=0.4-0.6时（约需培养10-12h），取出准备热激感受态细胞制备。以37℃，230rpm，培养1-2h为对照。
四、大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞制备（所有操作均在低温条件下进行）
1、取出达到需要OD值的菌液，立即静置于冰水混合物上10min；
2、将菌液分装于无菌的50mL锥形离心管（BDFALCON货号：352098），静置冰水混合物中5min；
3、转入冷冻离心机（ThermoSorvallST16R），4000rpm，4℃，离心10min；
4、轻轻取出离心管，弃尽上清后，置于冰水混合物上；
5、等量加入预冷的SB溶液（50mL），用去枪尖的蓝枪头轻轻重悬菌体，至菌体完全散开，冰水混合物上静置10min；
6、重复步骤3-4一次；
7、半量加入预冷的SB溶液（25mL），用去枪尖的蓝枪头轻轻重悬菌体，至菌体完全散开，冰水混合物上静置10min；
8、重复步骤3-4一次；
9、加入10mL预冷的SB溶液，并添加DMSO至终浓度为7%，轻轻重悬菌体，按100μL每管分装菌液于无菌1.5mLEP管中，-80℃保存备用。
实施例2、大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞热激转化
一、转化质粒pUC19（0.1ng/μL，Takara货号：3219）并统计转化效率
1、从-80℃分别取出本发明方法及对照制备的大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞，置于冰上3-5min至融化；
2、取1μLpUC19质粒，加到步骤1的感受态细胞，轻轻混匀，冰上静置30min；
3、将步骤2的菌混合物置于42℃的加热模块中热激90s，迅速取出置于冰上3min；
4、加500μLLB液体培养基（无抗生素）于步骤3的菌混合物中，200rpm，37℃培养1h；
5、取50μL稀释20倍的菌液均匀涂布于LB固体培养基上（含100μg/mL氨苄青霉素），待菌液干后倒扣于37℃烘箱中，过夜暗培养。次日拍照记录转化结果，并利用QuantityOne软件（Bio-Rad公司）进行菌落数计数。根据公式：转化效率（转化子数/每μg质粒DNA）=菌落数x稀释倍数x转化反应原液总体积/涂板菌液体积/质粒DNA加入量（μg），估算转化效率。
二、转化T载体连接产物并统计转化效率
1、按Takara操作步骤进行pMD18-T（Takara货号：6011，50ng/μL）与自有片段（片段为小麦ARGcDNA，大小为1.023kb，浓度为150ng/μL，GenBank登录号：JN415197）按1:3混合连接，16℃过夜温浴；
2、从-80℃分别取出本发明方法及对照制备的大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞，置于冰上3-5min至融化；
3、取步骤1中连接产物于步骤2的感受态细胞，轻轻混匀，冰上静置30min；
4、将步骤3的菌混合物置于42℃的加热模块中热激90s，迅速取出置于冰上3min；
5、加500μLLB液体培养基（无抗生素）于步骤4的菌混合物中，200rpm，37℃培养1h；
6、取50μL菌液均匀涂布于LB固体培养基上（含100μg/mL氨苄青霉素，40μg/mLX-Gal），待菌液干后倒扣于37℃烘箱中，过夜暗培养。次日拍照记录转化结果，并利用QuantityOne软件（Bio-Rad公司）进行菌落数计数。根据公式：转化效率（转化子数/每μg质粒DNA）=菌落数x转化反应原液总体积/涂板菌液体积/质粒DNA加入量（μg），估算转化效率。
三、转化基因功能研究载体并统计转化效率
1、表1配方配制连接反应，16℃过夜连接。pAH028为本实验室构建保存，主要用于农杆菌介导植物遗传转化研究，植物筛选标记为潮霉素（图4），外源片段同上；
2、从-80℃分别取出本发明方法及对照制备的大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞，置于冰上3-5min至融化；
3、取步骤1中连接产物于步骤2的感受态细胞，轻轻混匀，冰上静置30min；
4、将步骤3的菌混合物置于42℃的加热模块中热激90s，迅速取出置于冰上3min；
5、加500μLLB液体培养基（无抗生素）于步骤4的菌混合物中，200rpm，37℃培养1h；
6、取50μL菌液均匀涂布于LB固体培养基上（含50μg/mL卡那霉素），待菌液干后倒扣于37℃烘箱中，过夜暗培养。次日拍照记录转化结果，并利用QuantityOne软件（Bio-Rad公司）进行菌落数计数。根据公式：转化效率（转化子数/每μg质粒DNA）=菌落数x转化反应原液总体积/涂板菌液体积/质粒DNA加入量（μg），估算转化效率。
表1连接反应体系
四、保存的热激感受态细胞转化
1、从-80℃取出本发明方法制备的已储存1年以上的大肠杆菌菌株DH5α热激感受态细胞，置于冰上3-5min至融化；
2、余下步骤同三。

Claims (6)

1.一种高效、稳定的制备大肠杆菌热激感受态细胞方法，是通过室温进行大肠杆菌菌液扩繁的培养模式，并通过梯度递减方式进行菌液“收集-漂洗”操作，最后用添加7%DMSO的SB溶液对制备的热激感受态细胞进行超低温（-80℃）保存。
2.根据权利要求1所述的培养技术，其特征在于：室温过夜扩繁大肠杆菌菌种及梯度递减漂洗大肠杆菌细胞。
3.根据权利要求1所述的培养技术，LB液体培养基成分：10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母提取物；10g/L氯化钠；调pH=7.0；LB固体培养基成分：在LB液体培养基基础上添加15g/L琼脂粉；SB溶液组成为：10mMPIPES，sigma货号：P6757；55mMMnCl2；15mMCaCl2；pH=6.7，0.22μm孔径的无菌滤膜过滤灭菌后4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的培养技术，用于制备大肠杆菌热激感受态菌株为DH5α。
5.根据权利要求1所述的培养技术，用于制备大肠杆菌热激感受态菌种为直接从-80℃取出并在解冻前迅速划平板，避免反复冻融。
6.根据权利要求1所述的培养技术，新制备的大肠杆菌热激感受态细胞进行转化时，用量为一次一管。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574367A (zh) * 2022-04-25 2022-06-03 济宁学院 一种用于大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634469A (zh) * 2012-04-10 2012-08-15 生工生物工程(上海)有限公司 一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103045525A (zh) * 2013-01-22 2013-04-17 康盈创新生物技术(北京)有限公司 一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103387946A (zh) * 2012-05-11 2013-11-13 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种感受态宿主细胞的制备方法以及一种快速高效将外源物质转入宿主细胞的方法及其应用
CN103897994A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634469A (zh) * 2012-04-10 2012-08-15 生工生物工程(上海)有限公司 一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103387946A (zh) * 2012-05-11 2013-11-13 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种感受态宿主细胞的制备方法以及一种快速高效将外源物质转入宿主细胞的方法及其应用
CN103897994A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
CN103045525A (zh) * 2013-01-22 2013-04-17 康盈创新生物技术(北京)有限公司 一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHIMING TU等: "An improved system for competent cell preparation and high efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strains", 《ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
代军: "大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化", 《江苏农业科学》 *
杨坤等: "大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立", 《北方园艺》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114574367A (zh) * 2022-04-25 2022-06-03 济宁学院 一种用于大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用

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