JP2003047489A - アクチノバチルス・プレウロニウモニアからのタンパク質 - Google Patents

アクチノバチルス・プレウロニウモニアからのタンパク質

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ブタ肺病原体の重要な１つであるアクチノバ
チルス・プレウロニウモニア（APP ）からブタを保護す
るためのタンパク質に関する。 【解決手段】 APP から単離された５種の新規低分子量
タンパク質（“Omp20”, “OmpW”, “Omp27”, “OmpA
1”、及び“OmpA2” ）を共有する新規抗原性タンパク
質、それをコードするDNA 分子、前記タンパク質を含ん
で成る、APP に対するワクチンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】１．発明の分野 本発明は、動物健康の分野に関し、そしてアクチノバチ
ルス・プレウロニウモニア(Actinobacillus pleuropneu
moniae）に対してブタを保護するワクチンに向けられ
る。より詳しくは、本発明は、Ａ．プレウロニウモニア
の複数の血清型により共有される新規の抗原性タンパク
質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、前記タン
パク質を含んで成る、APP に対するワクチン、及び診断
用試薬に向けられる。
【０００２】
【従来の技術】２．発明の背景 Ａ．プレウロニウモニア（この後、“APP ”と称する）
は、最とも重要なブタ肺病原体の１つとして認識されて
いるグラム陰性ココバチルス(cocobacillus)である（Sh
ope, R.E., 1964, J. Exp. Med. 119 : 357-368 ; Sebu
nya, T.N.K. 及びSaunders, J.R., 1983, J. Am. Vet.
Med. Assoc. 182 : 1331-1337)。地理的分布において異
なる１２種の異なった血清型が認識されている（Sebuny
a, T.N.K. and Saunders, J.R., 1983、上記；Nielsen,
R., 1985, Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 18-22 ; N
ielsen, R., 1986, Acta. Vet. Scand. 27 : 453-455)
。
【０００３】APP に対するワクチン接種に対する免疫応
答は、主に血清型−特異的であり、このことは、ワクチ
ン−誘発された免疫性が血清型−特異的莢膜(capsular)
抗原に向けられていることを示す（Moclnnes, J.I. and
Rosendal, S., 1988, Can.Vet. J. 29 : 572-574 ; Fe
dorka-Cray, P.J.,など., 1994, Comp. Cont. Educ.Pra
ct. Vet. 16 : 117-125 ; Nielsen, R., 1979, Nord. V
et. Med. 31 : 407-413 ; Rosendal, S., など., 1986,
Vet. Microbiol. 12 : 229-240)。
【０００４】対照的に、いづれか１種の血清型に対する
天然の免疫性は、他の血清型により引き起こされる疾病
からの有意な保護を付与すると思われ、このことは、天
然の暴露が共有される抗原に対して交差反応免疫性を誘
発することを示している（Sebunya, T.N.K. and Saunde
rs, J.R., 1983、上記；Maclnnes, J.I. and Rosendal,
S., 1988, above ; Fedorka-Cray, P.J.,など., 1994
、上記；Nielsen, R.,1979 、上記；及びRosendal,
S., など., 1986 、上記）。
【０００５】交差反応性に寄与する次のようなビルレン
ス因子が、可能なワクチン候補体として提案されて来
た：外毒素(Apx)(Nakai, T.,など., 1983, Am. J. Vet.
Res.44 : 344-347 ; Frey, J. など., 1993, J. Gen.
Microbiol. 139 : 1723-1728; Fedorka-Cray, P.J., な
ど., 1993, Vet. Microbiol. 37 : 85-100) ; 莢膜抗原
（Rosendal, S., など., 1986, above) ; 外膜タンパク
質(OMP)(Denee, H. and Potter, A., 1989, Infect. Im
mune 57 : 798-804 ; Niven, D.F.,など., 1989, Mol.
Microbiol. 3 : 1083-1089 ; Gonalez, G., など., 199
0, Mol. Microbiol. 4 : 1173-1179 ; Geriach, G.F.,
など., 1992, Infect. Immun. 60 : 3253-3261) ; 及び
リポポリサッカライド(LPS)(Fenwick, B.W. and Osbor
n, B., 1986, Infect. Immun. 54 : 575-582)。
【０００６】しかしながら、そのような化合物により誘
発される交差−反応性／交差−保護のパターンは、すべ
ての１２種のAPP 血清型を満たしていない。さらに、AP
P からの単離された個々の成分、又は個々の成分の組合
せによる免疫化は、いくつかの異種血清型による攻撃か
らの保護を付与するのに、これまでは失敗している（未
公開の観察）。従って、天然の感染により誘発される交
差−保護応答は特定の血清型群に制限されることが推定
される。
【０００７】あるいは、天然の感染の後に観察される交
差−保護を担当する抗原のいくつかはまだ同定されてい
ない。APP 抗原に関するほとんどの研究は、抗体を用い
ての回復期(convalescent)血清中に検出される免疫優性
抗原の特徴化に集中して来た。そのようなアプローチ
は、一次応答対二次応答を示す抗体特異性間の可能な差
異の同定も、又は病原体との二次遭遇に対する保護を担
当するかも知れない感染での優性特異性の同定も可能に
していない。
【０００８】病原体への二次暴露が存在する場合に宿主
が疾病からうまくのがれることができように、一次感染
の間、リンパ球は教育される(educated)ことが一般的に
許容される（Mackay, C.R., 1993, Adv. Immunol. 53 :
217-240) 。この活性を担当する記憶細胞（抗原を経験
したＴ及びＢリンパ球）は、長時間持続し、そして抗原
との適切な続く遭遇に従って、再活性可能にある。未経
験の細胞に比較して、それらは一般的により早い応答時
間、特殊化された組織局在化、及びより効果的な抗原認
識及びエフェクター機能を示す（Mackay, C.R., 1993,
above ; Linton, P. and Klinman, N.R., 1992, Sem. I
mmun. 4 : 3-9 ; Meeusen, E.N.T.,など., 1991, Eur.
J. Immunol. 21 : 2269-2272) 。
【０００９】二次応答の生成の間、特定の抗原に応答す
ることができる前駆体細胞の頻度は、一次応答の間に示
される頻度よりも高い。二次応答に続く記憶細胞サブセ
ットの密集パターンはまた、未経験細胞のパターンとは
異なっている。未経験細胞は二次リンパ細胞のパターン
とは異なっている。未経験細胞は二次リンパ組織に対し
て比較的均質に移動するが、しかしそれらは非リンパ組
織に対しては良好に進行しなかった。これに対して、記
憶細胞は異種密集性(hetero geneous trafficking)を示
し、そして多くの場合、移動は一定の二次リンパ組織及
び非リンパ部位に制限されることが示されている（Mack
ay, C.R., 1993、上記；Gray, D., 1993, Ann. Rev. Im
munol. 11 : 49-77 ; Picker, L.S., など., 1993, J.
Immunol.150 : 1122-1136) 。
【００１０】げっ歯動物及び羊の両者における研究は、
腸からのリンパ球が腸とは反対方向に選択的に移動し、
そして皮膚又はリンパ節からの細胞はその皮膚又はリン
パ節とは反対方向に選択的に移動することを示した（Gr
ay, D., 1993、上記；Picker, L.S., など., 1993 、上
記）。従って、病原体との二次遭遇に基づいて、細胞−
介在性免疫性及び抗体分泌のための特定のエフェクター
細胞が感染部位及びリンパ節の方により効果的に進むこ
とができる（Meeusen, E.N.T.,など., 1991 、上記）。
結果的に、浸潤性リンパ球は、急速に増殖し、そしてそ
れらの特異性は再感染の初期段階の間、卓越しているで
あろう。
【００１１】再感染の後、初期の組織及び排出するリン
パ節からの局部Ｂ細胞の回収は、より狭い特異性範囲を
有する抗体を獲得するいくつかの研究を可能にした（Me
eusen, E.N.T. and Brandon, M., 1994, J. Immunol. M
eth. 172 : 71-76) 。そのような抗体は、いくつかの病
原体に対しての可能性ある保護抗原を同定するために都
合良く使用されて来た（Meeusen, E.N.T. and Brandon,
M., 1994 、上記；Meeusen, E.N.T. and Brandon, M.,
1994, Eur. J. Immunol. 24 : 469-474 ; Bowies, V.
M.,など., 1995, Immunol. 84 : 669-674) 。
【００１２】本明細書に開示される発明は、このアプロ
ーチの変法に基づいており、ここでは、同種及び異種AP
P 攻撃の後に誘発される局部記憶応答に関連する抗体−
分泌性細胞(ASC）プローブが回収された。異種攻撃の
後、気管支リンパ節(BLN）培養物から得られた抗体は、
すべての１２種のAPP 血清型に存在するまだ認識されて
いない４種のタンパク質を認識した。個々のタンパク質
についての部分アミノ酸配列が得られており、そしてそ
れらをコードする５種の新規のAPP タンパク質及びポリ
ヌクレオチド分子の同定を可能にするPCR プライマーを
生成するために使用された。
【００１３】３．発明の要約 本発明は、APP から単離された５種の新規の低分子量タ
ンパク質を提供し、それらは、本明細書においては、
“Omp20 ”，“OmpW”，“Omp27 ”，“OmpA1 ”、及び
“OmpA2 ”と称す。それらの“APP タンパク質”及びそ
れらをコードするポリヌクレオチド分子は、APP に対し
てブタを保護するためのワクチンにおける抗原性成分と
して、又はAPP により感染される又は感染されている
か、又は本発明のワクチンによりワクチン接種されてい
るブタに同定するための診断試薬としても有用である。
【００１４】Omp20 のアミノ酸配列は、株Pz416(ATCC 9
8926）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmp20
−コードORF によりコードされ、そしてその推定される
アミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜１９のシグナル配列
を含んで成る配列番号２として表わされる。OmpWのアミ
ノ酸配列は、株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に存在す
るプラスミドpER418のOmpW−コードORF によりコードさ
れ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残
基１〜２１のシグナル配列を含んで成る配列番号４とし
て表わされる。Omp27 のアミノ酸配列は、株Pz417(ATCC
98927）の宿主細胞に存在するプラスミドpER417のOmp2
7 −コードORF によりコードされ、そしてその推定され
るアミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜７のシグナル配列
を含んで成る配列番号６として表わされる。
【００１５】OmpA1 のアミノ酸配列は、株Pz419(ATCC 9
8929）の宿主細胞に存在するプラスミドpER419のOmpA1
−コードORF によりコードされ、そしてその推定される
アミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜１９のシグナル配列
を含んで成る配列番号８として表わされる。OmpA2 のア
ミノ酸配列は、株Pz420(ATCC 98930）の宿主細胞に存在
するプラスミドpER420のOmpA2 −コードORF によりコー
ドされ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ
酸残基１〜１９のシグナル配列を含んで成る配列番号１
０として表わされる。実質的に純粋な形でのそれらのAP
P タンパク質の個々が、本発明により供給される。
【００１６】本発明はさらに、本発明の前記APP タンパ
ク質のいづれかに対して相同である実質的に精製された
ポリペプチドを供給する。本発明はさらに、本発明のAP
P タンパク質又は相同ポリペプチドのいづれかのペプチ
ドフラグメントを供給する。本発明はさらに、キャリヤ
ー又は融合パートナーに連結された、本発明のAPP タン
パク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメント
を含んで成る融合タンパク質を供給する。本発明はさら
に、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプ
チドフラグメント又は融合タンパク質の類似体及び誘導
体を供給する。
【００１７】本発明はさらに、シグナル配列と共に又は
それを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmp20 を
コードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmp20 −コードポリペプチド分
子は、約nt３２９〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオ
チド配列を含んで成る。より好ましい態様におては、本
発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt２７２〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチ
ド配列を含んで成る。
【００１８】本発明はさらに、シグナル配列と共に又は
それを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmpWをコ
ードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリ
ヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmpW−コードポリペプチド分子
は、約nt４３９〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオ
チド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、
本発明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子
は、約nt３７６〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオ
チド配列を含んで成る。
【００１９】本発明はさらに、シグナル配列と共に又は
それを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmp27 を
コードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmp27 −コードポリペプチド分
子は、約nt２３８〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオ
チド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、
本発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分
子は、約nt１５７〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオ
チド配列を含んで成る。
【００２０】本発明はさらに、シグナル配列と共に又は
それを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmpA1 を
コードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリペプチド分
子は、約nt６７１〜約nt１７０８の配列番号１のヌクレ
オチド配列を含んで成る。より好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチ
ド分子は、約nt６１４〜約nt１７０８の配列番号１のヌ
クレオチド配列を含んで成る。
【００２１】本発明はさらに、シグナル配列と共に又は
それを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmpA2 を
コードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリペプチド分
子は、約nt２５４〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレ
オチド配列を含んで成る。より好ましい態様において
は、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチ
ド分子は、約nt１９７〜約nt１３０６の配列番号９のヌ
クレオチド配列を含んで成る。
【００２２】本発明はさらに、本発明の前記ポリヌクレ
オチド分子のいづれかに対して相同である単離されたポ
リヌクレオチド分子を供給する。本発明はさらに、本発
明のAPP タンパク質のいづれかに対して相同であるポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単
離されたポリヌクレオチド分子を供給する。本発明はさ
らに、本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかの
実質的部分であるヌクレオチド配列から成る単離された
ポリヌクレオチド分子を供給する。非制限的態様におい
て、本発明のポリヌクレオチド分子の実質的部分は、本
発明のAPP タンパク質又は相同ポリペプチドのペプチド
フラグメントをコードする。本発明はさらに、キャリヤ
ー又は融合パートナーに連結される、本発明のAPP タン
パク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメント
を含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を供給する。
【００２３】本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチ
ド分子のいづれかを増幅するためのプライマーとして、
又は診断用試薬として有用であるオリゴヌクレオチド分
子を供給する。そのようなオリゴヌクレオチド分子の特
定の非制限的態様は、配列番号１５〜４７及び４９〜９
３のいづれかから成る群から選択されたヌクレオチド配
列を有するオリゴヌクレオチド分子を包含する。
【００２４】本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチ
ド分子のいづれかをクローニングし、そして発現するた
めの組成物及び方法、本発明のポリヌクレオチド分子を
含んで成る組換えクローニングベクター及び組換え発現
ベクター、前記ベクターのいづれかにより形質転換され
た宿主細胞、及びそれらに由来する細胞系を提供する。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子により
コードされる、組換え的に発現されたAPP タンパク質、
相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、又は融合タ
ンパク質を提供する。
【００２５】本発明はさらに、ブタにおいてAPP に対し
ての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することが
できる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペ
プチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導
体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択され
た、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原；及び
獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成
る、APP に対してブタを保護するためのワクチンを提供
する。本発明のワクチンはさらに、アジュバント又は他
の免疫調節成分を含むことができる。
【００２６】非制限的態様においては、本発明のワクチ
ンは、APP 及び任意には、１又は複数の他の疾病又は病
理学的状態に対してブタを保護するための組合せワクチ
ンであり得、この組合せワクチンは、ブタにおいてAPP
に対しての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与する
ことができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチ
ド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、
誘導体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択
された、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原を
含んで成る第１成分；ブタを苦しめる疾病又は病理学的
状態に対する保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与す
ることができる、免疫学的有効量の異なった抗原を含ん
で成る第２成分；及び獣医学的に許容できるキャリヤー
又は希釈剤を有する。
【００２７】本発明の方法はさらに、APP に対してブタ
を保護することができるワクチンを調製するための方法
を提供し、ここで前記方法は、ブタにおいてAPP に対し
ての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することが
できる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペ
プチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導
体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択され
た、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原との獣
医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤とを、ブタへ
の投与のために適切な形で、組合すことを含んで成る。
本発明はさらに、ブタに本発明のワクチンを投与するこ
とを含んで成る、APPに対してブタを予防接種する方法
を提供する。
【００２８】本発明はさらに、APP に対してブタを予防
接種するためのワクチン用キットを提供し、ここで前記
キットは、ブタにおいてAPP に対しての保護応答を誘発
し、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP
タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメン
ト、融合タンパク質、類似体、誘導体、又はポリヌクレ
オチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量
の本発明の１又は複数の抗原を含んで成る容器を含んで
成る。前記キットはさらに、獣医学的に許容できるキャ
リヤー又は希釈剤を含んで成る第２容器を含むことがで
きる。本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質に対し
て特異的に結合する抗体を提供する。
【００２９】本発明はさらに、診断用キットも提供す
る。非制限的態様においては、その診断用キットは、AP
P タンパク質に対して向けられた、ブタ用抗体に対して
特異的に結合するであろう本発明のAPP タンパク質、相
同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク
質、類似体又は誘導体を含んで成る第１容器；及びブタ
用抗−APP 抗体に対して向けられた第２抗体を含んで成
る第２容器を含んで成る。前記第２抗体は好ましくは、
検出できるラベルを含んで成る。そのような診断用キッ
トは、APP により現在感染されているか、又は前に感染
されたことがあり、又は本発明のワクチンによる予防接
種の結果として血清転換されているブタを検出するため
に有用である。
【００３０】異なった非制限的態様においては、診断用
キットは、本発明のAPP タンパク質に結合する第１抗体
を含んで成る第１容器；及びAPP タンパク質上の異なっ
たエピトープに結合するか、又は前記第１抗体に結合す
る第２抗体を含んで成る第２容器を含んで成る。前記第
２抗体は好ましくは、検出できるラベルを含んで成る。
異なった非制限的態様においては、診断用キットは、本
発明のAPP 特異的ポリヌクレオチド分子を特異的に増幅
するために有用である本発明のポリペプチド分子又はオ
リゴヌクレオチド分子を含んで成る容器を含んで成る。
それらの後者の２種の診断用キットは、APP により現
在、感染されているブタを検出するために有用である。
【００３１】４．図面の説明 図１：APP 血清型−５により攻撃され、そしてAPP 血清
型−７により異種的に再攻撃されたブタNo．803 からの
（ａ）血清、及び（ｂ）気管支リンパ節（BLN）組織外
植体上清液に存在する抗体のウェスターンブロット分
析。２４又は４８時間のインキュベーションの後に集め
られたすべてのBLN 組織外植体上清液は、APP タンパク
質を特異的に認識した抗体を含んだ、BLN 組織外植体上
清液からの抗体は、APP 血清型−１，５及び７に存在す
るいくつかの低分子量タンパク質を強調した。
【００３２】図２：１２種の異なったAPP 血清型の個々
からの完全な細菌細胞抗原に対するブタNo．803 からの
BLN 組織外植体上清液に存在する抗体の交差−反応性の
ウェスターンブロット分析であって、これは、異種再攻
撃により誘発された抗体により認識される少なくとも３
種の低分子量タンパク質がすべての１２種のAPP 血清型
に存在したことを示す。この特定のBLN 上清液に存在す
る抗体はまた、他のタンパク質バンドによっても認識さ
れる。
【００３３】図３：低分子量タンパク質に対するブタN
o．803 からのBLN 組織外植体上清液における抗体の反
応性が細菌細胞上清液（Sups）よりもむしろ、細胞ペレ
ット（細胞）に存在するタンパク質に対して制限される
ことを示すウェスターンブロット分析。 図４：APP 血清型−７から精製されたタンパク質に対す
るブタNo．803 からの（ａ）BLN 組織外植体上清液及び
（ｂ）血清の反応性の、連続流動電気泳動によるウェス
ターンブロット分析。それぞれ、約１９〜２０、約２
３、約２７及び約２９kDa の分子量を有する４種のタン
パク質バンドが、この方法を用いて同定された。
【００３４】図５：APP OmpA1 及びAPP OmpA2 タンパク
質の推定されるアミノ酸配列の列挙。それらの２種のタ
ンパク質は、７３．１％のアミノ酸同一性を共有する。 図６：ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae)からのOm
pWタンパク質及びAPPからのOmpWタンパク質のアミノ酸
配列の列挙。それらの２種のタンパク質は、４４．９％
のアミノ酸同一性を共有する。
【００３５】５．発明の特定の記載 ５．１．複数のAPP 血清型により共有される新規タンパ
ク質 Omp20 のアミノ酸配列は、株Pz416(ATCC 98926）の宿主
細胞に存在するプラスミドpER416のOmp20 −コードORF
によりコードされる。Omp20 の推定されるアミノ酸配列
は、配列番号２として示される。
【００３６】配列番号２で示されるタンパク質の最初の
１９個のアミノ酸はシグナル配列を示し、そして本発明
は、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１７２（すなわ
ち、シグナル配列を欠いている）のみを有するOmp20 タ
ンパク質、及び配列番号２の配列（すなわち、シグナル
配列を含む）を有するOmp20 タンパク質を包含する。従
って、本発明は、配列番号２のおよそアミノ酸残基２０
〜およそアミノ酸残基１７２のアミノ酸配列を含んで成
る実質的に精製されたタンパク質を提供する。本発明は
さらに、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る実質的
に精製されたタンパク質も供給する。
【００３７】OmpWのアミノ酸配列は、株Pz418(ATCC 989
28）の宿主細胞に存在するプラスミドpER418のOmpW−コ
ードORF によりコードされる。OmpWの推定されるアミノ
酸配列は、配列番号４として示される。配列番号４で示
されるタンパク質の最初の２１個のアミノ酸はシグナル
配列を示し、そして本発明は、配列番号４のアミノ酸残
基２２〜２１５（すなわち、シグナル配列を欠いてい
る）のみを有するOmpWタンパク質、及び配列番号４の配
列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOmpWタン
パク質を包含する。従って、本発明は、配列番号４のお
よそアミノ酸残基２２〜およそアミノ酸残基２１５のア
ミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質
を供給する。本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配
列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質も供給す
る。
【００３８】Omp27 のアミノ酸配列は、株Pz417(ATCC 9
8927）の宿主細胞に存在するプラスミドpER417のOmp27
−コードORF によりコードされる。Omp27 の推定される
アミノ酸配列は、配列番号６として示される。配列番号
６で示されるタンパク質の最初の２７個のアミノ酸はシ
グナル配列を示し、そして本発明は、配列番号６のアミ
ノ酸残基２８〜２５８（すなわち、シグナル配列を欠い
ている）のみを有するOmp27 タンパク質、及び配列番号
６の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOm
p27 タンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番
号６のおよそアミノ酸残基２８〜およそアミノ酸残基２
５８のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタ
ンパク質を供給する。本発明はさらに、配列番号６のア
ミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質
も供給する。
【００３９】OmpA1 のアミノ酸配列は、株Pz419(ATCC 9
8929）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmpA1
−コードORF によりコードされる。OmpA1 の推定される
アミノ酸配列は、配列番号８として示される。配列番号
８で示されるタンパク質の最初の１９個のアミノ酸はシ
グナル配列を示し、そして本発明は、配列番号８のアミ
ノ酸残基２０〜３６４（すなわち、シグナル配列を欠い
ている）のみを有するOmpA1 タンパク質、及び配列番号
８の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOm
pA1 タンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番
号８のおよそアミノ酸残基２０〜およそアミノ酸残基３
６４のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタ
ンパク質を供給する。本発明はさらに、配列番号８のア
ミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質
も供給する。
【００４０】OmpA2 のアミノ酸配列は、株Pz420(ATCC 9
8930）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmpA2
−コードORF によりコードされる。OmpA2 の推定される
アミノ酸配列は、配列番号１０として示される。配列番
号１０で示されるタンパク質の最初の１９個のアミノ酸
はシグナル配列を示し、そして本発明は、配列番号１０
のアミノ酸残基２０〜３６９（すなわち、シグナル配列
を欠いている）のみを有するOmpA2 タンパク質、及び配
列番号１０の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を
有するOmpA2 タンパク質を包含する。従って、本発明
は、配列番号１０のおよそアミノ酸残基２０〜およそア
ミノ酸残基３６９のアミノ酸配列を含んで成る実質的に
精製されたタンパク質を供給する。本発明はさらに、配
列番号１０のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製さ
れたタンパク質も供給する。
【００４１】本発明のAPP タンパク質、すなわちOmp20,
OmpW, Omp27, OmpA1 、及びOmpA2は、それらの電気泳
動移動度に基づいて、それぞれ約１９〜２０、約２３、
約２７、約２９、及び約２９kDa の分子量；及びシグナ
ル配列を有さないそれらの推定されるアミノ酸配列に基
づいて、それぞれ約２０、約２３、約２７、約３５及び
約３５kDa の分子量を有する。
【００４２】本発明は、本発明のAPP タンパク質に対し
て相同であるポリペプチドを提供する。ポリペプチドを
言及するために本明細書において使用される場合、用語
“相同”とは、配列番号２，４，６，８及び１０から成
るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列、又は
１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基によ
り保存的に置換されている、それらの天然のシグナル配
列を有さない前記群のアミノ酸配列と同じアミノ酸を有
するポリペプチドを言及し、ここで前記相同ポリペプチ
ドは、いづれか標準のアミノ酸分析アルゴリズム（たと
えば、GENBANKのBlastPアルゴリズムの１つ）により決
定される場合、配列番号２，４，６，８及び１０から成
るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列を有す
るポリペプチドに対して、約７０％、より好ましくは約
８０％、及び最とも好ましくは約９０％の配列同一性を
有するアミノ酸配列を有し、そしてその得られる相同ポ
リペプチドは、本発明の実施において有用である。
【００４３】保存性アミノ酸置換は当業界において良く
知られている。そのような置換を行なうための規則は、
中でも、Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Foun
d.,Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3により記載され
る規則を包含する。より特定には、保存性アミノ酸置換
は、それらの側鎖の酸度、極性又は嵩高性に関係してい
るアミノ酸ファミリー内で一般的に起こる置換である。
遺伝子的にコードされたアミノ酸は一般的に次の４種の
グループに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、
グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒ
スチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない
極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイ
ン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニ
ン、トリプトファン、及びチロシンはまた、芳香族アミ
ノ酸として分類される。
【００４４】いづれかの特定のグループ内での１又は複
数の置換、たとえばイソロイシン又はバリンによるロイ
シンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリン
によるトレオニンの、又は構造的に関係するアミノ酸残
基、たとえば側鎖の類似する酸度、極性、嵩高度、又は
そのいくつかの組合せでの類似性を有するアミノ酸残基
によるいづれか他のアミノ酸残基の置換は一般的に、ポ
リペプチドの機能又は免疫原性に対して有意な効果を有
さないであろう。
【００４５】本明細書において使用される場合、ポリペ
プチドは、“本発明の実施において有用であり”、ここ
で前記ポリペプチドは、（ａ）免疫原性であり、すなわ
ち、APP に対してブタにおける保護応答を誘発するのに
単独で、又はAPP に対してブタにおける保護応答の誘発
に寄与する本発明の他の抗原と組合して、ワクチン組成
物に使用され得；又は（ｂ）哺乳類種のメンバーに投与
される場合、診断試薬として有用であるAPP −特異的抗
体の生成を誘発するために使用され得；又は（ｃ）APP
による感染又は本発明のワクチンによる予防接種のいづ
れかに起因するブタからの血液又は血清サンプルにおけ
る抗−APP 抗体の存在を検出するために診断試薬として
使用され得る。
【００４６】本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質
又は相同ポリペプチドのペプチドフラグメントを供給す
る。本明細書において使用される場合、“ペプチドフラ
グメント”とは、シグナル配列を有するか又は有さな
い、その対応する十分な長さのAPP タンパク質の完全な
アミノ酸配列よりも少ないアミノ酸配列から成るポリペ
プチド、又はそのアミノ酸配列の少なくとも約１０個、
より好ましくは少なくとも約２０個及び最とも好ましく
は少なくとも約３０個のアミノ酸残基の副配列を含んで
成る前記ポリペプチドの相同ポリペプチドを意味し、そ
してポリペプチドについての有用性が上記に定義される
ように、本発明の実施において有用な前記ポリペプチド
及びその相同体を意味する。
【００４７】本発明のペプチドフラグメントは、本発明
の十分な長さのタンパク質又は相同ポリペプチドの１以
上の副配列を含むことができる。たとえば、十分な長さ
のAPP タンパク質又は相同ポリペプチドからの複数の異
なった副配列は、それらがAPP タンパク質又は相同ポリ
ペプチドにおいて非連続性である場合、一緒にされ、そ
してペプチドフラグメントにおいてお互い接触せしめら
れ得る。好ましい態様においては、本発明のペプチドフ
ラグメントは、抗体が生ぜしめられ得る、APPタンパク
質又は相同ポリペプチドの１又は複数のエピトープ、又
はエピトープの複数のコピーを表わす１又は複数の副配
列を含んで成る。
【００４８】非制限的な態様において、本発明は、APP
タンパク質の天然のシグナル配列を含んで成る、本発明
のAPP タンパク質のペプチドフラグメントを供給する。
好ましい態様において、ペプチドフラグメントは、配列
番号２のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１
９(Omp20）、配列番号４のおよそアミノ酸残基１〜およ
そアミノ酸残基２１（OmpW）、配列番号６のおよそアミ
ノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２７（Omp27)、配列番
号８のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９
(Omp1)、及び配列番号１０のおよそアミノ酸残基１〜お
よそアミノ酸残基１９（OmpA1 ）から成る群から選択さ
れたアミノ酸配列から成る。
【００４９】そのようなシグナル配列、及びそれらをコ
ードするポリヌクレオチド分子は、種々の目的のため
に、たとえば、APP 又は他の細菌宿主細胞において発現
される組換えタンパク質の細胞密集を方向づけるため
に、又は感染された動物からの流体又は組織サンプルに
おけるAPP −特異的ポリヌクレオチド分子を検出するた
めの診断用プローブとして有用である。
【００５０】本発明はさらに、十分な長さのAPP タンパ
ク質又は相同ポリペプチドを提供し、ここでその副配列
は、ポリペプチドの抗原性を高め、変更し、又は他方で
は、改良するために、天然の分子に見出される副配列に
比較して、お互いに対して異なった相対的順序で配置さ
れている。本明細書において使用される場合、用語“抗
原”、“抗原性”及び同様のものは、体液性及び／又は
細胞性抗原−特異的応答を生成するために宿主の免疫シ
ステムを刺激する１又は複数のエピトープを含む分子を
意味する。この用語はまた、“免疫原”とも互換的に使
用され得る。本明細書において使用される場合、用語
“エピトープ”又は“エピトープ領域”とは、特定の抗
体分子が結合する抗原又はハプテン上の部位を意味す
る。この用語はまた、“抗原決定基”とも互換的に使用
される。
【００５１】本発明はさらに、ポリペプチドについての
有用性が上記で定義されたように、本発明の実施におい
て有用である、キャリヤー又は融合パートナーに連結さ
れた、本発明のAPP タンパク質パートナー（天然のシグ
ナル配列を有するか、又は有さない）、その相同ポリペ
プチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タ
ンパク質を提供する。融合パートナーの例については下
記セクション５．４．１を参照のこと。
【００５２】融合タンパク質は、種々の理由のために、
たとえば組換え的に発現されたAPPタンパク質の安定性
を高めるために、APP ワクチンにおける抗原性成分とし
て、特定のAPP タンパク質パートナーに対しての抗血清
を高めるために、APP タンパク質パートナーの生化学的
性質を研究するために、異なった又は増強された抗原性
質を有するAPP タンパク質を構築するために、診断用試
薬として作用せしめるために、又はたとえば、下記セク
ション５．４．１に記載されるように、発現されたAPP
タンパク質の同定又は精製において助けになるために有
用である。
【００５３】本発明の融合タンパク質はさらに、特定の
プロテアーゼ切断部位を含むよう、標準的技法を用いて
構築され得、その結果、特定のAPP タンパク質パートナ
ーが特定のプロテアーゼによる処理により、キャリヤー
又は融合パートナーから放たれ得る。たとえば、本発明
の融合タンパク質は、中でも、トロンビン又は第Ｘａ因
子切断部位を含むことができる。
【００５４】本発明はさらに、本発明のAPP タンパク
質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合
タンパク質の類似体及び誘導体を提供し、ここでそのよ
うな類似体及び誘導体は、ポリペプチドについての有用
性が上記で定義されたように、本発明の実施において有
用である。類似体の生成をもたらす操作は、類似体が調
製される特定のポリペプチドの生物学的又は免疫学的特
徴を改良し、又は他方では変えるために、遺伝子レベル
で又はタンパク質レベルで、又は両レベルで実施され得
る。
【００５５】たとえば、遺伝子レベルでは、本発明のAP
P タンパク質をコードするクローン化されたＤＮＡ分子
が、そのタンパク質の類似体をコードするよう、１又は
複数の既知の方法により修飾され得る。そのような修飾
は、エンドヌクレアーゼ消化、及び翻訳、開始、又は終
結配列を創造し、又は破壊し、又はコード領域における
変動を創造する突然変異、又はその組合せを包含する
が、但しそれらだけには限定されない。
【００５６】そのような技法は、中でも次の文献に記載
される：Maniatisなど., 1989, Molecualr Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, Cold Spring Harbor, NY ; Ausubelなど., 1989,
Current Protocols in Molecular Biology, Geene Pub
lishing Associates & Wiley Interscience, NY ; Samb
rookなど., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, 2d ed., ColdSpring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, NY ; Innis など., (eds), 19
95, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Dieg
o ; 及びErlich(ed), 1992, PCR Technology, Oxford U
niversity Press, New York (それらの開示は引用によ
り本明細書中に組込まれる）。
【００５７】これに代って又はこれに加えて、本発明の
類似体は、タンパク質レベルでは、本発明のAPP タンパ
ク質又は他のポリペプチドの修飾により調製され得る。
タンパク質の１又は複数の化学的修飾は、既知の技法、
たとえば次の技法（但し、それらだけには限定されな
い）を用いて実施され得る：カルバゼート又は三次中心
を生成するために、タンパク質の１又は複数のＬ−アミ
ノ酸のその対応するＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体又は
アミノ酸擬似物によ置換；又は特定の化学的修飾、たと
えばトリプシン、キモトリプシン、パパイン又はＶ８プ
ロテアーゼによるタンパク質分解、又はNaBH4 又は臭化
シアンによる処理、又はアセチル化、ホルミル化、酸化
又は還元、等。
【００５８】本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプ
チドは、１又は複数の次の化学基の接合により誘導体化
され得る：アセチル基、硫黄架橋基、グリコシル基、脂
質、及びホスフェート、及び／又は本発明の第２のAPP
タンパク質又は他のポリペプチド、又は他のタンパク
質、たとえば結成アルブミン、キーホールリンペット
（アカ貝）ヘモシアニン、又は市販の活性化されたBSA
、又はポリアミノ酸（たとえばポリリシン）、又はポ
リサッカライド（たとえば、セファロース、アガロース
又は変性された又は変性されていないセルロース）。そ
のような接合は好ましくは、APP タンパク質のアミノ酸
側鎖及び／又はＮ−末端又はＣ−末端で存在する。その
ような接合反応を実施するための方法は、タンパク質化
学の分野においては、良く知られている。
【００５９】本発明の実施において有用な誘導体はま
た、水溶性ポリマー、たとえばポリエチレングリコール
が本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプチド、又は
その類似体に接合されている誘導体を包含し、それによ
り、APP タンパク質の免疫原性を少なくとも一部、保持
し、又は改良すると共に、追加の所望する性質を提供す
る。それらの追加の所望する性質は、たとえば、水溶液
における高められた溶解性、貯蔵における高められた安
定性、タンパク質分解性劣化に対する高められた耐性、
及び高められたインビボ半減期を包含する。
【００６０】本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプ
チドへの接合のために適切な水溶性ポリマーは、次のも
のを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ポ
リエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレング
リコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレ
ングリコールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマー
及びコポリマーは未置換であり、又はアルキル基により
一端で置換されている）、ポリオキシエチル化されたポ
リオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、
ポリビニルエチルエーテル、及びβ，β−ポリ〔２−ヒ
ドロキシエチル〕−ＤＬ−アスパルタミド。ポリエチレ
ングリコールは特に好ましい。
【００６１】ポリペプチドの水溶性ポリマー接合体を製
造するための方法は、当業界において知られており、そ
して中でも、次の特許に記載されている：アメリカ特許
第3,788,948 号；第3,960,830 号；第4,002,531 号；第
4,055,635 号；第4,179,337号；第4,261,973 号；第4,4
12,989 号；第4,414,147 号；第4,415,665 号；第4,60
9,546 号；第4,732,863 号；第4,745,180 号；ヨーロッ
パ特許（EP）第152,847 号；EP第98,110号；及び日本特
許（JP）第5,792,435 号（それらは引用により本明細書
に組込まれる）。
【００６２】“APP タンパク質”及び同様のものに関す
るすべての続く言及は、特にことわらない限り、上記で
定義されたように、本発明のAPP タンパク質、相同ポリ
ペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類
似体及び誘導体を包含するつもりである。
【００６３】５．２．新規APP タンパク質をコードする
ポリヌクレオチド分子 本発明はさらに、APP タンパク質をコードするヌクレア
ーゼ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子
を提供する。本明細書において使用される場合、用語
“ポリヌクレオチド分子”、“ポリヌクレオチド配
列”、“コード配列”、“オープンリーディングフレー
ム（ORF ）”、及び同様のものは、１又は複数の原核配
列、cDNA配列、ゲノムDNA 配列（エキソン及びイントロ
ンを包含する）、又は化学的に合成されたDNA 及びRNA
配列を包含することができ；そしてセンス及びアンチセ
ンス鎖の両者を含むことができる、一本鎖又は二本鎖の
いづれかであり得るDNA 及びRNA 分子の両者を言及する
つもりである。
【００６４】本明細書において使用される場合、用語
“ORF ”とは、いづれの介在性終結コドンも有さない本
発明の特定のAPP タンパク質をコードすることを必要と
される最小ヌクレオチド配列を言及する。ポリヌクレオ
チドコード配列の境界は一般的に、５’（アミノ）末端
での開始コドンの存在、及び３’（カルボキシ）末端で
の翻訳停止の存在により決定される。
【００６５】下記に開示されるポリヌクレオチド分子及
びオリゴヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者の
範囲内であり、そして中でも、次の文献に記載される組
換え技法に従って実施され得る：Maniatisなど., 1989
、上記；Ausubel など., 1989 、上記；Sambrookな
ど., 1989 、上記；Innis など., 1995 、上記；及びEr
lich, 1992、上記。
【００６６】５．２．１．Omp20 をコードするポリヌク
レオチド分子 配列番号１からのヌクレオチド配列、及びその選択さ
れ、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特に
ことわらない限り、株Pz416(ATCC 98926）の宿主細胞に
存在するプラスミドpER416のその対応するOmp20 −関連
ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配
列番号２に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラ
グメントについての言及はまた、特にことわらない限
り、プラスミドpER416のOmp20 −関連ヌクレオチド配列
によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及す
るつもりである。
【００６７】本発明は、APP タンパク質、すなわちOmp2
0 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共
に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌク
レオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本
発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt３２９〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチ
ド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本
発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt２７２〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチ
ド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明
の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子は、
配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００６８】本発明はさらに、本発明のAPP Omp20 −コ
ードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”と
は、Omp20 −コードポリヌクレオチド分子を言及するた
めに使用される場合、（ａ）nt３２９〜nt７９０の配列
番号１のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコード
するが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチ
ド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；
又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4，７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMの
EDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリ
ダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSに
よる洗浄（Ausubel など. (eds.), 1989, Current Prot
ocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishi
ng Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc.,
New York, p 2.10.3を参照のこと）下で、配列番号２の
アミノ酸残基２０〜１７２をコードするヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子
を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００６９】好ましい態様においては、相同ポリヌクレ
オチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4 ,7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結
合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃
で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 198
9 、上記）下で、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１７
２をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実
施において有用である。より好ましい態様においては、
相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt３
２９〜nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列から成
るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そ
して本発明の実施において有用である。
【００７０】本明細書において使用される場合、ポリヌ
クレオチド分子は、次の場合、“本発明の実施において
有用である”：（ａ）ポリヌクレオチド分子がAPP に対
してブタにおいて保護応答を、単独で誘発するか、又は
その誘発に１又は複数の他の抗原と組合して寄与するよ
うワクチン組成物に使用され得るポリペプチドをコード
する場合；又は（ｂ）ポリヌクレオチド分子がAPP に対
してブタにおいて保護応答を、単独で誘発するか、又は
その誘発に１又は複数の他のポリヌクレオチド分子又は
１又は複数の他の抗原と組合して寄与するようDNA ワク
チン組成物に直接的に使用される場合；又は（ｃ）ポリ
ヌクレオチド分子が、哺乳類種のメンバーに投与される
場合、診断試薬として有用であるAPP −特異的抗体の生
成を誘発するために使用され得るポリペプチドをコード
する場合；又は（ｄ）ポリヌクレオチド分子がブタから
の血液又は血清サンプルにおけるAPP −特異的抗体の存
在を検出するために診断試薬として使用され得るポリペ
プチドをコードする場合；又は（ｅ）ポリヌクレオチド
分子がAPP −感染されたブタからの流体又は組織サンプ
ルにおけるAPP −特異的ポリヌクレオチド分子の存在を
検出するために診断試薬として使用される場合。
【００７１】本発明はさらに、“相同ポリペプチド”に
ついて上記セクション５．１において定義されるよう
に、本発明のOmp20 タンパク質に対して相同であるポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単
離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７２】本発明はさらに、本発明の前記Omp20 −関
連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分である
ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供
する。本明細書において使用される場合、Omp20 −関連
ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十
分な長さのOmp20 −関連ポリヌクレオチド分子の完全な
ヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかし
その特定の十分な長さのOmp20 関連ポリヌクレオチド分
子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、そしてよ
り好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そして
ポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定
義されているように、本発明の実施において有用である
ポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様にお
いては、Omp20 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な
部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定
義されたように、本発明の上記Omp20 −関連タンパク質
又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントを
コードする。
【００７３】本発明はさらに、配列番号２のおよそアミ
ノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９の生来のOmp20 シ
グナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る
ポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様にお
いては、Omp20 シグナル配列−コードポリヌクレオチド
分子は配列番号１の約nt２７２〜約nt３２８を含んで成
る。本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに
融合される、Omp20 タンパク質、相同ポリペプチド、又
はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質を
コードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオ
チド分子を提供する。
【００７４】５．２．２．OmpWをコードするポリヌクレ
オチド分子 配列番号３からのヌクレオチド配列、及びその選択さ
れ、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特に
ことわらない限り、株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に
存在するプラスミドpER418のその対応するOmpW−関連ヌ
クレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配列
番号４に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラグ
メントについての言及はまた、特にことわらない限り、
プラスミドpER418のOmpW−関連ヌクレオチド配列により
コードされるその対応するアミノ酸配列を言及するつも
りである。
【００７５】本発明は、APP タンパク質、すなわちOmpW
をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共に
又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。好ましい態様においては、本発
明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、
約nt４３９〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド
配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発
明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、
約nt３７６〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド
配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の
単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、配列
番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００７６】本発明はさらに、本発明のAPP OmpW−コー
ドポリヌクレオチド分子に対して相同である単離された
ポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、
OmpW−コードポリヌクレオチド分子を言及するために使
用される場合、（ａ）nt４３９〜nt１０２３の配列番号
３のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードする
が、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチド配
列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は
（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNa
HPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのEDTAに
おいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼ
ーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによる洗
浄（Ausubel など. (eds.)、上記）下で、配列番号４の
アミノ酸残基２２〜２１５をコードするヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子
を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００７７】好ましい態様においては、相同ポリヌクレ
オチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結
合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃
で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 198
9 、上記）下で、配列番号４のアミノ酸残基２２〜２１
５をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実
施において有用である。より好ましい態様においては、
相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt４
３９〜nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列から
成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、
そして本発明の実施において有用である。
【００７８】本発明はさらに、“相同ポリペプチド”に
ついて上記において定義されるように、本発明のOmpWタ
ンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子を提供する。本発明はさらに、本発明の前記Om
pW−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分
であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子
を提供する。
【００７９】本明細書において使用される場合、OmpW−
関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定
の十分な長さのOmpW−関連ポリヌクレオチド分子の完全
なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しか
しその特定の十分な長さのOmpW−関連ポリヌクレオチド
分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びよ
り好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そして
ポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定
義されているように、本発明の実施において有用である
ポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様にお
いては、OmpW−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部
分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義
されたように、本発明の上記OmpW−関連タンパク質又は
ポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコー
ドする。
【００８０】本発明はさらに、配列番号４のおよそアミ
ノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２１の生来のOmpWシグ
ナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポ
リペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様におい
ては、OmpWシグナル配列−コードポリヌクレオチド分子
は配列番号３の約nt３７６〜約nt４３８を含んで成る。
本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに融合
される、OmpWタンパク質、相同ポリペプチド、又はペプ
チドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分
子を提供する。
【００８１】５．２．３．Omp27 をコードするポリヌク
レオチド分子 配列番号５からのヌクレオチド配列、及びその選択さ
れ、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特に
ことわらない限り、株Pz417(ATCC 98927）の宿主細胞に
存在するプラスミドpER417のその対応するOmp27 −関連
ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配
列番号６に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラ
グメントについての言及はまた、特にことわらない限
り、プラスミドpER417のOmp27 −関連ヌクレオチド配列
によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及す
るつもりである。
【００８２】本発明は、APP タンパク質、すなわちOmp2
7 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共
に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌク
レオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本
発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt２３８〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオチ
ド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本
発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt１５７〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオチ
ド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明
の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子は、
配列番号５のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００８３】本発明はさらに、本発明のAPP Omp27 −コ
ードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”と
は、Omp27 −コードポリヌクレオチド分子を言及するた
めに使用される場合、（ａ）nt２３８〜nt９３３の配列
番号５のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコード
するが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチ
ド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；
又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのED
TAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダ
イゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによ
る洗浄（Ausubel など. (eds.)、上記）下で、配列番号
６のアミノ酸残基２８〜２５８をコードするヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
分子を意味し、そして本発明の実施において有用であ
る。
【００８４】好ましい態様においては、相同ポリヌクレ
オチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結
合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃
で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 198
9 、上記）下で、配列番号６のアミノ 酸残基２８〜２
５８をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の
実施において有用である。より好ましい態様において
は、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、
nt２３８〜nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列か
ら成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズ
し、そして本発明の実施において有用である。本発明は
さらに、“相同ポリペプチド”について上記において定
義されるように、本発明のOmp27 タンパク質に対して相
同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供す
る。
【００８５】本発明はさらに、本発明の前記Omp27 −関
連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分である
ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供
する。本明細書において使用される場合、Omp27 −関連
ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十
分な長さのOmp27 −関連ポリヌクレオチド分子の完全な
ヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかし
その特定の十分な長さのOmp27 −関連ポリヌクレオチド
分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びよ
り好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そして
ポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定
義されているように、本発明の実施において有用である
ポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様にお
いては、Omp27 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な
部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定
義されたように、本発明の上記Omp27 −関連タンパク質
又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントを
コードする。
【００８６】本発明はさらに、配列番号６のおよそアミ
ノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２７の生来のOmp27 シ
グナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る
ポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様にお
いては、Omp27 シグナル配列−コードポリヌクレオチド
分子は配列番号５の約nt１５７〜約nt２３７を含んで成
る。本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに
融合される、Omp27 タンパク質、相同ポリペプチド、又
はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質を
コードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオ
チド分子を提供する。
【００８７】５．２．４．OmpA1 をコードするポリヌク
レオチド分子 配列番号７からのヌクレオチド配列、及びその選択さ
れ、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特に
ことわらない限り、株Pz419(ATCC 98929）の宿主細胞に
存在するプラスミドpER419のその対応するOmpA1 −関連
ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配
列番号８に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラ
グメントについての言及はまた、特にことわらない限
り、プラスミドpER419のOmpA1 −関連ヌクレオチド配列
によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及す
るつもりである。
【００８８】本発明は、APP タンパク質、すなわちOmpA
1 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共
に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌク
レオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本
発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt６７１〜約nt１７０８の配列番号７のヌクレオ
チド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、
本発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分
子は、約nt６１４〜約nt１７０８の配列番号７のヌクレ
オチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本
発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分子
は、配列番号７のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００８９】本発明はさらに、本発明のAPP OmpA1 −コ
ードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”と
は、OmpA1 −コードポリヌクレオチド分子を言及するた
めに使用される場合、（ａ）nt６７１〜nt１７０８の配
列番号７のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコー
ドするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオ
チド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含
し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、
0.5MのNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mM
のEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブ
リダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDS
による洗浄（Ausubel など. (eds.)、上記）下で、配列
番号８のアミノ酸残基２０〜３６４をコードするヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイ
ブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド分子を意味し、そして本発明の実施において有用で
ある。
【００９０】好ましい態様においては、相同ポリヌクレ
オチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結
合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃
で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 198
9 、上記）下で、配列番号８のアミノ酸残基２０〜３６
４をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実
施において有用である。より好ましい態様においては、
相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt６
７１〜nt１７０８の配列番号７のヌクレオチド配列から
成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、
そして本発明の実施において有用である。
【００９１】本発明はさらに、“相同ポリペプチド”に
ついて上記において定義されるように、本発明のOmpA1
タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。本発明はさらに、本発明の前記
OmpA1 −関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的
部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド
分子を提供する。本明細書において使用される場合、Om
pA1 −関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”と
は、特定の十分な長さのOmpA1 −関連ポリヌクレオチド
分子の完全なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成
るが、しかしその特定の十分な長さのOmpA1 関連ポリヌ
クレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０
％、及びより好ましくは少なくとも約２０％を含んで成
り、そしてポリヌクレオチド分子についての“有用性”
が上記で定義されているように、本発明の実施において
有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的
な態様においては、OmpA1 −関連ポリヌクレオチド分子
の実質的な部分は、用語“ペプチドフラグメント”とし
て上記で定義されたように、本発明の上記OmpA1 −関連
タンパク質又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラ
グメントをコードする。
【００９２】本発明はさらに、配列番号８のおよそアミ
ノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９の生来のOmpA1 シ
グナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る
ポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様にお
いては、OmpA1 シグナル配列−コードポリヌクレオチド
分子は配列番号７の約nt６１４〜約nt６７０を含んで成
る。本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに
融合される、OmpA1 タンパク質、相同ポリペプチド、又
はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質を
コードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオ
チド分子を提供する。
【００９３】５．２．５．OmpA2 をコードするポリヌク
レオチド分子 配列番号９からのヌクレオチド配列、及びその選択さ
れ、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特に
ことわらない限り、株Pz420(ATCC 98930）の宿主細胞に
存在するプラスミドpER420のその対応するOmpA2 −関連
ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配
列番号１０に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフ
ラグメントについての言及はまた、特にことわらない限
り、プラスミドpER420のOmpA2 −関連ヌクレオチド配列
によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及す
るつもりである。
【００９４】本発明は、APP タンパク質、すなわちOmpA
2 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共
に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌク
レオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本
発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分子
は、約nt２５４〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレオ
チド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、
本発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分
子は、約nt１９７〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレ
オチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本
発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分子
は、配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００９５】本発明はさらに、本発明のAPP OmpA2 −コ
ードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”と
は、OmpA2 −コードポリヌクレオチド分子を言及するた
めに使用される場合、（ａ）nt２５４〜nt１３０６の配
列番号９のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコー
ドするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオ
チド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含
し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、
0.5MのNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mM
のEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブ
リダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDS
による洗浄（Ausubel など、上記）下で、配列番号１０
のアミノ酸残基２０〜３６９をコードするヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダ
イズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分
子を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００９６】好ましい態様においては、相同ポリヌクレ
オチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5M
のNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結
合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃
で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 198
9 、上記）下で、配列番号１０のアミ ノ酸残基２０〜
３６９をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明
の実施において有用である。より好ましい態様において
は、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、
nt２５４〜nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列
から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズ
し、そして本発明の実施において有用である。本発明は
さらに、“相同ポリペプチド”について上記において定
義されるように、本発明のOmpA2 タンパク質に対して相
同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供す
る。
【００９７】本発明はさらに、本発明の前記OmpA2 −関
連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分である
ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供
する。本明細書において使用される場合、OmpA2 −関連
ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十
分な長さのOmpA2 −関連ポリヌクレオチド分子の完全な
ヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかし
その特定の十分な長さのOmpA2 関連ポリヌクレオチド分
子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びより
好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポ
リヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定義
されているように、本発明の実施において有用であるポ
リヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様におい
ては、OmpA2 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部
分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義
されたように、本発明の上記OmpA2 −関連タンパク質又
はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコ
ードする。
【００９８】本発明はさらに、配列番号１０のおよそア
ミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９の生来のOmpA2
シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成
るポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様に
おいては、OmpA2 シグナル配列−コードポリヌクレオチ
ド分子は配列番号９の約nt１９７〜約nt２５３を含んで
成る。本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナー
に融合される、OmpA2 タンパク質、相同ポリペプチド、
又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレ
オチド分子を提供する。
【００９９】５．３．オリゴヌクレオチド分子 本発明は、さらに、本発明の前記ポリヌクレオチド分子
のいづれかにハイブリダイズし、又は本発明の前記ポリ
ヌクレオチド分子のいづれかの相補体であるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチド分子を提供する。そのようなオ
リゴヌクレオチド分子は好ましくは、少なくとも約１０
〜１５個の長さのヌクレオチドであるが、しかし配列番
号１，３，５，７又は９のいづれかの副配列、又はその
相同ポリヌクレオチド分子の長さまで及び、そして高い
緊縮条件下で、前記１又は複数のポリヌクレオチド分子
にハイブリダイズすることができる。
【０１００】より短いオリゴヌクレオチド分子に関して
は、高い緊縮条件の例は、約１４個の塩基のオリゴヌク
レオチドに関して、約３７℃、約１７個の塩基のオリゴ
ヌクレオチドに関して、約４８℃、約２０個の塩基のオ
リゴヌクレオチドに関して、約５５℃、及び約２３個の
塩基のオリゴヌクレオチドに関して約６０℃の温度での
6 ×SSC/0.5%ピロリン酸ナトリウム溶液による洗浄を包
含する。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち約
１００nt以上）に関して、高い緊縮条件の例は、上記セ
クション５．２に提供されている。他の適切なハイブリ
ダイゼーション条件は、使用される特定のオリゴヌクレ
オチド及びポリヌクレオチド分子に依存して、当業界に
おいて知られているようにして決定され、そして調節さ
れ得る。
【０１０１】好ましい態様においては、本発明のオリゴ
ヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、配列番号１，
３，５，７、又は９から選択されたヌクレオチド配列か
ら成るポリヌクレオチド分子に、又は配列番号１，３，
５，７又は９から選択されたヌクレオチド配列の補体で
あるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子に
ハイブリダイズする。非制限的態様においては、本発明
のオリゴヌクレオチド分子は、配列番号１５〜４７及び
４９〜９３から成る群から選択されたヌクレオチド配
列、及び前記配列の補体を含んで成る。非制限的態様に
おいては、オリゴヌクレオチド分子は、配列番号１５〜
４７及び４９〜９３から成る群から選択されたヌクレオ
チド配列及び前記配列の補体を含んで成る。
【０１０２】本発明のオリゴヌクレオチド分子は、種々
の目的のために、たとえば示差疾病診断への使用のため
にAPP タンパク質−コードポリヌクレオチド分子の増幅
におけるプライマーとして、又は遺伝子調節において有
用なアンチセンスをコードするために又はアンチセンス
として作用するために有用である。増幅は、組織又は流
体サンプル、たとえば感染された動物の粘膜又は気管支
においてAPP タンパク質をコードするポリヌクレオチド
分子の存在を検出するために使用され得る。特定の増幅
生成物の生成はAPP 細菌感染の診断の維持を助けると共
に、増幅される生成物の欠失はそのような感染の欠失を
示すことができる。本明細書に開示されるオリゴヌクレ
オチド分子はまた、アクチノバチルスの他の種又は株、
又は他の細菌から相同遺伝子を単離するためにも使用さ
れ得る。
【０１０３】増幅は、当業界において知られている他の
増幅技法、たとえばリガーゼ鎖反応が使用され得るが、
標準技法、たとえば“ポリメラーゼ鎖反応(PCR）によ
り、適切に企画されたオリゴヌクレオチド分子を用いて
実施され得る。たとえば、ＰＣＲに関しては、適切に企
画されたプライマー、増幅されるべきヌクレオチド配列
を含む鋳型、及び当業界において知られている適切なＰ
ＣＲ酵素及び緩衝液を含んで成る混合物が、鋳型の特定
のAPP −関連ポリヌクレオチド配列を増幅するために、
標準のプロトコールに従って調製され、そして処理され
る。ＰＣＲを実施するための方法は、中でも、Innis な
ど. (eds), 1995 、上記；及びErlich (ed), 1992 、上
記に記載されている。
【０１０４】５．４．組換え発現システム ５．４．１．クローニング及び発現ベクター 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづ
れかをクローニングし、そして発現するための組成物、
本発明のポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えクロ
ーニングベクター及び組換え発現ベクター、前記いづれ
かのベクターにより形質転換された宿主細胞、及びそれ
に由来する細胞系を提供する。本発明の組換えベクタ
ー、特に発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子のコー
ド配列（この後、“APP コード配列”と称する）が、ポ
リペプチドを生成するためにAPP コード配列の転写及び
翻訳のために必要な１又は複数の調節要素と作用可能に
関連して存在するよう、好ましくは構成される。
【０１０５】本明細書において使用される場合、用語
“調節要素”とは、ポリヌクレオチドコード配列の発現
を駆動し、そして／又は調節するよう作用する当業界に
おいて知られている、誘導性及び非誘導性プロモータ
ー、エンハンサー、オペレーター及び他の要素をコード
するヌクレオチド配列を包含するが、但し、それらだけ
には限定されない。また、本明細書において使用される
場合、APP コード配列は、１又は複数の調節要素と“作
用可能に関連して”存在し、ここで前記調節要素はコー
ド配列の転写又はそのmRNAの翻訳、又は両者を効果的に
調節し、そして可能にする。
【０１０６】適切な調節要素と作用可能に関連して、特
定のコード配列を含む組換えベクターを構成するための
方法、たとえばインビトロ組換え技法、合成技法、及び
インビボ遺伝子組換え法は、当業界において良く知られ
ている。たとえば、Maniatisなど., 1989 、上記；Ausu
bel など., 1989 、上記；Sambrookなど., 1989 、上
記；Innis など., 1995 、上記；及びErlich, 1992、上
記を参照のこと。
【０１０７】本発明のAPP コード配列のいづれか、たと
えばAPP コード配列を含む組換えバクテリオファージDN
A 、プラスミドDNA 及びコスミドDNA 発現ベクターを発
現するために使用され得る種々の発現ベクターは当業界
において知られている。本発明のAPP コード配列を含む
よう構築され得る典型的な原核発現ベクタープラスミド
は、中でも、pUC8, pUC9, pBR322及びpBR329（Biorad L
aboratories, Richmond, CA)，pPL 及びpKK223（Pharma
cia, Piscataway, NJ)，pQE50(Qiagen, Chatsworth, C
A) 、及びpGEXシリーズのプラスミド(Pharmacia）を包
含する。本発明のAPP コード配列を含むよう構築され得
る典型的な真核発現ベクターは、エクジソン−誘発性哺
乳類発現システム(Invitrogen, Carlsbad, CA)、サイト
メガロウィルスプロモーター−エンハンサーに基づくシ
ステム（Promega, Madison, WI ; Stratagene, La Joll
a, CA ; Invitrogen) 、バキュロウィルス−に基づく発
現システム(Promega）、及び植物−に基づく発現システ
ムを包含する。
【０１０８】それらの及び他のベクターの調節要素は、
それらの強さ及び特異性において変化することができ
る。使用される宿主／ベクターシステムに依存して、多
くの適切な転写及び翻訳要素のいづれかが使用され得
る。たとえば、哺乳類細胞系においてクローニングする
場合、哺乳類細胞のゲノムから単離されたプロモータ
ー、たとえばマウスメタロチオネインプロモーター、又
はそれらの細胞において増殖するウィルスから単離され
たプロモーター、たとえばワクシニア ウィルス７．５
Ｋプロモーター又はMoloney ネズミ肉腫ウィルスの長い
末端反復体が使用され得る。組換えDNA 又は合成技法に
より得られたプロモーターもまた、挿入されたコード配
列の転写を付与するために使用され得る。
【０１０９】さらに、一定のプロモーターからの発現
は、特定のインデューサー、たとえばメタロチオネイン
プロモーターのための亜鉛及びカドニウムイオンの存在
下で高められ得る。転写調節領域又はプロモーターの非
制限的例は、細菌に関しては、β-galプロモーター、Ｔ
７プロモーター、TAC プロモーター、λ左及び右プロモ
ーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、trp-lac 融合
プロモーター、等；酵母に関しては、解糖酵素プロモー
ター、たとえばADH-I 及びIIプロモーター、GPKプロモ
ーター、PGI プロモーター、TRP プロモーター、等；及
び哺乳類細胞に関しては、SV40初期及び後期プロモータ
ー、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【０１１０】特定の開始シグナルがまた、挿入されたコ
ード配列の十分な翻訳のために必要とされる。それらの
シグナルは典型的には、ATG 開始コドン及び隣接する配
列を包含する。それ自体の開始コドン及び隣接する配列
を含む本発明のAPP コード配列が適切な発現ベクター中
に挿入されている場合、追加の翻訳制御シグナルは必要
とされない。しかしながら、APP コード配列の一部のみ
が挿入されている場合、ATG 開始コドンを包含する外因
性翻訳制御シグナルが必要とされる。それらの外因性翻
訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の種々
の源から得られる。さらに、開始コドンは、完全な挿入
体のイン−フレーム翻訳を確保するために、コード領域
のオープンリーディングフレームと整合して存在すべき
である。
【０１１１】キャリヤー又は融合パートナーに融合され
る本発明のAPP −関連ポリペプチドのいづれかを含んで
成る融合タンパク質を発現するであろう発現ベクターが
また構成され得る。そのような融合タンパク質は、種々
の目的のために、たとえば組換え的に発現されたAPP タ
ンパク質の安定性を高めるために、APP タンパク質に対
する抗血清を高めるために、APP タンパク質の生化学的
性質を研究するために、変更された免疫学的性質を示す
APP タンパク質を構築するために、又は組換え的に発現
されたAPP タンパク質の同定又は精製を助けるために使
用され得る。
【０１１２】可能な融合タンパク質発現ベクターは、保
護ペプチド、たとえば下記セクション８．２に記載され
るもの、並びにβ−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合
体、マルトース−結合タンパク質融合体、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST）融合体、及びポリヒス
チジン融合体（キャリヤー領域）をコードする配 列を
組込んでいるベクターを包含するが、但しそれらだけに
は限定されない。それらの及び他の融合タンパク質をコ
ードする発現ベクターを構成するために使用され得る方
法は、当業界において良く知られている。
【０１１３】融合タンパク質は、発現されたタンパク質
の精製を助けるために有用である。非制限的な態様にお
いては、たとえばAPP タンパク質−マルトース−結合融
合タンパク質はアミロース樹脂を用いて精製され得；AP
P タンパク質−GST 融合タンパク質はグルタチオン−ア
ガロースビーズを用いて精製され得；そしてAPP タンパ
ク質−ポリヒスチジン融合タンパク質は二価のニッケル
樹脂を用いて精製され得る。他方では、キャリヤータン
パク質又はペプチドに対する抗体は、融合タンパク質の
アフィニティークロマトグラフィー精製のために使用さ
れ得る。
【０１１４】たとえば、モノクローナル抗体の標的エピ
トープをコードするヌクレオチド配列が調節要素と作用
可能に関連して発現ベクター中に構築され、そして位置
決定され、その結果、発現されたエピトープが本発明の
APP タンパク質に融合される。非制限的な例において
は、親水性マーカーペプチドである、FLAGTMエピトープ
標識(International Biotechnologies Inc.)をコードす
るヌクレオチド配列は、APP タンパク質のアミノ又はカ
ルボキシル末端に対応する点で発現ベクター中に標準技
法により挿入され得る。次に、発現されたポリペプチド
−FLAGTMエピトープ融合生成物が検出され、そして市販
の抗−FLAGTM抗体を用いてアフィニティー精製され得
る。
【０１１５】本発明の発現ベクターはまた、特定のプロ
テアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含む
よう構築され得、その結果、発現されたAPP タンパク質
は、特定のプロテアーゼによる処理によりキャリヤー領
域又は融合パートナーから開放され得る。たとえば、融
合タンパク質ベクターは、中でも、トロンビン又は第Ｘ
ａ因子切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むこ
とができる。
【０１１６】APP コード配列から上流に及び前記配列と
オープンリーディングフレームを整合して存在するシグ
ナル配列は、発現されたAPP ポリペプチドの密集及び分
泌を方向づけるために、既知の方法により発現ベクター
中に構築され得る。シグナル配列の非制限的例は、本明
細書に開示されるような本発明のAPP タンパク質に対し
て生来である配列、並びにα−因子、免疫グロブリン、
外層膜タンパク質、ペニシリナーゼ及びＴ−細胞受容体
からのシグナル配列を包含する。
【０１１７】本発明の組換えベクターにより形質転換さ
れた又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助け
るために、ベクターは、レポーター遺伝子生成物又は他
の選択マーカーのためのコード配列をさらに含んで成る
よう構築され得る。そのようなコード配列は好ましく
は、上記のように、調節要素と作用可能に関係して存在
する。本発明の実施において有用であるレポーター遺伝
子は、当業界において良く知られており、そして中で
も、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(CAT）、緑色螢光タンパク質、ホタル、ルシフェラーゼ
及びヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を包含する。
選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、当業界
において良く知られており、そして抗生物質又は抗−代
謝物に対して耐性を付与する遺伝子生成物をコードし、
又は栄養要求必要条件を供給する、それらの配列を包含
する。そのような配列の例は、中でも、チミジン キナ
ーゼ活性、又はメトトレキセート、アンピシリン、カナ
マイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、テトラサ
イクリン、及びカルベニシリンに対する耐性をコードす
るそれらの配列を包含する。
【０１１８】特定の非制限的態様においては、本発明
は、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託さ
れている宿主に存在する、下記セクションに記載される
ように構成された次のプラスミドクローニングベクター
を供給する：株Pz416(ATCC 98926) の宿主細胞に存在
し、そしてOmp20 のORF を含んで成るプラスミドpER41
6；株Pz418(ATCC 98928) の宿主細胞に存在し、そしてO
mpWのORF を含んで成るプラスミドpER418；株Pz417(ATC
C 98927) の宿主細胞に存在し、そしてOmp27 のORFを含
んで成るプラスミドpER417；株Pz419(ATCC 98929) の宿
主細胞に存在し、そしてOmpA1 のORF を含んで成るプラ
スミドpER419；及び株Pz420(ATCC 98930) の宿主細胞に
存在し、そしてOmpA2 のORF を含んで成るプラスミドpE
R420。
【０１１９】５．４．２．宿主細胞の形質転換 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子又は組
換えベクターにより形質転換された宿主細胞、及びそれ
らに由来する細胞系を提供する。本発明の実施において
有用な宿主細胞は、原核細胞か又は真核細胞のいづれか
であり得る。そのような形質転換された宿主細胞は、微
生物、たとえば組換えバクテリオファージDNA 、プラス
ミドDNA 又はコスミドDNA 発現ベクターにより形質転換
された細菌細胞；又は組換え発現ベクターにより形質転
換された酵母細胞；又は動物細胞、たとえば組換えウィ
ルス発現ベクター、たとえばバキュロウィルスにより感
染された昆虫細胞、又は組換えウィルスベクター、たと
えばアデノウィルス又はワクシニアウィルスにより感染
された哺乳類細胞を包含するが、但しそれらだけには限
定されない。
【０１２０】細菌細胞は一般的に、宿主細胞として好ま
しい。Ｅ．コリ株、たとえばGibcoBRL, Life Technolog
ies(Gaithersburg, MD) から入手できる株DH5 α、又は
下記に記載されるようなＥ．コリ株LW14が典型的には使
用され得る。真核宿主細胞、たとえば酵母細胞、及び哺
乳類細胞、たとえばマウス、ハムスター、ブタ、牛、サ
ル又はヒト細胞系からの細胞がまた、効果的に使用され
得る。本発明の組換えタンパク質を発現するために使用
され得る真核宿主細胞の例は、Chinese ハムスター卵巣
(CHO）細胞（たとえば、ATCC受託番号(CL61)及びNIH Sw
iss マウス胚細胞NIH/3T3(たとえばATCC受託番号CRL165
8)を包含する。
【０１２１】本発明の組換えベクターは好ましくは、実
質的に均質な細胞培養物中の１又は複数の宿主細胞中に
形質転換され、又はトランスフェトされる。ベクターは
一般的に、既知技法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、
塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレ
クトロポレーション、組換えされたウィルスとの接触に
よるトランスフェクション、リポソーム介在性トランス
フェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン トランスフェ
クション、トランスダクション、接合、又は微小発射物
衝撃により、宿主細胞中に導入される。形質転換体の選
択は、標準方法により、たとえば組換えベクターに関係
する選択マーカー、たとえば耐抗生物質性を発現する細
胞を選択することによって実施され得る。
【０１２２】ベクターが宿主細胞中に導入されると、宿
主細胞ゲノムにおける、又はエピソーム的に、APP コー
ド配列の組込み及び維持が、予測されるタンパク質生成
物を検出するために、標準の技法、たとえばサザンハイ
ブリダイゼーション分析、制限酵素分析、PCR 分析、た
とえば逆転写酵素PCR(rt-PCR) 、又は免疫学的アッセイ
により確かめられ得る。APP コード配列を含み、そして
／又は発現する宿主細胞は、当業界において良く知られ
ている次の少なくとも４種の一般的アプローチのいづれ
かにより同定され得る：（ｉ）DNA-DNA ，DNA-RNA 又は
RNA −アンチセンスRNA ハイブリダイゼーション；（i
i）“マーカー”遺伝子機能の存在の検出；（iii ）宿
主細胞におけるAPP −特異的mRNA転写体の発現により測
定されるような転写のレベルの評価；及び（iv）たとえ
ばイムノアッセイにより測定されるような成熟APP タン
パク質生成物の存在の検出。
【０１２３】５．４．３．組換えポリペプチドの発現 APP コード配列が適切な宿主細胞中に安定して導入され
ると、形質転換された宿主細胞はクローン的に増殖し、
そしてその得られる細胞がAPP タンパク質の最大生成の
助けとなる条件下で増殖せしめられる。そのような条件
は、典型的には、そのような細胞を高密度に増殖するこ
とを包含する。発現ベクターが誘発性プロモーターを含
む場合、適切な誘発条件、たとえば温度シフト、栄養物
の消耗、無償性誘発物質（たとえば炭水化物の類似体、
たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド(IPTG)）の添加、過剰の代謝副生成物の蓄積、又は同
様のことが、発現を誘発するために、必要により使用さ
れる。
【０１２４】組換え的に発現されたAPP タンパク質が宿
主細胞の内部に保持される場合、細胞は収穫され、そし
て溶解され、そしてAPP タンパク質がその溶解物から、
タンパク質分解を最小にするために当業界において知ら
れている抽出条件；たとえば４℃で、又はプロテアーゼ
インヒビターの存在下で、又は両者の存在下で、実質的
に精製され、又は単離される。組換え的に発現されたAP
P タンパク質が宿主細胞から分泌される場合、消耗され
た栄養培地が単純に集められ、そしてAPP ポリペプチド
がそれから実質的に精製され、そして単離される。
【０１２５】組換え的に発現されたAPP タンパク質は、
標準の方法、たとえば次の方法のいづれかの組合せを用
いて、細胞溶解物又は培養培地から部分的又は実質的に
精製され又は単離され得る：硫酸アンモニウム沈殿、サ
イズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、密度
遠心分離、及びアフィニティークロマトグラフィー。本
発明のAPP ポリペプチドの高まる純度は、たとえばサイ
ズ、又はAPP ポリペプチドに対して特異的な抗体との反
応性に基づいて、又は融合標識の存在により決定され得
る。
【０１２６】本発明の実施に、たとえばワクチン組成物
への使用のためには、APP タンパク質は、培養流体中に
分泌されるような精製されていない状態で、又は宿主細
胞又は細胞溶解物に存在するものとして、又は実質的に
精製された又は単離された形で使用され得る。本明細書
において使用される場合、APP タンパク質は“実質的に
精製され”、ここで前記タンパク質は、特定の調製物に
おけるタンパク質の約２０％重量％以上を構成する。ま
た、本明細書において使用される場合、APP タンパク質
は“単離され”、ここで前記タンパク質は特定の調製物
におけるタンパク質の少なくとも約８０重量％を構成す
る。
【０１２７】従って、本発明は、本発明のAPP タンパク
質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合
タンパク質の調製方法を提供し、ここで前記方法は、組
換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養
し、ここで前記組換え発現ベクターは、次のものをコー
ドするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド
分子を含んで成り：（ａ）生来のシグナル配列を伴っ
て、又は伴わないで、配列番号２，４，６，８又は１０
のアミノ酸配列を含んで成るAPP タンパク質；又は
（ｂ）前記（ａ）のAPP タンパク質に対して相同である
ポリペプチド；あるいは（ｃ）前記（ａ）のAPP タンパ
ク質、又は（ｂ）の相同ポリペプチドのペプチドフラグ
メント；あるいは（ｄ）融合パートナーに融合された、
（ａ）のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ポリペプチド、
又は（ｃ）のペプチドフラグメント、を含んで成る融合
タンパク質；前記ポリヌクレオチド分子は、APP タンパ
ク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融
合タンパク質の生成の助けとなる条件下で、宿主細胞に
おけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する１又は複
数の調節要素と作用可能に関連して存在し；そして前記
細胞培養物からAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペ
プチドフラグメント又は融合タンパク質を回収すること
を含んで成る。
【０１２８】本発明のAPP タンパク質が十分な純度で得
られると、それは標準の方法、たとえばSDS-PAGE、サイ
ズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、血清学
的反応性、等により特徴づけられ得る。APP タンパク質
のアミノ酸配列は、標準のペプチド配列決定技法を用い
て決定され得る。APP タンパク質はさらに、親水性分析
（たとえば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 78 : 3824を参照のこと）、又は類似ソフ
トウェアアルゴリズムを用いて、特徴づけられ、疏水性
及び親水性領域が同定され得る。
【０１２９】構造分析は、特定の二次構造を仮定するAP
P タンパク質の領域を同定するために実施され得る。生
物物理学的方法、たとえばＸ−線結晶学（Engstram, 19
74,Biochem. Exp. Biol. 11 : 7-13)、コンピューター
モデリング（Fletterick andZoller (eds.), 1986, Cur
rent Communications in Molecular Biology, ColdSpri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 、核
磁気共鳴(NMR）及び質量分光学がまた、タンパク質を特
徴づけるために使用され得る。それらの研究から得られ
る情報は、たとえばより効果的なワクチン組成物を企画
するために、又はAPP タンパク質の特定部分のみを含ん
で成るワクチンを選択するために使用され得る。
【０１３０】本発明の実施において有用であるAPP タン
パク質は、（ａ）免疫原性であり、すなわちブタに投与
される場合、APP に対する保護応答を単独で誘発するこ
とができ、又はその誘発に、他のAPP タンパク質又は他
のAPP −関連抗原と組合して寄与することができ；ある
いは（ｂ）哺乳類種のメンバーに投与される場合、抗−
APP 抗体の生成を誘発することができ；あるいは（ｃ）
APP による感染、又は本発明のワクチンによる予防接種
に起因するブタからの血液又は血清サンプルにおける抗
−APP 抗体の存在を検出するために診断用試薬として使
用され得るポリペプチドである。
【０１３１】そのようなタンパク質は、調製されると、
当業界において知られている通常のスクリーニング方法
を用いて同定され得る。たとえば、APP に対する係免疫
応答を誘発し、又はその誘発に寄与する能力は、ブタに
APP タンパク質を単独で、又は他のAPP タンパク質又は
他のAPP −関連抗原と組合して投与し、そしてAPP −中
和抗体のその得られる誘発について、又は予防接種され
ていない対照に比較して、APP による続く攻撃を耐える
予防接種された動物のその得られる能力について試験す
ることによって同定され得る。
【０１３２】APP −特異的抗体の生成を誘発する能力
は、モデル動物、たとえばマウス、ブタ、羊、ヤギ、
馬、牛、等にAPP タンパク質を投与し、そして標準の技
法を用いて、APP −特異的抗体の存在について動物の血
清を試験することによって同定され得る。診断用試薬と
してAPP タンパク質を使用する能力は、APP により前に
又は現在、感染されているか、又は本発明のワクチンに
より前もって予防接種されている動物の血液又は血清サ
ンプルにAPP タンパク質を暴露し、そして前記サンプル
からのAPP タンパク質又はAPP −特異的抗体への結合性
を、標準の技法、たとえばELISA アッセイを用いて検出
することによって、決定され得る。
【０１３３】５．５．APP ワクチン 本発明は、次の１又は複数の成分の免疫学的有効量：
（ａ）その生来のシグナル配列を伴って、又は伴わない
で、配列番号２，４，６，８又は１０から成る群から選
択されたアミノ酸配列を含んで成るAPP タンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のAPP タンパク質に対して相同である
ポリペプチド；（ｃ）前記（ａ）のAPP タンパク質の副
配列又は（ｂ）の相同ポリペプチドから成るペプチドフ
ラグメント；（ｄ）融合パートナーに融合された、
（ａ）のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ポリペプチド、
又は（ｃ）のペプチドフラグメント；（ｅ）前記（ａ）
のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ポリペプチド、（ｃ）
のペプチドフラグメント、又は（ｄ）の融合タンパク質
の類似体又は誘導体；あるいは（ｆ）前記（ａ）のAPP
タンパク質、（ｂ）の相同ペプチド、（ｃ）のペプチド
フラグメント、（ｄ）の融合タンパク質又は（ｅ）の類
似体又は誘導体；ここで前記APP タンパク質、相同ポリ
ペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類
似体、誘導体又はポリヌクレオチド分子は、ブタにおい
てAPP に対しての保護応答を、単独で、又は１又は複数
の他のそのような抗原と組合わせて、誘発し、又はその
誘発に寄与することができ；及び獣医学的に許容できる
キャリヤーを含んで成る、APP に対してブタを保護する
ためのワクチンを提供する。本明細書において使用され
る場合、用語“免疫学的有効量”とは、１回の投与の後
又は複数回の投与の後、APP の１又は複数の血清型に対
してのブタにおける保護免疫応答を誘発することがで
き、又はその誘発に寄与することができるその抗原の量
を意味する。
【０１３４】用語“保護免疫応答を誘発することができ
る”とは、APP に対して予防接種された動物を保護する
よう作用する予防接種に応答してブタにおけるいづれか
の免疫に基づく応答、たとえば抗体又は細胞介在性免疫
応答を誘発し、又は高めるために本明細書において広く
使用される。用語“保護免疫応答”、“保護する”、及
び同様のものは、本明細書において使用される場合、AP
P −関連のブタ肺炎の絶対的な予防又はAPP によるブタ
の感染の絶対的な予防に限定されるものではなく、しか
し病原体による感染の程度又は速度のいづれかの低下、
又は疾病の重症度又は病原体による感染に起因するいづ
れかの徴候又は症状のいづれかの低下、たとえば肺病理
学におけるいづれかの検出できる低下を、予防接種され
ていない、感染された対照動物において生じる症状に比
較して言及することを意図する。
【０１３５】本発明のワクチン組成物は、標準の緩衝
液、キャリヤー、安定剤、希釈剤、保存剤及び溶解剤を
用いて、許容された慣例に従って配合され得、そしてま
た、持効性を促進するためにも配合され得る。希釈剤
は、水、塩溶液、デキストロース、エタノール、グリセ
ロール及び同様のものを包含することができる。等張性
のための添加剤は、中でも塩化ナトリウム、デキストロ
ース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを
包含することができる。安定剤は、中でも、アルブミン
を包含する。
【０１３６】アジュバントは任意には、ワクチンに使用
され得る。アジュバントの非制限的例は、RIBIアジュバ
ントシステム(Ribi Inc.）、みょうばん、水酸化アルミ
ニウムゲル、水中油エマルジョン、油中水エマルジョ
ン、たとえばフロイント完全及び不完全アジュバント、
ブロックコポリマー(CytRx, Atlanta GA) 、SFA-M(Chir
on, Emeryville CA)、AMPHIGEN登録商標アジュバント、
サポニン、QuilA, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cam
bridge MA)、又は他のサポニン画分、SEAM-1、モノホス
ホリル脂質Ａ、アビリジン脂質−アミンアジュバント、
Ｅ．コリ（組換え体又は他）からの熱不安定性エンテロ
トキシン、コレラトキシン、又はムラミルジペプチドを
包含する。ワクチンはさらに、１又は複数の免疫調節
剤、たとえばインターロイキン、インターフェロン、又
は他のサイトカインを含むことができる。
【０１３７】適切な獣医学的に許容できるワクチンビー
クル、キャリヤー、及び添加剤は、知られており、又は
当業者に明らかであろう。たとえば、Remnington's Pha
rmaceutical Science, 18th Ed., 1990, Mack Publishi
ng（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
ワクチンは、溶液で、又は他方では、投与の前、無菌希
釈剤溶液により再構成され得る凍結乾燥された形で貯蔵
され得る。
【０１３８】本発明はさらに、抗原の持効性開放のため
のワクチン配合物を提供する。そのような持効性開放配
合物の例は、生物適合性ポリマー、たとえばポリ（乳
酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロ
ース、ヒアルロン酸、コラーゲン及び同様のものの複合
材料と組合しての抗原を包含する。薬物供給ビークルに
おける分解性ポリマーの構造、選択及び使用は、いくつ
かの出版物、たとえばA.Domb など., 1992, Polymers f
or Advanced Technologies 3 : 279-292 （引用により
本明細書に組込まれる）に再考されている。
【０１３９】医薬製剤におけるポリマーの選択及び使用
についての追加の手引きは、M. Chasin and R. Langer
(eds.), 1990, “Biodegradable Polymers as Drug Deb
ivery Systems ”, Drugs and the Pharmaceutical Sci
ence, Vol. 45, M. Dekker,NY（これもまた、引用によ
り本明細書に組込まれる）によるテキストに見出され得
る。他方では、又はさらに、抗原は、投与性及び効能を
改良するためにマイクロカプセル封入され得る。抗原を
マイクロカプセル封入するための方法は、当業界におい
て良く知られており、そして中でも、アメリカ特許第3,
137,631 号；第3,959,457 号；第4,205,060 号；第4,60
6,940 号；第4,744,933 号；第5,132,117 号；国際特許
公開WO95/28227（それらのすべては、引用により本明細
書に組込まれる）に記載される技法を包含する。
【０１４０】リポソーム及びリポソーム誘導体（たとえ
ば蝸牛状物（cochleate)、小胞(vesicles)がまた、抗原
の持効性を提供するために使用され得る。リポソーム配
合物をいかにして製造し、そして使用するかに関する詳
細は、中でも、アメリカ特許第4,016,100 号；第4,452,
747 号；第4,921,706 号；第4,927,637 号；第4,944,94
8 号；第5,008,050 号；及び第5,007,956 号（それらの
すべては、引用により本明細書に組込まれる）に見出さ
れ得る。
【０１４１】非制限的な態様においては、本発明のワク
チンは、APP 、及び任意には、ブタを苦しめる１又は複
数の他の疾病又は病理学的状態に対してブタを保護する
ための組合せワクチンであり得、ここで前記組合せワク
チンは、ブタにおいてAPP に対して保護応答を誘発する
ことができ、又はその誘発に寄与することができる本発
明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラ
グメント、融合タンパク質、類似体、誘導体又はポリヌ
クレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有
効量の本発明の抗原を含んで成る第１成分；ブタを苦し
める疾病又は病理学的状態に対しての保護応答を誘発す
ることができ、又はその誘発に寄与することができる、
第１成分における抗原とは異なる、免疫学的有効量の抗
原を含んで成る第２成分；及び獣医学的に許容できるキ
ャリヤー又は希釈剤を含んで成る。
【０１４２】組合せワクチンの第２成分は、APP 、又は
当業界において知られているように、ブタを苦しめる他
の病原体、疾病、又は病理学的状態に対する保護応答を
誘発し、又はその誘発に寄与するその能力に基づいて選
択される。ブタのためのワクチン組成物において有用で
あることが現在知られているか、又は未来において決定
されるべきいづれかの免疫原性組成物がその組合せワク
チンの第２成分に使用され得る。
【０１４３】そのような免疫原性組成物は、アクチノバ
チルス・スイス(Actinobacillus suis) 、パステウレラ
・ムルトシダ(Pasteurella multocida) 、サルモネラ・
コレラスイス(Salmonella cholerosuis)、ストレプトコ
ーカス・スイス(Streptococcus suis)、エリシペロスリ
ックス・ルシオパチアエ(Erysipelothrix rhusipathia
e）、レプトスピラ sp.(Leptospira sp.)、スタフィロ
コーカス・ヒカス(Staphylococcus hyicus) 、ハエモフ
ィラス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ボルデテ
ラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica) 、
マイコプラズマ・ハイプネウモ・ニアエ(Mycoplasma hy
opneumoniae)、ラウソニア・イントラセルラリス(Lawso
nia intracellularis)、エスシュリシア・コリ(Escheri
chia coli)、ブタ生殖及び呼吸症候群ウィルス、ブタ、
インフルエンザウィルス、感染性胃腸炎ウィルス、脳心
筋炎ウィルス、コロナウィルス、仮性狂犬病ウィルス、
及びサーコウィルス(circovirus)に対して保護性を提供
するものを包含するが、但しそれらだけには限定されな
い。非制限的な例においては、その組合せワクチンは、
本発明の１又は複数のAPP タンパク質を含む成分、及び
１又は複数の他APP 細菌成分、たとえばAPXI, APXII 及
びOmlAの組合せを含んで成る。
【０１４４】第２成分を含んで成る抗原は、任意には、
キメラ分子を生成するために、第１成分の抗原に共有結
合され得る。非制限的態様においては、第２成分の抗原
は、ハプテンを含んで成り、その免疫原性は、第１成分
の抗原への接合により検出できるほどに高められる。組
合せワクチンの第１及び第２成分の共有結合される抗原
を含んで成るキメラ分子は、当業界において知られてい
る１又は複数の技法を用いて合成され得る。
【０１４５】たとえば、キメラ分子は、標準の化学的合
成方法を利用して、市販のペプチド合成機を用いて合成
的に生成され得る（たとえば、Merrifield, 1985, Scie
nce232 : 341-347 を参照のこと）。他方では、別の抗
原が別々に合成され、そして次に、当業界において知ら
れているように、化学結合基により一緒に連結され得
る。他方では、キメラ分子は組換えDNA 技法を用いて生
成され得、それにより、たとえばキメラ分子の異なった
抗原をコードする配列を有する別のポリヌクレオチド分
子が一緒にスプライシングされ、そしてキメラ融合ポリ
ペプチドの続く単離のために、適切な形質転換された宿
主細胞において発現される。
【０１４６】本発明のワクチンがポリペプチドよりもむ
しろポリヌクレオチド分子を含む場合、そのスプライシ
ングされたポリヌクレオチド分子はワクチン組成物にそ
れ自体使用され得る。そのような組換え技法を実施する
ための十分な手引きは、中でも、Maniatisなど., 1989
、上記；Ausubel など., 1989 、上記；Sambrookな
ど., 1989 、上記；Innis など., 1995 、上記；及びEr
lich, 1992、上記に提供される。
【０１４７】本発明はさらに、APP に対してブタを保護
するためのワクチンの調製方法を提供し、ここで前記方
法は、ブタにおいてAPP に対する保護応答を誘発するこ
とができ、又はその誘発に寄与することができる本発明
のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグ
メント、融合タンパク質、類似体、誘導体又はポリヌク
レオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効
量の本発明の１又は複数の抗原と、獣医学的に許容でき
るキャリヤー又は希釈剤とを、ブタへの投与のために適
切な形で組合すことを含んで成る。
【０１４８】本発明はさらに、ブタへの本発明のワクチ
ンを投与することを含んで成る、APP に対してブタを予
防接種する方法を提供する。投与される抗原の量は、予
防接種される動物の年齢、体重、健康及び一般的な物理
的特徴のような要因、及び投与される特定のワクチン組
成物に依存する。個々のパラメーターのための最適な用
量の決定は、経験的研究の観点から通常の方法を用いて
行なわれ得る。投与されるAPP タンパク質の量は、約
０．１μｇ〜約１０mg、より好ましくは約１０μｇ〜約
１mg、及び最とも好ましくは約２５μｇ〜約０．１mgの
ポリペプチドであろう。DNA ワクチンに関しては、ポリ
ヌクレオチド分子の量は、好ましくは約０．０５μｇ〜
約５００mg、より好ましくは約０．５μｇ〜約５０mgの
範囲であろう。さらに、ワクチンの典型的な用量は、約
０．５ml〜約５ml／用量／動物の範囲であろう。
【０１４９】動物はいづれか適切な時期、たとえば生後
１週間以内で、又は乳離れの時期で、又は交配の直前又
はその時期で、又はAPP 感染が動物集団の１又は複数の
メンバーに最初に出現し始める時期で予防接種され得
る。補充の投与、又は追加免疫は、十分な保護を達成す
るために必要とされ得る。適切な免疫保護が動物におい
て達成されているかどうかを決定するための方法は、当
業界において良く知られており、そしてたとえばセロコ
ンバージョンの決定を包含する。ワクチンは、いづれか
適切な経路、たとえば経口、鼻腔内、筋肉内、リンパ節
内、経皮内、腹腔内、皮下、直腸又は膣内投与により、
又はそれらの経路の組合せにより投与され得る。当業者
は、選択される経路に従ってワクチン組成物を容易に配
合することができるであろう。
【０１５０】本発明はさらに、APP により引き起こされ
る感染又は疾病に対してブタを予防接種するためのワク
チン用キットを提供し、ここで前記キット、ブタにおい
てAPP に対する保護応答を誘発でき、又はその誘発に寄
与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリ
ペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類
似体、誘導体又はポリヌクレオチド分子から成る群から
選択された、免疫学的有効量の１又は複数の本発明の抗
原を含んで成る第１容器を含んで成る。前記キットは任
意には、獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を
含んで成る第２容器をさらに含むことができる。ワクチ
ン組成物は、溶液で、又は第２容器のキャリヤー又は希
釈剤を用いて再構成されるべき凍結乾燥された形で第１
容器において貯蔵され得る。
【０１５１】５．６．抗−APP 抗体 本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質に結合する単
離された抗体を提供する。そのような抗体は、種々の目
的のために、たとえばAPP タンパク質を精製するための
親和性試薬として、又はたとえばELISA 又はウェスター
ンブロットアッセイの使用により、APP −感染された動
物から集められた細胞、組織又は流体サンプルにおける
APP タンパク質の存在を検出するために、又はAPP 感染
を予防し、制御し、又は処理するための治療剤として有
用である。
【０１５２】本発明のAPP タンパク質に対する抗体は、
本発明の適切な抗原を、ブタ、牛、馬、ウサギ、ヤギ、
羊、及びマウスから選択された宿主動物に投与すること
によって、既知方法に従って生ぜしめられ得る。種々の
アジュバント、たとえば上記に記載されるアジュバント
が、抗体生成を増強するために使用され得る。本発明の
抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいづ
れかであり得る。ポリクローナル抗体は、免疫化された
動物の血清から調製され、そして単離され、そして標準
の技法を用いて、抗−APP タンパク質特異性について試
験され得る。
【０１５３】他方では、APP タンパク質に対するモノク
ローナル抗体は、培養における連続した細胞系による抗
体分子の生成を提供するいづれかの技法を用いて、調製
され、そして単離され得る。それらは、Kohler and Mil
stein(Nature, 1975, 256 :495-497)により最初に記載
されるハイブリドーマ技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドー
マ技法（Koskorなど., 1983, Immunology Today 4 : 72
; Cote など., 1983,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80
: 2026-2030)；及びEBV −ハイブリドーマ技法（Cole
など., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) を包含するが、
但しそれらだけには限定されない。他方では、一本鎖抗
体の生成について記載する技法（たとえば、アメリカ特
許第4,946,778 号を参照のこと）が、APP タンパク質−
特異的一本鎖抗体を生成するために適合され得る。
【０１５４】本発明のAPP タンパク質のための特異的結
合部位を含む抗体フラグメントもまた、本発明の範囲内
に包含される。そのようなフラグメントは、損なわれて
いない抗体分子のペプシン消化により生成され得るF(a
b')2 フラグメント、及びF(ab')2 フラグメントのジス
ルフィド橋を還元することによって生成され得るFab フ
ラグメントを包含するが、但し、それらだけには限定さ
れない。他方では、Fab及び／又はscFv発現ライブラリ
ーが、本発明のAPP タンパク質に対する所望する特異性
を有するフラグメントの急速な同定を可能にするために
構成され得る（たとえば、Huseなど., 1989, Science 2
46 : 1275-1281を参照のこと）。
【０１５５】モノクローナル抗体及び抗体フラグメント
の生成及び単離のための技法は、当業界においてよく知
られており、そして中でも次の文献にさらに記載され
る：Harlow and Lane, 1988, Antibodies : A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory、及び in
J.W. Goding, 1986, Monoclonal Antlbodies : Princip
ies and Practice, Academic Press, London。上記引用
されるすべての出版物は、引用により本明細書中に組込
まれる。
【０１５６】５．７．診断用キット 本発明はさらに、診断用キットを提供する。非制限的態
様においては、本発明の診断キットは、APP タンパク質
に対して向けられた抗体に対して特異的に結合すること
ができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、
ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、又は
誘導体を含んで成る第１容器；及びブタ抗体に対して向
けられた第２抗体を含んで成る第２容器を含んで成る。
第２抗体は好ましくは、検出できるラベルを含んで成
る。そのような診断キットは、APPにより現在感染され
ているか、又はすでに感染されたことがあるか、又は本
発明のワクチンによる予防接種の結果としてセロコンバ
ートされているブタを検出するために有用である。
【０１５７】もう１つの態様においては、本発明は、AP
P タンパク質に対して結合する第一抗体を含んで成る第
１容器；及びAPP タンパク質上の異なったエピトープに
結合し、又は前記一次抗体に対して向けられる第二抗体
を含んで成る第２容器を含んで成る診断用キットを提供
する。第二抗体は好ましくは、検出できるラベルを含ん
で成る。他の態様においては、診断用キットは、APP −
特異的ポリヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズ
するか、又はそれを増幅することができる本発明のポリ
ヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子を含んで
成る容器を含んで成る。それらの後者の２種の診断用キ
ットは、APP により現在、感染されているブタを検出す
るために有用である。
【０１５８】５．８．アンチセンスオリゴヌクレオチド
及びリボザイム 本発明はさらに、APP タンパク質コードのmRNAに結合
し、分解し、そして／又は阻害する。アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド、ホスホロチオエート、及びリボザイム
を包含するオリゴヌクレオチド分子を提供する。アンチ
センスRNA 分子及びアンチセンスDNA 分子を包含するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化されたmRNAに
結合することによってmRNAの翻訳を直接的に阻止するよ
う作用し、そしてそれにより、タンパク質翻訳を妨げ
る。たとえば、少なくとも約１５個の、及びAPP タンパ
ク質をコードするmRNA転写体配列のユニーク領域に対し
て相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、たとえ
ば従来のホスホジエステル技法により合成され得る。
【０１５９】リボザイムは、RNA の特定の分解を触媒す
ることができる酵素性RNA 分子である。リボザイム作用
の機構は、相補的標的RNA へのリボザイム分子の配列特
異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレオチド
分解性切断を包含する。APPタンパク質mRNA配列のエン
ドヌクレオチド分解性切断を特異的且つ効果的に触媒す
る構築されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は
また、本発明の範囲内である。
【０１６０】いづれかの可能性あるRNA 標的物内の特定
のリボザイム切断部位は、最初に、次の配列：GUA, GUU
及びGUC を包含するリボザイム切断部位のための標的分
子を走査することによって同定される。同定されると、
切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２
０個のリボヌクレオチドの短いDNA 配列が、オリゴヌク
レオチド配列を不適切にする予測される構造特徴、たと
えば二次構造のために評価され得る。候補体標的物の適
合性がまた、たとえばリボヌクレアーゼ保護アッセイを
用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼ
ーションへのそれらの接近性を試験することによっても
評価され得る。
【０１６１】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
及びリボザイムの両者は、既知の方法により調製され得
る。それらは、化学合成、たとえば固相ホスホラミジッ
ト化合合成のための技法を包含する。他方では、アンチ
センスRNA 分子は、RNA 分子をコードするDNA 配列のイ
ンビトロ又はインビボ転写により生成され得る。そのよ
うなDNA 配列は、適切なRNA ポリメラーゼプロモータ
ー、たとえばＴ７又はSP6 ポリメラーゼプロモーターを
組込む広範囲の種類のベクター中に組込まれ得る。
【０１６２】本発明のオリゴヌクレオチドに対する種々
の修飾が、細胞内安定性及び半減期を高める手段として
導入され得る。可能な修飾は、分子の５’及び／又は
３’末端へのフランキング配列、又はリボヌクレオチド
又はデオキシリボヌクレオチドの付加、又はオリゴヌク
レオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりもむし
ろホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用を包
含するが、但しそれらだけには限定されない。次の例
は、例示的であって、本発明の範囲を限定するものでは
ない。
【０１６３】
【実施例】６．例：新規APP タンパク質の同定 次の実験の結果は、APP 血清型−５により前に攻撃され
たブタがAPP 血清型−７により異種的に再攻撃された場
合に誘発される局部抗体応答の特異性を示す。抗体特異
性は、これまで認識されていないAPP タンパク質を同定
するために使用され、それらのタンパク質のうち３種
（Omp20, OmpW, Omp27）が、すべての１２種のAPP 血清
型に存在することが、ウェスターンブロット分析により
示された。２種の追加の新規タンパク質（OmpA1, OmpA
2）が、タンパク質画分単離及び濃縮に従って同定され
た（下記、セクション６．１．６．を参照のこと）。
【０１６４】６．１．材料及び方法 ６．１．１．細菌攻撃 ブタ攻撃材料を調製するために使用されるAPP 血清型−
５培養物（株K-17）を、Dr. R.A. Schulz, Avaca, IA,
USA から得た。ブタ攻撃材料を調製するために使用され
るAPP 血清型−７培養物（株WF-83 ）を、Dr. E. Jone
s, Swedeland, PA, USAから得た。
【０１６５】臨床学的に健康な生後７〜８週目の接種の
ブタを、APP 感染のこれまでの病歴を有さないネバラス
カ州のブタから得、そしてIACUC ガイドラインに従っ
て、Pfizer Animal Health, Lincoln, NE での分離用施
設に収容した。動物は、研究の開始の前、それらの健康
状態を決定するために獣医により試験された。２週間の
順化に続いて、約１ml／５０ポンド体重の割合で投与さ
れる、１００mg／mlのテラゾール、５０mg／mlのキシラ
ジン及び５０mg／mlのカテミンの組合せを用いて、ブタ
に麻酔をし、そして２．６×１０6 cfu のAPP 血清型−
５を鼻腔内接種した。
【０１６６】一次攻撃の後７８日で、臨床学的APP 疾病
を示したが、しかし回復した生存するブタの６匹に対し
て、再び上記のように麻酔をした。それらの６匹のブタ
の第１及び第２のブタを、１×１０7 cfu のAPP 血清型
−５により鼻腔内再攻撃し、（同種再攻撃）；それらの
ブタの第３及び第４のブタを、１×１０6 cfu のAPP血
清型−７により鼻腔内再攻撃し、（異種再攻撃）；そし
て第５及び第６のブタを、細菌増殖培地のみ（対照）に
より鼻腔内接種した。
【０１６７】すべてのブタを、再攻撃の４８時間後に殺
害し、それらの血清及び器官を集め、そして器官からの
組織片を、下記セクション６．１．２及び６．１．３に
記載のようにして、２４又は４８時間、インビトロで培
養した。組織外植片培養物からの抗体−含有上清液を用
いて、同種再攻撃又は１回の攻撃（対照）により誘発さ
れる記憶抗体プロフィールと異種再攻撃により誘発され
る記憶抗体プロフィールとを比較した。組織外植片によ
りインビトロで生成される抗体の特異性を、すべての１
２種のAPP 血清型を表わす完全な細菌細胞調製物のパネ
ルに対して、ウェスターンブロット分析により決定し
た。この分析は、同種再攻撃又は１回の攻撃（対照）に
続く抗体プロフィールとは異なる、異種再攻撃に続く抗
体プロフィールの存在を示した。
【０１６８】ウェスターンブロットのための材料を調製
するために使用されるAPP 血清型−１（株4074）、血清
型−２（株226 ）、血清型−３（株1421）、血清型−４
（株M62 ）、血清型−５（株K-17）、血清型−６（株Fe
mo FE 171D）、血清型−７（株WF-83 ）、血清型−８
（株405 ）、血清型−９（株CVJ-13261 ）、血清型−１
０（株13039 ）、血清型−１１（株56153 ）及び血清型
−１２（株8329）対照培養物は、Dr. B. Fenwick, Kans
as State University, Manhattan, KS, USA から得られ
た。
【０１６９】６．１．２．組織収集 血清サンプルを、再攻撃の前、及び検死の前（再攻撃の
４８時間後）再びブタから得た。ブタを、静脈内ペイン
トバルビタールの過剰用量により再攻撃の４８時間後、
安楽死せしめた。肺を除き、そしてAPP 感染に寄与する
特徴的な大まかな病巣について試験し、そして完全な肉
眼での試験をすべての主要器官に対して行なった。肺、
リンパ節（腸間膜、膝窩、気管支）、Peyer パッチ及び
扁桃の組織サンプルを集め、７０％エタノールにより洗
浄し、そしてRPMI輸送媒体（１０mMのHEPES ，５％のFB
S, 50U／mlのペニシリン及び５０μｇ／mlのストレプト
マイシンにより補充されたＲＰＭＩ媒体（Gibco/BRL, G
rand Island, NY ））により３度すすいだ。
【０１７０】洗浄の後、組織を、１０mlの輸送媒体を含
む５０mlの遠心分離管に入れ、そして実験において処理
されるまで氷上に配置した（収集の３時間以内）。追加
の組織サンプルを、後でのmRNA単離及び免疫組織化学の
ために、液体窒素において凍結し、又は組織病理学のた
めにホルスリンに固定した。肺組織のサンプルをまた、
細菌同定のために、University of Nebraska-Lincoln診
断実験室に提出した。
【０１７１】６．１．３．組織外植片培養物 組織を、約５mlの輸送媒体を含む個々のペトリ皿に配置
した。約２×２mmの小さな組織片を、解剖用メス及び／
又はハサミによりオリジナルサンプルから切断し、そし
て２mlの洗浄媒体（１０mMのHEPES 及び及び50μg/mlの
ゲンタマイシンにより補充された、Ｃａ2+及びＭｇ2+を
含まないハンクス溶液（HBSS))を含む１２−又は２４−
ウェルプレート（Costar, Cabridge, MA）の個々のウェ
ルに配置した。組織片を洗浄媒体によりすすぎ、そして
洗浄媒体を含むもう１つのウェルに移した。
【０１７２】この洗浄／すすぎ操作を４度くり返し、そ
して次に、組織片を、１０％のFBS，１０mMのHEPES ，
２mMのグルタミン、５０μｇ／mlのゲンタマイシン、６
２μｇ／mlのアンホテリシンＢ、４０μｇ／mlのナトリ
ウムデノキシコレート、５０Ｕ／mlのペニシリン及び５
０μｇ／mlのストレプトマイシンにより補充されたRPMI
培地を含むウェルに移した。プレートを、５％ CO2の湿
潤されたチャンバーにおいて、３８．５℃で２４又は４
８時間インキュベートした。
【０１７３】６．１．４．ウェスターンブロット分析 組織外植片上清液における回収された抗体の特異性を、
次のようにしてウェスターンブロットにより試験した。
12APP 血清型の個々の代表的な単離物をそれぞれ別々に
増殖し、上清液を試験するために完全な細菌細胞抗原を
生成した。個々の株を、１０μｇ／mlのβ−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（β−NAD）により補充さ
れた最少培地−３（ＭＭ３）（１．８％のBacterin HP
媒体、１．７％の乳酸、０．３％のグリセロール、0.05
M のHEPES, 0.011M のＬ−グルタミン酸（−ナトリウム
塩）、5 ×10-5M のニコチンアミド及び０．２％のカサ
ミノ酸）において、３７℃で５〜６時間、約０．５〜
０．６のＯＤ560 まで、１８０rpm で撹拌しながら培養
した（１％の種子）。
【０１７４】細胞を12,000×g での１０分間の遠心分離
によりペレット化し、培地を分析のために除去し、そし
てペレットを５mlのダルベッコリン酸緩衝溶液（DPBS）
に再懸濁した。タンパク質アッセイの前、その再懸濁さ
れたペレットを−２０℃で凍結し、そして次に、融解
し、いづれかの損なわれていない細菌細胞を溶菌した。
個々の分離物のタンパク質濃度を、BCA Protein Assay
Reagent Kit(Pierce, Rockford, IL）を用いて決定し
た。APP 抗原調製物（５μｇ／レーン）を、４〜２０％
のトリス−グリシンゲル（Novex, San Diego, CA）上に
負荷し、そしてタンパク質を、室温で、２０mAの一定の
電流を用いて、電気泳動により分離した。
【０１７５】分離されたタンパク質を、単一乾燥グラッ
ファイトエレクトロブロッター（Milliblot, Millipor
e, Seattle, WA ）を用いて、ProBlot TM膜（Applied B
iosystems, Foster City, CA ）に移した。移行は、室
温で３０分間、２００mAの一定電流を用いて実施され
た。移行の完結後、膜を、緩衝液Ａ（５０mMのトリスHC
l，１５０mMのNaCl，pH７．４、及び５％（ｗ／ｖ）の
脱脂粉乳）と共に室温で一晩インキュベートすることに
よってブロックした。
【０１７６】次に、そのブロック用緩衝液をデカント
し、そして緩衝液Ａ中、血清（１：１００の希釈度）又
は組織外植片培養上清液（１：３の希釈度）により置換
し、そして膜を室温で１時間、インキュベートし、続い
て、緩衝液Ｂ（０．２％（ｖ／ｖ）のTriton X-100を含
む緩衝液Ａ）により１０分間の洗浄及び緩衝液Ａにより
２回の１０分間の洗浄を行なった。洗浄の完結後、膜
を、緩衝液Ａにより１：１０００に希釈された、ホスフ
ァターゼ接合されたヤギ抗−ブタ抗体（Kirkegaard& Pe
rry Laboratories, Gaithersburg, MD ）と共に室温で
１時間インキュベートした。次に、膜を緩衝液Ａにより
１０分間、洗浄し、そして５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリ
ウム（BCIP/NBT）基質系（Kirkegaad & Perry Laborato
ries）と共に１５分間インキュベートした。
【０１７７】６．１．５．APP 血清型−７膜の調製 APP 血清型−７のアリコートを、10μg/mlのβ-NADによ
り補充されたMM３中に接種し（１％）、そして３７℃で
一晩培養した（180rpm）。一晩の培養物の一部を、新鮮
な培地中に接種し（細菌接種物は合計体積の３％であっ
た）、そして５〜６時間、又は247Klett単位の培養物密
度までインキュベートした。細胞を、4,500rpmで４０分
間、１０℃での遠心分離によりペレット化し、上清液を
除去し、そしてペレットを、５０mMのトリス−HCl(pH8.
0)5ml 及び１mMのPMSF（フェニルメチルスルホニルフル
オリド）の最終濃度をもたらすために十分なPMSFと共に
５０mMのトリス−HCl(pH8.0)5 mlに再懸濁した。
【０１７８】細菌細胞を、40K PSI 圧力セルにおいて1
6,000ポンド／インチ2 下でFrench Press(Sim Aminco.,
Rochester, NY)を用いて溶菌した。破壊された細胞を
1,000×g で１５分間、遠心分離し、大きな細菌残骸を
除去した。全粗膜を、45,000rpm で６０分間、１８℃で
の遠心分離により集めた。上清液を捨て、ペレットを５
０mMのトリス−HCl(pH8.0)に再懸濁し、そしてタンパク
質をBradford StandardProtein Assay を用いて決定し
た。
【０１７９】３mlの体積における１５mgの粗膜に、１０
０mMのPMSF30μl 及び2.5 ％サルコシル（sarkosyl）７
５０μｌを添加し、そして全体積を十分に混合した。氷
上での３０分間のインキュベーションの後、膜を、２０
０，０００×ｇで１５分間、１０℃での遠心分離により
ペレット化した。上清液を、ペレット化された膜画分か
ら除去し、そしてペレットを５０mMのトリス−HCl ／１
００mMのNaCl（pH８．０）溶液３mlに再懸濁した。APP
血清型−７の膜抗原を表わしたこの膜調製物を、−２０
℃で貯蔵した。
【０１８０】６．１．６．膜タンパク質分別及び精製 Ｎ−末端配列決定のためのAPP タンパク質の精製を、Bi
oRad Model 491 PrepCell(BioRad, Richmond, CA ）を
用いて、連続−溶出SDS-PAGEを通して行なった。１０ml
の体積（４．５mgの合計タンパク質）のAPP 血清型−７
膜タンパク質画分を、等体積の非還元性サンプル緩衝液
（１２５mMのトリス−HCl, pH6.8, 4%のSDS, 20%のグリ
セロール、及び０．１％のブロムフェノールブルー）と
共に混合した。このタンパク質−緩衝液混合物を５分
間、煮沸し、そして３％の積重ね用／１５％の分離用Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用した。サンプルを
２０mAの一定電流（初期電圧１７５〜２５０Ｖ、最終電
圧２００〜３００Ｖ）で、７２時間、電気泳動した。
【０１８１】約８００×５mlの画分を、１ml／分の流速
で、その実験を通して集め、そしてＡ260 での分光測光
によりタンパク質含有率について分析した。１０番目ご
との画分を、SDS-PAGE及び銀染色（Bio-Rad, Richmond,
CA ）により分析した。分子量により決定されるよう
に、推定上、同じタンパク質を含む画分をプールし、そ
して４℃で貯蔵した。プールされたサンプルを脱塩し、
そしてＮ−末端配列決定のために濃縮した。脱塩は、プ
ールされたサンプルのアリコートを、１０mlの層体積を
有するPrestoTM脱塩カラム（Pierce, Rockford, IL）に
適用することによって実施された。
【０１８２】個々のタンパク質プールのアリコート３ml
を別々のカラムに適用し、そしてddH2O により溶出し、
１０×２mlの画分を得た。これを、３０mlが脱塩される
まで、個々のタンパク質プールのために１０度くり返し
た。ウェスターンブロット分析により決定される場合、
脱塩されたタンパク質の大部分は、画分No．２に見出さ
れた。従って、個々の１０回の溶出からの第２画分を、
それぞれ個々のタンパク質のためにプールした。得られ
る２０mlのサンプルを凍結乾燥せしめ、そしてＮ−末端
配列決定のために、０．５mlのddH2O に再懸濁した。Ｎ
−末端配列は、Pfizer Central Research Molecular Sc
ience Sequence Facility で得られた。
【０１８３】６．２．結果 ６．２．１．再攻撃後の臨床学的徴候及び病理学的発見 ブタは、同種（血清型−５）又は異種（血清型−７）の
再攻撃の後、臨床学的疾病のいづれの徴候も示さなかっ
た。病理学的試験は、動物が、再攻撃に続く急性APP 感
染と一致する肺病巣を進行しなかったことを確かめた。
しかしながら、血清型−７により再攻撃された動物の気
管支リンパ節は、血清型−５により再攻撃された動物又
は対照動物からのリンパ節に比較して、出血性であり、
そして拡大された。
【０１８４】６．２．２．再攻撃により誘発される抗体
の特異性 血清及び組織外植片上清液に存在する抗体の特異性を、
上記のようにして、ウェスターンブロット分析により評
価した。２４又は４８時間のインキュベーションの後に
集められたすべての組織由来の上清液は、APP タンパク
質を特異的に認識する抗体を含んだ。一般的に、血清型
−５抗原に対する反応性は、血清型−７又は血清型−１
の抗原に対する反応性よりも高かった。しかしながら、
ほとんどの組織由来の上清液の反応性は、血清の反応性
よりも弱く、そしてスペクトルにおいては、狭かった
（図１ａ）。
【０１８５】一般的に、組織外植片上清液の反応性は、
特定のパターンを有さなかった。それにもかかわらず、
１つの特定の動物（No．８０３、血清型−７により異種
的に再攻撃された）からの組織外植片上清液のウェスタ
ーンブロット反応性のパターンは、強く、そしてAPP 血
清型−１，−５、及び−７に存在するいくつかの低分子
量タンパク質を強調した（図１ｂ）。この上清液は、AP
P 血清型−５より始め、攻撃されたブタにおいて、APP
血清型−７による異種再攻撃により誘発される二次（記
憶）抗体応答の交差反応性の程度をさらに特徴づけるた
めに抗体源として使用された。
【０１８６】ブタNo．803 からのBLN 組織外植片上清液
における抗体の交差反応性の程度を、１２種の異なった
APP 血清型の個々から調製された完全な細菌細胞抗原を
用いて、ウェスターンブロット分析により評価した。こ
の分析は、抗体により認識される３種の低分子量タンパ
ク質がすべての１２種の血清型に存在したことを示した
（図２）。このＢＬＮ組織外植片上清液に存在する抗体
はまた、他のタンパク質バンドも認識した。
【０１８７】外毒素ApxII （Nakai, 1983 、上記を参照
のこと）に対応する、血清型−１，２，４，５，６，
７，８及び９に存在する高分子量バンド、及び血清型
２，５，８及び１０に存在するもう１つのタンパク質バ
ンドは、第２の最とも交差反応性のパターンを表わし
た。APP 細胞ペレット及び上清液のウェスターンブロッ
ト分析は、低分子量タンパク質に対する、ＢＬＮ組織外
植片上清液における抗体の反応性が、細胞ペレットに存
在するタンパク質に制限されることを示し（図３）、こ
のことは、そのタンパク質が細菌細胞に関係し、そして
分泌されないことを示す。
【０１８８】６．２．３．交差反応性抗体により認識さ
れるタンパク質 低分子量タンパク質を上記のようにして精製し、次のも
のを用いてウェスターンブロット分析により同定される
ような興味あるタンパク質を含む部分精製された調製物
を生成する：（ａ）分析No．803 からのBLN 組織外植片
上清液；又は（ｂ）ブタNo．803 からの血清（図４）。
膜タンパク質の分別に基づいて、それぞれ約１９〜２
０、約２３、約２７及び約２９kDa の分子量を有する４
種のタンパク質バンドが、この方法を用いて同定され
た。
【０１８９】前記４種のバンドにおけるタンパク質のＮ
−末端配列分析は、下記表１に示されるように、一次配
列及び推定上の残基（括弧内）を示し、そして本明細書
においては、“Pep-1 ”（配列番号１１）、“Pep-2 ”
（配列番号１２）、“Pep-3”（配列番号１３）及び“P
ep-4 ”（配列番号１４）と命名した。時おり、第２シ
グナルが観察され、そしてたぶん、少々の汚染物の存在
によるものであった（データは示されていない）。表１
に示される部分Ｎ−末端配列を用いてプローブ及びプラ
イマーを企画し、交差反応性APP タンパク質をコードす
る一次DNA 配列を得た。配列相同性の比較は、異種再攻
撃の後、誘発される優性の局部抗体応答により認識され
る前記４種のタンパク質がこれまでAPP に関して記載さ
れたことがなかったことを示した。
【０１９０】
【表１】
【０１９１】１：Xaa は、特定位置でのアミノ酸残基が
決定され得なかったことを示す。 ７．例：APP タンパク質をコードするDNA の分子クロー
ニング ７．１．染色体DNA の単核及びゲノムライブラリーの構
成 １２種のAPP 血清型の個々からのゲノムDNA を、ヘキサ
デシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）−プロ
ティナーゼＫ方法（Ausubel など., 1988, Curr. Proto
cols Mol. Biol. Wiley Interscience, NY) 、又はDNA
Isolator Genomic DNA Isolation Reagent（Genosys Bi
otechnologies, Inc., The Woodlands,Texas)のいづれ
かにより、別々に単離した。APP DNA をＴＥ緩衝液（１
０mMのトリス−HCl ，pH８．０，１mMのEDTA）に、１μ
ｇ／ml以下で溶解し、そしてＵＶ分光計により定量化し
た。
【０１９２】Omp20, OmpW, Omp27及びOmpAをコードする
APP 遺伝子配列のクローニングを促進するために、いく
つかのゲノムライブラリーを構成した。それらのライブ
ラリーを、供給者により実質的に推薦されるようにし
て、制限されたDNA フラグメントの５’及び３’末端へ
の既知の配列(Vectorette IITM，Genosys Biotechnolog
ies, Inc., The Woodlands, TX) の連結により特別に修
飾した。従って、Vectoretteライブラリーを、APP7-1
（血清型７、継代１）からの染色体DNA ２μｇを、制限
エンドヌクレアーゼBamHI, BglII, HindIII, EcoRI, Dr
aI、又はHpaIにより３７℃で一晩、別々に消化すること
によって構成した。
【０１９３】次に、反応を、追加の新鮮な制限酵素によ
り封じ、そして２mMのATP ，２mMのDTT に最終濃度を調
節した。Vectorette末端化を、T4 DNAリガーゼ（４００
Ｕ）及び３ｐモルの適切な適合性Vectoretteリンカー
（BamHI Vectorette：BamHI, BglII；HindIII Vectoret
te：HindIII ；EcoRI Vectorette：EcoRI ；ブラントVe
ctorette：DraI, HpaI）の添加により実施した。その混
合物を２０℃で、６０分間、３サイクル、インキュベー
トし；３７℃で３０分間で、その末端化反応を完結し；
そして次に、dH2Oにより２００μｌに調節し、そして−
２０℃で貯蔵した。
【０１９４】７．２．Omp20 の分子クローニング Vectoretteライブラリーのスクリーニングを実施し、Ｏ
ｍｐ２０及びフランキング領域をコードするDNA フラグ
メントを得た。変性オリゴヌクレオチドER49（配列番号
３９）を、このタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列に基
づいて企画した（表１，Pep-1 （配列番号１１），aa1-
9 ）。
【０１９５】Omp20 遺伝子のフラグメントのPCR 増幅の
ために、オリゴヌクレオチドＥＲ４９（配列番号３９）
を、１×PCR 緩衝液II（Perkin Elmer）、１．５mMのMg
Cl2, 200 μM の個々のデオキシ−NTP, 100p モルの個
々のプライマー、及び２．５ＵのAmpliTaq Gold(Perkin
Elmer) 熱安定性ポリメラーゼを含む反応物５０μｌに
おいて、Vectorette特異的プライマーER70（配列番号４
８）と組合して使用した。複数回の単一反応を、DNA 鋳
型としてVectoretteライブラリー５μｌを用いて、実施
した。増幅は次の通りに実施された：変性（９５℃，９
分）；３５サイクルの変性（９５℃，３０秒）；アニー
リング（５５℃，１分）；及び重合（７２℃，３分）；
続いての最終延長（７２℃，７分）。
【０１９６】増幅された生成物を、１．２％アガロース
ゲル（Sigma ）上での分離により可視化した。４３３−
bpの生成物は、EcoRI Vectoretteライブラリーの増幅に
起因した。フラグメントを、pGEM登録商標−T Easy PCR
クローニングベクター（Promega, Madison, WI）中にク
ローン化し、そして配列決定した。配列の分析は、Ｎ−
末端アミノ酸配列（Ｐｅｐ−１）に基づいてOmp20 を部
分的にコードするようなフラグメントの同一性を確かめ
た。
【０１９７】この部分遺伝子の新しく同定された配列に
基づいて、特定のプライマーER67（配列番号４６）及び
ER68（配列番号４７）を企画し、上記のようなPCR 増幅
によるVectoretteライブラリーの第２回目スクリーニン
グにより、追加の５’及び３’フランキング配列を得
た。ER68（配列番号４７）及びER70（配列番号４８）を
用いてのPCR によるEcoRI, HindIII, DraI、及びHpaI V
ectorette ライブラリーのスクリーニングは、DraI Vec
torette ライブラリーからの約６００bpのフラグメント
の成功した増幅をもたらした。このフラグメントを、配
列決定し、Omp20遺伝子の３’末端を決定した。
【０１９８】ユニークな生成物はER67（配列番号４６）
及びER70（配列番号４８）を用いてのそれらのライブラ
リーのスクリーニングの間、観察されなかったので、追
加の特定のプライマーER71（配列番号４９）、ER72（配
列番号５０）、ER76（配列番号５２）及びER77（配列番
号５３）を企画し、ER47結合部位の５’側に位置するDN
A フラグメントを得た。多くのVectorette DNAライブラ
リーからの増幅によるそのような“ゲノムウォーキング
（genome walking）”を、ORF の外側の境界、すなわち
翻訳開始及び停止コドン及びフランキングヌクレオチド
配列が特徴づけられるまで、反復した。一般的に、PCR
生成物は、配列分析の前、直接的にクローン化され、又
はpGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター中に
クローン化された。
【０１９９】７．３．Omp27 の分子クローニング Omp27 のためのVectoretteライブラリーのスクリーニン
グを、上記Omp20 についての記載のようにして実質的に
実施した。但し、精製されたOmp27 タンパク質（表１，
Pep-3 （配列番号１３），aa13-24 ）のＮ−末端アミノ
酸配列に基づいて企画された変性オリゴヌクレオチドER
50（配列番号４０）を使用した。上記のようなVectoret
teライブラリーのPCR 増幅に続いて、152-bpのフランキ
ングを、Pep-3 （配列番号１３）のＮ−末端アミノ酸配
列に基づいてOmp27 の一部をコードすることを確かめ
た。
【０２００】BamH2, BglII, HindIII, EcoRI, HpaI、及
びDraI Vectorette ライブラリー及び特定のプライマー
ER88（配列番号６４）及びER89（配列番号６５）を用い
ての第２回目のゲノムウォーキングは、DraIライブラリ
ーからの約２kbのフラグメント、及びHindIII ライブラ
リーからの約１．５kbのフラグメントのPCR 増幅をもた
らした。それらのDNA フラグメントを、pGEM登録商標−
T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化し、そ
れぞれ、Omp27 遺伝子の５’及び３’側のヌクレオチド
配列の誘導体化を可能にした。
【０２０１】７．４．OmpA1 及びOmpA2 の分子クローニ
ング 精製された２９kDa のタンパク質（表１，Pep-4 （配列
番号１４））から得られたＮ−末端アミノ酸配列を用い
て、APP 染色体DNA からの２９kDa のタンパク質をコー
ドする遺伝子の直接的なPCR 増幅への使用のための変性
Ｎ−末端プライマーRA22（配列番号７３）及びRA34（配
列番号７７）を企画した。
【０２０２】Pep-4 の配列を、GenBank タンパク質デー
タベース（Altschulなど., 1990, J. Mol. Biol. 215 :
403-10)に対して、Blastpコンピュータープログラム比
較（National Center for Biotechnology Information)
を用いて分析し、そして次のいくつかの異なったコ−バ
クテリアのOmpAタンパク質との相同性を示すことを見出
した：パステウレラ・ムルトシタ（Pasteurella multoc
ida ）、Ｐ．ハエモリチカ（P.haemolytica ）、ハエモ
フィラス・ドクレイ（Haemophilus ducreyi ）、Ｈ．ソ
ムナス（H.somnus）、Ｈ．インフルエンザ（H.influenz
ae）、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタン
ス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、Ｅ．コ
リ、シゲラ（Shigella）及びサルモネラ（Salmonell
a）。パステウレラセアエ（Pasteurellaceae ）からのO
mpA−関連タンパク質のＮ−末端配列を一列に並べ、次
のコンセンサス配列を生成した：Ala-Pro-Gln-Ala/Glu-
Asn-Thr-Phe-Tyr-Ala/Val-Gly-Ala-Lys-Ala （配列番号
９４）。
【０２０３】それらの一列配列を分析し、そしてそれを
用いて、いくつかの追加のＮ−末端変性プライマーを企
画した。オリゴヌクレオチドプライマーRA53（配列番号
８１）、RA54（配列番号８２）、RA55（配列番号８
３）、RA56（配列番号８４）及びRA57（配列番号８５）
はお互いオーバーラップし、そしてこのコンセンサスペ
プチドのそれぞれ、aa4-11, aa5-12, aa3-10, aa1-8 、
及びaa1-7 をコードする領域に結合するよう企画され
た。
【０２０４】他の変性オリゴヌクレオチドプライマー
を、OmpA−関連タンパク質のＣ−末端領域の一列配列に
従って企画した。この一列配列は、アミノ酸配列Cys-Le
u-Ala-Pro-Asp-Arg-Arg-Val-Glu-Ile （配列番号９５）
を包含するＣ−末端近くの高く保存された領域を示し
た。RA49（配列番号７８）及びRA50（配列番号７９）逆
方向プライマーを、OmpAのこの領域における負のDNA 鎖
に結合せしめるよう企画した。
【０２０５】それらの逆方向プライマーを、二次元マト
リックスに適用し、このマトリックスにおいては、RA49
（配列番号７８）及びRA50（配列番号７９）が、組合さ
れたKlen Taq1 及びPfu ポリメラーゼを用いて、HotSta
rt 50 TM管（Molecular Bioproducts Inc., San Diego,
CA)において、RA22（配列番号７３）、RA34（配列番号
７７）、RA53（配列番号８１）、RA54（配列番号８
２）、RA55（配列番号８３）、RA56（配列番号８４）及
びRA57（配列番号８５）と、それぞれ対のように組合さ
れた。
【０２０６】次の文献は、“ホットスタート”方法を記
載する：D'Aquilaなど., 1991, NuCl, Acids Res. 19 :
3749 ; 及びHortonなど., 1994, Biotechniques 16 :
42-43 。PCR のサイクルプログラムは“タッチダウンPC
R ”プロトコートの変法であり、そして次の通りに実施
された：変性（９４℃，５分）；３０サイクルの変性
（９４℃，３０秒）、アニーリング（５９℃，３０秒の
初期サイクル、次に、追加のサイクル当たり−０．１
℃）、及び重合（７２℃，１分）；続いての最終延長
（７２℃，１５分）。次の文献が“タッチダウンPCR ”
プロトコールを記載する：Roux, 1994, BioTechniques,
16 : 812-814 ; 及びHecker and Roux, 1996,BioTechn
iques 20 : 478-485 。
【０２０７】生成されるPCR 生成物の中で、約９５０−
bpのバンドを、個々が前方向プライマーRA34（配列番号
７７）、RA53（配列番号８１）、RA56（配列番号８４）
又はRA57（配列番号８５）と対のように組合される場
合、RA49（配列番号７８）又はRA50（配列番号７９）の
いづれかとの反応から生成した。それらのDNA フラグメ
ントを、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクタ
ー中にクローン化し、そして配列決定した。それらの配
列決定されたフラグメントの分析は、２種の変異体配列
の存在を示した。
【０２０８】RA49（配列番号７８）／RA57（配列番号８
５）、及びRA50（配列番号７９）／RA56（配列番号８
４）に由来する生成物は、変異体Ａ１を示し、そして部
分的にコードされたタンパク質を“OmpA1 ”と命名し
た。RA50（配列番号７９）／RA34（配列番号７７）、及
びRA50（配列番号７９）／RA53（配列番号８１）に由来
する生成物は、変異体Ａ２を表わし、そして部分的にコ
ードされたタンパク質を、“OmpA2 ”と命名した。
【０２０９】２種の類似するが、まだ異なっているOmpA
部分DNA 配列を、前記Vectoretteライブラリーの適用に
よりゲノムウォーキングを通して、完全なORF 及びフラ
ンキング５’及び３’配列を含むよう延長した。部分Om
pA1 及びOmpA2 DNA 配列の一列配列は、それらの密接に
関連する遺伝子配列を区別することができる特定のオリ
ゴヌクレオチドプライマーの企画を可能にした。それぞ
れ、OmpA1 の５’又は３’領域、すなわちER55（配列番
号４１）、ER58（配列番号４２）に対して特異的な、及
びOmpA2 、すなわちER59（配列番号４３）、ER62（配列
番号４４）に対して特異的な、外側に面する異なったプ
ライマーを用いて、上記のようなVectoretteライブラリ
ーをプローブした。
【０２１０】約１１００，４００，４５０及び２８０−
bpのユニークフラグメントが、それぞれ、ER70（配列番
号４８）及び、ER55（配列番号４１）、ER58（配列番号
４２）、ER59（配列番号４３）、又はER62（配列番号４
４）のいづれかによりプローブされる場合、EcoRI Vect
oretteライブラリーから得られた。得られるフラグメン
トの配列の分析は、OmpA1 及びOmpA2 ORF 両者のエンド
ポイント及びフランキング領域の決定を可能にした。
【０２１１】７．５．OmpWの分子クローニング 精製された２３kDa のタンパク質（表１，Pep-2 （配列
番号１２））から得られたＮ−末端アミノ酸を用いて、
RA20（配列番号７２）、すなわちPep-2 のアミノ酸１−
８に対応する変性オリゴヌクレオチドプライマーを企画
した。
【０２１２】精製されたAPP DNA を、“遺伝子ウォーキ
ングPCR ”方法の変法において鋳型として使用した。単
一PCR プライマーRA20（配列番号７２）を、組合された
KlenTaq1 （Ab Pentides, Inc., St. Louis, MO) 及び
Ｐｆｕ（Stratagene, Inc.,La Jolla, CA) ポリメラー
ゼとの“ホットスタート”反応に使用した。PCR のため
のサイクルプログラムは、“タッチダウンPCR ”プロト
コールの変法であり、そして次の通りに実施された：変
性（９４℃，５分）；４０サイクルの変性（９４℃，１
分）、アニーリング（６３℃，２分の初期サイクル、次
に、追加のサイクル当たり−０．２℃及び−２秒）、及
び重合（７２℃，１５分）；続いての最終延長（７２
℃，１０分）。
【０２１３】生成される多くのPCR 生成物の中で、約２
２０−bpの生成物を得、そしてｐＧＥＭ登録商標−T Ea
sy PCRクローニングベクター中にクローン化した。この
プラスミド挿入体の配列分析は、クローン化されたPCR
生成物が、Ｐｅｐ−２（配列番号１２）のＮ−末端アミ
ノ酸配列に基づいて、２３kDa のタンパク質の一部に対
応するアミノ酸をコードしたことを確かめた。
【０２１４】この新しく同定された配列に基づいて、特
定のプライマー、すなわちＲＡ２３（配列番号７４）
を、下流の配列の増幅のために生成した。APP 血清型−
７ DNA のゲノムミニ−ライブラリーを、Taq a I 又は
HinPII（両者とも、５’−ＣＧオーバーハングを創造す
る）による制限消化により構成した。このDNA をBspDI
−切断されたpUC21 又はpUC128中に連結し、そしてＥ．
コリDH5 αを形質転換し、ゲノムライブラリーを生成し
た。
【０２１５】それらのプラスミド−ホモゲノムライブラ
リーのMini-prepsを、“ホットスタート”方法を用いて
“遺伝子ウォーキングPCR ”における鋳型として使用し
た。ベクター特異的M13 前方向及びM13 逆方向配列決定
プライマーに加えて、その特定のプライマーRA23（配列
番号７４）を、組合されたKlen Taq及びPfu ポリメラー
ゼと共に使用した。PCR のためのサイクルプログラムは
次の通りに実施された：変性（９４℃，５分）；３２サ
イクルの変性（９４℃，３０秒）、アニーリング（６３
℃，３０秒の初期サイクル、次にサイクル当たり−０．
２℃）、及び重合（７２℃，３０秒）；続いての最終延
長（７２℃，７分）。
【０２１６】生成される多くのPCR 生成物の中で、０．
８kbの生成物及び１．４kbの生成物を、pGEM登録商標−
T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化し、そ
して配列決定した。その得られる配列、及び上記で得ら
れた配列の分析及び一例配列は、成熟タンパク質の配列
を生成した。OmpW遺伝子の５’フランキング領域の配列
を得るために、特定のプライマーRA24（配列番号７５）
及びRA26（配列番号７６）を、上記のようにして、多く
のVectoretteライブラリーをプローブするために使用し
た。
【０２１７】増幅を次の通りに実施した：変性（９５
℃，９分）；４０サイクルの変性（９５℃，３０秒）、
アニーリング（６０℃，１分）及び重合（７２℃，３
分）；続いての最終延長（７２℃，７分）。特定の６０
０及び７００−bpの生成物は、それぞれ、HpaI及びDraI
Vectorette ライブラリーのプロービングに起因した。
その７００−bpの生成物を、５’−フランキング領域を
包含するヌクレオチド配列を得るために直接的に配列決
定し、そして２３kDa のタンパク質のＮ−末端をコード
していた。予測されるAPP ２３kDa タンパク質と予測
されるビブリオコレラOmpWタンパク質との間の部分的な
類似性のために、APP 遺伝子フラグメントを、“OmpW”
と命名した。
【０２１８】７．６．APP タンパク質をコードする遺伝
子の分子分析 ７．６．１．DNA の特異的PCR 増幅 上記のように、新規APP タンパク質のクローニング及び
予備的な配列決定からの結果を用いて、APP 血清型−７
染色体DNA から直接的に、損なわれていないOmp20, Omp
27, OmpA1, OmpA2及びOmpW遺伝子の特異的増幅のための
オリゴヌクレオチドプライマーを企画した。このアプロ
ーチは、Ｅ．コリにおける遺伝子フラグメントのクロー
ニングの間に生じる可能性ある突然変異のために、配列
決定人工物の導入を排除する所望に基づいて選択され
た。
【０２１９】従って、上記の損なわれていないAPP 遺伝
子を端に有するオリゴヌクレオチドは、染色体DNA から
のそれらの領域を特別に増幅するために使用された。個
々の遺伝子増幅のために利用される５’及び３’プライ
マー対は次の通りであった：Omp20 のためには、プライ
マーはER80（配列番号５６）及びER81（配列番号５７）
であり；Omp27 のためには、プライマーはER95（配列番
号６９）及びER96（配列番号７０）であり；OmpA1 のた
めには、プライマーはER84（配列番号６０）及びER86
（配列番号６２）であり；OmpA2 のためには、プライマ
ーはER87（配列番号６３）及びER66（配列番号４５）で
あり；そしてOmpWのためには、プライマーはER82（配列
番号５８）及びER83（配列番号５９）である。
【０２２０】PCR 反応を三重反復して実施し、そしてそ
れは、２６０ngの精製された染色体DNA ，1 ×PC2 緩衝
液（Ab Peptides, Inc.)、２００μＭの個々のｄＮＴ
Ｐ，１００ｐモルの個々のプライマー、７．５ＵのKlen
Taq1及び０．１５Ｕのクローン化されたＰｆｕ熱安定性
ポリメラーゼを、１００μｌの最終サンプル体積におい
て含んだ。増幅のため条件は、変性（９４℃，５分）、
続いて３０サイクルの変性（９５℃，３０秒）、アニー
リング（６５℃，３０秒）、及び重合（７２℃，２分）
から成った。
【０２２１】最終延長（７２℃，７分）は、標的の損な
われていない遺伝子領域の増幅を完結せしめた。増幅に
続いて、三重反復サンプルの個々をプールし、そして特
定の生成物を、ABI 自動DNA 配列決定機（Applied Bios
ystems, Foster City, CA)に基づいてDyeDeoxy終結反応
を用いての直接的な配列分析の前、アガロースゲル電気
泳動及び回転クロマトグラフィー（QIAquickTM，QIAGEN
Inc., Santa Clarita, CA) による抽出により精製し
た。合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、APP
血清型−７からの増幅された生成物の両DNA 鎖を配列決
定した。APP タンパク質遺伝子を配列決定するために使
用されるプライマーは、下記表２に示されている。
【０２２２】Omp20 のORF のヌクレオチド配列は、nt２
７２〜７９０の配列番号１に示される。OmpWのORF のヌ
クレオチド配列は、nt３７６〜１０２３の配列番号３に
示される。Omp27 のORF のヌクレオチド配列は、nt１５
７〜９３３の配列番号５に示される。OmpA1 のORF のヌ
クレオチド配列は、nt６１４〜１７０８の配列番号７に
示される。OmpA2 のORF のヌクレオチド配列は、nt１９
７〜１３０６の配列番号９に示される。
【０２２３】
【表２】
【０２２４】７．６．２．APP 血清型−7 OmpA1 及びOm
pA2 タンパク質の類似性 OmpA1 タンパク質（配列番号８）及びOmpA2 タンパク質
（配列番号１０）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号
７及び９から推定し、そしてそれらの類似性を比較する
ために一列配列した。推定されるOmpA1 タンパク質は、
３６４個の長さのアミノ酸であり、これは推定されるOm
pA2 タンパク質よりも５個のアミノ酸が短い。図５に示
されるAPP タンパク質の一列配列は、２種のタンパク質
が73.1%(270/369)のアミノ酸同一性を共有することを示
す。
【０２２５】７．６．３．ビブリオコレラOmpWとAPP 血
清型−7 OmpWとの比較 ２３kDa のAPP OmpWタンパク質をコードするORF のヌク
レオチド配列（配列番号３）から推定されるアミノ酸配
列（配列番号４）は、ビブリオコレラについて記載され
るOmpWタンパク質に最とも類似することが決定された
（Jalajakumari,M.B., など., 1990, Nucleic Acids Re
s. 18 (8) : 2180)。それらの２種のタンパク質のアミ
ノ酸配列を、Clustal W(ver 1.4)Multiple Sequence Al
ignment Algorithm （Thompson, J.D., など., 1994, N
ucleic Acids Res., 22 : 4673-4680)を用いて一列配列
した。この比較は、それぞれ、２１５及び２１６の長さ
の残基を有するAPP OmpW及びＶ．コレラが44.9%(97/21
6) のアミノ酸同一性を共有することを示した。この一
列配列されたタンパク質は、図６に示される。
【０２２６】７．７．サザンブロットハイブリダイゼー
ション 異なったAPP 血清型間でOmp20, OmpW, Omp27, OmpA1 及
びOmpA2 タンパク質をコードするDNA 配列の保存性が、
異なった血清型からのAPP DNA に対するプローブとして
５種の異なったコード配列の個々を用いてサザンブロッ
トハイブリダイゼーション分析を実施することによって
決定された。プローブは、PCR DIG TM Probe Synthesis
Kit（Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Ind
iana) により、製造業者の説明書に従って生成された。
たとえば、OmpWプローブは、次の態様で構成された。
【０２２７】OmpWコード配列を包含するPCR 生成物を、
OmpW特異的プライマー、及びAPP 血清型−7 DNA を用い
て生成した。APP 血清型−７ゲノムDNA （０．２μ
ｇ）、１μＭのMW3 プライマー（配列番号７１）、１μ
ＭのプライマーＲＡ５２（配列番号８０）、７．５Ｕの
KlenTaq1ポリメラーゼ（Ab Peptides, Inc.)、０．０７
５ＵのPfu ポリメラーゼ（Stratagene）、１×KlenTaq1
緩衝液及び０．２mMのdNTPを、５０μｌの体積において
組合した。PCR を次の通りに実施した：変性（９４℃，
５分）；３５サイクルの変性（９４℃，３０秒）、アニ
ーリング（５８℃，３０秒）及び重合（７２℃，１
分）；及び最終延長（７２℃，７分）。
【０２２８】約６５０−bpのOmpW PCR生成物を、JETsor
b TMキット（GENUMED, Inc., Research Triangle Park,
NC)を用いて、アガロースゲル電気泳動に従って精製し
た。精製されたDNA を、Low Mass DNA Ladder TM質量標
準（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD ）を用いて定量化し
た。ジゴキシゲニル−ラベルされたプローブを、製造業
者の説明書に従って、PCR DIG TM Probe Synthesis Kit
を用いて、上記のようにして生成された２４pgのOmpW P
CR生成物のPCR 増幅により生成し、そしてPCR−生成さ
れたプローブを、精製しないで−２０℃で貯蔵した。
【０２２９】APP 血清型１，２，５，７，８及び９の個
々から得られた、ＥｃｏＲＩ−消化されたAPP ゲノムDN
A （１．５μｇ）を、アガロースゲル電気泳動により分
離した。DNA プロフィールを、製造業者の説明書に従っ
て、TurboblotterTM Kit（Schleicher & Schuell, In
c., Keene, New Hampshire) によるアルカリトランスフ
ァーを用いて、Hybond-N 0.45μM のナイロン膜（Amer
sham, Inc. Cloveland,OH) にトランスファーした。DNA
を、自動−架橋説定（１２０mJ／cm2 ）で、Stratalin
kerTM UV Cross-Linker(Stratagene ）を用いて、ＵＶ
照射により前記膜に共有結合せしめた。ブロットを乾燥
せしめ、そして室温で貯蔵した。
【０２３０】ナイロンDNA ブロットを、複数のAPP 血清
型におけるプローブ配列の検出のためのハイブリダイゼ
ーションを可能にするためにプローブの存在下でインキ
ュベートした。ブロットを、過剰（０．２ml／cm2 ）の
1 ×Prehybridization Solution(GIBCO/BRL ）を用い
て、６８℃で２．５時間、プレ−ハイブリダイズした。
プローブ−ハイブリダイゼーション溶液を、５００μｌ
の1 ×Hybridization Solution(GIBCO/BRL) に５．４μ
ｌの精製されていないジゴキシゲニン−ラベルされたプ
ローブを添加し、そして１００℃で１０分間、煮沸する
ことによって調製した。
【０２３１】プローブを０℃に１分間冷却し、そして次
に、十分な1 ×Hybridization Solutionに添加し、合計
０．０２５ml／cm2 のブロットを付与した。ブロット
を、このプローブ−ハイブリダイゼーション溶液混合物
において、６８℃で１６時間、ハイブリダイズせしめ
た。緊縮洗浄を次の通りに、ブロットに対して実施し
た：（ｉ）過剰（０．２ml／cm2 ）の2 ×SSC/0.1% SDS
による２５℃で５分間の２回の洗浄；（ii）過剰（０．
２ml／cm2 ）の0.1 ×SSC/0.1% SDSによる６８℃で１５
分間の２回の洗浄。次に、ブロットを、DIG TM High Pr
ime DNA Labeling andDetection Starter Kit II 、及
びDIG TM Wash and 3lock Buffer Set（Boehringer Man
nheim, Inc., Indianapolis, Indiana) による化学発光
法を用いて、製造業者の説明書に従って展開せしめた。
【０２３２】プローブを、試験されるすべてのAPP 血清
型（血清型１，２，５，７，８及び９）におけるDNA に
よるハイブリダイズされた、Omp20, OmpW, Omp27, OmpA
1 、及びOmpA2 に対して上記のようにして生成した。検
出されるEcoRI バンドのサイズは、OmpA1 及びOmpA2 に
関してすべての血清型を通して同一であったが、しかし
Omp20, OmpW 及びOmp27 に関しては保存されなかった。
【０２３３】個々の血清型においてOmp20 プローブによ
りハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは
次の通りであった：血清型１，２，７及び９は５．８kb
のフラグメントを付与し；血清型−５は６．１kbのフラ
グメントを付与し；血清型−８は５．０kbのフラグメン
トを付与した。個々の血清型においてOmpWプローブによ
りハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは
次の通りであった：血清型−１は１．５kbのフラグメン
トを付与し；血清型−２は１．１kbのフラグメントを付
与し；血清型−５は１．０kbのフラグメントを付与し；
血清型−７は０．９kbのフラグメントを付与し；血清型
−８は１．０５kbのフラグメントを付与し；そして血清
型−９は１．２kbのフラグメントを付与した。
【０２３４】個々の血清型においてOmp27 プローブによ
りハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは
次の通りであった：血清型−１，２及び９は約９．５kb
のフラグメントを付与し；血清型−５，７及び８は約１
０．５kbのフラグメントを付与した。OmpA1 プローブに
よりハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズ
は、すべての血清型において２．３kbであった。０．５
５kb及び０．８５kbの弱いハイブリダイズするフラグメ
ントをまた検出した。OmpA2 プローブによりハイブリダ
イズされるEcoRI フラグメントのサイズは、すべての血
清型において０．８５kbであった。０．５５kb及び２．
３kbの弱いハイブリダイズするフラグメントをまた検出
した。
【０２３５】８．例：組換えAPP タンパク質の発現 ８．１．宿主株 組換えタンパク質発現のために使用されるＥ．コリ宿主
は、Ｅ．コリLW14であった。この株の遺伝子型は、λ-I
N(rrnD-rrnE)1galE::Tn10 λC 1857ΔH1bio である。こ
の株は、Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, King
of Prussia, PA, USA により供給され、そして３０℃で
λプロモーターからの発現を阻害する感温性λリプレッ
サーλC ／８５７を含む。４２℃で、このリプレッサー
は不活性化され、そしてλプロモーターからの発現が可
能にされ、高レベルの転写及びタンパク質合成が生成さ
れる。Ｅ．コリＬＷ１４は、３０℃で増殖された。
【０２３６】８．２．プラスミド発現ベクター 組換えタンパク質合成のために使用される発現ベクター
は、pEA181であり、これは他方では、pEA181KanRBS3 と
も称す。このベクターは６．７６６kbのサイズであり、
耐カナマイシン性（Kan ）をコードし、そして強いλプ
ロモーターＰLを含む。このベクターは、最適化された
リボソーム−結合部位のすぐ下流にNdeI部位を含む；こ
のNdeI部位の存在は最適な発現のためのタンパク質のMe
t 開始コドンの正確な配置を可能にする。ベクターはま
た、不良に発現されたタンパク質の増強された発現を可
能にするためにNS1 リーダー融合タンパク質をコードす
る。このベクターは、Smith Kline Beecham Pharmaceut
icals により供給された（また、アメリカ特許第4,925,
799 号及びRosenberg など., 1983, Meth. Enzymol. 10
1 : 123-138 も参照のこと）。
【０２３７】５種のAPP タンパク質の個々のコード配列
を、Ｍｅｔ開始コドン（ATG ）をオーバーラップするNd
eI部位（CATATG）を生成するよう企画された５’特異的
プライマー、及びpEA181における3'XbaI部位中へのクロ
ーニングのために企画された３’特異的プライマーを用
いて、ＰＣＲにより増幅した。それぞれのPCR 生成物
を、始めに、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベ
クター（Promega Corp）中にクローン化し、そして市販
のコンピテントＥ．コリDH5 α（MAX EfficiencyDH5α
Competent Cells, GIBCO/BRL ）を形質転換した。
【０２３８】PCR 生成物をそれらのプラスミドクローン
から、NdeI-XbaI 又はNdeI-SpeI フラグメントとして切
り出し、そしてNdeI/XbaI 切断のpEA181をクローン化し
た。強いλプロモーターＰL の存在のために、pEA181誘
導体は、感温性λリプレッサーλC /857の活性によりベ
クターからの発現を抑制するＥ．コリLW14のみを形質転
換することができた。形質転換及びpEA181及びその誘導
体を担持する形質転換体の増殖は、３０℃で行なわれ
た。Ｅ．コリLW14は、凍結されたコンピテント細胞の調
製のためのHanahan の方法によりコンピテントにされた
（Hanaban, 1985,DNA Cloning : A Practical Approach
(Glover, D., ed.) Vol 1, pp. 109-135, IRL Press,
Oxford, England) 。
【０２３９】Ｅ．コリLW14における成熟OmpWの発現に関
する困難性のために、増強されたタンパク質合成を可能
にするリーダーペプチドを使用した。“保護ペプチド”
又は“ｐｐ”と称するこのリーダーペプチドは、Sungな
ど., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 561-565
; Sung など., 1987, Meth. Enzymol. 153 : 385-389
; 及びアメリカ特許第5,460,954 号（それらは引用に
より本明細書中に組込まれる）からの情報に基づけば、
タンパク質加水分解から組換えタンパク質を保護する。
【０２４０】アミノ酸配列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Th
r-Thr-Ser-Arg （配列番号９６）から成る保護ペプチド
が、APP コード配列から上流の保護ペプチドコード配列
を含むようにPCR プライマーを企画することによって、
APP タンパク質の個々のＮ−末端に融合された。そのよ
うなプライマーによる別のAPP コード配列の増殖は、成
熟（すなわち、生来のシグナル配列を欠いている）APP
タンパク質における最初のアミノ酸に融合されるＮ−末
端保護ペプチドをコードする配列を生成した。NdeI部位
は、保護ペプチドにおけるMet コドンに位置し、その結
果、それはpEA181のNdeI部位中に凍結され得た。
【０２４１】保護ペプチド−APP タンパク質コード配列
の増幅のためのプライマー対は、次の通りであった：Om
pWに関しては、MW3 （配列番号７１）及びRA52（配列番
号８０）；OmpA1 に関しては、RA78（配列番号８８）及
びRA71（配列番号８７）；OmpA2 に関しては、RA78（配
列番号８８）及びRA69（配列番号８６）；Omp20 に関し
ては、ER78（配列番号５４）及びER73（配列番号５
１）；及びOmp27 に関しては、ER92（配列番号６７）及
びER94（配列番号６８）。
【０２４２】８．３．組換えタンパク質の発現 それぞれの成熟APP タンパク質OmpA1, OmpA2, Omp20, O
mpW 及びOmp27 と共に保護ペプチド融合体をコードする
ｐＥＡ１８１誘導体を担持するＥ．コリLW14形質転換体
を、３０℃でLB Km 50（50μg/mlのカナマイシンスルフ
ェートを含むLuria ブイヨン）において一晩、増殖し
た。その培養物を、2 × YT K m 50培地（５０μｇ／ml
のカナマイシンスルフェートを含む、１．６％トリプト
ン、１％酵母抽出物、０．５％ NaCl、及び１．２５mM
のNaOH溶液）中に１：１００で希釈し、そして３０℃
で、Ａ600 が０．８〜１．０になるまで、増殖した。次
に、培養物を水浴インキュベーターにおいて４２℃に移
し、そして３〜４時間インキュベートした。
【０２４３】２× YT K m 50培地において増殖し、そし
てpp-OmpA1, pp-OmpA2又はpp-OmpWのいづれかを発現す
る５ｌの発酵物からのＥ．コリLW14形質転換体の湿潤細
胞を、遠心分離により収穫した。細胞を0.1Mのトリス−
ＨＣｌ（pH８．０）に懸濁し、そして高圧ホモジナイザ
ーにより溶解した。封入体を遠心分離により集め（12,0
00RCF, 30 分）、そして2 ×RIPA/TET（５：４）により
１度又は２度、洗浄した。２×RIPAは、２０mMのトリス
（pH７．４）、０．３ＭのNaCl，２．０％のナトリウム
デオキシコレート及び２％（ｖ／ｖ）のLgepal CA-630
TM（Sigma ）である。TET は、０．１Ｍのトリス（pH
８．０）、５０mMのEDTA及び２％（v/v)Triton X-100を
含む。封入体を、５Ｍのグアニジン−塩酸に溶解し、
２．５Ｍのグアニジン−塩酸塩において１．４mg／ml以
上のタンパク質に調節し、そしてフィルター殺菌した
（０．２μｍ）。この調製物を、下記のように、予防接
種のために使用した。
【０２４４】２×YT Km 50培地において増殖され、そし
てpp-Omp20を発現する、５ｌの発酵物からのＥ．コリLW
14形質転換体の湿潤細胞を、遠心分離により収穫した。
細胞を、リゾチームを含む、２５％スクロース−５０mM
のトリス-HCl（pH8.0)溶液に懸濁し（５０mlの培養物に
関しては、細胞は０．５mlのスクロース緩衝液に分散さ
れた；各mlのスクロース緩衝液に関しては、１０mg／ml
でのリゾチーム溶液０．１２５mlが添加された）、そし
て音波処理した。封入体を遠心分離（12,000RCF, 30
分）により集めし、上記のような2 ×RIPA/TETにより洗
浄し、遠心分離により再び集め、そしてpH１１での０．
１Ｍのグリシン及びZwittergent 3-14(Calbiochem)溶液
により洗浄した。pHを７．０に調節し、そして封入体を
遠心分離（12,000RCF, 30 分）により集め、3.5Mのグア
ニジン塩酸塩に溶解し（最終タンパク質濃度、６．３６
mg／ml）、そしてフィルター殺菌（０．２μｍ）した。
この調製物を、下記のように、予防接種試験のために使
用した。
【０２４５】上記のようにして２×YT Km 50培地におい
て増殖され、そしてpp-Omp27を発現する、１６００mlの
発酵物からのＥ．コリLW14形質転換体の湿潤細胞を、遠
心分離により収穫した。細胞を、上記のように、リゾチ
ームを含む、２５％スクロース−５０mMのトリス−HCl
（pH８．０）溶液に懸濁し、音波処理し、上記のように
２×RIPA/TETにより洗浄し、そして遠心分離により集め
た。封入体を遠心分離（12,000RCF, 30 分）により集
め、５Ｍのグアニジン塩酸塩に溶解し（最終タンパク質
濃度、２．４６mg／ml）、そしてフイルター殺菌（０．
２μｍ）した。この調製物を、下記のように予防接種試
験のために使用した。
【０２４６】９．例：組換えAPP タンパク質の免疫学的
特徴化 ９．１．材料及び方法 ９．１．１．ウェスターンブロットのためのAPP 完全細
胞抗原の調製及び定量化 完全な細菌細胞抗原を、上記セクション６．１．４に記
載のようにして調製した。但し、ＨＰ増殖培地を、MM3
培地の代わりに用い、そして細胞を、５mlのDPBSの代わ
りに１０mlのDPBSに懸濁した。個々の調製物のタンパク
質濃度を、BCAProtein Assay Kit(Pierce) を用いて決
定した。手短に言及すると、個々のサンプルを、脱イオ
ン化された、無菌の蒸留水（ddH2 O）により１／１０，
１／２０，１／４０及び１／８０に希釈した。BSA （タ
ンパク質標準）を、２００〜８００μｇ／mlの範囲の濃
度に希釈した。２０μｌの体積のサンプル又は標準を、
９６−ウェルマイクロタイタープレート１〜におけるウ
ェルに三重反復して添加し、そして試薬Ａに１／５０に
希釈された試薬Ｂの溶液２００μｌを個々のウェルに添
加した。プレートを、３７℃で３０分間インキュベート
した。サンプルの吸光度を５６０nmで測定した。個々の
サンプルについてのタンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線
を用いて、外挿により計算した。
【０２４７】９．１．２．抗体 ウェスターンブロットのために使用される二次抗体は、
アルカリホスファターゼ接合のヤギ抗−ブタIgG(H+L)及
びヤギ抗−マウスIgG(H+L)（Kirkegaard and Perry Lab
oratories)を含んだ。それらの抗体は、ウェスターンブ
ロット分析により、血清又は上清液サンプルにおけるAP
P タンパク質−特異的抗体を可視化するために使用され
た。両抗体を、使用の前、希釈緩衝液（PBS, 0.05% Twe
en 20.5%脱脂乳粉末）により１／１０００に希釈した。
【０２４８】９．１．３．予防接種プロトコール セクション８．３に記載のようにして調製された、組換
え的に発現されたタンパク質調製物を、DPBSに希釈し、
８０μｇ／mlにし、そして次に、２倍に濃縮されたSEAM
-1アジュバント（８０μｇ／mlのQuilA, 16 μg/mlのコ
レステロール、５％のスクアレン、１％のSpan 85 ，
０．１％のビタミンＡアセテート、０．１％のエタノー
ル及び０．０１％の４メロゾール）により１：１に組合
した。雄のＣＦ１マウスに、組換えタンパク質１０μ
ｇ，QuilA １０μｇ及びコレステロール２μｇを含む
タンパク質／アジュバント調製物０．２５mlをｓ．ｃ．
注射した。負（アジュバント）の対照のグループは、
１：１でアジュバントと共混合されたDPBS ０．２５ml
を受けた。マウスは、一時予防接種の後、２０〜２２日
で、同じタンパク質調製物により２度目の予防接種を受
けた。２度目の予防接種後２週間で、動物をCO2 により
麻酔し、そして気管支動脈又は心臓穿刺により採血し
た。血清を個々の血液サンプルから分離し、そして同じ
グループ内のマウスからの血清プールを−２０℃で貯蔵
した。
【０２４９】９．１．４．ウェスターンブロット分析 １０μｇのタンパク質に対応する体積のAPP 完全細菌細
胞溶解物（APP 血清型１，２，５，７、又は９からの；
セクション９．１．１に記載のようにして調製された）
を、水と共に混合し、１０μｌの最終体積にし、そして
２μｌの５×還元サンプル緩衝液（Pierce）を添加し
た。類似する態様で、組換えタンパク質（上記セクショ
ン８．３を参照のこと）（タンパク質負荷は不定であっ
た）のアリコートをまた調製した。サンプルを１００℃
で５分間加熱し、そして全体積を、１４％トリス−グリ
シンゲル（Novex ）を含む、１．５mmの厚さの１５−ウ
ェルの別々のウェル中に負荷した。予備染色された、広
範囲の分子量マーカー（５μｌ／ウェル）（BioRad）が
また、個々のゲルに含まれた。選択されたゲルにおける
分離されたタンパク質をクーマシーブルーにより染色し
た。
【０２５０】SDS-PAGEにより分離されたタンパク質を、
２００mAの一定の電流で、１．５時間、PVDF膜（BioRa
d）にトランスファーした。ブロットを、（ｉ）ブロッ
キング緩衝液（５％脱脂乳粉末及びPBS 中、０．０５％
Tween 20）において直接的にインキュベートし；又は
（ii）室温で乾燥せしめ、必要まで、−２０℃で凍結貯
蔵し、次にメタノールに再水和化し、水によりすすぎ、
そして続いて、ブロッキング緩衝液においてインキュベ
ートした。膜を、軽く撹拌しながら、ブロッキング緩衝
液（希釈緩衝液としても使用される）において一晩イン
キュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、そして
希釈された血清又は上清液サンプルを前記膜に添加し、
続いて、室温で１時間、インキュベートした。
【０２５１】試験サンプルの除去の後、膜をPBST（０．
０５％のTween 20を含むPBS ）により、それぞれ５〜１
０分間、３度洗浄した。アルカリホスファターゼ−接合
された抗−ネズミ又は抗−ブタIgG(H+L)抗体を希釈し、
洗浄された膜に添加し、そして室温で１時間インキュベ
ートした。膜をPBSTにより洗浄し、そして基質BCIP/NBT
（Kirkegaard and Perry Laboratories)を前記膜に添加
し、そして軽く撹拌しながら、適切な色の反応が進行す
るまで、インキュベートした。次に、膜を水によりすす
ぎ、反応を停止し、そして室温で乾燥せしめた。
【０２５２】９．２．結果 新規APP タンパク質の抗原性特徴を、次の３種の方法を
用いて決定した。第１の方法は、ブタ抗体プローブ、す
なわちAPP 血清型−１又は血清型−５、又は血清型−
５、続く血清型−７による再攻撃により実験的に感染さ
れた動物から得られた回復期ブタ血清又はASC 上清液
を、組換え発現されたAPP タンパク質を含むウェスター
ンブロットにおける免疫学的プローブとして使用した
（表３）。第２の方法は、APP 抗原（完全な細菌細胞ペ
レット）を含むウェスターンブロットをプローブするた
めに組換え発現されたAPP タンパク質により免疫化され
たマウスから得られた血清を使用した（表４）。第３の
方法は、組換え発現されたAPP タンパク質を含むウェス
ターンブロットをプローブするために組換え発現された
APP タンパク質により免疫化されたマウスからの血清を
使用した（表６）。個々の方法の結果は、下記に記載さ
れる。
【０２５３】９．２．１．APP 血清型に対して生成され
たブタ抗体プローブによる組換えAP P タンパク質の認識 抗体プローブ（血清又はASC 上清液）を、APP 血清型−
１、又は血清型−５のいづれかによる実験的な攻撃、又
は血清型−５による攻撃、続く血清型−７による再攻撃
に続いてブタから得た。血清は、新規APP タンパク質を
同定するために使用された（図１〜４）。表３は、ウェ
スターンブロットによる組換え発現されたAPP タンパク
質と抗体プローブとの反応性を要約する。血清型−５に
よる攻撃及び血清型−７による再攻撃に続いて生成され
たASC プローブは、OmpW, OmpA1,OmpA2及びOmp20 組換
えタンパク質を認識した。ASC プローブは、組換えOmp2
7とは免疫学的に反応しなかった。
【０２５４】対照的に、血清型−１、又は血清型−５に
より攻撃され、又は血清型−５により攻撃され、続いて
血清型−７により再攻撃された動物に由来する血清は、
単に、OmpA1 及びOmpA2 組換えタンパク質を認識した。
攻撃されていない対照ブタ（No．780 ）から得られたＡ
ＳＣプローブは、組換え発現されたタンパク質のいづれ
とも反応しなかった。しかしながら、追加の攻撃されて
いない対照ブタ（No．779 ）は、すべての組換え発現さ
れたタンパク質と反応した。さらに、攻撃されていない
対照ブタ（No．1421）からの血清は、OmpA1 及びOmpA2
と反応した。それらの後者の２匹の動物は、APP により
潜在的に感染されていると思われた。
【０２５５】９．２．２．組換えAPP タンパク質に対し
て生成されたマウス抗血清によるAP P タンパク質の認識 組換え発現されたAPP タンパク質により免疫化されたマ
ウスからの抗血清を、細菌細胞ペレットからのAPP 抗原
を含むウェスターンブロットをプローブするために使用
した。結果は表４に要約される。組換えpp-OmpW 、又は
pp-OmpA1、又はpp-OmpA2により免疫化されたマウスは、
特定のAPP タンパク質の予測される分子量と一致する特
定のバンドを認識した血清抗体を生成した。しかしなが
ら、組換えOmp20 又はOmp27 のいづれかにより免疫化さ
れたマウスからの血清は、試験されたいづれかの血清型
において、特定の生来のタンパク質と特異的に反応しな
かった。
【０２５６】９．２．３．組換えAPP タンパク質に対し
て生成されたマウス抗血清による組換えAPP タンパク質
の認識 組換え発現された新規タンパク質により免疫化されたマ
ウスからの抗血清を、組換えAPP タンパク質を含むウェ
スターンブロットをプローブするために使用した。結果
は表５に要約される。組換えOmpWにより免疫化されたマ
ウスの血清は、GST 又はpp融合タンパク質のいづれかと
して、組換えOmpW, OmpA1 及びOmpA2 タンパク質を認識
した。組換えOmpA1 又はOmpA2 のいづれかにより免疫化
されたマウスからの血清は、OmpA1 及びOmpA2 免疫原と
強く反応した。
【０２５７】組換えOmp20 により免疫化されたマウスか
らの血清は、組換えOmp20 と強く反応し、そして組換え
OmpA1 及びOmpA2 とは、いくらか低く反応した。対照的
に、組換えOmp27 により予防接種されたマウスからの血
清は、組換えOmp27 を認識しなかったが、しかし組換え
OmpA1 及びOmpA2 とは反応した。PBS により予防接種さ
れた対照マウスからの血清は、組換えOmpA1 及びOmpA2
とはひじょうに弱く反応し、そして組換えOmpW, Omp20
又はOmp27 を認識しなかった。
【０２５８】要約すると、APP により実験的に感染され
たブタは、OmpW, OmpA1, OmpA2及びOmp20 組換えタンパ
ク質を認識した局部抗体（ASC プローブ）を生成し、と
ころが血清抗体は、ウェスターンブロットにより示され
るように（表３）、組換えOmpA1 及びOmpA2 とは反応し
た。従って、血清は、ASC プローブよりも、免疫学的反
応性に関して、より一層制限されると思われる。血清も
ASC プローブも、組換え発現されたOmp27 を認識しなか
った。Omp27 は、アッセイの変性のために、ウェスター
ンブロットアッセイにおいては、たぶん認識されない。
【０２５９】組換えOmpW, OmpA1 及びOmpA2 の免疫学的
特徴化は、それらのタンパク質が、血清型１，２，５，
７，８及び９に見出される生来のタンパク質（予測され
る分子量に基づく）を認識し（表４）、そしてそれらの
タンパク質の組換え的に誘導された形を認識する（表
５）血清抗体を誘発することができ、そして組換えOmp2
0 がまた認識されることを示す。
【０２６０】組換えOmp20 又はOmp27 により免疫化され
たマウスからの血清を、インビトロ増殖されたAPP 血清
型１，２，５，７，８、及び９に由来する完全な細菌細
胞抗原を含むウェスターンブロットをプローブするため
に使用した（表４）。それらの血清は、試験されるAPP
血清型のいづれにおいても、それらの生来の形と一致す
るバンドを認識しなかった。Omp20 及びOmp27 はたぶ
ん、インビボでのみ発現されるAPP の抗原を表わし、そ
して従って、実験室において調製された細菌細胞ペレッ
トには存在しないであろう。他方では、それらの２種の
タンパク質は、ウェスターンブロット方法により変性さ
れており、そして特定抗体に認識できなくされている。
【０２６１】
【表３】
【０２６２】１：組換えタンパク質の個々は、保護ペプ
チド（ｐｐ）を含み、生来のシグナル配列を欠いてお
り、そして封入体（ＩＢ）に由来した。 ２：１／１２５に希釈された血清、又は１／４に希釈さ
れたＡＳＣプローブが、組換えタンパク質の個々に対し
て特異的な抗体について試験された。 ３：動物は示されるAPP 血清型により攻撃された。動物
No．803 及び808 は、血清型−５により攻撃され、感染
からの回復を可能にされ、そして次に、血清型−７によ
り再攻撃された。 ４：（＋）は示された組換えタンパク質に対応するバン
ドの存在を示し；（−）は、血清又はASC プローブが特
定の組換えタンパク質と反応しなかった事を示す。 ５：ＮＤ＝測定されなかった。
【０２６３】
【表４】
【０２６４】１：完全な細菌細胞調製物（レーン、当た
り１０μｇ）におけるタンパク質を、SDS-PAGEにより分
離し、PVDF膜にトランスファーし、そしてマウス血清
（１／５０）によりプローブした。 ２：マウスを、組換えAPP タンパク質調製物又はPBS
（対照）のいづれかにより２度、s.c.免疫化した。 ３：マウス免疫化のために使用されるすべての組換えAP
P タンパク質は、溶解された封入体調製物であった。す
べてのAPP タンパク質は保護ペプチドを含んだが、但し
OmpW-GST融合タンパク質又はpp-OmpW 融合タンパク質の
いづれかとして利用されるOmpWを除く。 ４：（＋）は動物を免疫化するために使用される組換え
タンパク質に対応するバンドの存在を示し；（−）は特
定バンドの不在を示す。
【０２６５】
【表５】
【０２６６】１：SDS-PAGEにより分離された組換えタン
パク質が、PVDF膜にトランスファーされ、そしてマウス
血清（１／５０）によりプローブされた。 ２：マウスは、組換えタンパク質調製物又はＰＢＳ（対
照）により２度、ｓ．ｃ．免疫化された。 ３：SDS-PAGEゲルにおける組換えAPP タンパク質の個々
は、保護ペプチド（pp）を含み、そして生来のシグナル
配列を欠いた。 ４：マウス免疫化のために使用されるすべての組換えAP
P タンパク質は、溶解された封入体調製物からであっ
た。すべてのタンパク質は保護ペプチドを含んだが、但
しOmpW-GST融合タンパク質又はpp-OmpW 融合タンパク質
のいづれかとして利用されるOmpWは除かれ、そしてすべ
てのタンパク質は生来のシグナル配列を欠いた。
【０２６７】５：（＋）は、試験血清が特定の組換えタ
ンパク質と反応したことを示し；（−）は、特定のバン
ドの不在を示し；ＰＢＳ対照に関して、（＋／−）は、
それらのバンドが見えたが、しかし免疫化された動物か
らの血清に比較して、ひじょうに弱いことを示す。（＋
＋）はひじょうに強い免疫反応性を示す。 ６：ＮＤ＝測定されなかった。
【０２６８】１０．例：種々の抗原組合せの効能を試験
するための動物研究 １０．１．材料及び方法 ５０匹の明らかに健康な雑種のブタ（生後、約６．５
週）を、APP 疾病又は予防接種の病歴を有さない動物群
から得た。動物は、１０匹のブタからそれぞれ成る５つ
のグループに、同腹子により、又はＡｐｘII細胞溶解性
中和抗体力価によりランダムに割当てられた（９８％の
動物は、研究の開始の前、≦１：２００の血清中和力価
を有した）。ブタは、研究の開始の前、１週間、順化さ
れた。
【０２６９】動物は、生後約７．５週目である１０日
目、２mlの適切なワクチン（ｐｐを有し、そしてシグナ
ル配列を有さないAPP タンパク質）又はプラセーボを、
筋肉内経路（ＩＭ：左の首の筋肉）により予防接種され
た。３週間後、動物は、２回目の２mlの用量（ＩＭ：左
の首の筋肉）により追加免疫化された。表６は、５つの
グループのブタの第１及び第２予防接種のために使用さ
れるワクチンを同定する。
【０２７０】
【表６】
【０２７１】すべてのブタは、予防接種の後、約１時
間、嘔吐、うつ病、下痢、運動失調−協調不能、高めら
れた呼吸、及び震えについて観察された。さらに、毎日
の観察は、最初及び２回目の予防接種に続いて、３日間
行なわれた。直腸温度を、予防接種の１日前、予防接種
の直前、予防接種の６時間後及び予防接種の１日後に記
載された。
【０２７２】２回目の予防接種の２週間後、ブタは、非
免疫ブタにおいて約５０％の死亡率を引き起こすAPP 血
清型−１（ATCC株27088 ）の生存ビルレント培養物によ
り鼻腔内攻撃された。1.5 ×10R7 cfu/ml を含む培養物
１．０ml（０．５ml／外鼻孔）の用量が使用された。す
べての動物は、１．０ml／５０ポンドの体重の速度で、
１ml当たり５０mgのテラゾール、５０mgのキシラジン及
び５０mgのケタミンの組合せから成るｉ．ｍ．注射によ
り、攻撃の前、麻酔された。
【０２７３】１０．２．結果 有意な体温の上昇は、本発明の組換えタンパク質による
第１回又は第２回目の予防接種の後、見出されなかっ
た。有意な後−ワクチン部位反応は、すべての他のグル
ープに比較して、市販のワクチンを受けた動物に観察さ
れた（表７）。新規のAPP タンパク質のみを受けた動物
（グループＣ）は、後−ワクチン部位反応を示さず、そ
して新規のAPP タンパク質及びApxI/ApxII/OmpA （５）
の組合せの第２回目の予防接種を受けた１匹の動物のみ
が、後−ワクチン部位反応を示した。
【０２７４】
【表７】
【０２７５】新規APP タンパク質及びApxI/ApxII/OmpA
（５）のすべてにより予防接種されたグループＡは、市
販のワクチンを含めて、いづれの他のグループよりも低
い死亡率を有した（30% vs.60%）（表８）。肺損傷の量
（％外傷率）はまた、グループＢ，Ｃ及び対照に比較し
て、グループＡにおいては低かったが、しかし市販のワ
クチンを受けた動物（グループＤ）において見られる肺
損傷には類似した。
【０２７６】
【表８】
【０２７７】それらの結果は、本発明の新規APP タンパ
ク質と毒素抗原との組合せから成るワクチンが異種APP
攻撃に対しての保護を付与することを示しており、この
保護は、市販のワクチンの保護に等しいか又は卓越して
いる。
【０２７８】１１．例：プラスミド及び寄託材料の調製 American Type Culture Collection(ATCC)への寄託のた
めに個々のAPP タンパク質をコードする別々のプラスミ
ド構造体を調製した。個々の構造体は、その生来のシグ
ナル配列と共に、特定のAPP タンパク質をコードする全
ORF を含んだ。ORF は、ラクトースプロモーターに対し
て反対方向に、pCR2.1TopoのＴＡクローニング部位にお
いて挿入された。ORF は、下記表９に列挙されるプライ
マーを用いて、APP 血清型−７ゲノムDNA からのPCR に
より得られた。宿主細胞及びベクターの両者は、Invitr
ogen(Carlsbad, CA)から入手できる。５’プライマーは
すべて、それぞれのORF のATG 開始コドンで開始する。
上記のようにして調製、そして下記表９に列挙される菌
株は、１９９８年１０月１５日、10801 University Blv
d, Manassas, VA, 20110, USA のATCCに寄託され、そし
て下記列挙される受託番号を割り当てられた。
【０２７９】
【表９】
【０２８０】上記に引用されるすべての特許、特許出願
及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。本発
明は、記載される特定の態様により範囲を限定されるも
のではなく、それらの態様は、本発明の個々の観点を単
に例示するためのものである。機能的に同等の組成物及
び方法は、本発明の範囲内である。
【０２８１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc. <120> NOVEL PROTEINS FROM ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE <130> PC9854A <140> <141> <160> 96 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1018 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> CDS <222> (272)..(787) <400> 1 ggttggaaaa caccttatga agtttacttc aaaaaatcgt tgcacttggt ttgacaattc 60 aagactaaaa atgaccggtc gtgagctaaa accgcatgac cgtactgtgg atgtgacgat 120 tcgtcgtatt cgtaaacact ttgaagatca ccctaataca ccggaaatca ttgtaaccat 180 tcatggtgaa ggttaccgtt tttgcggcga gttagagtag taattaaacg cctataagcg 240 tttagcatct tctttctaaa aaggacattt t atg aaa aat tta aca gtt tta 292 Met Lys Asn Leu Thr Val Leu 1 5 gca tta gca ggt tta ttc tct gcg tcg gca ttt gcc gca ccg gtc gga 340 Ala Leu Ala Gly Leu Phe Ser Ala Ser Ala Phe Ala Ala Pro Val Gly 10 15 20 aat acc ttt acc ggc gta ggc gta ggc gtt gat ctc acc acg gta aaa 388 Asn Thr Phe Thr Gly Val Gly Val Gly Val Asp Leu Thr Thr Val Lys 25 30 35 tat aaa gtg gac ggt gtg aaa ggt aaa caa tca acc ggt cct gcg tta 436 Tyr Lys Val Asp Gly Val Lys Gly Lys Gln Ser Thr Gly Pro Ala Leu 40 45 50 55 gtc gta gat tac ggt atg gat tac ggt gac aat ttt gtc ggt gtt gta 484 Val Val Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Gly Asp Asn Phe Val Gly Val Val 60 65 70 caa ggt aaa gta aaa gta ggc agt aca aaa gta ttt agc gat gta aaa 532 Gln Gly Lys Val Lys Val Gly Ser Thr Lys Val Phe Ser Asp Val Lys 75 80 85 caa aaa act aaa tat act gtc gct tat caa caa ggt tat cgt gta gct 580 Gln Lys Thr Lys Tyr Thr Val Ala Tyr Gln Gln Gly Tyr Arg Val Ala 90 95 100 tct gat tta ctt ccg tat gtc aaa gtc gat gtg gcg caa agt aaa gtc 628 Ser Asp Leu Leu Pro Tyr Val Lys Val Asp Val Ala Gln Ser Lys Val 105 110 115 ggc gat acc aat ttc cgt ggt tac ggt tac ggt gcc ggt gct aaa tat 676 Gly Asp Thr Asn Phe Arg Gly Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Lys Tyr 120 125 130 135 gcc gta tca agt aat gta gaa gtg ggt gcg gaa tat acg cgc agc aat 724 Ala Val Ser Ser Asn Val Glu Val Gly Ala Glu Tyr Thr Arg Ser Asn 140 145 150 tta aga aaa agc ggt gct aaa tta aaa ggt aat gaa ttt act gcg aac 772 Leu Arg Lys Ser Gly Ala Lys Leu Lys Gly Asn Glu Phe Thr Ala Asn 155 160 165 cta ggt tac cgt ttc taattatttt tcccttatga caagcggtcg tttcttgcaa 827 Leu Gly Tyr Arg Phe 170 aaaatttgcg aaaaacgacc gcttattttt ttattaatac tttatttact gagccatttt 887 ttcagctacg gttagaaaac cgtctgcagt cgcatagatt tcttcaaagc cttgcgcttg 947 tagaatacgg tcggacactt cacgaaatgc gccctctcca cctgcctttt ctaatatcca 1007 atccgctttt g 1018
【０２８２】 <210> 2 <211> 172 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 2 Met Lys Asn Leu Thr Val Leu Ala Leu Ala Gly Leu Phe Ser Ala Ser 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Pro Val Gly Asn Thr Phe Thr Gly Val Gly Val Gly 20 25 30 Val Asp Leu Thr Thr Val Lys Tyr Lys Val Asp Gly Val Lys Gly Lys 35 40 45 Gln Ser Thr Gly Pro Ala Leu Val Val Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Gly 50 55 60 Asp Asn Phe Val Gly Val Val Gln Gly Lys Val Lys Val Gly Ser Thr 65 70 75 80 Lys Val Phe Ser Asp Val Lys Gln Lys Thr Lys Tyr Thr Val Ala Tyr 85 90 95 Gln Gln Gly Tyr Arg Val Ala Ser Asp Leu Leu Pro Tyr Val Lys Val 100 105 110 Asp Val Ala Gln Ser Lys Val Gly Asp Thr Asn Phe Arg Gly Tyr Gly 115 120 125 Tyr Gly Ala Gly Ala Lys Tyr Ala Val Ser Ser Asn Val Glu Val Gly 130 135 140 Ala Glu Tyr Thr Arg Ser Asn Leu Arg Lys Ser Gly Ala Lys Leu Lys 145 150 155 160 Gly Asn Glu Phe Thr Ala Asn Leu Gly Tyr Arg Phe 165 170
【０２８３】 <210> 3 <211> 1188 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> CDS <222> (376)..(1020) <400> 3 ctaacgcata aagtaaatgt gccggttcaa tgtagttatt atcttttccg atagctaacg 60 attgggcttc tgcaagggct tcttgcaatt tggtagtaaa tttttcgaaa ttcatatttt 120 tactcctaaa tttcattaat ctgtatcgag cagaatttat accgcttcaa cgttttaata 180 aatggagcta gtcgaactta tttcaagtga aaatgtgaaa aagatcgcaa aaaataaatt 240 agtacctcgt tgtaggtact aaaatggcgt atatttgatt cttgtcaata aaagttagcc 300 gaattgttct tagaatgtta ttaacgtaac gaattggtta cttttttatt tttaagaaaa 360 tattaagagg tcaaa atg aaa aaa gca gta tta gcg gca gta tta ggc ggt 411 Met Lys Lys Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly 1 5 10 gcg tta tta gcg ggt tcg gca atg gca cat caa gcg ggc gat gtg att 459 Ala Leu Leu Ala Gly Ser Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Val Ile 15 20 25 ttc cgt gcc ggt gcg atc ggt gtg att gca aat tca agt tcg gat tat 507 Phe Arg Ala Gly Ala Ile Gly Val Ile Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr 30 35 40 caa acc ggg gcg gac gta aac tta gat gta aat aat aat att cag ctt 555 Gln Thr Gly Ala Asp Val Asn Leu Asp Val Asn Asn Asn Ile Gln Leu 45 50 55 60 ggt tta acc ggt acc tat atg tta agt gat aat tta ggt ctt gaa tta 603 Gly Leu Thr Gly Thr Tyr Met Leu Ser Asp Asn Leu Gly Leu Glu Leu 65 70 75 tta gcg gca aca ccg ttt tct cac aaa atc acc ggt aag tta ggt gca 651 Leu Ala Ala Thr Pro Phe Ser His Lys Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ala 80 85 90 aca gat tta ggc gaa gtg gca aaa gta aaa cat ctt ccg ccg agc ctt 699 Thr Asp Leu Gly Glu Val Ala Lys Val Lys His Leu Pro Pro Ser Leu 95 100 105 tac tta caa tat tat ttc ttt gat tct aat gcg aca gtt cgt cca tac 747 Tyr Leu Gln Tyr Tyr Phe Phe Asp Ser Asn Ala Thr Val Arg Pro Tyr 110 115 120 gtt ggt gcc ggt tta aac tat act cgc ttt ttc agt gct gaa agt tta 795 Val Gly Ala Gly Leu Asn Tyr Thr Arg Phe Phe Ser Ala Glu Ser Leu 125 130 135 140 aaa ccg caa tta gta caa aac tta cgt gtt aaa aaa cat tcc gtc gca 843 Lys Pro Gln Leu Val Gln Asn Leu Arg Val Lys Lys His Ser Val Ala 145 150 155 ccg att gcg aat tta ggt gtt gat gtg aaa tta acg gat aat cta tca 891 Pro Ile Ala Asn Leu Gly Val Asp Val Lys Leu Thr Asp Asn Leu Ser 160 165 170 ttc aat gcg gca gct tgg tac aca cgt att aaa act act gcc gat tat 939 Phe Asn Ala Ala Ala Trp Tyr Thr Arg Ile Lys Thr Thr Ala Asp Tyr 175 180 185 gat gtt ccg gga tta ggt cat gta agt aca ccg att act tta gat cct 987 Asp Val Pro Gly Leu Gly His Val Ser Thr Pro Ile Thr Leu Asp Pro 190 195 200 gtt gta tta ttc tca ggt att agc tac aaa ttc taagtatttt gaaactgtta 1040 Val Val Leu Phe Ser Gly Ile Ser Tyr Lys Phe 205 210 215 tgagaaaggg agcgttaatc gctccctttt tgttgtaaaa aatccttgaa aaacgaccgc 1100 ttgttaagca caaaaatgta ggatcatttt agtgagcaat tcacgagtcg gctcaataaa 1160 ttttgtttct aaaaattcat ccggctgg 1188
【０２８４】 <210> 4 <211> 215 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 4 Met Lys Lys Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ser Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Val Ile Phe Arg Ala Gly 20 25 30 Ala Ile Gly Val Ile Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Gln Thr Gly Ala 35 40 45 Asp Val Asn Leu Asp Val Asn Asn Asn Ile Gln Leu Gly Leu Thr Gly 50 55 60 Thr Tyr Met Leu Ser Asp Asn Leu Gly Leu Glu Leu Leu Ala Ala Thr 65 70 75 80 Pro Phe Ser His Lys Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ala Thr Asp Leu Gly 85 90 95 Glu Val Ala Lys Val Lys His Leu Pro Pro Ser Leu Tyr Leu Gln Tyr 100 105 110 Tyr Phe Phe Asp Ser Asn Ala Thr Val Arg Pro Tyr Val Gly Ala Gly 115 120 125 Leu Asn Tyr Thr Arg Phe Phe Ser Ala Glu Ser Leu Lys Pro Gln Leu 130 135 140 Val Gln Asn Leu Arg Val Lys Lys His Ser Val Ala Pro Ile Ala Asn 145 150 155 160 Leu Gly Val Asp Val Lys Leu Thr Asp Asn Leu Ser Phe Asn Ala Ala 165 170 175 Ala Trp Tyr Thr Arg Ile Lys Thr Thr Ala Asp Tyr Asp Val Pro Gly 180 185 190 Leu Gly His Val Ser Thr Pro Ile Thr Leu Asp Pro Val Val Leu Phe 195 200 205 Ser Gly Ile Ser Tyr Lys Phe 210 215
【０２８５】 <210> 5 <211> 1171 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> CDS <222> (157)..(930) <400> 5 tatttgagct taggctttaa taaagctcga atcctaagcc aggaaatata gaaagtacat 60 taaatataat ttagtattgt attaatagag gataaagcca caaactggca agcaagaatt 120 ggttttactt tttaacctca ctaaaaggag acaact atg aaa cat agc aaa ttc 174 Met Lys His Ser Lys Phe 1 5 aaa tta ttt aaa tat tat tta att agc ttt cct ttt att act ttt gca 222 Lys Leu Phe Lys Tyr Tyr Leu Ile Ser Phe Pro Phe Ile Thr Phe Ala 10 15 20 agt aat gtt aat gga gcc gaa att gga ttg gga gga gcc cgt gag agt 270 Ser Asn Val Asn Gly Ala Glu Ile Gly Leu Gly Gly Ala Arg Glu Ser 25 30 35 agt att tac tat tct aaa cat aaa gta gca aca aat ccc ttt tta gca 318 Ser Ile Tyr Tyr Ser Lys His Lys Val Ala Thr Asn Pro Phe Leu Ala 40 45 50 ctt gat ctt tct tta ggt aat ttt tat atg aga ggg act gca gga att 366 Leu Asp Leu Ser Leu Gly Asn Phe Tyr Met Arg Gly Thr Ala Gly Ile 55 60 65 70 agc gaa ata gga tat gaa caa tct ttc act gac aat ttc agc gta tca 414 Ser Glu Ile Gly Tyr Glu Gln Ser Phe Thr Asp Asn Phe Ser Val Ser 75 80 85 ctg ttt gtt aac cca ttt gat ggt ttt tca att aaa gga aaa gac ttg 462 Leu Phe Val Asn Pro Phe Asp Gly Phe Ser Ile Lys Gly Lys Asp Leu 90 95 100 tta cct gga tat caa agt att caa act cgc aaa act caa ttt gcc ttt 510 Leu Pro Gly Tyr Gln Ser Ile Gln Thr Arg Lys Thr Gln Phe Ala Phe 105 110 115 ggt tgg gga tta aat tat aat ttg gga ggt tta ttc ggc tta aat gat 558 Gly Trp Gly Leu Asn Tyr Asn Leu Gly Gly Leu Phe Gly Leu Asn Asp 120 125 130 act ttt ata tcc ttg gaa gga aaa agc gga aaa cgt ggt gcg agt agt 606 Thr Phe Ile Ser Leu Glu Gly Lys Ser Gly Lys Arg Gly Ala Ser Ser 135 140 145 150 aat gtc agc tta ctt aaa tcg ttt aat atg acg aaa aat tgg aaa gtt 654 Asn Val Ser Leu Leu Lys Ser Phe Asn Met Thr Lys Asn Trp Lys Val 155 160 165 tca cca tat att ggc tca agt tat tat tca tct aaa tat aca gat tat 702 Ser Pro Tyr Ile Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Lys Tyr Thr Asp Tyr 170 175 180 tac ttt ggt att aaa caa tcc gaa tta ggt aat aaa att aca tcc gta 750 Tyr Phe Gly Ile Lys Gln Ser Glu Leu Gly Asn Lys Ile Thr Ser Val 185 190 195 tat aaa cct aaa gca gct tat gca aca cac ata ggt att aat act gat 798 Tyr Lys Pro Lys Ala Ala Tyr Ala Thr His Ile Gly Ile Asn Thr Asp 200 205 210 tat gct ttc acg aac aat ctt ggc atg ggt tta tct gtc ggt tgg aat 846 Tyr Ala Phe Thr Asn Asn Leu Gly Met Gly Leu Ser Val Gly Trp Asn 215 220 225 230 aaa tat tct aaa gaa att aag caa tct cct atc ata aaa cga gac tct 894 Lys Tyr Ser Lys Glu Ile Lys Gln Ser Pro Ile Ile Lys Arg Asp Ser 235 240 245 caa ttt act tca tct ctt agc ctt tat tat aag ttc taaaatagaa 940 Gln Phe Thr Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Tyr Lys Phe 250 255 tattctaggg agaatactca ttctttatct ttataaagtt aattgtttct ccctgtttct 1000 atattattta gttacttgtt caaaagctac attggttatt ttgtcatttt ataaaagata 1060 ataaggtggt tattttgaaa attaagaaat atattaaata taccctattt actttccttt 1120 taggcatatc atatttatat tttgggggcg aaaacgaaaa ttatcaagag a 1171
【０２８６】 <210> 6 <211> 258 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 6 Met Lys His Ser Lys Phe Lys Leu Phe Lys Tyr Tyr Leu Ile Ser Phe 1 5 10 15 Pro Phe Ile Thr Phe Ala Ser Asn Val Asn Gly Ala Glu Ile Gly Leu 20 25 30 Gly Gly Ala Arg Glu Ser Ser Ile Tyr Tyr Ser Lys His Lys Val Ala 35 40 45 Thr Asn Pro Phe Leu Ala Leu Asp Leu Ser Leu Gly Asn Phe Tyr Met 50 55 60 Arg Gly Thr Ala Gly Ile Ser Glu Ile Gly Tyr Glu Gln Ser Phe Thr 65 70 75 80 Asp Asn Phe Ser Val Ser Leu Phe Val Asn Pro Phe Asp Gly Phe Ser 85 90 95 Ile Lys Gly Lys Asp Leu Leu Pro Gly Tyr Gln Ser Ile Gln Thr Arg 100 105 110 Lys Thr Gln Phe Ala Phe Gly Trp Gly Leu Asn Tyr Asn Leu Gly Gly 115 120 125 Leu Phe Gly Leu Asn Asp Thr Phe Ile Ser Leu Glu Gly Lys Ser Gly 130 135 140 Lys Arg Gly Ala Ser Ser Asn Val Ser Leu Leu Lys Ser Phe Asn Met 145 150 155 160 Thr Lys Asn Trp Lys Val Ser Pro Tyr Ile Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser 165 170 175 Ser Lys Tyr Thr Asp Tyr Tyr Phe Gly Ile Lys Gln Ser Glu Leu Gly 180 185 190 Asn Lys Ile Thr Ser Val Tyr Lys Pro Lys Ala Ala Tyr Ala Thr His 195 200 205 Ile Gly Ile Asn Thr Asp Tyr Ala Phe Thr Asn Asn Leu Gly Met Gly 210 215 220 Leu Ser Val Gly Trp Asn Lys Tyr Ser Lys Glu Ile Lys Gln Ser Pro 225 230 235 240 Ile Ile Lys Arg Asp Ser Gln Phe Thr Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Tyr 245 250 255 Lys Phe
【０２８７】 <210> 7 <211> 1922 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> CDS <222> (614)..(1705) <400> 7 acggtaacta cttattcttc tcatgttgca acgccaattc ttgcagagaa attaatcccg 60 atgttacaaa aaggcgactt aggggagccg acacctgctg ctgaaatcga caacgtttac 120 ttacgtgata tcaacgatgc aatccgtaac catccggttg aattaatcgg tcaagagtta 180 cgtggttata tgacggatat gaaacgtatt tcatcgcaag gttaattaaa aattaatcaa 240 aagcctactt cgcaagaagt gggctttttg ttattcaagc cgcttaccgc tatcaatggt 300 aagtgatatg cataatagct tataaattat aagttgtttt aagcaaatat atctctatcg 360 gtaagtaaaa aattaattgt agatcattaa aaaacggata aaaaaatcta ttttttgagt 420 gaattacgca taaaaaatga tctaaattat aggtttagtt gtatttttca atttttattt 480 ggtagaatac aactgtaata aaagcttaat tattttgaga tacacataaa ataatttacg 540 gctttattca ttatcccttt taggttaggg atttgtcttt aatagatgac gataaattta 600 gaggatcatc aaa atg aaa aaa tca tta gtt gct tta aca gta tta tcg 649 Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Thr Val Leu Ser 1 5 10 gct gca gcg gta gct caa gca gcg cca caa caa aat act ttc tac gca 697 Ala Ala Ala Val Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala 15 20 25 ggt gcg aaa gca ggt tgg gcg tca ttc cat gat ggt atc gaa caa tta 745 Gly Ala Lys Ala Gly Trp Ala Ser Phe His Asp Gly Ile Glu Gln Leu 30 35 40 gat tca gct aaa aac aca gat cgc ggt aca aaa tac ggt atc aac cgt 793 Asp Ser Ala Lys Asn Thr Asp Arg Gly Thr Lys Tyr Gly Ile Asn Arg 45 50 55 60 aat tca gta act tac ggc gta ttc ggc ggt tac caa att tta aac caa 841 Asn Ser Val Thr Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Leu Asn Gln 65 70 75 gac aaa tta ggt tta gcg gct gaa tta ggt tat gac tat ttc ggt cgt 889 Asp Lys Leu Gly Leu Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr Phe Gly Arg 80 85 90 gtg cgc ggt tct gaa aaa cca aac ggt aaa gcg gac aag aaa act ttc 937 Val Arg Gly Ser Glu Lys Pro Asn Gly Lys Ala Asp Lys Lys Thr Phe 95 100 105 cgt cac gct gca cac ggt gcg aca atc gca tta aaa cct agc tac gaa 985 Arg His Ala Ala His Gly Ala Thr Ile Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu 110 115 120 gta tta cct gac tta gac gtt tac ggt aaa gta ggt atc gca tta gta 1033 Val Leu Pro Asp Leu Asp Val Tyr Gly Lys Val Gly Ile Ala Leu Val 125 130 135 140 aac aat aca tat aaa aca ttc aat gca gca caa gag aaa gtg aaa act 1081 Asn Asn Thr Tyr Lys Thr Phe Asn Ala Ala Gln Glu Lys Val Lys Thr 145 150 155 cgt cgt ttc caa agt tct tta att tta ggt gcg ggt gtt gag tac gca 1129 Arg Arg Phe Gln Ser Ser Leu Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr Ala 160 165 170 att ctt cct gaa tta gcg gca cgt gtt gaa tac caa tgg tta aac aac 1177 Ile Leu Pro Glu Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Trp Leu Asn Asn 175 180 185 gca ggt aaa gca agc tac tct act tta aat cgt atg ggt gca act gac 1225 Ala Gly Lys Ala Ser Tyr Ser Thr Leu Asn Arg Met Gly Ala Thr Asp 190 195 200 tac cgt tcg gat atc agt tcc gta tct gca ggt tta agc tac cgt ttc 1273 Tyr Arg Ser Asp Ile Ser Ser Val Ser Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe 205 210 215 220 ggt caa ggt gcg gta ccg gtt gca gct ccg gca gtt gaa act aaa aac 1321 Gly Gln Gly Ala Val Pro Val Ala Ala Pro Ala Val Glu Thr Lys Asn 225 230 235 ttc gca ttc agc tct gac gta tta ttc gca ttc ggt aaa tca aac tta 1369 Phe Ala Phe Ser Ser Asp Val Leu Phe Ala Phe Gly Lys Ser Asn Leu 240 245 250 aaa ccg gct gcg gca aca gca tta gat gca atg caa acc gaa atc aat 1417 Lys Pro Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asp Ala Met Gln Thr Glu Ile Asn 255 260 265 aac gca ggt tta tca aat gct gcg atc caa gta aac ggt tac acg gac 1465 Asn Ala Gly Leu Ser Asn Ala Ala Ile Gln Val Asn Gly Tyr Thr Asp 270 275 280 cgt atc ggt aaa gaa gct tca aac tta aaa ctt tca caa cgt cgt gcg 1513 Arg Ile Gly Lys Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg Ala 285 290 295 300 gaa aca gta gct aac tac atc gtt tct aaa ggt gct ccg gca gct aac 1561 Glu Thr Val Ala Asn Tyr Ile Val Ser Lys Gly Ala Pro Ala Ala Asn 305 310 315 gta act gca gta ggt tac ggt gaa gca aac cct gta acc ggc gca aca 1609 Val Thr Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Val Thr Gly Ala Thr 320 325 330 tgt gac aaa gtt aaa ggt cgt aaa gca tta atc gct tgc tta gca ccg 1657 Cys Asp Lys Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala Pro 335 340 345 gat cgt cgt gtt gaa gtt caa gtt caa ggt act aaa gaa gta act atg 1705 Asp Arg Arg Val Glu Val Gln Val Gln Gly Thr Lys Glu Val Thr Met 350 355 360 taatttagtt aattttctaa agttaaatta gtaaccctct tgcttattta agcaagaggg 1765 ttattttttt gttccatttt aattagtgct actcttcctg tgtttatatt tgtgtttatg 1825 ataaactctt cataactttt attcacttat agatgaaaat gaaatacagc ttaacccctt 1885 tccatacctt tcatttagcg gcaaatgcaa caaaatc 1922
【０２８８】 <210> 8 <211> 364 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 8 Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Thr Val Leu Ser Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Ala Lys Ala 20 25 30 Gly Trp Ala Ser Phe His Asp Gly Ile Glu Gln Leu Asp Ser Ala Lys 35 40 45 Asn Thr Asp Arg Gly Thr Lys Tyr Gly Ile Asn Arg Asn Ser Val Thr 50 55 60 Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Leu Asn Gln Asp Lys Leu Gly 65 70 75 80 Leu Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr Phe Gly Arg Val Arg Gly Ser 85 90 95 Glu Lys Pro Asn Gly Lys Ala Asp Lys Lys Thr Phe Arg His Ala Ala 100 105 110 His Gly Ala Thr Ile Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu Val Leu Pro Asp 115 120 125 Leu Asp Val Tyr Gly Lys Val Gly Ile Ala Leu Val Asn Asn Thr Tyr 130 135 140 Lys Thr Phe Asn Ala Ala Gln Glu Lys Val Lys Thr Arg Arg Phe Gln 145 150 155 160 Ser Ser Leu Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr Ala Ile Leu Pro Glu 165 170 175 Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Ala 180 185 190 Ser Tyr Ser Thr Leu Asn Arg Met Gly Ala Thr Asp Tyr Arg Ser Asp 195 200 205 Ile Ser Ser Val Ser Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Gly Ala 210 215 220 Val Pro Val Ala Ala Pro Ala Val Glu Thr Lys Asn Phe Ala Phe Ser 225 230 235 240 Ser Asp Val Leu Phe Ala Phe Gly Lys Ser Asn Leu Lys Pro Ala Ala 245 250 255 Ala Thr Ala Leu Asp Ala Met Gln Thr Glu Ile Asn Asn Ala Gly Leu 260 265 270 Ser Asn Ala Ala Ile Gln Val Asn Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Lys 275 280 285 Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg Ala Glu Thr Val Ala 290 295 300 Asn Tyr Ile Val Ser Lys Gly Ala Pro Ala Ala Asn Val Thr Ala Val 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Val Thr Gly Ala Thr Cys Asp Lys Val 325 330 335 Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val 340 345 350 Glu Val Gln Val Gln Gly Thr Lys Glu Val Thr Met 355 360
【０２８９】 <210> 9 <211> 1319 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> CDS <222> (197)..(1303) <400> 9 atgtaatatt aggactggaa agttcgaaat tacaaattga tattacaaat tgattgtagt 60 tttgcttttt atccttgata attaactctc ttttttctct agtgagacga gagcattaaa 120 tcaaaacttt ggtgccataa gcggtgctga agtgattttg ttttattaat cgatgacaat 180 ttagaggatc atcaaa atg aaa aaa tca tta gtt gct tta gca gta tta tca 232 Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Ala Val Leu Ser 1 5 10 gct gca gca gta gct caa gca gct cca caa caa aat act ttc tac gca 280 Ala Ala Ala Val Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala 15 20 25 ggt gcg aaa gtt ggt caa tca tca ttt cac cac ggt gtt aac caa tta 328 Gly Ala Lys Val Gly Gln Ser Ser Phe His His Gly Val Asn Gln Leu 30 35 40 aaa tct ggt cac gat gat cgt tat aat gat aaa aca cgt aag tat ggt 376 Lys Ser Gly His Asp Asp Arg Tyr Asn Asp Lys Thr Arg Lys Tyr Gly 45 50 55 60 atc aac cgt aac tct gta act tac ggt gta ttc ggc ggt tac caa atc 424 Ile Asn Arg Asn Ser Val Thr Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile 65 70 75 tta aac caa aac aat ttc ggt tta gcg act gaa tta ggt tat gat tac 472 Leu Asn Gln Asn Asn Phe Gly Leu Ala Thr Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr 80 85 90 tac ggt cgt gta cgt ggt aac gat ggt gaa ttc cgt gca atg aaa cac 520 Tyr Gly Arg Val Arg Gly Asn Asp Gly Glu Phe Arg Ala Met Lys His 95 100 105 tct gct cac ggt tta aac ttt gcg tta aaa cca agc tac gaa gta tta 568 Ser Ala His Gly Leu Asn Phe Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu Val Leu 110 115 120 cct gac tta gac gtt tac ggt aaa gta ggt gtt gcg gtt gtt cgt aac 616 Pro Asp Leu Asp Val Tyr Gly Lys Val Gly Val Ala Val Val Arg Asn 125 130 135 140 gac tat aaa tcc tat ggt gca gaa aac act aac gaa cca aca gaa aaa 664 Asp Tyr Lys Ser Tyr Gly Ala Glu Asn Thr Asn Glu Pro Thr Glu Lys 145 150 155 ttc cat aaa tta aaa gca tca act att tta ggt gca ggt gtt gag tac 712 Phe His Lys Leu Lys Ala Ser Thr Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr 160 165 170 gca att ctt cct gaa tta gcg gca cgt gtt gaa tac caa tac tta aac 760 Ala Ile Leu Pro Glu Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Tyr Leu Asn 175 180 185 aaa gcg ggt aac tta aat aaa gca tta gtt cgt tca ggc aca caa gat 808 Lys Ala Gly Asn Leu Asn Lys Ala Leu Val Arg Ser Gly Thr Gln Asp 190 195 200 gtg gac ttc caa tat gct cct gat atc cac tct gta aca gca ggt tta 856 Val Asp Phe Gln Tyr Ala Pro Asp Ile His Ser Val Thr Ala Gly Leu 205 210 215 220 tca tac cgt ttc ggt caa ggc gct gta gca cca gtt gtt gag cca gaa 904 Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Gly Ala Val Ala Pro Val Val Glu Pro Glu 225 230 235 gtt gta act aaa aac ttc gca ttc agc tca gac gtt tta ttt gat ttc 952 Val Val Thr Lys Asn Phe Ala Phe Ser Ser Asp Val Leu Phe Asp Phe 240 245 250 ggt aaa tca agc tta aaa cca gca gca gca aca gct tta gac gca gct 1000 Gly Lys Ser Ser Leu Lys Pro Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asp Ala Ala 255 260 265 aac act gaa atc gct aac tta ggt tta gca act cca gct atc caa gtt 1048 Asn Thr Glu Ile Ala Asn Leu Gly Leu Ala Thr Pro Ala Ile Gln Val 270 275 280 aac ggt tat aca gac cgt atc ggt aaa gaa gct tca aac tta aaa ctt 1096 Asn Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Lys Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu 285 290 295 300 tca caa cgc cgt gca gaa act gta gct aac tac tta gtt tct aaa ggt 1144 Ser Gln Arg Arg Ala Glu Thr Val Ala Asn Tyr Leu Val Ser Lys Gly 305 310 315 caa aac cct gca aac gta act gca gta ggt tac ggt gaa gca aac cca 1192 Gln Asn Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro 320 325 330 gta acc ggc gca aca tgt gac aaa gtt aaa ggt cgt aaa gca tta atc 1240 Val Thr Gly Ala Thr Cys Asp Lys Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile 335 340 345 gct tgc tta gca ccg gat cgt cgt gtt gaa gtt caa gta caa ggt gct 1288 Ala Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Val Gln Val Gln Gly Ala 350 355 360 aaa aac gta gct atg taatatagtg ggtttt 1319 Lys Asn Val Ala Met 365
【０２９０】 <210> 10 <211> 369 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 10 Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Ala Lys Val 20 25 30 Gly Gln Ser Ser Phe His His Gly Val Asn Gln Leu Lys Ser Gly His 35 40 45 Asp Asp Arg Tyr Asn Asp Lys Thr Arg Lys Tyr Gly Ile Asn Arg Asn 50 55 60 Ser Val Thr Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Leu Asn Gln Asn 65 70 75 80 Asn Phe Gly Leu Ala Thr Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr Tyr Gly Arg Val 85 90 95 Arg Gly Asn Asp Gly Glu Phe Arg Ala Met Lys His Ser Ala His Gly 100 105 110 Leu Asn Phe Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu Val Leu Pro Asp Leu Asp 115 120 125 Val Tyr Gly Lys Val Gly Val Ala Val Val Arg Asn Asp Tyr Lys Ser 130 135 140 Tyr Gly Ala Glu Asn Thr Asn Glu Pro Thr Glu Lys Phe His Lys Leu 145 150 155 160 Lys Ala Ser Thr Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr Ala Ile Leu Pro 165 170 175 Glu Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Tyr Leu Asn Lys Ala Gly Asn 180 185 190 Leu Asn Lys Ala Leu Val Arg Ser Gly Thr Gln Asp Val Asp Phe Gln 195 200 205 Tyr Ala Pro Asp Ile His Ser Val Thr Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe 210 215 220 Gly Gln Gly Ala Val Ala Pro Val Val Glu Pro Glu Val Val Thr Lys 225 230 235 240 Asn Phe Ala Phe Ser Ser Asp Val Leu Phe Asp Phe Gly Lys Ser Ser 245 250 255 Leu Lys Pro Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asp Ala Ala Asn Thr Glu Ile 260 265 270 Ala Asn Leu Gly Leu Ala Thr Pro Ala Ile Gln Val Asn Gly Tyr Thr 275 280 285 Asp Arg Ile Gly Lys Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg 290 295 300 Ala Glu Thr Val Ala Asn Tyr Leu Val Ser Lys Gly Gln Asn Pro Ala 305 310 315 320 Asn Val Thr Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Val Thr Gly Ala 325 330 335 Thr Cys Asp Lys Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala 340 345 350 Pro Asp Arg Arg Val Glu Val Gln Val Gln Gly Ala Lys Asn Val Ala 355 360 365 Met
【０２９１】 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> SITE <222> (18) <223> Xaa=unknown amino acid <400> 11 Ala Pro Val Gly Asn Thr Phe Thr Gly Val Lys Val Tyr Val Asp Leu 1 5 10 15 Thr Xaa Val Ala 20
【０２９２】 <210> 12 <211> 35 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> SITE <222> (30) <223> Xaa=Asn or Val <400> 12 His Gln Ala Gly Asp Val Ile Phe Arg Ala Gly Ala Ile Gly Val Ile 1 5 10 15 Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Gln Thr Gln Ala Asp Val Xaa Leu Asp 20 25 30 Val Asn Asn 35
【０２９３】 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 13 Ala Glu Ile Gly Leu Gly Gly Ala Arg Glu Ser Ser Ile Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Lys His Lys Val Ala Thr Asn Pro Phe Leu Ala Leu Asp Leu 20 25 30
【０２９４】 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa=Asp or Glu <220> <221> SITE <222> (14) <223> Xaa=unknown amino acid <220> <221> SITE <222> (15) <223> Xaa=unknown amino acid <220> <221> SITE <222> (17) <223> Xaa=unknown amino acid <400> 14 Ala Xaa Pro Glu Asn Thr Phe Tyr Pro Gly Ala Lys Val Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Phe His
【０２９５】 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 aaaaatttgc gaaaaacgac 20
【０２９６】 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 acttctacat tacttgatac 20
【０２９７】 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 tccgtatgtc aaagtcgatg 20
【０２９８】 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 taaacaatca accggtcctg 20
【０２９９】 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 19 ttaccttgta caacaccgac 20
【０３００】 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 aaaagcagta ttagcggcag 20
【０３０１】 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 21 ttgatgtgcc attgccgaac 20
【０３０２】 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 gttttaaact ttcagcactg 20
【０３０３】 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 23 agttcgtcca tacgttggtg 20
【０３０４】 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 aatatatctc tatcggtaag 20
【０３０５】 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 25 ctaaacctat aatttagatc 20
【０３０６】 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 26 tgtttccgca cgacgttgtg 20
【０３０７】 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 27 aagtaaacgg ttacacggac 20
【０３０８】 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 atcaaccgta attcagtaac 20
【０３０９】 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 29 atagtcataa cctaattcag 20
【０３１０】 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 30 gtatgggtgc aactgactac 20
【０３１１】 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 31 aacacgtgcc gctaattcag 20
【０３１２】 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 32 tgcttgagct accgctgcag 20
【０３１３】 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 33 gcgaaagttg gtcaatcatc 20
【０３１４】 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 34 ataacgatca tcgtgaccag 20
【０３１５】 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 35 tgcgtctaaa gctgttgctg 20
【０３１６】 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 36 atcaagctta aaaccagcag 20
【０３１７】 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 37 ctataaatcc tatggtgcag 20
【０３１８】 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 38 tgcacctaaa atagttgatg 20
【０３１９】 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 39 ggggatccgc dccdgtdggh aatacnttta cngg 34
【０３２０】 <210> 40 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 40 ggggatccat ytattatwsw aaacataaag tdgcdacnaa tcc 43
【０３２１】 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 41 ggggatccgt accgcgatct gtgtttttag 30
【０３２２】 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 42 ggggatccgg tgctccggca gctaacg 27
【０３２３】 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 43 ggggatccat acttacgtgt tttatcatta taacg 35
【０３２４】 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 44 ggggatccgg tcaaaaccct gcaaacg 27
【０３２５】 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 45 tttgcccggg ctcttttatt gatttaagtt act 33
【０３２６】 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 46 gactaacgca ggaccggttg attg 24
【０３２７】 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 47 ggggatccgt gggtgcggaa tatacgcgca g 31
【０３２８】 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 48 caacgtggat ccgaattcaa gcttc 25
【０３２９】 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 49 gtcaccgtaa tccataccgt aatg 24
【０３３０】 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 50 gattgtttac ctttcacacc gtccac 26
【０３３１】 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 51 tcacccggga aaaatatcta gaaacgg 27
【０３３２】 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 52 ccgtggtgag atcaacgcct acgcctac 28
【０３３３】 <210> 53 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 53 cctttcacac cgtccacttt atattttacc gtggtgag 38
【０３３４】 <210> 54 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 54 gcgcatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtgcac cggtcggaaa tacctttacc 60 ggcgtagg 68
【０３３５】 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 55 caagactaaa aatgaccggt cgtg 24
【０３３６】 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 56 tgaatttacg accacgtaaa tgttt 25
【０３３７】 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 57 ctatgtgaaa gcaaaagcgg attgg 25
【０３３８】 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 58 ccgtccggtt gtttgactaa cgc 23
【０３３９】 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 59 tcgaacaagc acaccagccg gatg 24
【０３４０】 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 60 ggcggaatac ggtaactact tattc 25
【０３４１】 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 61 cgcataaaaa atgatctaaa ttatagg 27
【０３４２】 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 62 ggggaattca acgattttgc ttgc 24
【０３４３】 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 63 gaattcttgc tcgtttgaat tagaag 26
【０３４４】 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 64 ggtaattttt atatgagagg gactg 25
【０３４５】 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 65 caaacagtga tacgctgaaa ttgtc 25
【０３４６】 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 66 gcaacacaca taggtattaa tactg 25
【０３４７】 <210> 67 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 67 gcgcatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtgccg aaattggatt gggaggagcc 60 cgtgag 66
【０３４８】 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 68 gtattctctc tagaatattc tattttag 28
【０３４９】 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 69 gccacatgaa gaattattat ttgagct 27
【０３５０】 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 70 acgtgaaaaa taatctcttg ataat 25
【０３５１】 <210> 71 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 71 cgccatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtcatc aggcgggaga tgtgattttc 60
【０３５２】 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 72 caycargcdg ghgatgtdat ytt 23
【０３５３】 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 73 gcdgadccdg araayacdtt yta 23
【０３５４】 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 74 accggtacct atatgttaag tg 22
【０３５５】 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 75 ataggtaccg gttaaaccaa gc 22
【０３５６】 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 76 gttgccgcta ataattcaag acc 23
【０３５７】 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 77 aayacnttyt ayccdggngc naa 23
【０３５８】 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 78 nacdckdckr tcnggngcna rrca 24
【０３５９】 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 79 datytcnacd ckdckrtcng g 21
【０３６０】 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 80 cgctctagag attttttaca acaaaaaggg 30
【０３６１】 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 81 gmnaayacnt tytaygyngg ngc 23
【０３６２】 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 82 aayacnttyt aygynggngc naar 24
【０３６３】 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 83 cargmnaaya cnttytaygy ngg 23
【０３６４】 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 84 gcnccncarg mnaayacntt yta 23
【０３６５】 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 85 cgcgcnccnc argmnaayac ntt 23
【０３６６】 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 86 cggtcgactg atttaagtta ctaaaaccc 29
【０３６７】 <210> 87 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 87 cggtcgacgg gttactaatt taactttag 29
【０３６８】 <210> 88 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 88 gcgtcgacca tatgaacacc accaccacca ccacctctcg tgcgccacaa caaaatactt 60 tytacgc 67
【０３６９】 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 89 atgaaaaatt taacagtttt agcattagca gg 32
【０３７０】 <210> 90 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 90 atgaaacata gcaaattcaa attatttaaa tattattt 38
【０３７１】 <210> 91 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 91 atgaaaaaag cagtattagc ggcagtatta gg 32
【０３７２】 <210> 92 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 92 atgaaaaaat cattagttgc tttaacagta ttatcg 36
【０３７３】 <210> 93 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 93 atgaaaaaat cattagttgc tttagcagta ttatca 36
【０３７４】 <210> 94 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:N-terminal consensus sequence of OmpA-related proteins from Pasteurellaceae <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa=Ala or Glu <220> <221> SITE <222> (9) <223> Xaa=Ala or Val <400> 94 Ala Pro Gln Xaa Asn Thr Phe Tyr Xaa Gly Ala Lys Ala 1 5 10
【０３７５】 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:C-terminal consensus sequence of OmpA-related proteins from Pasteurellaceae <400> 95 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile 1 5 10
【０３７６】 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:protective peptide <400> 96 Met Asn Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg 1 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、APP 血清型−５により攻撃され、そし
てAPP 血清型−７により再攻撃されたブタからの（Ａ）
血清及び（Ｂ）気管支リンパ節（BLN ）組織外植体上清
液に存在する抗体のウェスターンブロットを示す。
【図２】これは、１２種の異なったAPP 血清型からの細
菌細胞抗原に対するブタからのBLN 組織外植体上清液に
存在する抗体の交差反応性のウェスターンブロット分析
を示す。
【図３】これは、低分子量タンパク質に対するブタから
のBLN 組織外植体上清液及び細胞ペレット（細胞）に存
在する抗体の反応性のウェスターンブロット分析を示
す。
【図４】これは、APP 血清型−７に対するブタからの
（Ａ）BLN 組織外植体上清液、及び（Ｂ）血清の反応性
の電気泳動によるウェスターンブロット分析を示す。
【図５】これは、APP OmpA1 及びAPP OmpA2 タンパク質
の推定されるアミノ酸配列の列挙を示す。
【図６】こけは、ビブリオコレラからのOmpWタンパク質
及びAPP からのOmpWタンパク質のアミノ酸配列の列挙を
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｈ０４５ 16/12 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者 メアリー ジョー バーシュ アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー インコーポレイティド (72)発明者 マニュエル キャンポス アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー インコーポレイティド (72)発明者 ロビン リー キーチ アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー インコーポレイティド (72)発明者 エブレット リー ロージー アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー インコーポレイティド (72)発明者 リン マリー ウォーレン ステュワート アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタン ポイント ロー ド，ファイザー インコーポレイティド (72)発明者 ブライアン トーマス スーター アメリカ合衆国，ネブラスカ 68521，リ ンカーン，ウエスト コーンハスカー ハ イウェイ 601，ファイザー インコーポ レイティド Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA61 CA02 DA06 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ79 QR32 QR48 QR51 QR55 QS33 QS34 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02 CA24 CA26 CA27 CA44 CA46 4C084 AA19 MA02 NA14 ZA592 ZB072 ZB352 4C085 AA03 BA15 BB11 CC05 CC07 DD22 EE01 GG01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 DA75 DA86 EA20 EA50 FA74

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミノ
    酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミノ
    酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミノ
    酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０〜
    アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ酸
    配列を有する実質的に精製されたタンパク質。
  2. 【請求項２】 配列番号４，６，８及び１０から成る群
    から選択されたアミノ酸配列を有する請求項１記載のタ
    ンパク質。
  3. 【請求項３】 （１）配列番号４のアミノ酸残基２２〜
    アミノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜
    アミノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜
    アミノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基
    ２０〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたア
    ミノ酸配列に対しておよそ７０％以上の配列同一性を有
    し； （２）配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミノ酸残基２
    １５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミノ酸残基２
    ５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３
    ６４、又は配列番号１０のアミノ酸残基２０〜アミノ酸
    残基３６９のアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸
    の保存的アミノ酸置換により異り；そして （３）動物に投与した場合にＡＰＰ−特異的抗体を誘導
    するのに使用し得る；アミノ酸配列を有する、実質的に
    精製されたタンパク質。
  4. 【請求項４】 （１）配列番号４，６，８及び１０から
    成る群から選択されたアミノ酸配列に対しておよそ７０
    ％以上の配列同一性を有し； （２）配列番号：４，６，８又は１０のアミノ酸配列か
    ら、１〜複数個のアミノ酸の保存的アミノ酸置換により
    異り；そして （３）動物に投与した場合にＡＰＰ−特異的抗体を誘導
    するのに使用し得る；アミノ酸配列を有する、実質的に
    精製されたポリペプチド。
  5. 【請求項５】 （ａ）配列番号４のアミノ酸残基２２〜
    アミノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜
    アミノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜
    アミノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基
    ２０〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたア
    ミノ酸配列を有するポリペプチドのペプチドフラグメン
    トである実質的に精製されたポリペプチド。
  6. 【請求項６】 配列番号４，６，８及び１０から成る群
    から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのペ
    プチドフラグメントである請求項５記載のポリペプチ
    ド。
  7. 【請求項７】 配列番号４のアミノ酸残基１〜アミノ酸
    残基２１、配列番号６のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基
    ２７、配列番号８のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基１
    ９、及び配列番号１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基
    １９から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請
    求項６記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 キャリヤー又は融合パートナーに連結さ
    れた、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミノ酸
    残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミノ酸
    残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミノ酸
    残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０〜ア
    ミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ酸配
    列を有するポリペプチド；又は（ｂ）前記（ａ）のポリ
    ペプチドのペプチドフラグメント、を有する融合タンパ
    ク質。
  9. 【請求項９】 前記融合パートナーが、保護ペプチド、
    β−ガラクトシダーゼ、trpE、マルトース−結合タンパ
    ク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びポリ
    ヒスチジンから成る群から選択される請求項８記載の融
    合タンパク質。
  10. 【請求項１０】 前記融合パートナーが、アミノ酸配列
    Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg （配列番号
    ９６）を含んで成る保護ペプチドである請求項９記載の
    融合タンパク質。
  11. 【請求項１１】 （ａ）配列番号４のアミノ酸残基２２
    〜アミノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８
    〜アミノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０
    〜アミノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残
    基２０〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択された
    アミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのペプチドフラグメン
    ト；あるいは（ｃ）キャリヤー又は融合パートナーに連
    結された、前記（ａ）のポリペプチド又は（ｂ）のペプ
    チドフラグメントを含んで成る融合タンパク質、の類似
    体又は誘導体。
  12. 【請求項１２】 配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミ
    ノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミ
    ノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミ
    ノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０
    〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  13. 【請求項１３】 配列番号３のnt４３９〜nt１０２３の
    ヌクレオチド配列を含んで成る、配列番号４のアミノ酸
    残基２２〜アミノ酸残基２１５のアミノ酸配列をコード
    する請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  14. 【請求項１４】 配列番号４のアミノ酸配列をコードす
    る請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  15. 【請求項１５】 配列番号３のnt３７６〜nt１０２３の
    ヌクレオチド配列を含んで成る請求項１４記載の単離さ
    れたポリヌクレオチド分子。
  16. 【請求項１６】 配列番号３のヌクレオチド配列を含ん
    で成る請求項１５記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  17. 【請求項１７】 配列番号５のnt２３８〜nt９３３のヌ
    クレオチド配列を含んで成る、配列番号６のアミノ酸残
    基２８〜アミノ酸残基２５８のアミノ酸配列をコードす
    る請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  18. 【請求項１８】 配列番号６のアミノ酸配列をコードす
    る請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  19. 【請求項１９】 配列番号５のnt１５７〜nt９３３のヌ
    クレオチド配列を含んで成る請求項１８記載の単離され
    たポリヌクレオチド分子。
  20. 【請求項２０】 配列番号５のヌクレオチド配列を含ん
    で成る請求項１９記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  21. 【請求項２１】 配列番号７のnt６７１〜nt１７０８の
    ヌクレオチド配列を含んで成る、配列番号８のアミノ酸
    残基２０〜アミノ酸残基３６４のアミノ酸配列をコード
    する請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  22. 【請求項２２】 配列番号８のアミノ酸配列をコードす
    る請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  23. 【請求項２３】 配列番号７のnt６１４〜nt１７０８の
    ヌクレオチド配列を含んで成る請求項２２記載の単離さ
    れたポリヌクレオチド分子。
  24. 【請求項２４】 配列番号７のヌクレオチド配列を含ん
    で成る請求項２３記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  25. 【請求項２５】 配列番号９のnt２５４〜nt１３０６の
    ヌクレオチド配列を含んで成る、配列番号１０のアミノ
    酸残基２０〜アミノ酸残基３６９のアミノ酸配列をコー
    ドする請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  26. 【請求項２６】 配列番号１０のアミノ酸配列をコード
    する請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  27. 【請求項２７】 配列番号９のnt１９７〜nt１３０６の
    ヌクレオチド配列を含んで成る請求項２６記載の単離さ
    れたポリヌクレオチド分子。
  28. 【請求項２８】 配列番号９のヌクレオチド配列を含ん
    で成る請求項２７記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  29. 【請求項２９】 配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミ
    ノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミ
    ノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミ
    ノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０
    〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対し
    て高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし；且
    つ、動物に投与した場合にＡＰＰ−特異的抗体の生産を
    誘導するために使用することができるポリペプチドをコ
    ードし、又はＡＰＰに感染したブタからの流体サンプル
    もしくは組織サンプル中のＡＰＰ−特異的ポリヌクレオ
    チド分子の存在を検出する診断剤として使用することが
    できる、単離されたポリヌクレオチド分子。
  30. 【請求項３０】 配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミ
    ノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミ
    ノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミ
    ノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０
    〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列の実質的な部分であるヌクレオチド配列から成
    る単離されたポリヌクレオチド分子。
  31. 【請求項３１】 配列番号４のアミノ酸残基１〜アミノ
    酸残基２１、配列番号６のアミノ酸残基１〜アミノ酸残
    基２７、配列番号８のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基１
    ９、及び配列番号１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基
    １９から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の相補体
    に対して高緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
    オチド分子の実質的部分であり；且つ、動物に投与した
    場合にＡＰＰ−特異的抗体の生産を誘導するために使用
    することができるポリペプチドをコードし、又はＡＰＰ
    に感染したブタからの流体サンプルもしくは組織サンプ
    ル中のＡＰＰ−特異的ポリヌクレオチド分子の存在を検
    出する診断剤として使用することができる、ヌクレオチ
    ド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  32. 【請求項３２】 配列番号４のアミノ酸残基１〜アミノ
    酸残基２１、配列番号６のアミノ酸残基１〜アミノ酸残
    基２７、配列番号８のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基１
    ９、及び配列番号１０のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基
    １９から成る群から選択されたアミノ酸配列をコードす
    るヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
    オチド分子。
  33. 【請求項３３】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号３
    のnt３７６〜nt４３８、配列番号５のnt１５７〜nt２３
    ７、配列番号７のnt６１４〜nt６７０、及び配列番号１
    のnt１９７〜nt２５３から成る群から選択される請求項
    ３２記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  34. 【請求項３４】 キャリヤー又は融合パートナーに連結
    された、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミノ
    酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミノ
    酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミノ
    酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０〜
    アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ酸
    配列を有するポリペプチド；又は前記（ａ）のポリペプ
    チドのペプチドフラグメント、を含んで成る融合タンパ
    ク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離さ
    れたポリヌクレオチド分子。
  35. 【請求項３５】 前記融合パートナーが、保護ペプチ
    ド、β−ガラクトシダーゼ、trpE、マルトース−結合タ
    ンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び
    ポリヒスチジンから成る群から選択される請求項３４記
    載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  36. 【請求項３６】 前記融合パートナーが、アミノ酸配列
    Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg （配列番号
    ９６）を含んで成る保護ペプチドである請求項３５記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  37. 【請求項３７】 配列番号３，５，７もしくは９から選
    択されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分
    子、又は配列番号３，５，７もしくは又は９から選択さ
    れたヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列
    から成るポリヌクレオチド分子、に対して高い緊縮条件
    下でハイブリダイズすることができ、且つ、ＡＰＰに感
    染したブタからの流体サンプル又は組織サンプル中のＡ
    ＰＰ−特異的ポリヌクレオチド分子の存在の検出に使用
    することができる、オリゴヌクレオチド分子。
  38. 【請求項３８】 配列番号１５〜４７及び４９〜９３か
    ら成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成る
    請求項３７記載のオリゴヌクレオチド分子。
  39. 【請求項３９】 請求項１２〜３６のいずれか１項に記
    載のポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えベクタ
    ー。
  40. 【請求項４０】 配列番号３のnt４３９〜nt１０２３の
    ヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を
    含んで成る請求項３９記載の組換えベクター。
  41. 【請求項４１】 株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に存
    在するプラスミドpER418と同じであるプラスミドである
    請求項４０記載の組換えベクター。
  42. 【請求項４２】 配列番号５のnt２３８〜nt９３３のヌ
    クレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含
    んで成る請求項３９記載の組換えベクター。
  43. 【請求項４３】 株Pz417(ATCC 98927）の宿主細胞に存
    在するプラスミドpER417と同じであるプラスミドである
    請求項４２記載の組換えベクター。
  44. 【請求項４４】 配列番号７のnt６７１〜nt１７０８の
    ヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を
    含んで成る請求項３９記載の組換えベクター。
  45. 【請求項４５】 株Pz419(ATCC 98929）の宿主細胞に存
    在するプラスミドpER419と同じであるプラスミドである
    請求項４４記載の組換えベクター。
  46. 【請求項４６】 配列番号９のnt２５４〜nt１３０６の
    ヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を
    含んで成る請求項３９記載の組換えベクター。
  47. 【請求項４７】 株Pz420(ATCC 98930）の宿主細胞に存
    在するプラスミドpER420と同じであるプラスミドである
    請求項４６記載の組換えベクター。
  48. 【請求項４８】 請求項３９記載の組換えベクターを含
    んで成る、形質転換された宿主細胞。
  49. 【請求項４９】 アクチノバチルス・プレウロニウモニ
    ア（APP ）に対するワクチンであって、（ａ）配列番号
    ４のアミノ酸残基２２〜アミノ酸残基２１５、配列番号
    ６のアミノ酸残基２８〜アミノ酸残基２５８、配列番号
    ８のアミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３６４、及び配列
    番号１０のアミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３６９から
    成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペ
    プチド；（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのペプチドフ
    ラグメント；（ｃ）キャリヤー又は融合パートナーに連
    結された、前記（ａ）のポリペプチド、又は（ｂ）のペ
    プチドフラグメントを含んで成る、融合タンパク質；
    （ｄ）前記（ａ）のポリペプチド、又は（ｂ）のペプチ
    ドフラグメント又は（ｃ）の融合タンパク質の類似体又
    は誘導体；あるいは（ｅ）前記（ａ）のポリペプチド、
    （ｂ）のペプチドフラグメント、（ｃ）の融合タンパク
    質、又は（ｄ）の類似体もしくは誘導体をコードするポ
    リヌクレオチド分子から成る群から選択された、ブタに
    おけるAPP に対しての保護応答を誘発し、又はその誘発
    に寄与することができる、免疫学的有効量の抗原；及び
    獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成
    るワクチン。
  50. 【請求項５０】 免疫調節成分をさらに含んで成る請求
    項４９記載のワクチン。
  51. 【請求項５１】 前記免疫調節成分がアジュバントであ
    る請求項５０記載のワクチン。
  52. 【請求項５２】 ブタを苦しめる疾病又は病理学的状態
    に対する保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与するこ
    とができる、第一の抗原としての前記の抗原とは異る第
    二の抗原の免疫学的有効量を含んで成る、請求項４９に
    記載のワクチン。
  53. 【請求項５３】 APP に対してブタを保護することがで
    きるワクチンの調製方法であって、（ａ）配列番号４の
    アミノ酸残基２２〜アミノ酸残基２１５、配列番号６の
    アミノ酸残基２８〜アミノ酸残基２５８、配列番号８の
    アミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３６４、及び配列番号
    １０のアミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３６９から成る
    群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチ
    ド；（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのペプチドフラグ
    メント；（ｃ）キャリヤー又は融合パートナーに連結さ
    れた、（ａ）のポリペプチド又は（ｂ）のペプチドフラ
    グメントを含んで成る、融合タンパク質；（ｄ）前記
    （ａ）のポリペプチド、又は（ｂ）のペプチドフラグメ
    ント又は（ｃ）の融合タンパク質の類似体又は誘導体；
    あるいは（ｅ）前記（ａ）のポリペプチド、（ｃ）のペ
    プチドフラグメント、（ｄ）の融合タンパク質又は
    （ｅ）の類似体又は誘導体をコードするポリヌクレオチ
    ド分子から成る群から選択された、ブタにおけるAPP に
    対しての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与するこ
    とができる、免疫学的有効量の本発明の抗原と、ブタへ
    の投与のために適切な形で、獣医学的に許容できるキャ
    リヤー又は希釈剤とを組合すことを含んで成る方法。
  54. 【請求項５４】 APP に対してブタを予防接種するため
    の方法であって、請求項４９記載のワクチンをブタに投
    与することを含んで成る方法。
  55. 【請求項５５】 APP に対してブタを予防接種するため
    のワクチンキットであって、免疫学的有効量の請求項４
    ９記載の１又は複数の抗原を含んで成る容器を含んで成
    るキット。
  56. 【請求項５６】 獣医学的に許容できるキャリヤー又は
    希釈剤を含んで成る第２容器をさらに含んで成る請求項
    ５５記載のキット。
  57. 【請求項５７】 配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミ
    ノ酸残基２１５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミ
    ノ酸残基２５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミ
    ノ酸残基３６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０
    〜アミノ酸残基３６９から成る群から選択されたアミノ
    酸配列を含んで成るポリペプチドに特異的に結合する単
    離された抗体。
  58. 【請求項５８】 診断用キットであって、APP 抗原に対
    して向けられたブタ抗体に特異的に結合するであろう、
    （ａ）配列番号４のアミノ酸残基２２〜アミノ酸残基２
    １５、配列番号６のアミノ酸残基２８〜アミノ酸残基２
    ５８、配列番号８のアミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３
    ６４、及び配列番号１０のアミノ酸残基２０〜アミノ酸
    残基３６９から成る群から選択されたアミノ酸配列を含
    んで成るポリペプチド；（ｂ）前記（ａ）のポリペプチ
    ドのペプチドフラグメント；（ｃ）キャリヤー又は融合
    パートナーに連結された、（ａ）のポリペプチド又は
    （ｃ）のペプチドフラグメント、を含んで成る融合タン
    パク質；（ｄ）前記（ａ）のポリペプチド、（ｂ）のペ
    プチドフラグメント又は（ｃ）の融合タンパク質を含ん
    で成る第１容器；並びにブタ抗体に対して向けられた第
    ２抗体を含んで成る第２容器、を含んで成るキット。
  59. 【請求項５９】 診断用キットであって、配列番号４の
    アミノ酸残基２２〜アミノ酸残基２１５、配列番号６の
    アミノ酸残基２８〜アミノ酸残基２５８、配列番号８の
    アミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３６４、及び配列番号
    １０のアミノ酸残基２０〜アミノ酸残基３６９から成る
    群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るAPP タンパ
    ク質に結合する一次抗体を含んで成る第１容器；並びに
    APP タンパク質上の異なったエピトープに結合し、又は
    前記一次抗体に対して向けられる第２抗体を含んで成る
    第２容器を含んで成るキット。
  60. 【請求項６０】 診断用キットであって、APP −特異的
    ポリヌクレオチド分子に対して特異的にハイブリダイズ
    するか、又は前記分子を増幅することができる請求項１
    ２〜３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子
    又は請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド分子を含ん
    で成る容器を含んで成るキット。
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