JP2003000235A - システインプロテアーゼ活性の改善方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 食品加工分野で利用されるシステインプロテ
アーゼの活性を、その機能特性を阻害することなく、増
強する方法を見出すことを目的とする。 【解決手段】 本発明によれば、システインプロテアー
ゼに電子線を照射し、そのプロテアーゼ活性を上げるこ
とからなるシステインプロテアーゼ活性の改善方法、こ
の方法で得られるシステインプロテアーゼ及び該酵素を
用いて得られる製品が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、システインプロテ
アーゼに電子線を照射し、そのプロテアーゼ活性を上げ
ることからなるシステインプロテアーゼ活性の改善方
法、この方法で得られるシステインプロテアーゼ及び該
酵素を用いて得られる食品、医薬品、化粧品、飼料分野
等で利用される製品に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】自然
界に広く分布するシステインプロテアーゼは、その機能
を利用して、医薬品や食品の製造に用いられている。し
かし、システインプロテアーゼは活性中心にメルカプト
基(-SH基)をもつので、チオール試薬といわれる重金属
もしくはその誘導体、アルキル化剤、酸化剤などと反応
して、その活性が阻害されやすいことが知られている。
このため、システインプロテアーゼをそのまま単独で使
用する場合には、活性が低いことから、例えば肉の軟化
やビールの冷却時の混濁防止などの限られた目的にしか
適用できず、また酵素を多量に使用する必要があるとい
う問題があった。

【０００３】システインプロテアーゼ活性の維持あるい
は向上を目的として、システインプロテアーゼをシステ
イン等の還元剤又はEDTA等のキレート剤と組合わせて使
用する方法が知られている(赤堀四郎編；酵素研究法、
朝倉書店、293-298(1955))。しかしながら、この方法で
は、併用される還元剤又はキレート剤が、食品加工の際
に味や風味などの点で悪影響を及ぼすことが指摘されて
いる。また、システインプロテアーゼの水溶液にガンマ
線を照射して、その活性を変化させる方法が検討されて
いる(古田ら、Pep. Prog.Polym.Phys.Jpn, Vol.41, 559
-562(1998)及びBogutaら、Int.J.Radiat. Biol.Relat.P
hys.Chem. Med., Vol.43, No.3, 249-265(1983))。しか
し、これらの方法では、水溶液中でラジカルが発生する
ために酵素活性が低下しており、放射線での照射によっ
て酵素活性を向上させる具体的な技術も確立されていな
い。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、電子線を照射
したシステインプロテアーゼは、非照射のものと比較し
てプロテアーゼ活性を向上させること、また照射したプ
ロテアーゼを用いた製品では、外観、味、風味などにな
んら変化がないことを見出した。したがって、本発明に
よれば、システインプロテアーゼに電子線を照射し、そ
のプロテアーゼ活性を上げることからなるシステインプ
ロテアーゼ活性の改善方法、この方法で得られるシステ
インプロテアーゼ及び該酵素を用いて得られる製品が提
供される。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明で用いられるシステインプ
ロテアーゼは植物、動物、細菌、酵母、原虫類などから
得られ、その活性中心にSH基を有するプロテアーゼであ
れば特に限定されない。一例として、パパイヤ、パイナ
ップル、イチジクなどの植物を由来とするパパイン、キ
モパパイン、ブロメライン及びフィシンが挙げられ、特
にパパインが好ましい。

【０００６】システインプロテアーゼは、市販品、又
は、植物から抽出・濃縮等の通常の手段により得られる
ものであってもよく、含水率が20％以下、特に7％以下
であれば、ミネラルなどのタンパク質以外の成分を含ん
でいてもよい。また、その形態は、フィルム状、板状、
粒状または粉末状のような乾燥物の形態であることが好
ましく、粒状または粉末状の形態であるのがより好まし
い。

【０００７】このようなシステインプロテアーゼは、電
子線で照射することによって、そのプロテアーゼ活性を
向上させることができる。電子線は、例えば直線型電子
加速器、バン・デ・グラーフ型電子加速器、エリアビー
ム型あるいはコッククロフトワルトン型あるいはダイナ
ミトロン型放射線発生装置などの電子線加速器から発生
される電子線が使用される。

【０００８】電子線の吸収線量は1〜10kGy、特に1〜5kG
yの範囲であることが好ましい。また、加速電圧は、50k
V〜10MVの範囲が好適である。50kVより低い加速電圧で
は、期待する効果が得られず、また10MVより高い加速電
圧では、食品での用途が禁止されている。このため、通
常利用される加速電圧の範囲は、50kV〜2.5MVであり、
好ましくは300kV〜１MVの範囲である。さらに、線量率
は1.5x10⁶〜2.0x10⁹Gy/hrの範囲に管理されていること
が好適である。

【０００９】システインプロテアーゼに電子線を照射す
る方法は特に限定されないが、厚みが80μm以下のポリ
エチレン製袋などの容器中で、システインプロテアーゼ
を1〜10mmの厚みなるように薄く広げた状態にして、電
子線を照射することが望ましい。上記のようにして電子
線を照射したシステインプロテアーゼは、1.1倍以上、
特に電子線の吸収線量が1〜5kGyの範囲である際には、
1.5〜2.2倍、そのプロテアーゼ活性を向上させる。

【００１０】このようなプロテアーゼ活性の向上が、電
子線の照射により、どのようなメカニズムで生じるのか
は不明である。しかしながら、本発明者らは、電子線の
照射によって、酵素中に占めるα-へリックス構造の含
有率が低下し、酵素活性の向上とα-へリックス構造含
有率の低下に逆の相関関係があること、及び酵素反応速
度が増加していることを確認した。α-へリックス構造
含有率の低下は、本来存在するα-へリックス構造がほ
ぐれ、プロテアーゼの高次構造に変化を生じていること
を示唆し、酵素反応速度の上昇は、直接プロテアーゼ活
性の向上をもたらす。このため、電子線を照射したシス
テインプロテアーゼの活性の向上は、上記のような現象
の結果によるものと思われる。

【００１１】電子線は、工業的に安価に使用することが
でき、その照射技術も確立されているので、簡便な操作
で大量のシステインプロテアーゼの活性を向上させるこ
とができる。また、本発明の方法により照射されたシス
テインプロテアーゼには、酵素本来の機能阻害が認めら
れない。したがって、従来使用されていた還元剤やキレ
ート剤を使用することなく、本発明の方法によって処理
したシステインプロテアーゼを単独で使用することによ
って、種々の分野、例えば食品、医薬品、医薬部外品、
化粧品、農薬、飼料などの製造において、所望の活性を
得ることができる。

【００１２】特に食品の分野では、この発明の方法は、
以下の食品の製造時に利用されるシステインプロテアー
ゼに適用することができる：畜産加工品（ハム、ソーセ
ージ、サラミ、酢豚、焼き豚、ホルモン焼き、ミートボ
ール、コーンビーフ、レバーペースト、ハンバーグ）、
水産加工品（かまぼこ、はんぺん、すり身、珍味かまぼ
こ、揚げかまぼこ、おでんの種、ツナ油漬け、イワシ・
サバみそ漬け、貝加工品、エビクリーム煮）、農産加工
品（惣菜、八宝菜、サラダ、弁当、すきやき、マーボー
豆腐、ソース、酒、みりん、シチュー、カレー、ミート
ソース、スープ類）、乳製品（コーヒー用ミルク、練
乳、豆乳飲料、チーズ、ヨーグルト、各種調整乳製
品）、タマゴ製品（マヨネーズ、卵焼き、出し巻きタマ
ゴ）、餅や餅加工品、米飯類（すし、うなぎめし、ピラ
フ、かにめし、チャーハンなど）、デザート類（プリ
ン、ゼリー、フラン、ぜんざいなど）、冷菓類（アイス
クリーム、かき氷、シャーベット、勝ち割り氷など）及
び冷凍加工食品（冷凍食品類）、つけもの類（福神漬
け、味噌漬け、醤油漬け、からし漬け、奈良漬けな
ど）、果実製品（ぶどうシロップ漬け、オレンジジュー
ス、透明リンゴジュース、トマトジュース、トマトケッ
チャプ、トマトソース、アンズジャム、ゼリー、プレザ
ープ、くり甘露煮など）、飲料（コーヒー、コーヒー乳
飲料、紅茶、炭酸飲料、コーラ入り炭酸飲料、清涼飲
料、ネクター、緑茶）、アルコール飲料（清酒、あまざ
け、微生物割り飲料、果汁入り飲料、各種カクテル、ワ
イン、ビールなど）、ヌードル製品（カップめん、うど
ん、ラーメン、そば、めんつゆなど）、小麦粉製品（ケ
ーキ、冷凍ケーキ、お好み焼きパウダー、たこ焼きパウ
ダー、から揚げ粉）、大豆製品、レトルト加工、無菌充
填工程の製品。

【００１３】

【実施例】以下、実施例を挙げて説明するが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。 実施例１： １）電子線照射 パパイン（シグマ社、分子量23,400、１ユニット1.0μm
ole BAEE/min、ｐH6.2、水分4.2%）の粉末試料をポリエ
チレン製の袋（日本生産（株）、E-8、厚さ80μm）に入
れて厚さ1mmに薄く伸ばし、空気の存在下で電子線を照
射した。照射はダイナミトロン型電子線発生装置（住友
重機械工業社製）を用い、加速電圧10MV（線量率9.6×1
0⁷Gy/hr）、吸収線量1〜10kGyで行なった。照射皿の搬
送速度1m/minとした。

【００１４】２）酵素活性の測定 酵素活性は、システインプロテアーゼをカゼインに作用
させる際に、ペプチド結合の切断に伴って増加する酸可
溶性分解産物の量を測定する方法を用いた。活性単位
は、プロテアーゼが乳製カゼインに30℃で作用すると
き、反応初期の1分間に、１μgのチロシンに相当する非
タンパク質性のフォリン試薬呈色物質の増加をもたらす
酵素量を１ユニットとした。カゼイン溶液（乳製カゼイ
ン1.20g（無水物換算）を量り、0.05Nリン酸二ナトリウ
ム160mlを加えて加温溶解し、0.5N塩酸を加えてpH7.0に
調整し、水を加えて200mlとする）5mlを正確に量り、試
験管に入れて、30±0.5℃で10分間加温する。ついで直
ちに、電子線照射したパパイン及び非照射パパイン各1.
0gを酢酸カルシウム・塩化ナトリウム混液（酢酸カルシ
ウム0.35g、塩化ナトリウム0.58gを１N塩酸または１N水
酸化ナトリウムを加えてpH6.0とし水で1000mlに定容）
に溶かし100mlとしパパイン溶液とする。

【００１５】つぎに、活性単位が30〜40ユニット/mlの
範囲に入るように酢酸カルシウム・塩化ナトリウム混液
を用いて希釈した上記パパイン溶液を酵素溶液とし、そ
の1mlを加温した上記カゼイン溶液に加え、直ちに振り
混ぜる。酵素溶液とカゼイン溶液の混合液を30±0.5℃
で正確に10分間放置した後、トリクロル酢酸溶液（トリ
クロル酢酸18g、6N酢酸55ml、水1000mlに定容）5mlを加
えてよく振り混ぜ、再び30±0.5℃で30分間放置した
後、ろ紙でろ過する。このろ液2mlを正確に量り、炭酸
ナトリウム溶液（炭酸ナトリウム58.3g、水1000mlに定
容）5mlおよび薄めたフォリン溶液（フェノール試薬10m
l、水30mlに定容）1mlを加えてよく振り混ぜ、30±0.5
℃で30分間放置した後、この液の波長660nmにおける吸
光度Arを測定する。別途、上記酵素溶液1mlにトリクロ
ル酢酸溶液5mlを加え、次にカゼイン溶液5mlを加えて振
り混ぜ、30±0.5℃で30分間放置し、以下同様に操作し
て吸光度Asを測定する。酵素溶液1ml中の酵素量（g）を
Wとし、以下の計算式により、各吸収線量で電子線を照
射したパパインの酵素活性を求めた。 活性単位（ユニット/g）＝（Ar−As）×119.96×11/2×
1/10×1/W

【００１６】

【表１】

【００１７】表１に示すように、パパインに電子線を照
射することにより、その酵素活性が約1.1〜2倍に向上す
ることが確認された。

【００１８】実施例２：実施例１で得たパパイン(吸収
線量1kGy)及び電子線非照射のパパインをポリエチレン
製の袋に入れ、70℃の恒温器に6時間保持し、加熱後の
プロテアーゼ活性を実施例１と同様に測定して比較し
た。その結果、表２に示すように、電子線を照射するこ
とで、加熱後も非照射パパインの約1.3倍のプロテアー
ゼ活性を保持していることがわかった。

【００１９】

【表２】

【００２０】実施例３：実施例１で得た照射パパインの
二次構造変化をCDスペクトルの測定により分析した。分
析は、日本分光社製のCDスペクトル測定装置（J750）を
用いた。その測定条件は、温度25℃、バンド幅1.0nm、
スリット幅autoとし、感度は100mdeg、レスポンス:0.25
nm、走査速度:20nm/minとし、セル光路長は1mm及び10mm
とした。スペクトルは、5回測定した平均値で記録し
た。波長域は、190-220nmと220-350nmを連続的に測定し
た。試料濃度については、1mmセル使用時が2.0×10^-6M
〜2.5×10 ^-6M、1cmセル使用時が2.0×10^-7M〜2.5×10^-7
M（パパイン分子量23400）とした。その結果、電子線照
射した場合には、280nmでの吸収スペクトルの巾が小さ
くなり、非照射のものと比較して、α-ヘリックス構造
の数が減少していることがわかった(図１)。また、208n
m及び222nmのスペクトルの値からα-ヘリックス構造の
パパインの全構造中に占める含有率をGreenfield＆Fasm
an(1969)が用いた計算式により算出し、プロテアーゼ活
性との関係を検討したところ、図２に示すように、活性
の向上に伴ってα-へリックス構造の含有率が低下して
いることがわかった。

【００２１】実施例４：実施例１で得た照射パパイン
(吸収線量5kGy)について、基質としてp-ニトロフェニル
・アセテート（pNPA）を用いて、その酵素活性の反応速
度を測定した。活性速度は、実施例１で得た照射パパイ
ン(吸収線量5kGy)及び非照射パパイン（各25μｇ）を含
む酵素溶液1mlと活性化試薬0.2mlと3mM基質溶液5mlを混
合し、試験溶液の吸光度を30秒ごとに測定して得られた
吸光度の勾配から、酵素溶液1mgが1分間に分解するp-ニ
トロフェノールのモル数を求め、非照射パパインの酵素
反応速度と比較した。

【００２２】

【表３】

【００２３】この結果、非照射のパパインではKm=30.6
1、Vmax＝135.39であるのに対し、電子線照射したパパ
インではKm＝36.20、Vmax＝178.88であり、電子線照射
により、反応速度は約1.2倍に向上したことが確認され
た。これは、電子線照射が酵素の活性中心に影響してお
らず、その活性中心の周辺の構造が照射の影響を受けて
いる可能性があることを示唆している。

【００２４】実施例５：白米10kｇに実施例１で得たパ
パイン（吸収線量3kGy）2gを混合し、清酒を得た。この
清酒は従来の酵素製剤を使用して製造する場合の約３分
の２の時間で製造することができ、また使用したパパイ
ンの量は従来の酵素製剤の半分量であり、得られた清酒
は味、風味ともに良好であった。

【００２５】実施例6：−20℃で凍結貯蔵した牛肉（肩
部及び首部の肉1：１）を、10℃の低温室で半解凍した
後、スライサーで筋繊維に直角に切り、縦10〜15cm、横
5〜10cm、厚さ１cmに成形した。この肉500gに、pH8のア
ンモニウム緩衝液に実験例１で得た照射パパイン（吸収
線量４kGy）及び非照射のパパインを各0.1%重量添加し
た溶液500gを注入したのち、30℃の恒温下に60分間保存
した。その後、非照射パパインで処理した肉と照射パパ
インで処理した肉をそれぞれ100℃で30分加熱して水煮
し、10名のパネラーで比較評価した。この結果、照射パ
パインで処理した肉が、非照射パパインで処理した肉よ
り柔らかく、またこの肉の外観及び味、風味が損なわれ
ておらず、食感が良いことが確認された。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、システインプロテアー
ゼに電子線を照射し、そのプロテアーゼ活性を上げるこ
とからなるシステインプロテアーゼ活性の改善方法、こ
の方法で得られたシステインプロテアーゼ及び該酵素を
用いて得られる製品が提供される。電子線は工業的に安
価に使用することができ、その照射技術も確立されてい
ることから、本発明の方法により、従来使用されていた
還元剤又はキレート剤などを用いず、また酵素本来の機
能を阻害することなく、簡便な操作で大量のシステイン
プロテアーゼを処理し、その酵素活性を向上させること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】電子線非照射および電子線照射のパパインのCD
スペクトルを示す。

【図２】電子線照射したパパインのプロテアーゼ活性と
α-ヘリックス構造の含有率の関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂上 和之 大阪府豊能郡豊能町東ときわ台５丁目14番 12号 Ｆターム(参考） 2B150 DF09 4B015 GG14 4B018 LB06 MD90 ME14 MF12 4B042 AC05 AC09 AD39 AG02 AH01 AP13 AP27 4B050 CC10 DD13 HH01 LL01 LL02 LL05

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 システインプロテアーゼに電子線を照射
   し、そのプロテアーゼ活性を上げることからなるシステ
   インプロテアーゼ活性の改善方法。
2. 【請求項２】 電子線が、吸収線量1〜10kGyの範囲で用
   いられる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 電子線が、電子線加速器を通して加速電
   圧50kV〜10MV及び線量率1.5×10⁶〜2.0×10⁹Gy/hrの条
   件下で用いられる請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 システインプロテアーゼがパパインであ
   る請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１つに記載の方
   法で得られるシステインプロテアーゼ。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のシステインプロテアー
   ゼを用いて得られる製品。